專利名稱：能夠特異性結(jié)合Aβ寡聚體的抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可特異性地結(jié)合A β寡聚體的抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多種證據(jù)已顯示，記憶的衰退起因于由可溶性Αβ寡聚體觸發(fā)的突觸功能障礙 (參見非專利文獻(xiàn)1和2)。A β寡聚體的過量積聚與沉著可觸發(fā)一系列病理學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo) 致阿爾茨海默氏病(AD)。因此，靶向Αβ寡聚體的治療介入對(duì)阻斷這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能是有 效的。然而，對(duì)于該淀粉狀蛋白級(jí)聯(lián)的假說中，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變，特別是由Αβ寡聚體介 導(dǎo)的神經(jīng)變性的核心分子，其實(shí)驗(yàn)證據(jù)最早來自體外實(shí)驗(yàn)(參見非專利文獻(xiàn)3)。該神經(jīng)變 性未在體內(nèi)得到直接證實(shí)。之前報(bào)道的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)最大的缺陷在于，它們無法證明內(nèi)源Αβ 寡聚體的突觸毒性。這是由于缺乏對(duì)構(gòu)象具有特異性的分子工具(參見非專利文獻(xiàn)4)。在 阿爾茨海默氏病小鼠模型中亦難以解決的問題，還沒有辦法在人類腦內(nèi)解決。因而，內(nèi)源 Αβ的體內(nèi)神經(jīng)毒性往往受到忽視。為何在人類內(nèi)嗅皮質(zhì)中的NFT形成與神經(jīng)細(xì)胞喪失發(fā) 生于老年斑形成之前，以及A β如何涉及該機(jī)制，人們都尚不知曉。涉及現(xiàn)行發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)信息如下所示[非專利文獻(xiàn) 1]Klein WL, Trends Neurosci. 24 :219_224，2001[非專利文獻(xiàn) 2] Selkoe DJ, Science 298 :789_791，2002[非專利文獻(xiàn) 3]Hass C et al. =Nature Review 8 101-12，2007[非專利文獻(xiàn) 4] Lee EB, et al. :J. Biol. Chem. 281 =4292-4299, 2006本發(fā)明的公開[本發(fā)明需解決的問題]本發(fā)明是鑒于上述情況完成的。本發(fā)明的一個(gè)目的為提供可特異性地結(jié)合Αβ寡 聚體的抗體及其應(yīng)用。更加具體而言，本發(fā)明提供了可特異性地結(jié)合Αβ寡聚體的抗體，以 及使用該抗體檢測(cè)Αβ寡聚體的方法，使用該抗體診斷阿爾茨海默氏病的方法，以及包含 該抗體的藥劑。[解決該問題的手段]本發(fā)明人產(chǎn)生了這樣的單克隆抗體，它們僅對(duì)可溶性淀粉樣蛋白β (Αβ)寡聚體 具有特異性，而不識(shí)別屬于生理性分子的可溶性A β單體，此外，本發(fā)明人確證了所述抗體 具有下列功能(1)抗神經(jīng)毒性活性；(2)阻抑A β淀粉樣蛋白原纖維形成的活性；(3)僅識(shí)別A β寡聚體的特異性；(4)在AD腦中捕獲Αβ寡聚體的能力；以及(5)預(yù)防類阿爾茨海默氏病表型(記憶損害，腦部Αβ積聚水平)在APPswe轉(zhuǎn)基 因小鼠(Tg2576)中發(fā)展的能力。使用超濾/分子篩方法，在產(chǎn)生的抗體中，確定了單克隆抗體1A9與2C3特異性的
4識(shí)別30kDa或更大，主要為IOOkDa或更大的寡聚體，但不識(shí)別大約4. 5kDa左右的單體。通 過測(cè)量?jī)煞N抗體在已分化為神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞中針對(duì)Αβ 1-42-誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的中和 作用，確證了它們具有神經(jīng)毒性中和活性。硫代黃素T測(cè)定與電子顯微鏡觀察顯示所述抗 體具有阻抑Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成的活性。通過下述方法確證了 1Α9與2C3在AD腦中 捕獲A β寡聚體的能力，即使用這些抗體在具有SDS穩(wěn)定性的4_，5_，8-以及12-聚體的存 在下進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。進(jìn)一步，為確定在人腦中的體內(nèi)神經(jīng)毒性，對(duì)在主要為Braak NFT I到III期的人類內(nèi)嗅皮質(zhì)中所述抗體識(shí)別的多聚體的量進(jìn)行了測(cè)量。對(duì)據(jù)報(bào)道在動(dòng)物研 究中具有神經(jīng)毒性的12-聚體加以特別關(guān)注，結(jié)果確證了該多聚物的積聚發(fā)生于認(rèn)知機(jī)能 障礙出現(xiàn)之前，并隨著Braak NFT期的進(jìn)展而增加。該結(jié)果首次顯示，所述12-聚體，其被 所述抗體所特異性識(shí)別，是一種構(gòu)象聚合體(conformational assembly)，在人腦中導(dǎo)致體 內(nèi)神經(jīng)毒性。本發(fā)明人亦發(fā)現(xiàn)由所述抗體識(shí)別的寡聚構(gòu)象結(jié)構(gòu)存在于腦脊液(CSF)中，并 在AD患者中增加。本發(fā)明人將1A9或2C3與其它神經(jīng)病癥同樣地通過靜脈內(nèi)注射進(jìn)行被動(dòng) 免疫治療。經(jīng)確證Tg2576小鼠通過亞慢性被動(dòng)免疫治療而受保護(hù)免于罹患記憶缺陷，老年 斑形成，突觸障礙與Αβ積聚，且無有害副作用。本發(fā)明人獲得的該結(jié)果首次說明，單克隆 1Α9與2C3很有希望被選擇作為在Tg2576小鼠中預(yù)防類阿爾茨海默氏病表型的治療抗體， 其可望通過常規(guī)外周靜脈內(nèi)給藥顯示其效應(yīng)，從而無需考慮腦內(nèi)轉(zhuǎn)移(brain transfer)的 問題。本發(fā)明人亦確證使用所述1A9與2C3抗體的被動(dòng)免疫療法可阻抑老年斑淀粉狀蛋 白形成以及腫大變性的神經(jīng)突形成。進(jìn)一步，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)投入血液的1A9與2C3中有一 部分轉(zhuǎn)移入腦部。如上所述，本發(fā)明人在本文中公開了單克隆1A9與2C3——它們是特異性結(jié)合Αβ 寡聚體的抗體——符合了所有診斷性/治療性抗體的標(biāo)準(zhǔn)，并且是供診斷/預(yù)防阿爾茨海 默氏病的治療抗體的有望候選。本發(fā)明人成功獲取了 Ε12，IClO與4D3抗體，它們與所述1Α9與2C3抗體相似，不 識(shí)別A β單體，但可特異性地結(jié)合A β寡聚體，且發(fā)現(xiàn)其中所述Ε12抗體具有阻抑A β淀粉 樣蛋白微纖維形成的活性。因此，本發(fā)明認(rèn)為上述Ε12，IClO與4D3亦為供診斷/預(yù)防阿爾茨海默氏病的治療 抗體的有望候選。更加具體而言，本發(fā)明提供了下述[1] 一種可結(jié)合A β寡聚體的抗體，其中所述抗體不結(jié)合A β單體；[2] 一種可結(jié)合Αβ寡聚體的抗體，所述Αβ寡聚體可結(jié)合包含具有SEQID NO=I 的氨基酸序列的H鏈與具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L鏈的抗體；[3] 一種可結(jié)合A β寡聚體的抗體，所述A β寡聚體可結(jié)合包含具有SEQID NO 21 的氨基酸序列的H鏈與具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L鏈的抗體；[4] 一種可結(jié)合A β寡聚體的抗體，所述A β寡聚體可結(jié)合包含具有SEQID NO 41 的氨基酸序列的H鏈與具有SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L鏈的抗體；[5]下述(1)到(20)中任一項(xiàng)的抗體(1) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列作為CDRl，SEQ ID NO 11 的氨基酸序列作為⑶R2，以及SEQ ID NO 13的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；
(2) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列作為CDRl，SEQ ID NO 17 的氨基酸序列作為⑶R2，以及SEQ ID NO 19的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(3) 一種抗體，其包含⑴的H鏈與⑵的L鏈；(4) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列作為VH的H鏈；(5) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列作為VL的L鏈；(6) 一種抗體，其包含⑷的H鏈與(5)的L鏈；(7) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 29的氨基酸序列作為CDRl、SEQ ID NO 31 的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 33的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(8) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列作為CDRl，SEQ ID NO 37 的氨基酸序列作為⑶R2，以及SEQ ID NO 39的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(9) 一種抗體，其包含(7)的H鏈與(8)的L鏈；(10) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 25的氨基酸序列作為VH的H鏈；(11) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 27的氨基酸序列作為VL的L鏈；(12) 一種抗體，其包含(10)的H鏈與(11)的L鏈；(13) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列作為CDRl，SEQ ID NO 51的氨基酸序列作為⑶R2，以及SEQ ID NO 53的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(14) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列作為CDRl，SEQ ID NO 57的氨基酸序列作為⑶R2，與SEQ ID NO 59的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(15) 一種抗體，其包含(13)的H鏈與(14)的L鏈；(16) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 45的氨基酸序列作為VH的H鏈；(17) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列作為VL的L鏈；(18) 一種抗體，其包含(16)的H鏈與(17)的L鏈；(19) 一種抗體，其是在(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體中替換，缺失，添加和/或插入 一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的，并具有與所述(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體等價(jià)的活性；以及(20) 一種抗體，其可結(jié)合(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體所結(jié)合的表位；[6] [5]所述的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體或人源化抗體；[7] 一種組合物，其包含[1]到[6]任一項(xiàng)所述的抗體與藥用載體；[8] 一種抗認(rèn)知機(jī)能障礙劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合 物作為活性成分；[9] 一種阿爾茨海默氏病治療劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的 組合物作為活性成分；[10] 一種阻抑阿爾茨海默氏病進(jìn)展的藥劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗 體或[7]的組合物作為活性成分；[11] 一種阻抑老年斑形成的藥劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7] 的組合物作為活性成分；[12] 一種阻抑Αβ積聚的藥劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的 組合物作為活性成分；[13] 一種抗神經(jīng)毒性劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物 作為活性成分；
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[14] 一種抑制Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成的試劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所 述的抗體或[7]的組合物作為活性成分；[15] 一種抗突觸毒性劑，其包含[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物 作為活性成分；[16] 一種預(yù)防和/或治療認(rèn)知機(jī)能障礙的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng)所 述的抗體或[7]的組合物作為活性成分施用的步驟；[17] 一種預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng) 所述的抗體或[7]的組合物作為活性成分施用的步驟；[18] 一種阻抑阿爾茨海默氏病進(jìn)展的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的 抗體或[7]的組合物作為活性成分施用的步驟；[19] 一種阻抑老年斑形成的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或 [7]的組合物作為活性成分施用的步驟；[20] 一種阻抑Αβ積聚的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7] 的組合物作為活性成分施用的步驟；[21] 一種中和神經(jīng)毒性的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7] 的組合物作為活性成分施用的步驟；[22] 一種抑制Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng) 所述的抗體或[7]的組合物作為活性成分施用的步驟；[23] 一種中和突觸毒性的方法，其包括將[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7] 的組合物作為活性成分施用的步驟；[24] 一種檢測(cè)Αβ寡聚體的方法，其包括使用[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體檢 測(cè)自受試者收集的試樣中所含的Αβ寡聚體的步驟；[25] 一種診斷受試者是否可能為阿爾茨海默氏病患者的方法，其包括使用[1]到 [6]中任一項(xiàng)所述的抗體在收集自受試者的試樣中檢測(cè)Αβ寡聚體；[26] 一種診斷受試者是否可能為阿爾茨海默氏病患者的方法，其包括下述步驟(a)使收集自受試者的試樣與[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體接觸；以及(b)測(cè)定所述試樣中Αβ寡聚體的量，其中當(dāng)步驟(b)中測(cè)得的量高于健康個(gè)體的量時(shí)，確定所述受試者可能為阿爾茨 海默氏病患者；[27] 一種診斷受試者是否可能為阿爾茨海默氏病患者的方法，其包括下述步驟(a)使收集自受試者的試樣與[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體以及可結(jié)合Aβ單 體的抗體接觸；以及(b)測(cè)定所述試樣中A β寡聚體對(duì)A β單體的比例，其中當(dāng)步驟(b)中測(cè)得的比例高于健康個(gè)體的比例時(shí)，確定所述受試者可能為阿 爾茨海默氏病患者；[28] [24]到[27]中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述試樣為血液或腦脊液；[29] 一種用于[24]到[27]中任一項(xiàng)所述的方法的藥劑；以及[30] 一種用于[24]到[27]中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了下述
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[31] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備抗認(rèn)知機(jī)能障礙劑中 的應(yīng)用；[32] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備阿爾茨海默氏病的治 療劑中的應(yīng)用；[33] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備阻抑阿爾茨海默氏病 的進(jìn)展的藥劑中的應(yīng)用；[34] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備阻抑老年斑形成的藥 劑中的應(yīng)用；[35] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備阻抑Αβ積聚的藥劑 中的應(yīng)用；[36] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備中和(阻抑)神經(jīng)毒 性的藥劑中的應(yīng)用；[37] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備抑制Αβ淀粉樣蛋白 原纖維形成的藥劑中的應(yīng)用；[38] [1]到[6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物在制備中和(阻抑)突觸毒 性的藥劑中的應(yīng)用；[39] [1]至丨 能障礙；[40] [1]至I
海默氏病；[41][1]到 進(jìn)展；[42] [1]至[43] [1]至[44] [1]至 性；[45] [1]至丨 纖維形成；[46] [1]至 性；本發(fā)明的效果由本發(fā)明提供的抗體預(yù)期將對(duì)以引起阿爾茨海默氏病病理狀態(tài)的責(zé)任分子為對(duì) 象的選擇性預(yù)防/治療方法的建立，以及阿爾茨海默氏病早期診斷標(biāo)志的建立產(chǎn)生很大的 貢獻(xiàn)。本發(fā)明的發(fā)明人獲得的證據(jù)顯示，即使在靶向腦內(nèi)病理狀態(tài)的抗體療法中，外周的靜 脈內(nèi)施藥已經(jīng)足夠，無需考慮腦內(nèi)轉(zhuǎn)移。從而，本發(fā)明預(yù)期將大大加快針對(duì)阿爾茨海默氏病 的抗體藥物的進(jìn)展。附圖簡(jiǎn)述

圖1的照片與圖片顯示對(duì)寡聚體特異性的抗體的生成和特征確定的結(jié)果。A 免疫 原的電泳。無Αβ 1-42單體污染的Αβ 1-42四聚體(紅色箭頭)使用SDS-PAGE分離。泳道
J [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于預(yù)防和/或治療認(rèn)知機(jī)
J [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于預(yù)防和/或治療阿爾茨
J [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于阻抑阿爾茨海默氏病的
IJ [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于阻抑老年斑形成； IJ [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于阻抑A β積聚； IJ [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于中和(阻抑)神經(jīng)毒
J [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于抑制Αβ淀粉樣蛋白原
IJ [6]中任一項(xiàng)所述的抗體或[7]的組合物，用于中和(阻抑)神經(jīng)毒
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1 溶解于IOmM磷酸緩沖液中的Αβ 1-42 ；泳道2 溶解于去離子蒸餾水中的Aβ 1-420B =Aβ 淀粉樣蛋白，其不溶于緩沖液，但可使用甲酸自阿爾茨海默氏病患者的腦中提取出來，使用 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液對(duì)其進(jìn)行免疫沉淀，并使用蛋白-G瓊脂糖(Amersham)選 擇性地分離其免疫復(fù)合物。測(cè)試了九個(gè)克??；泳道2 (紅色星號(hào))為1A9而泳道6(紅色雙 星號(hào))為2C3。C: 一個(gè)條件化培養(yǎng)基SEC的洗脫曲線(profile)。在所述24個(gè)經(jīng)SEC收集 的級(jí)分中，對(duì)級(jí)分8，13與16進(jìn)行1A9免疫沉淀。Αβ免疫反應(yīng)性使用4G8檢測(cè)。紅色箭頭 指示三聚體，而空心箭頭指示二聚體。星號(hào)Γ)指示抗小鼠IgG輕鏈。圖2的照片與圖片顯示1Α9與2C3的抗毒性活性。A到F 經(jīng)NGF處理的 PC12(PC12N)細(xì)胞的代表性圖像，這些細(xì)胞在37°C下在所述抗體存在或不存在的情況下暴 露于無聚合種(seed-free)的Αβ1_42 48小時(shí)(每個(gè)小圖的左半部分)。鈣黃綠素ΑΜ/ΡΙ 染色的代表圖，其中活細(xì)胞染為綠色而死細(xì)胞染為紅色(每個(gè)小圖的右半部分)。G:與下 列抗體一起暴露于無聚合種的A β 1-42 (25 μ Μ)的細(xì)胞的存活率非特異性IgG2b(實(shí)心方 塊)；4G8(空心三角)；1A9(空心方塊)；以及2C3(實(shí)心圓)。圖3的照片與圖片顯示由認(rèn)9與203所靶向的毒性六0聚集聚合體的大小與形態(tài) 特征。A:對(duì)Αβ 1-42(25μΜ)的540000x g上清使用多個(gè)超濾膜進(jìn)行連續(xù)的分子篩過程，超 濾膜的分子量截留值為3，10，30與IOOkDa(Microcon)。由此被分級(jí)的四種類型的濾液如 下命名級(jí)分 1 ( < 3kDa)，級(jí)分 2 (3 到 IOkDa)，級(jí)分 3 (10 到 30kDa)，級(jí)分 4 (30 到 IOOkDa)； 以及最后保留的級(jí)分5( > IOOkDa)。在上述每個(gè)級(jí)分中Αβ 1-42的存在均用4G8免疫印 跡法加以檢測(cè)。B 用所述五個(gè)級(jí)分在37°C下處理48小時(shí)的經(jīng)NGF處理的PC12 (PC12N)細(xì) 胞的代表性圖像。每個(gè)級(jí)分的毒性如上面圖2所述的方法衡量。C 經(jīng)Αβ 1-42的540000Χ g上清液以及五個(gè)級(jí)分(級(jí)分1到5)處理的細(xì)胞的活力。兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)果。 其值以相對(duì)對(duì)照的百分比(平均值士SD)表示。D 所述五個(gè)級(jí)分(級(jí)分1到5)的點(diǎn)印跡 分析。使印跡與A11、1A9，2C3和4G8反應(yīng)。E :5個(gè)級(jí)分的AFM圖。在具有最強(qiáng)毒性的級(jí)分 5 (Fr. 5)中，除了粒狀分子外，還發(fā)現(xiàn)了環(huán)形與珠形結(jié)構(gòu)。圖4的照片與圖片顯示1A9與2C3阻抑Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成的活性。A 通 過ThT分析法在37°C下監(jiān)視A β 1-42在多種濃度下(10 μ M (空心方塊)，25 μ M (實(shí)心菱形) 與50μΜ(空心圓))的淀粉樣蛋白原纖維形成直至72小時(shí)。8:對(duì)于203(空心圓)，觀察 到了針對(duì)Αβ 1-42淀粉樣蛋白原纖維形成的共存抗體依賴性抑制(coexsisting antibody dose-dependent inhibition)。與之相對(duì)，1A9 (空心方塊)，4G8 (實(shí)心三角)與非特異性 IgG (實(shí)心方塊)抗體并不抑制無種子的A β 1-42的原纖維形成性組裝(ThT陰性540000Χ g 上清)。C 對(duì)于2C3 (空心圓)，觀察到了針對(duì)A β 1-42原纖維形成性組裝的共存抗體依賴性 抑制，且1Α9(空心方塊)于3μ M亦見到近乎完全的抑制。D 預(yù)培育24小時(shí)以供A β 1-42 淀粉樣蛋白原纖維形成，此后添加的所有測(cè)試抗體均無法使Αβ 1-42淀粉樣蛋白纖維溶解 或解聚。E到G :Α β 1-42在不存在2C3與1Α9 (小圖Ε)、或存在2C3 (小圖F)、或存在1Α9 (小 圖G)情況下的EM圖像。圖5的照片與圖片為關(guān)于與毒性相關(guān)的Αβ 1-42寡聚體。A 點(diǎn)印跡分析法(小 圖A的上半部分)Αβ 1-42單體(25 μ Μ)在37°C下培育特定時(shí)間(0到72小時(shí))，并固化 于硝酸纖維素膜上，并對(duì)其用All，1A9，2C3或4G8進(jìn)行點(diǎn)印跡分析。對(duì)每個(gè)抗體測(cè)試了免 疫反應(yīng)性陽(yáng)性結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。免疫反應(yīng)性強(qiáng)度分析(小圖A的下邊部分)點(diǎn)印跡分析的結(jié)果使用Multi Gauge ν 3. 0軟件(Fuji Film, Tokyo)進(jìn)行半定量的分析。為將所述寡聚 體形成與淀粉樣蛋白原纖維形成相關(guān)聯(lián)，在同一個(gè)時(shí)間軸上疊加了 ThT熒光值(右邊的Y 軸)。B 在37°C下培育0，2，4與24小時(shí)后的A β 1-42聚合體，以及所述A β 1-42聚合體 在進(jìn)一步培育48小時(shí)后的變化。所述A β 1-42聚合體通過4G8免疫印跡法檢測(cè)。C 上述 多種Aβ 1-42聚合體的毒性活性。神經(jīng)細(xì)胞的活力通過圖2中所述LIVE/DEAD分析法確 定。D 使用多種A β 1-42聚合體(在37°C下0與2小時(shí)形成的A β 1-42聚合體(“Oh”與 “2h”)；以及在540000X g下超速離心兩小時(shí)后收集的ThT陽(yáng)性上清(“2h sup”))，測(cè)量 1A9與2C3的抗神經(jīng)毒性活性。在所述抗體存在或不存在情況下暴露于多種Aβ 1-42聚合 體的PC12N細(xì)胞的代表性的圖像示于小圖D的左半部分(a:“0h”；b :“2h”;c :"2hsup";d "2h sup，，+IgG2b ;e :‘‘2h sup，，+lA9 ;f :“2h sup，，+2C3)。在所述抗體存在或不存在情況下 暴露于多種Αβ 1-42聚合體的細(xì)胞的活力以相對(duì)于對(duì)照的百分比(平均值士SD)表示，并 示于小圖D的右半部分。較之“0h”Ai3 1-42聚合體，“2h”Ai3 1-42聚合體降低了神經(jīng)毒性。 "2h sup”使神經(jīng)毒性恢復(fù)到類似于“0h”Ai3 1-42聚合體的程度。非特異性的IgG2b無法 阻斷“2h sup”Ai3 1-42聚合體的神經(jīng)毒性誘導(dǎo)。單克隆1A9完全抑制了 “2h sup”誘導(dǎo)的 神經(jīng)毒性，而2C3抑制該毒性的能力略為低下。在使用所述兩種單克隆抗體(mAb)的實(shí)驗(yàn) 中，在mAb Αβ比例為1 < 25到50時(shí)觀察到了所述mAb的抗毒性活性。這表明結(jié)構(gòu) 上不同的寡聚性1Α9或2C3聚合體以相對(duì)低的濃度存在。圖6的照片和圖顯示可溶性1Α9或2C3寡聚體存在于人類腦中。針對(duì)A β寡聚體 的抗體只有在用蛋白酶K預(yù)處理后方可在AD腦中檢出老年斑與血管淀粉樣蛋白。A 1Α9染 色；B :2C3染色；以及C =All染色。D 用4G8對(duì)經(jīng)1A9或2C3免疫沉淀的Aβ在可溶于緩 沖液的AD腦中(泳道1，2，4與5)與健康對(duì)照腦中(泳道3與6)進(jìn)行免疫印跡分析。1Α9 與2C3的代表性結(jié)果分別示于所述小圖的左邊與右邊部分。E與F 在自健康老年人群的 50個(gè)尸體剖檢病例中獲取的人內(nèi)嗅皮質(zhì)中，可溶性1Α9免疫反應(yīng)性12-聚體(小圖Ε)與可 溶性2C3-免疫反應(yīng)性12-聚體(小圖F)的半定量分析(BraakNFT I期或II期m = 35 ； Braak NFT III 期或 IV 期n = 13 ；以及 Braak NFT > IV 期，AD 病例n = 2)。圖7-1的圖片顯示可溶性1A9或2C3寡聚體存在于人類CSF中。用匯集的全腦 脊液(CSF) (AD = 10,NC = 10)(小圖A與B)與匯集的無脂蛋白(lipoprotein-d印leted) CSF(AD = 10，NC = 10)(小圖C與D)進(jìn)行尺寸排阻色譜(SEC)。在小圖A與B中，通過對(duì) 收集的級(jí)分進(jìn)行BNT77-BA27與BNT77-BC05 ELISA分析，考察了 A β 40與A β 42單體的分 布。小圖C與D顯示被1A9/2C3混合抗體捕獲的Aβ 40與Aβ 42單體的存在。圖7-2為圖7-1的繼續(xù)。在12個(gè)AD病例(空心圓)與13個(gè)NC病例(實(shí)心圓) (小圖E與G)中測(cè)定了寡聚性1Α9聚合體的量(1A9-BC05與1A9BA27ELISA)或2C3聚合體 的量(2C3-BC05與2C3-BA27 ELISA)。寡聚體/單體比例分別示于小圖F(1A9)與H(2C3)。圖8的圖片顯示可通過被動(dòng)免疫接種治療來預(yù)防Tg2576小鼠記憶障礙的發(fā)病。 將13月齡的Tg2576小鼠分為下列三組以實(shí)施學(xué)習(xí)/行為測(cè)試PBS施用組n = 10 ； 1A9 施用組n= 13;以及2C3施用組n= 11。所有這些測(cè)得的值均示為平均值士SE。(A) Y-迷宮測(cè)試。在每個(gè)組中測(cè)定8分鐘期間的Y-迷宮任務(wù)中自發(fā)改變行為(spontaneous alteration behavior)。單向 ANOVA 的結(jié)果如下所述F (1，52) = 3. 09，ρ < 0. 05 廣與 施用PBS的Tg2576小鼠相比較ρ < 0. 05。(B)新物體識(shí)別測(cè)試。保持期(retentionsession)在訓(xùn)練24小時(shí)后進(jìn)行。在10分鐘期間的新物體識(shí)別測(cè)試中測(cè)定每組的探查偏好 (exploratorypreference)。雙向 ANOVA 的結(jié)果如下所述訓(xùn)練 / 保持，F(xiàn)(l，64) = 31. 53,ρ
<0. 01 ；動(dòng)物組，F(xiàn) (2，64) 7. 49，ρ < 0. 01 ；所述動(dòng)物組進(jìn)行的反復(fù)訓(xùn)練/記憶，F(xiàn) (2，64) =10. 12，ρ < 0. 01 ；**與對(duì)應(yīng)的非訓(xùn)練小鼠相比較ρ < 0.01ο ##與施用PBS的Tg2576小 鼠相比較ρ < 0. 01。(C)在水迷宮測(cè)試中60秒期間內(nèi)對(duì)每個(gè)組測(cè)量游泳路程長(zhǎng)度。雙向 ANOVA 的結(jié)果如下所述試驗(yàn)，F(xiàn) (9，320) = 20. 46，ρ < 0. 01 ；動(dòng)物組，F(xiàn) (2，320) = 12. 59， P < 0.01 ；所述動(dòng)物組進(jìn)行的反復(fù)試驗(yàn)，F(xiàn) (18，320) = 1.78，ρ <0.05 ；ρ < 0. 05廣與施用 PBS的Tg2576小鼠相比較ρ < 0. 01。有條件的恐懼學(xué)習(xí)測(cè)試(fear-conditioned learning test)確定了背景依賴性(context dependent) (D)與線索依賴性(clue dependent)僵 直時(shí)間(freezingtime)。雙向ANOVA結(jié)果如下所述背景依賴性測(cè)試，F(xiàn) (2，32) = 5. 94，ρ
<0. 01 ；線索依賴性測(cè)試，F(xiàn) (2，32) = 7. 33，ρ < 0. 01 ；*與施用PBS的Tg2576小鼠相比較 ρ < 0. 05 ；** 同樣比較 ρ < 0. 01。圖9的圖片與照片顯示被動(dòng)免疫療法可在Tg2576中預(yù)防腦內(nèi)Αβ積聚。對(duì)于三 組13月齡的Tg2576小鼠(PBS施用組n = 10 ； 1A9施用組n = 13 ；以及2C3施用組m =11)，將海馬與大腦皮層以三個(gè)連續(xù)步驟中提取出來，制備可溶于緩沖液的級(jí)分、可溶于 SDS的級(jí)分、和可用甲酸(FA)抽提的級(jí)分。對(duì)每個(gè)部分進(jìn)行A β特異性ELISA測(cè)定(WAK0 試劑盒對(duì) A β χ-40，ΒΝΤ77-ΒΑ27 ；對(duì) A β χ-42，BNT77-BC05)。發(fā)現(xiàn) A β 40 (SDS 與 FA)與 A β 42 (SDS)的積聚僅在經(jīng)1Α9處理的組中被顯著阻抑。All-陽(yáng)性寡聚體(4-聚體)的積 聚阻抑作用在來自兩個(gè)經(jīng)抗體處理的組中SDS可溶性大腦皮層級(jí)分中得到了確證。圖10的照片與圖片顯示在Tg2576的血漿與腦中的Αβ寡聚體。A與B 作為ELISA 分析的結(jié)果，在PBS施用組與免疫治療組間未觀察到血漿中Aβ χ-40與Αβ χ-42的量有顯 著變化。C:類似地，在經(jīng)測(cè)試的三個(gè)組中未觀察到A β 40/Α β 42比例的變化。D 作為使用 匯集的腦組織勻漿進(jìn)行點(diǎn)印跡分析的結(jié)果，在三個(gè)經(jīng)測(cè)試的組間未觀察到可溶于生理鹽水 的All陽(yáng)性寡聚體量有變化。海馬(左邊小圖)與大腦皮層(右邊小圖)。PBS施用組n =10;1A9施用組n = 13 ；以及2C3施用組n = 11。E 根據(jù)使用抗寡聚體抗體All的免 疫印跡分析，在經(jīng)SDS抽提的大腦皮層級(jí)分(右邊小圖)中Αβ四聚體的免疫反應(yīng)性在經(jīng) 施用1Α9與2C3的組中較之施用PBS的組降低。而另一方面，在海馬(左邊小圖)中未觀 察到此現(xiàn)象。F:自這些組中每一個(gè)收集血液(除去白蛋白的血漿，小圖F的上邊部分；除 去白蛋白/脂蛋白的血漿，小圖F的下邊部分)，并對(duì)其進(jìn)行All點(diǎn)印跡分析。其結(jié)果，發(fā) 現(xiàn)All免疫反應(yīng)性在經(jīng)施用1A9與2C3的組中較之PBS施用組增加(小圖F)。2C3寡聚體 的以脂蛋白結(jié)合形式存在的比例較之1A9寡聚體為高(小圖F的下邊部分)。進(jìn)一步，All 免疫印跡法亦顯示在大約200kDa處的陽(yáng)性信號(hào)，其免疫反應(yīng)性在1A9與2C3施用組中較之 PBS施用組明顯增加(小圖G)。由這些結(jié)果可以想到，在所述施用抗體的組中獲得了僅靶 向Αβ寡聚體分子的選擇性的治療功效，而沒有影響到生理分子。圖11的照片與圖片顯示在Tg2576小鼠腦中通過被動(dòng)免疫接種治療阻抑了老年斑 淀粉樣蛋白形成(Α :Αβ特異性抗體染色；以及B 硫代黃素-S陽(yáng)性分析)與腫大變性神經(jīng) 突形成(C:突觸泡蛋白陽(yáng)性分析)。圖12的照片顯示用1Α9與2C3的被動(dòng)免疫接種治療阻抑了突觸退行性變。突觸 泡蛋白(左邊小圖)與腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(drebrin)(右邊小圖)點(diǎn)狀外周細(xì)胞(dot-like
11peripheral cell)中的免疫染色。上圖施用PBS ；中圖施用1A9 ；以及下圖施用2C3。圖13的照片顯示所述抗體通過被動(dòng)免疫接種治療發(fā)生腦內(nèi)轉(zhuǎn)移。顯示了在 Tg2576小鼠腦中施用的抗體的分布。用抗Αβ抗體(左邊小圖)與IgG(中間小圖)染色。 施用1Α9 (A)，施用2C3 (B)，以及施用PBS (C)。圖14的照片通過點(diǎn)印跡分析顯示，單克隆抗體2C3，E12，IClO (同種型IgM)，以及 4D3特異于寡聚體(3-96h)，但無法識(shí)別單體(Oh)。圖15的照片通過點(diǎn)印跡分析顯示，E12抗體，其類別已通過基因工程從IgM變?yōu)?IgG2b，并不識(shí)別A β單體(Ohr)，但特異于A β寡聚體(3_96hr)。圖16的圖顯示已通過基因工程從IgM類別變?yōu)镮gG2b的E12抗體針對(duì)Aβ淀粉樣 蛋白原纖維形成的阻抑活性。以三種不同濃度將該抗體添加于Αβ 1-42溶液中(12.5μΜ)。 在37°C下培育24小時(shí)后，通過ThT熒光強(qiáng)度方法測(cè)量A β淀粉樣蛋白原纖維形成的水平。 水平軸指示添加的抗體的量，而垂直軸顯示由所述抗體添加而得的淀粉樣蛋白原纖維形成 水平相對(duì)于作為標(biāo)準(zhǔn)的未添加抗體時(shí)的淀粉樣蛋白原纖維形成水平的值。發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明將在下面更加詳細(xì)的加以說明。如上所述，本發(fā)明發(fā)明人成功的獲取下述抗體，其可特異性結(jié)合Αβ寡聚體而非 Αβ單體。亦即，本發(fā)明提供了可結(jié)合Αβ寡聚體而非Αβ單體的抗體。所述抗體優(yōu)選為分 離的或純化的。術(shù)語(yǔ)“分離的”與“純化的”的用于本發(fā)明的物質(zhì)(抗體與其它)時(shí)，指明該物質(zhì) 實(shí)質(zhì)上不包含至少一種可能存在于其天然來源中的物質(zhì)。因此“分離的抗體，，與“提純的 抗體”指下述抗體，即其實(shí)質(zhì)上不包含該抗體(蛋白質(zhì))所來源的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞材 料，例如烴類，脂肪或其它污染蛋白質(zhì)。當(dāng)所述抗體為化學(xué)合成時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指下述抗體，即其 實(shí)質(zhì)上不含有化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中本發(fā)明的抗體為分離的或 純化的?！翱贵w”指具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w對(duì)特定抗原顯示結(jié)合特異性。在本文 中“抗原”指下述蛋白，其具有可結(jié)合相應(yīng)抗體的能力，并可在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)。A β蛋白，其為淀粉樣蛋白的主要構(gòu)成成分，為由40到42個(gè)氨基酸組成的肽，且 已知其由稱為淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的前體蛋白通過蛋白酶的作用產(chǎn)生。除了被收集 于超速離心沉降級(jí)分中的淀粉樣蛋白原纖維外，自APP產(chǎn)生的淀粉樣蛋白分子還包括寡聚 的非纖維性的聚合體(assembly)，以及可溶性單體。本發(fā)明中的“Αβ寡聚體”指非纖維性 的聚合體。本發(fā)明的“Αβ寡聚體”包括，例如，Aβ 40 (Αβ 1-40)寡聚體與Aβ 42 (Αβ 1-42) 寡聚體。舉例而言，本發(fā)明的“Α β 42寡聚體”為在SDS-PAGE中顯示分子量45到160kDa， 并在Blue Native PAGE中顯示分子量22. 5到1035kDa的分子。使用分子篩時(shí)，所述分子 主要被收集于> IOOkDa的保留溶液。當(dāng)在原子力顯微鏡下觀察時(shí)，所述分子顯示混合的形 態(tài)，包括顆粒狀、珠形與環(huán)形的分子，其高度為1. 5到3. lnm。在凝膠過濾方法中，所述分子 可洗脫于分子量為680kDa或更高的空體積級(jí)分8中，和分子量為17到44kDa的級(jí)分15中。對(duì)在本發(fā)明中所用的抗體的來源與形式并無限制，只要其可結(jié)合Αβ寡聚體而非 Aβ單體。本發(fā)明的“抗體”包括單克隆抗體與多克隆抗體兩者。本發(fā)明的抗體亦包括任何類型的抗體，例如非人動(dòng)物抗體，人源化抗體，嵌合抗體，人類抗體，近來描述的迷你抗體 (minibody)，氨基酸序列被修飾的抗體，綴合有其它分子(例如，如聚乙二醇等多聚物)的 修飾抗體，以及糖鏈被修飾的抗體。在本文中所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指下述抗體，它們是從實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的抗體群體 中獲取的。亦即，構(gòu)成該群體的各個(gè)抗體彼此相同，除了可能以痕量存在的天然突變體之 外。單克隆抗體具有非常高的特異性，且識(shí)別單一的抗原位點(diǎn)。每個(gè)單克隆抗體識(shí)別所述 抗原的單一決定簇，這與常規(guī)的(多克隆)抗體制備物不同，后者通常含有針對(duì)不同抗原決 定簇(表位)的不同抗體。除上面提及的特異性外，單克隆抗體亦具有下述優(yōu)勢(shì)，即它們可由未經(jīng)其它免疫 球蛋白污染的雜交瘤培養(yǎng)物合成。因此“單克隆”指明可得自實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的抗體群體的抗 體的特征。該術(shù)語(yǔ)并不表示需要任何特定的抗體生產(chǎn)方法?；旧?，單克隆抗體可使用已知技術(shù)生產(chǎn)。舉例而言，其可通過最先由Kohler and Milstein (Nature 256 :495_7，1975)描述的雜交瘤技術(shù)，或由重組 DNA 方法(Cabilly et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =3273-7,1984)生成，但其方法并不僅限于此。舉例而 言，當(dāng)使用所述雜交瘤方法時(shí)，Aβ寡聚體(例如，描述于實(shí)施例中的Αβ四聚體)用作致 敏抗原，而免疫接種通過常規(guī)的免疫接種方法進(jìn)行。所得的免疫細(xì)胞與已知親本細(xì)胞通過 常規(guī)細(xì)胞融合方法融合，且可使用常規(guī)篩選方法篩選與分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞。本發(fā)明所述的單克隆抗體可如下所述產(chǎn)生。首先，將合成Αβ 1_42(Ρ印tide Institute, Inc.，Osaka)溶解于去離子蒸餾水或IOmM磷酸緩沖液溶液，并在37°C下培育 18小時(shí)。隨后，用4-12% SDS-PAGE分離該肽，并通過CBB染色顯影，而僅切出未經(jīng)Aβ 1-42 單體污染的A β 1-42四聚體部分。繼之，對(duì)BALB/c小鼠在其足墊上用2. 5 μ g的以弗氏完 全佐劑乳化的Αβ 1-42四聚體進(jìn)行免疫接種。隨后，進(jìn)行六次的加強(qiáng)免疫(booster)。利用 鼠蹊部淋巴結(jié)，通過使用聚乙二醇1500與Sp/0-Agl4細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤。在本發(fā)明中，用致敏抗原免疫接種的動(dòng)物并無特別限定，但優(yōu)選考慮到與供細(xì)胞 融合使用的親本細(xì)胞的相容性進(jìn)行選取。一般而言，使用嚙齒類，兔形類或靈長(zhǎng)類。嚙齒類 包括，例如，小鼠，大鼠與倉(cāng)鼠。兔形類包括，例如，家兔。靈長(zhǎng)類包括，例如，狹鼻(舊大陸) 猴，例如食蟹猴(Macacafascicularis)，獼猴(Macaca mulatta)，阿拉伯狒狒與黑猩猩。動(dòng)物使用致敏抗原根據(jù)抑制方法進(jìn)行免疫接種。舉例而言，作為標(biāo)準(zhǔn)方法，免疫接 種通過腹腔內(nèi)或皮下對(duì)哺乳類注射致敏抗原來進(jìn)行。親本細(xì)胞與前述免疫細(xì)胞融合的一個(gè)實(shí)例為Sp2/0_Agl4細(xì)胞，其描述于下面的 實(shí)施例。然而可使用多種其它已知細(xì)胞系。前述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞間的細(xì)胞融合可基本上根據(jù)已知的方法進(jìn)行，包括 Kohler 與 Milstein 的方法(Kohler G. and Milstein C.，MethodsEnzymol. (1981)73， 3-46)。以此方式獲取的雜交瘤通過對(duì)其在常規(guī)選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行選擇，所述 培養(yǎng)基可以舉出HAT培養(yǎng)基為例，其含有次黃嘌呤，氨基蝶呤與胸苷。在上述HAT培養(yǎng)基中 的培養(yǎng)通常持續(xù)數(shù)日至數(shù)周以提供充足時(shí)間殺滅除所期望的雜交瘤外的細(xì)胞(非融合細(xì) 胞)。繼之，可進(jìn)行常規(guī)的有限稀釋方法以篩選并單獨(dú)克隆可產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤。在此之后，將所得的雜交瘤移植到小鼠的腹腔，并提取含有所期望單克隆抗體的
13腹水。舉例而言，所述抗體可自所述腹水通過常規(guī)的蛋白質(zhì)分離和/或純化方法進(jìn)行純 化，所述方法例如柱層析(包括但不僅限于親和層析)、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯 酰胺凝膠電泳以及等電聚焦的選擇組合(Antibodies =A Laboratory manual, Harlow and David, Lane (edit. ), Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。蛋白A柱與蛋白G柱可用于親和柱。使用的蛋白A柱的實(shí)例包括HyperD，POROS 與 Sepharose F. F. (Pharmacia) 0層析(排除親和層析)包括離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反向?qū)游鲆约拔?Ρ Μ /Τ ( "Strategies for Protein Purification and Characterization ALaboratory Course Manual，，，Daniel R Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press, 1996)。當(dāng)進(jìn)行層析時(shí)，可使用液相層析方法例如HPLC與FPLC。以該方式制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可于常規(guī)的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，且其可 在液氮中長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)藏。任何哺乳類均可使用的免疫原進(jìn)行免疫接種以生產(chǎn)抗體。然而，當(dāng)通過產(chǎn)生雜交 瘤制備單克隆抗體時(shí)，優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合以供產(chǎn)生雜交瘤的親本細(xì)胞的相容性。一般而言，嚙齒類，兔形類或靈長(zhǎng)類用于免疫接種。嚙齒類包括，例如，小鼠，大鼠 與倉(cāng)鼠。兔形類包括，例如，家兔。靈長(zhǎng)類包括，例如，狹鼻(舊大陸)猴，例如食蟹猴，獼猴， 阿拉伯狒狒與黑猩猩。使用具有人類抗體基因庫(kù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在本領(lǐng)域是已知的(Ishida I, etal., Cloning and Stem Cells 4 =91-102, 2002) 和其它動(dòng)物一樣，為獲取人類單克隆抗體， 對(duì)所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，隨后自該動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞融合 以產(chǎn)生雜交瘤，且可自這些雜交瘤產(chǎn)生抗蛋白質(zhì)的人類抗體(參見國(guó)際公布W092/03918， W094/02602, W094/25585, W096/33735 和 W096/34096)?；蛘撸冒┗蛴郎牧馨图?xì)胞可用于產(chǎn)生單克隆抗體。舉例而言，對(duì)于用EB 病毒等感染的人類淋巴細(xì)胞在體外用免疫原進(jìn)行免疫接種。然后，將經(jīng)免疫接種的淋巴細(xì) 胞與源自人類，能夠無限分裂的骨髓瘤細(xì)胞(U266，等)融合，從而獲得產(chǎn)生所期望人類抗 體的雜交瘤(日本公開專利公報(bào)(JP-A)昭63-17688)。一旦單克隆抗體可通過任何前述方法獲取，所述抗體亦可使用遺傳工程方法 (參見，例如 Borrebaeck CAK and Larrick Jff, Therapeutic MonocIonalAntibodies, MacMillan Publishers, UK, 1990)制備。舉例而言，重組抗體可通過從抗原產(chǎn)生細(xì)胞(如 雜交瘤或經(jīng)免疫接種的淋巴細(xì)胞)克隆出編碼期望抗體的DNA，并將所克隆的DNA插入合適 的載體中，再將該載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞，來加以制備。上述重組抗體亦包含于本發(fā)明 中。本發(fā)明的單克隆抗體的實(shí)例包括1A9單克隆抗體，2C3單克隆抗體，E12單克隆抗 體，IClO單克隆抗體與4D3單克隆抗體。所述單克隆抗體優(yōu)選包括下述(i)到(iii)的抗 體(i) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的H鏈(重鏈)與具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L鏈(輕鏈)；(ii) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列的H鏈(重鏈)與具有 SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L鏈(輕鏈)；
(iii) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 41的氨基酸序列的H鏈(重鏈)與具有 SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L鏈(輕鏈)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括迷你抗體。迷你抗體包含抗體片段但缺乏 全抗體的一部分，且無特別限制，只要其具有結(jié)合抗原的能力。抗體片段的實(shí)例包括Fab， Fab，，F(xiàn)(ab，)2 與 Fv。迷你抗體的實(shí)例包括 Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)v，scFv(單鏈 Fv)，雙抗 體(diabody)，以及 sc (Fv) 2 (單鏈(Fv) 2)。為獲取針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的多克隆抗體，對(duì)經(jīng)抗原致敏的哺乳動(dòng)物，在確證所期 望的抗體血清水平上升后，從其取出血液。通過已知方法自血液分離出血清。當(dāng)使用多克 隆抗體時(shí)，可使用含該多克隆抗體的血清。或者，若需要，可自血清分離出含所述單克隆抗 體的級(jí)分然后再使用。舉例而言，免疫球蛋白G或M可如下制備使用與本發(fā)明的蛋白質(zhì)偶 聯(lián)的親和柱獲得特異性識(shí)別所述蛋白質(zhì)的級(jí)分，然后使用蛋白A或蛋白G柱提純?cè)摷?jí)分。在本發(fā)明中，可結(jié)合A β寡聚體的為結(jié)合1A9，2C3，E12，1C10或4D3的抗體。該抗 體優(yōu)選為下述(A)至(C)中任一項(xiàng)所述的抗體(A) 一種可結(jié)合下述Αβ寡聚體的抗體，所述Αβ寡聚體可結(jié)合包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的H鏈(重鏈)與具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L鏈(輕鏈)的 抗體；(B) 一種可結(jié)合下述Αβ寡聚體的抗體，所述Αβ寡聚體可結(jié)合包含具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列的H鏈與具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L鏈的抗體；(C) 一種可結(jié)合下述Αβ寡聚體的抗體，所述Αβ寡聚體可結(jié)合包含具有SEQ ID NO 41的氨基酸序列的H鏈與具有SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L鏈的抗體。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述抗體與之結(jié)合的Αβ寡聚體。所述抗體優(yōu)選包 括，例如，1Α9單克隆抗體，2C3單克隆抗體，Ε12單克隆抗體，IClO單克隆抗體以及4D3單克 隆抗體。上述Αβ寡聚體可用作供制備抗體或疫苗的抗原。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體包括，例如，下述(1)到(20)中任一項(xiàng)所述的 抗體(1) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列作為CDRl、SEQ ID NO 11 的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 13的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(2) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列作為CDRl、SEQ ID NO 17 的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 19的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(3) 一種抗體，其包含⑴的H鏈與⑵的L鏈；(4) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列作為VH的H鏈；(5) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列作為VL的L鏈；(6) 一種抗體，其包含⑷的H鏈與(5)的L鏈；(7) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 29的氨基酸序列作為CDRUSEQ ID NO 31 的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 33的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(8) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列作為CDRl、SEQ ID NO 37 的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 39的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(9) 一種抗體，其包含(7)的H鏈與(8)的L鏈；(10) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 25的氨基酸序列作為VH的H鏈；
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(11) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO ,21的氨基酸序列作為VL的L鏈；(12) 一種抗體，其包含(10)的H鏈與(11)的L鏈；(13) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列作為CDRl、SEQ ID NO 51的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 53的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(14) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列作為CDRl、SEQ ID NO 57的氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 59的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(15) 一種抗體，其包含(13)的H鏈與(14)的L鏈；(16) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 45的氨基酸序列作為VH的H鏈；(17) 一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列作為VL的L鏈；(18) 一種抗體，其包含(16)的H鏈與(17)的L鏈；(19) 一種抗體，其是(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體中替換，缺失，添加和/或插入一 個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的，且具有與所述(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體等價(jià)的活性；以及(20) 一種抗體，其可結(jié)合(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體所結(jié)合的表位。上述(1)中“具有SEQ ID NO 9 (E12抗體H鏈⑶Rl的序列)的氨基酸序列作為 CDRUSEQ ID NO :11(E12抗體H鏈CDR2的序列)的氨基酸序列作為CDR2、以及SEQ ID NO: 13 (E12抗體H鏈⑶R3的序列)的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈”中VH的一個(gè)實(shí)例，是具有 SEQ ID NO 5 (E12抗體VH的序列)的氨基酸序列的VH0上述⑵中“具有SEQ ID NO :15 (E 12抗體L鏈⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 為CDRl、SEQ ID NO 17 (E12抗體L鏈CDR2的序列)的氨基酸序列作為CDR2、以及SEQ ID NO 19 (E12抗體L鏈⑶R3的序列)的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈”中VL的一個(gè)實(shí)例，是 具有SEQ ID NO : 7 (El2抗體VL的序列)的氨基酸序列的VL0上述(7)中“具有SEQ ID NO 29 (1C10抗體H鏈⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 為CDR1、SEQ ID NO :31 (1C10抗體H鏈CDR2的序列)的氨基酸序列作為CDR2、以及SEQ ID NO 33 (1C10抗體H鏈⑶R3的序列)的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈”中VH的一個(gè)實(shí)例，是 具有SEQ ID NO 25 (1C10抗體VH的序列)的氨基酸序列的VH。上述⑶中“具有SEQ ID NO 35 (1C10抗體L鏈⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 為CDR1、SEQ ID NO :37 (1C10抗體L鏈CDR2的序列)的氨基酸序列作為CDR2、以及SEQ ID NO 39 (1C10抗體L鏈⑶R3的序列)的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈”中VL的一個(gè)實(shí)例，是 具有SEQ ID NO 27 (1C10抗體VL的序列)的氨基酸序列的VL。上述(13)中“具有SEQ ID NO 49 (4D3抗體H鏈⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 為CDRl、SEQ ID NO 51 (4D3抗體H鏈CDR2的序列)的氨基酸序列作為CDR2、以及SEQ ID NO 53 (4D3抗體H鏈⑶R3的序列)的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈”中VH的一個(gè)實(shí)例，是 具有SEQ ID NO 45 (4D3抗體VH的序列)的氨基酸序列的VH。上述⑵中“具有SEQ ID NO 55 (4D3抗體L鏈⑶Rl的序列)的氨基酸序列作為 CDR1、SEQ ID NO :57 (4D3抗體L鏈CDR2的序列)的氨基酸序列作為CDR2、以及SEQ ID NO: 59 (4D3抗體L鏈⑶R3的序列)的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈”中VL的一個(gè)實(shí)例，是具有 SEQ ID NO 47 (4D3抗體VL的序列)的氨基酸序列的VL。對(duì)本發(fā)明所述的E12抗體，其全長(zhǎng)H鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :1與SEQ ID NO :2 ；其全長(zhǎng)L鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 3與SEQ ID NO :4;其H鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :5與 SEQ ID NO 6 ；其L鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :7與SEQ ID NO 8 ；其H鏈CDRl的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :9與SEQ IDNO 10 ； 其H鏈⑶R2的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID N0:11與SEQ ID N0:12;其H鏈 ⑶R3的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQID NO 13與SEQ ID NO :14 ；其L鏈⑶Rl的 氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID N0:15與SEQ ID NO 16 ；其L鏈⑶R2的氨基酸 序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO 18 ；而其L鏈⑶R3的氨基酸序列 與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 19與SEQ ID NO :20。對(duì)本發(fā)明所述的IClO抗體，其全長(zhǎng)H鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 21與SEQ ID NO 22 ；其全長(zhǎng)L鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 23與SEQ ID N0:24;其H鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 25與SEQ ID N0:26;其L鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 27與SEQID NO 28 ；其H鏈⑶Rl的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 29與 SEQ ID NO :30 ；其H鏈⑶R2的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :31與SEQ ID NO 32 ；其H鏈⑶R3的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :33與SEQ ID NO 34 ； 其L鏈⑶Rl的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO :35與SEQ ID NO :36 ；其L鏈 ⑶R2的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID N0:37與SEQ ID NO :38 ；而其L鏈⑶R3 的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID N0:39與SEQ IDNO 40。對(duì)本發(fā)明所述的4D3抗體，其全長(zhǎng)H鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 41與SEQ ID NO 42 ；其全長(zhǎng)L鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 43與SEQ ID N0:44;其H鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 45與SEQ ID N0:46;其L鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO: 47與SEQ IDNO 48 ；其H鏈⑶Rl的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 49與 SEQ ID NO 50 ；其H鏈⑶R2的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQID NO 51與SEQ ID NO 52 ；其H鏈⑶R3的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 53與SEQ ID NO 54 ； 其L鏈⑶Rl的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID NO 55與SEQ ID NO 56 ；其L鏈 ⑶R2的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID N0:57與SEQ ID NO :58 ；而其L鏈⑶R3 的氨基酸序列與核苷酸序列分別示于SEQ ID N0:59與SEQ ID NO :60。上面提及的(1)到(20)的抗體并不僅僅包括單價(jià)抗體，亦包括具有兩個(gè)或更多結(jié) 合價(jià)的多價(jià)抗體。本發(fā)明的多價(jià)抗體包括其抗原結(jié)合位點(diǎn)全部相同的多價(jià)抗體，以及其抗 原結(jié)合位點(diǎn)部分或完全不同的多價(jià)抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上面提及的(19)的抗體是不具備經(jīng)修飾的CDR的抗體。 舉例而言，上面提及的(19)的抗體中所謂“在(1)的抗體中替換，缺失，添加，和/或插入 一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的，其具有與(1)的抗體等價(jià)的活性的抗體”，優(yōu)選為“具有與(1) 的抗體等價(jià)的活性的，在(1)的抗體中替換、缺失、添加和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得 到的，且包括具有SEQ IDNO 9的氨基酸序列作為⑶Rl、SEQ ID NO 11的氨基酸序列作為 ⑶R2，與SEQ ID NO 13的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈的抗體”。另一個(gè)上述(19)的抗體 的優(yōu)選抗體可以類似的方式表述。在本文中“等價(jià)的活性”指關(guān)注的抗體具有與本發(fā)明抗體相似的生物學(xué)或生物化
17學(xué)活性。本發(fā)明所述“活性”的實(shí)例包括與Αβ寡聚體但不與Αβ單體特異性結(jié)合的活性， 抗神經(jīng)毒性活性，阻抑A β淀粉樣蛋白原纖維形成的活性，抗突觸毒性的活性，與抗記憶功 能障礙的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的制備具有與某多肽等價(jià)的活性的多肽的方法包括在該多 肽中導(dǎo)入突變。舉例而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用定點(diǎn)誘變等方法(Hashimoto-Gotoh，!1. et al. (1995)Gene 152,271-275 ；Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)Methods Enzymo1. 100， 468-500 ；Kramer,W. et al. (1984)NucleicAcids Res. 12,9441-9456 ；Kramer W,and Fritz HJ (1987)Methods. Enzymo1. 154,350-367 ；Kunkel，TA (1985)Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 82， 488-492 ；Kunkel (1988)Methods Enzymol. 85，2763-2766)將合適的突變導(dǎo)入抗體，來制備 其活性等價(jià)于本發(fā)明的抗體的活性的抗體。氨基酸突變亦可天然發(fā)生。本發(fā)明所述的抗體 亦包括下述抗體其包含在本發(fā)明抗體的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或更多突變而得到的氨基 酸序列，且具有與本發(fā)明所述抗體活性等價(jià)的活性。在上述突變體中，突變氨基酸的數(shù)量通 ?？蔀?0個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選30個(gè)氨基酸或更少，且更優(yōu)選十個(gè)氨基酸或更少(例如， 五個(gè)氨基酸或更少)。氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)楸Ａ羲霭被醾?cè)鏈性質(zhì)的其它氨基酸。舉例而言，氨基 酸根據(jù)其側(cè)鏈性質(zhì)進(jìn)行如下分類疏水氨基酸(A，I，L，M, F，P，W，Y與V)，親水氨基酸(R， D，N，C，E，Q，G，H，K，S與T)，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G，A，V，L，I與P)，具有含羥基側(cè)鏈 的氨基酸(S，T與Y)，具有含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C與M)，具有含羧酸與含酰胺側(cè)鏈的氨 基酸(D，N，E與Q)，具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(R，K與H)，以及具有含芳環(huán)側(cè)鏈的氨基酸(H， F，Y與W)(氨基酸在括號(hào)中以單字母密碼表示)。已知具有在某一氨基酸序列中一個(gè)或更多氨基酸殘基經(jīng)修飾(缺失，添加，和/或 替換為其它氨基酸)而得到的氨基酸序列的多肽可保留其原來的生物學(xué)活性(功能)。除上面提及的修飾外，本發(fā)明的抗體可與其它物質(zhì)綴合，只要其活性得到保持即 可。所述物質(zhì)的實(shí)例包括肽，脂質(zhì)，糖與糖鏈，乙酰基團(tuán)，以及天然與合成多聚物?？蓪?shí)施這 些修飾以給予所述抗體額外的功能，或使其穩(wěn)定化。本發(fā)明的抗體的氨基酸序列添加數(shù)個(gè)氨基酸殘基而得的抗體包括含有該抗體的 融合蛋白。在該融合蛋白中，該抗體與其它肽或蛋白質(zhì)融合。產(chǎn)生融合蛋白的方法可通過 將編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸與編碼另一多肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸閱讀框一致地連接， 并將其插入表達(dá)載體，并將該融合構(gòu)建體在宿主中表達(dá)來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技 術(shù)可用于該目的。與本發(fā)明的抗體融合的肽或多肽包括，例如，已知的肽，例如FLAG(Hopp， Τ. P. et al.，BioTechnology (1988) 6，1204-1210)，由六個(gè)組氨酸(His)殘基組成的6x His, IOx His，流感血凝素(HA)，人c-myc片段，VSV-GP片段，pl8HIV片段，T7-標(biāo)簽，HSV-標(biāo)簽， E-標(biāo)簽，SV40T抗原片段，Ick標(biāo)簽，α-微管蛋白片段，B-標(biāo)簽以及蛋白C片段；谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；免疫球蛋白恒定區(qū)域；半乳糖苷酶；以及麥芽糖結(jié)合蛋白(ΜΒΡ)， 等等。編碼這些肽或多肽的可市購(gòu)的多核苷酸可與編碼本發(fā)明所述抗體的多核苷酸融合， 且可通過表達(dá)如是制備的融合多核苷酸來產(chǎn)生所述融合多肽。本發(fā)明所述的抗體可在氨基酸序列，分子量，糖鏈的存在與否，結(jié)構(gòu)等方面彼此不 同，取決于產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞或宿主，或者純化方法。然而，只要所得抗體具有等價(jià)于本發(fā) 明抗體活性的活性，其即包含于本發(fā)明中。
與上述(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體所結(jié)合的表位結(jié)合的抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的方法獲取。舉例而言，該抗體可通過下述方法獲取(i)用常規(guī)方法確定該(1)到 (18)中任一項(xiàng)所述的抗體結(jié)合的表位，并使用包含該表位中含有的氨基酸序列的多肽作為 免疫原產(chǎn)生該抗體；或(ii)通過常規(guī)方法確定所產(chǎn)生的抗體的表位，并選擇其表位與(1) 到(18)中任一項(xiàng)所述抗體的表位相同的抗體。上面提及的(1)到(20)的抗體亦包括任何類型的抗體，例如上面提及的迷你抗 體，具有修飾氨基酸序列的抗體，例如人源化抗體與嵌合抗體，非人動(dòng)物抗體，人抗體，與其 它分子(例如，如聚乙二醇的多聚物)綴合的修飾抗體，以及糖鏈修飾抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗體為修飾抗體，例如嵌合抗體與人源化 抗體。優(yōu)選抗體的實(shí)例包括(i)其可變區(qū)源自E12抗體、IClO抗體或4D3抗體，且其恒定區(qū) 源自人類免疫球蛋白的嵌合抗體；以及(ii)其CDR源自E12抗體、IClO抗體或4D3抗體， 且其FR源自人類免疫球蛋白，且其恒定區(qū)源自人類免疫球蛋白的人源化抗體。這些修飾抗 體可使用已知方法產(chǎn)生。由于在人類體內(nèi)嵌合抗體或人源化抗體的抗原性減少，這樣的抗體可用于為治療 等目的施用于人類。嵌合抗體通過組合源自不同動(dòng)物的序列來產(chǎn)生。嵌合抗體的實(shí)例包括這樣的 抗體，其包含小鼠抗體的重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)，以及人類抗體的重鏈恒定區(qū)和輕 鏈恒定區(qū)。嵌合抗體的產(chǎn)生可使用已知方法進(jìn)行(參見，例如，Jones et al. , Nature 321 522-5,1986 ；Riechmann et al. , Nature 332:323-7,1988;以 ^SPrestaiCurr. Opin. Struct. Biol. 2 :593-6，1992)。舉例而言，首先，自抗體產(chǎn)生細(xì)胞的RNA通過聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法(參見，例如，Larrick et al.，“Methods :a Companion to Methods in EnzymologyVol. 2 106,1991 ；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，，inMonoclonal Antibodies :Production, Engineering and Clinical Application ；Ritter et al. (eds. ),page 166,Cambridge University Press, 1995,以及 Ward etal. , "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，，in MonoclonalAntibodies :Principles and Applications ；and Birch et al. (eds·), page 137,ffiley-Liss, Inc. ,1995)制備編碼目標(biāo)抗體可變區(qū)或⑶R的基因。將所制備的編碼可 變區(qū)的基因連接于編碼恒定區(qū)或框架區(qū)的基因。所述編碼恒定區(qū)或框架區(qū)的基因可用類似 于針對(duì)CDR編碼基因的方式確定，或者，其可基于已知抗體的序列信息制備。編碼嵌合產(chǎn) 物與CDR移植產(chǎn)物的DNA序列可完全或部分使用寡聚核苷酸合成技術(shù)加以合成。舉例而 言，可實(shí)施由Jones等(Nature 321 =522-5,1986)描述的寡聚核苷酸合成。進(jìn)一步，在一些 情況下，可適當(dāng)?shù)厥褂枚c(diǎn)誘變與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。由Verhoeyen et al. (Science 239 1534-6,1988)與 Riechmann et al. (Nature 332:323-7,1988)描述的對(duì)已知可變區(qū)進(jìn)行 寡核苷酸特異性誘變的技術(shù)可用于修飾所述可變區(qū)序列，例如，以增強(qiáng)嵌合抗體的結(jié)合能 力。進(jìn)一步，若需要，可使用T4 DNA聚合酶對(duì)有缺口的寡聚核苷酸進(jìn)行酶促填充，例如，描 述于 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029-33，1989 與 WO 90/07861)。舉例而言，CDR-移植技術(shù)在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?“Immunoglobulin genes”，Academic Press (London), pp 260-74,1989 ；and Michael A et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 969-73,1994)。使用該技術(shù)，將給定抗體的⑶R替換為另一個(gè)抗體的⑶R。通過這樣的替
19換，前者抗體的結(jié)合特異性改變?yōu)楹笳呖贵w的結(jié)合特異性。在這樣的嵌合抗體中，其中框架 氨基酸源自人類抗體的稱為“人源化抗體(CDR-移植抗體)”。當(dāng)使用抗體治療人類時(shí)，優(yōu) 選使用人類抗體或人源化抗體。一般而言，嵌合抗體包括非人哺乳類來源的抗體的可變區(qū)與源自人類抗體的恒定 區(qū)。另一方面，人源化抗體包括非人哺乳類來源的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及源自人類 抗體的框架區(qū)與恒定區(qū)。在產(chǎn)生所述嵌合抗體或人源化抗體后，可變區(qū)(例如，F(xiàn)R)或恒定區(qū)中的氨基酸可 替換為其它氨基酸。所述嵌合抗體的可變區(qū)或所述人源化抗體的CDR的來源并不特別限定。源自人類抗體的C-區(qū)域用于所述嵌合抗體與人源化抗體的C-區(qū)域。舉例而言， Cyl,Cy2,Cy3,Cy4,Cy,C5,Cal,Ca2%Ce 可用于 H-鏈的 C-區(qū)域，而 C κ 與(入 可用與L-鏈的C-區(qū)域。它們的序列是已知的。進(jìn)一步，所述人類抗體C區(qū)域可經(jīng)修飾以 改善該抗體的穩(wěn)定性或其產(chǎn)生。本發(fā)明所述抗體針對(duì)抗原(Αβ寡聚體)的結(jié)合活性可使用例如，吸光度測(cè)定方 法、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法、酶免疫分析(EIA)方法、放射性免疫分析(RIA)方法 和/或熒光免疫分析方法等方法來測(cè)定。在ELISA中，將抗體固化在平板上，且該抗體的抗 原添加至板上，并進(jìn)行預(yù)培育。在洗滌后，將酶底物例如對(duì)硝基苯基磷酸添加至板上，并測(cè) 定其吸光度以測(cè)量所述目標(biāo)試樣的抗原結(jié)合能力。所述測(cè)量可使用BIAcore (Pharmacia) 來進(jìn)行。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了包括上面提及的本發(fā)明的抗體與藥用載體的組合物。如下所述，本發(fā)明強(qiáng)烈暗示單克隆1A9與2C3抗體為預(yù)防類阿爾茨海默氏病表型 的治療抗體的有望候選。人們已顯示記憶衰退與由可溶性Aβ寡聚體引起的突觸功能障礙 相關(guān)(Klein WL, 2001, Trends Neurosci ；and SelkoeDJ，2002，Science)。A β 寡聚體的過 量積聚與沉著可觸發(fā)導(dǎo)致阿爾茨海默氏病的復(fù)雜下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)。若事實(shí)確為如此，則使用 包含本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物的治療介入可有效阻斷所述病理學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并由此 可使阿爾茨海默氏病的治療成為可能。本發(fā)明所述的“治療”并不一定針對(duì)展示病癥或疾病的癥候具有完全的治療或預(yù) 防效果，但可具有部分的效果。本發(fā)明中的“治療阿爾茨海默氏病”指緩解至少一種可由阿爾茨海默氏病導(dǎo)致的 癥狀，其實(shí)例包括緩解或阻抑認(rèn)知機(jī)能障礙，緩解或阻抑老年斑形成，緩解或阻抑突觸功能 障礙，以及減少或阻抑Αβ在腦組織，血液等處的積聚。在本文中，“認(rèn)知機(jī)能障礙”包括，例 如，記憶障礙，包括長(zhǎng)期/短期記憶障礙，物體認(rèn)知記憶障礙，空間記憶障礙與聯(lián)想及情緒 記憶障礙。本發(fā)明提供了包含含有本發(fā)明的抗體與藥用載體的組合物作為活性成分的藥物 組合物或藥劑。在本發(fā)明中，短語(yǔ)“包含含有本發(fā)明的抗體與藥用載體的組合物作為活性成分” 意指包含含有本發(fā)明的抗體與藥用載體的組合物作為主要活性成分，但并不限定其實(shí)際含量。上面體積的藥物組合物的實(shí)例包括抗認(rèn)知機(jī)能障礙劑，阿爾茨海默氏病治療劑，
20阿爾茨海默氏病進(jìn)展阻抑劑，老年斑形成阻抑劑，Αβ積聚阻抑劑，抗神經(jīng)毒性劑(神經(jīng)毒 性中和劑)，Αβ淀粉樣蛋白纖維抑制劑，以及抗突觸毒性劑(突觸毒性中和劑)。上面提及的本發(fā)明的藥物組合物還可表現(xiàn)為，例如，“阻抑阿爾茨海默氏病的方 法”，所述方法包括對(duì)受試者(個(gè)體)施用包含本發(fā)明的抗體與藥用載體的組合物。在其它 實(shí)施方案中，實(shí)例包括阻抑認(rèn)知機(jī)能障礙的方法，阻抑阿爾茨海默氏病進(jìn)展的方法。阻抑老 年斑形成的方法，阻抑A β積聚的方法，中和(阻抑)神經(jīng)毒性活性的方法，抑制A β淀粉 樣蛋白原纖維形成的方法，以及中和(阻抑)突觸毒性的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，實(shí) 例包括預(yù)防和/或治療認(rèn)知障礙的方法，以及預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病的方法。本發(fā)明亦提供了包含本發(fā)明的上述抗體與藥用載體的組合物在生產(chǎn)上面提及的 藥物組合物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及下述組合物。_ 一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于預(yù)防和/或治療認(rèn)知障礙。_ 一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于預(yù)防和/或治療阿爾茨 海默氏病。-一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于阻抑阿爾茨海默氏病的進(jìn)展。-一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于阻抑老年斑形成。-一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于阻抑Aβ積聚。-一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于中和(阻抑)神經(jīng)毒性活 性。-一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于阻抑Αβ淀粉樣蛋白原 纖維形成。-一種包含上述的本發(fā)明抗體與藥用載體的組合物，用于中和(阻抑)突觸毒性活 性。上面提及的本發(fā)明的藥劑可施用于人類或其它動(dòng)物。在本發(fā)明中，被施以所述藥 劑的非人動(dòng)物包括小鼠，大鼠，豚鼠，家兔，雞，貓，狗，綿羊，豬，牛，猴，狒狒與黑猩猩。這些 動(dòng)物優(yōu)選展示至少一種選自下組的癥狀例如，認(rèn)知機(jī)能障礙，老年斑形成、突觸功能障礙， 腦組織或血液中的Αβ積聚，等等。包含于本發(fā)明的藥物組合物中的抗體并不特別限定，只要它們包括于上面提及的 本發(fā)明的抗體中，其實(shí)例包括本文所描述的抗體。當(dāng)使用上面提及的本發(fā)明的抗體用于藥物組合物時(shí)，它們可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的方法配制。舉例而言，視需要，它們可用水或其它藥用液體以可注射的無菌溶液或懸 浮液的形式配制，且可用于非腸道施用。舉例而言，包含于所述藥物組合物中的抗體可與 可接受的載體或介質(zhì)，尤其是無菌水，生理鹽水，植物油，乳化劑，懸浮液，表面活性劑，穩(wěn)定 劑，調(diào)味劑，賦形劑，溶劑，防腐劑，粘合劑等，并混合為通常需用于接受的藥物實(shí)踐的單位 劑量。短語(yǔ)“藥用”指該物質(zhì)是惰性的，并含有通常用作稀釋劑或溶媒的物質(zhì)。合適的賦形 劑與其配制物描述于，例如，Remington，sPharmaceutical Sciences, 16th ed. (1980)Mack Publishing Co. , ed. Oslo et al. 0
生理鹽水與其它含有葡萄糖或佐劑(舉例而言，D-山梨醇，D-甘露糖，D-甘露醇 與氯化鈉)的等滲溶液可用作供注射的水溶液。它們可與合適的增溶劑，例如醇類，更具體 而言，乙醇與多元醇(丙二醇，聚乙二醇等)，以及非離子表面活性劑(Polysorbate 80 , HCO-5O等)一起使用。芝麻油或大豆油可用作油性液，而苯甲酸芐酯或苯甲醇可組合用作增溶劑。緩沖 液(例如，磷酸緩沖液與乙酸鈉緩沖液)，鎮(zhèn)痛劑(例如，鹽酸普魯卡因)，穩(wěn)定劑(例如，苯 甲醇與苯酚)，以及抗氧化劑可用于配制劑。制備好的注射液可注入合適的安瓿瓶。給藥優(yōu)選為非腸道給藥，具體的例子包括通過注射給藥，經(jīng)鼻給藥，經(jīng)肺給藥，以 及經(jīng)皮給藥。通過注射給藥的實(shí)例包括系統(tǒng)性或局部性的通過靜脈內(nèi)注射，肌肉內(nèi)注射，腹 膜內(nèi)注射，皮下注射等給藥。所述藥物組合物包括藥學(xué)有效量的活性組分(上面提及的本發(fā)明抗體)?！八帉W(xué)有 效量(的化合物)”指所述的量足以治療和/或預(yù)防上述的本發(fā)明抗體在其中發(fā)揮重要作用 的病癥。舉例而言，“藥用量”可以是當(dāng)所述化合物施用于個(gè)體(患者)時(shí)，減少Αβ積聚、 中和Αβ誘導(dǎo)毒性、減少Αβ淀粉樣蛋白形成等，由此治療或預(yù)防由阿爾茨海默氏病造成 的病狀所需的量。所述減少或中和可為，例如，減少或中和至少大約5%，10%，20%，30%， 40%，50%，75%，80%，90%，95%，99% 或 100%。確定上面提及的本發(fā)明的抗體的上述藥學(xué)有效量的評(píng)估可使用標(biāo)準(zhǔn)的臨床方法 進(jìn)行，包括組織病理學(xué)診斷。合適的給藥方法可取決于患者的年齡與癥狀選取。含有抗體的藥物組合物的劑量 可在，例如，對(duì)于每次給藥在每千克體重0. OOOlmg到IOOOmg的范圍內(nèi)選擇?；蛘撸?，對(duì) 于每個(gè)患者所述劑量可在0. 001到IOOOOOmg/體重的范圍內(nèi)選擇；然而所述劑量并不一定 限定于這些范圍內(nèi)。盡管劑量與給藥方法根據(jù)患者的體重，年齡，癥狀等變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可合適的對(duì)它們進(jìn)行選擇。在后面描述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，所述劑量是基于免疫球蛋白大 劑量靜注療法(400mg/kg)(該療法為人類健康保險(xiǎn)所涵蓋)選取的。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了在試樣中檢測(cè)Αβ寡聚體(實(shí)例包括Aβ 40 (Αβ 1-40)與 A β 42 (Α β 1-42))的方法。本發(fā)明中“試樣”的實(shí)例包括自受試者收集的試樣。具體而言， 本方法包括使用本發(fā)明的抗體檢測(cè)收集自受試者的試樣中所含的Αβ寡聚體的步驟。試 樣中的Αβ寡聚體的檢測(cè)可利用，例如，使用化學(xué)發(fā)光的夾心固相酶免疫測(cè)定法(sandwich solid-phase enzymeimmunoassay method)(化學(xué)發(fā)光ELISA)，使用所得抗體的免疫沉淀方 法、免疫印跡、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、質(zhì)譜與免疫組織化學(xué)分析。當(dāng)通過上面提及的測(cè)量方法在收集自受試者的試樣中檢測(cè)出Αβ寡聚體時(shí)，所述 受試者是可能的阿爾茨海默氏病患者。舉例而言，當(dāng)將收集自受試者的試樣中Αβ寡聚體 的量與來自健康個(gè)體進(jìn)行比較，且Αβ寡聚體的量在受試者中高于在健康個(gè)體中時(shí)，該受 試者確定為可能的阿爾茨海默氏病患者。受試者是否為可能的阿爾茨海默氏病患者通常由 醫(yī)師(包括受醫(yī)師指導(dǎo)的個(gè)人，本文下同)診斷。通過本診斷方法獲得的收集自受試者以 及健康個(gè)體的試樣中的Αβ寡聚體的量的數(shù)據(jù)對(duì)醫(yī)師進(jìn)行診斷將是有用的。因此，本診斷 方法也可表現(xiàn)為，收集并呈現(xiàn)對(duì)醫(yī)師診斷有用的數(shù)據(jù)的方法。具體而言，本發(fā)明提供了診斷是否受試者為可能的阿爾茨海默氏病患者的方法， 其中所述方法包括使用本發(fā)明的抗體檢測(cè)自受試者收集的試樣中的Αβ寡聚體。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供診斷受試者是否為可能的阿爾茨海默氏病患者的方法，其包 括下述步驟(a)使自受試者收集的試樣與本發(fā)明的抗體以及與Αβ單體結(jié)合的抗體相接觸； 以及(b)測(cè)量所述試樣中A β寡聚體對(duì)A β單體的比例，其中若步驟(b)中測(cè)得的比例高于健康個(gè)體，則將所述受試者確定為可能的阿爾 茨海默氏病患者。首先，在本方法中，使收集自受試者的試樣與本發(fā)明的抗體和可結(jié)合A β單體的 抗體相接觸。在本文中，“接觸”可通過，例如，將上面提及的每個(gè)抗體添加入收集自受試者 的試樣(其置于試管中)來實(shí)施。在此情況下，所述抗體以溶液，冷凍干燥所得的固體等形 式適宜添加。當(dāng)將所述抗體作為水溶液添加時(shí)，所述溶液可純粹包含所述抗體本身，或可包 含，例如，表面活性劑，賦形劑，著色劑，調(diào)味劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，緩沖劑，助懸劑，張度劑，粘 合劑，崩解劑，潤(rùn)滑劑，流動(dòng)性促進(jìn)劑或矯味劑。所述抗體添加的濃度并非特別限定。舉例 而言，如使用人類免疫球蛋白配制物，可適宜使用500-mg，1000-mg與2500_mg等冷凍干燥 的配制物。然后，測(cè)量前述試樣中Αβ寡聚體對(duì)Αβ單體的比例(在本文中，亦稱為“0/Μ指 數(shù)”)。為測(cè)量該比例，適宜地使用下述方法。舉例而言，在如下文的實(shí)施例中所述，可使用 比較自相同試樣獲取的所述寡聚體與單體的ELISA值的方法來實(shí)施測(cè)量。然后，將該比例與健康個(gè)體的比例進(jìn)行比較。當(dāng)該比例在受試者中較之健康個(gè)體 中為高時(shí)，確定該受試者為可能的阿爾茨海默氏病患者。 本發(fā)明的診斷方法既可在體外又可在體內(nèi)進(jìn)行，但其優(yōu)選在體外進(jìn)行。優(yōu)選地，本發(fā)明的“試樣”并不特別限定，只要其為源自受試者的組織即可。實(shí)例 包括受試者的腦(腦實(shí)質(zhì)等)，器官與體液(血液，腦脊液等)。在本發(fā)明中，所述試樣優(yōu)選 為血液(更優(yōu)選血漿)或腦脊液。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用于上面提及的在試樣中測(cè)量Αβ寡聚體的方法或診斷受 試者是否為可能的阿爾茨海默氏病患者的方法的藥劑。在本發(fā)明中，包含抗體的藥物組合物可包含于產(chǎn)品與試劑盒中，所述產(chǎn)品與試劑 盒包含對(duì)治療受試者的病理狀態(tài)有用的材料。所述產(chǎn)物可包括任何化合物的帶標(biāo)簽容器。 合適的容器包括瓶，小瓶與試管。所述容器可用多種材料制成，例如玻璃與塑料。容器表面 的標(biāo)簽應(yīng)指明所述組合物用于治療或預(yù)防所述疾病的一種或更多種癥候。所述標(biāo)簽亦可載 明給藥的描述等。除上面提及的容器外，含包括抗體的藥物組合物的試劑盒可任選地包括第二容 器，其儲(chǔ)藏藥用稀釋劑。所述試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)或用戶角度看期望的材料，包 括其它緩沖劑，稀釋劑，填充劑，注射針頭，注射器，以及載有用途描述的包裝插頁(yè)。若需要，所述藥物組合物可于包裝或分配裝置中提供，所述包裝或分配裝置包含 一個(gè)或更多含有活性成分的單位劑量形式。所述包裝可包括金屬或塑料箔，或者例如為發(fā) 泡包裝。所述包裝或分配裝置可伴有給藥說明書。在上面提及的藥劑與試劑盒中，除作為活性成分的本發(fā)明的抗體外，還可根據(jù)需 要混合，例如，滅菌水，生理鹽水，植物油，表面活性劑，脂肪，助溶劑，緩沖劑，蛋白穩(wěn)定劑
23(BSA,明膠等)，防腐劑，封閉溶液，反應(yīng)溶液，反應(yīng)淬滅溶液，處理試樣的試劑等。所有本文引用的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)通過引用的方式并于本說明書中。實(shí)施例下文中，通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但并不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明受實(shí)施例的限定。Tffe制備單克降1A9, 2C3, E12, IClO 與 4D3合成A β 1-42 (Peptide Institute, Inc.，Osaka)溶解于蒸溜水或 IOmM 磷酸緩沖 液，并在37°C下培育18小時(shí)。然后，用SDS-PAGE(4-12% NuPAGE Tris-甘油膠)分離肽， 并在用CBB染色顯現(xiàn)后，僅切出A β 1-42四聚體而無A β 1-42的污染。然后，對(duì)BALB/c小鼠用2. 5 μ g的經(jīng)弗氏完全佐劑乳化的A β 1-42四聚體在其足 墊進(jìn)行免疫接種。隨后，進(jìn)行六次的加強(qiáng)免疫接種。使用小鼠蹊部淋巴結(jié)，通過與Sp/0-Agl4 細(xì)胞使用聚乙二醇1500融合產(chǎn)生雜交瘤。確定抗體同種型純化的免疫球蛋白的同種型的確定使用Serotec (Oxford，UK)小鼠單克隆抗體同 種型確定試劑盒。1A9與2C3的同種型為IgG2b。點(diǎn)印跡分析(初步篩詵)初始篩選通過點(diǎn)印跡分析使用硝酸纖維素膜進(jìn)行，所述膜上固化了預(yù)培育18小 時(shí)的2. 5μ 1的Αβ 1-42(2. 5 μ g/點(diǎn))。膜上非特異性結(jié)合位點(diǎn)用含5%低脂奶粉、BSA 與0. 05% Tween-20的磷酸緩沖液封閉，然后將該膜與培養(yǎng)上清一起培育。培養(yǎng)上清中的 Aβ寡聚體結(jié)合抗體通過辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠F(ab’)2(l 3000 ;AmerSham)檢 測(cè)，并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒與LAS3000 mini (Fujitsu, Tokyo, Japan)顯影。在 400個(gè)克隆中，對(duì)其中16個(gè)在所述點(diǎn)印跡中為陽(yáng)性的，包括1A9與2C3，進(jìn)行下述的二次篩 選。免疫沉淀與免疫印跡分析(二次篩選)二次篩選使用富含A β寡聚體的淀粉樣蛋白級(jí)分(Matsubara E，et al.， Neurobiol Aging, 2004)進(jìn)行免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Ghiso J，et al.，Biochem J，1993)，以評(píng)估 在初步篩選中選出的16個(gè)克隆可否在AD腦中捕獲Αβ寡聚體。將一個(gè)自AD腦制備的、 不溶于緩沖液但可溶于甲酸的級(jí)分與組織上清和蛋白G-Siipharose —起培育。將被免疫 沉淀的Aβ寡聚體使用NuPAGE4-12% Bis-Tris-甘氨酸凝膠分離，并使用含10%甲醇的 IOmM 3-環(huán)己基氨基-1-丙烷磺酸(pHll)在400mA下經(jīng)一小時(shí)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或 Immobilon P(Milliipore)上。膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)用含5 %低脂奶粉，1 % BSA與 0. 05% Tween-20的磷酸緩沖液在室溫下封閉3小時(shí)。通過免疫印跡法用4G8 (1 1000) 或6E10(1 1000)單克隆抗體如上所述檢測(cè)經(jīng)免疫沉淀的Aβ寡聚體。自所述16個(gè)克隆 中選出兩個(gè)克隆，1Α9與2C3，作為阿爾茨海默氏病治療抗體的候選?？贵w6Ε10 與 4G8 單克隆抗體(Covance Immuno-Technologies, Dedham, MA)分別識(shí)別 人類Αβ序列的氨基酸位置1-16與17-24的表位。特異性識(shí)別Αβ寡聚體的多克隆抗體 All 購(gòu)自 Biosource (Camarillo，CA)。Alex Fluor (AF) 488-或 594-綴合的山羊抗小鼠 IgG 與 Alex Fluor (AF) 488-綴合的山羊抗大鼠 IgG 購(gòu)自 Molecular Probes (Eugene, OR)?？剐∈?IgG2b 購(gòu)自 Sigma (St. Louis, M0)。抗突觸泡蛋白抗體購(gòu)自 Santa Cruz (Santa Cruz, CA)，而抗腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白抗體購(gòu)自MBL(Nag0ya，Japan)。尺寸排阻層析法(SEC)進(jìn)行了 SEC以評(píng)估1A9與2C3的尺寸特異性。根據(jù)之前報(bào)道的方法(Matsubara E.，et al. , Neurobiol Aging，25 :833_841，2004)，可選擇性地分離 Aβ 單體與 Αβ 寡聚 體，或脂蛋白結(jié)合的Αβ與無脂蛋白的Αβ。本發(fā)明人使用Microcon 3kDa分子量截留濾器 (Millipore Corp.)將來自過表達(dá)APP/PS1的HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)上清液濃縮約十倍。然 后，將濃縮液使用經(jīng)磷酸緩沖液預(yù)平衡的Superose 12尺寸排阻柱(lcmx30cm ；Pharmacia Biotech.，Uppsala, Sweden ；流速為0. 5ml/min)分為28個(gè)1毫升的級(jí)分。對(duì)每個(gè)級(jí)分的 一半使用1A9或2C3進(jìn)行免疫沉淀。使用4G8通過免疫印跡法檢測(cè)所得免疫沉淀物中所含 的Αβ。對(duì)匯集自阿爾茨海默氏病患者或與其年齡匹配的健康個(gè)體各十例的腦脊液(CSF) 以及除去脂蛋白的CSF在相同條件下進(jìn)行了分離。Αβ的收集級(jí)分的鑒定通過各個(gè)級(jí)分的 ELISA來進(jìn)行。為評(píng)估脂質(zhì)，使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Wako，Osaka，Japan)對(duì)總膽固醇進(jìn)行酶學(xué)定 量。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)條件下，CSF的脂蛋白在級(jí)分7-14中洗脫，而級(jí)分15-28包含無膽 固醇的蛋白質(zhì)。不含種子的A β溶液的制備將合成Αβ 1-42以250μΜ溶解于0.02%氨水中。然后，為制備不含種子的A β溶 液，使用Optima TL超離心機(jī)(Beckman，USA)以540000x g超離心3小時(shí)以沉淀未溶解的肽 (它們可能充當(dāng)種子)。收集所得的上清，并將其等分并儲(chǔ)藏于-80°C直至使用。試樣的制 備是在即將使用前將所述A β儲(chǔ)藏溶液解凍，并用Tris緩沖鹽水(TBS ； 150mM NaCl與IOmM Tris-HCl (pH7. 4))將其稀釋10倍。所得的25 μ M溶液用于下述的實(shí)驗(yàn)。合成A β 1-42 (HCL 形式；Peptide Institute, Inc. ，Osaka)帝[J備為 50 μ Μ。A β 培育與 ThT 分析(Yamamoto N, et al.，J Biol Chem, 282 2646~2655, 2007)A β溶液(25 μ Μ)在預(yù)定濃度的抗體存在下在37°C下培育2或24小時(shí)。所述培 育混合物的ThT熒光強(qiáng)度使用熒光分光光度計(jì)(RF-5300PC ；Shimadzu Co.，Kyoto, Japan) 確定。使用Iml含5 μ M ThT與50mM甘氨酸-NaOH(pH8. 5)的反應(yīng)混合物，在激發(fā)與發(fā)射波 長(zhǎng)為446與490nm的條件下，為Αβ淀粉樣蛋白原纖維確定最佳熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度在混 合物制備后立即測(cè)定。進(jìn)一步，Ε12抗體用于阻抑Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成的活性通過下述步驟評(píng)價(jià)。 將用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到12. 5 μ M的A β 1-42溶液在所述Ε12抗體存在或不存在的條件下在 37°C下培育24小時(shí)。形成的淀粉樣蛋白纖維的量通過上述ThT熒光強(qiáng)度測(cè)定法確定。A β 誘導(dǎo)性神經(jīng)毒性測(cè)定(Yamamoto N, et al.，J Biol Chem, 282 2646~2655, 2007)將大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞在含10%熱失活的馬血清(Invitrogen)與5%胎 ^iiyf (FBS) (Invitrogen)白勺 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中培育。為誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)細(xì)胞，將PC12細(xì)胞以20000個(gè)細(xì)胞/cm2的密 度鋪于經(jīng)聚-L-賴氨酸(10mg/ml)包被的培養(yǎng)皿中，并在添加有l(wèi)OOng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF ；Alornone Labs, Jerusalem, Israel)的 DMEM 中培育六天(PC12N)。將 PC12N 在 1A9
25或2C3抗體存在或不存在的條件情況下在4°C下暴露于25 μ M不含種子的A β 1-42或經(jīng)預(yù) 培育的Aβ 1-42中48小時(shí)。由Αβ 1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性通過Live/Dead雙色熒光測(cè)定法 根據(jù)供應(yīng)商的說明(Molecular Probes, Eugene, Oregon)來進(jìn)行評(píng)估。進(jìn)一步，E12抗體的中和Αβ誘導(dǎo)性神經(jīng)毒性的活性通過下述方法評(píng)價(jià)。首先，將 人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)在含10% FBS的DMEM中，以150000細(xì)胞/孔的密度培 育24小時(shí)。然后，將該培養(yǎng)基替換為不含血清、含A β 1-42(12. 5 μ Μ)、且添加或未添加Ε12 抗體的培養(yǎng)基，并將所述細(xì)胞另行培養(yǎng)24小時(shí)。為確定由Αβ 1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，利用 CytoToX96試劑盒(Promega)測(cè)定源自死細(xì)胞的、釋放到所述培養(yǎng)基的LDH的水平。超濾與分子篩為確定神經(jīng)毒性A β寡聚體在25 μ M的尺寸依賴性特征，使用Micr0n3kDa，IOkDa, 30kDa與IOOkDa截留膜進(jìn)行連續(xù)超濾，制備四種濾出液(< 3kDa，3到IOkDa, 10到30kDa, 30到IOOkDa)以及1種保留溶液(> IOOkDa)。對(duì)每個(gè)級(jí)分進(jìn)行上述的A β誘導(dǎo)性神經(jīng)毒 性測(cè)定。使PC12N暴露于每個(gè)級(jí)分，如上所述評(píng)價(jià)毒性級(jí)分。還通過上述點(diǎn)印跡分析鑒定 了由All，1A9，2C3或4G8所識(shí)別的三維結(jié)構(gòu)的分布。對(duì)各個(gè)級(jí)分進(jìn)行原子力顯微鏡檢查來 鑒定神經(jīng)毒性寡聚體的形態(tài)學(xué)特征。電子顯微鏡檢杳(EM)與原子力顯微鏡檢杳(AFM)用蒸餾水稀釋試樣，并將其噴灑在經(jīng)碳包被的網(wǎng)格上以進(jìn)行電子顯微鏡分析。 所述網(wǎng)格用磷酸鎢酸負(fù)染色，并在Hitachi H-7000電子顯微鏡(Tokyo，Japan)下 用77kV的加速電壓進(jìn)行觀察。AFM評(píng)價(jià)如近來所報(bào)道一般進(jìn)行。將試樣滴于新剝開的 云母上。讓所述云母靜置30分鐘，并然后用水洗滌，并使用Nanoscope IIIa(Digital Instruments, Santa Barbara，CA，USA)設(shè)為輕敲(tapping)模式以分析液體試樣。使用的 懸臂(cantilever)為 0MCL-TR400PSA(Olympus，Japan)。受試者組織與抽提本研究基于來自東京都老人綜合研究所腦銀行(Tokyo MetropolitanBrain Bank for Aging Research of the Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology) (Itabashi, Tokyo, Japan)的尸體剖檢病例(η = 50 ；26位男性與24位女性)進(jìn)行。本研究計(jì)劃經(jīng)東 京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(the Faculty of Medicine, theUniversity of Tokyo)、東京都老人綜合研
K^kff ri^(the TokyoMetropolitan Geriatric Hospital of the Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology)(the National
Center of Geriatrics andGerontology)的機(jī)構(gòu)內(nèi)倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)。已有人報(bào)道了受 試者與試樣收集的細(xì)節(jié)(Katsuno T，Neurology，64 :687_692，2005)。然而彼研究分析的是 不溶性腦級(jí)分，而在本研究計(jì)劃中，本發(fā)明人分析了可溶性腦級(jí)分，其在之前的研究中未經(jīng) 鑒定(Katsuno T, Neurology,64 =687-692,2005) 0將凍結(jié)的組織試樣(內(nèi)嗅皮層的前部) 在九倍體積的含蛋白酶抑制劑雞尾酒的Tris緩沖鹽水(TS)中勻漿。將勻漿在265000X g 下超離心20分鐘。對(duì)所得上清等分試樣的三分之一(0.5ml)進(jìn)行免疫印跡分析。免疫組織化學(xué)Tg2576小鼠的左腦半球使用低溫切片機(jī)(RM 2145 ；Leica, ffetzlar, Germany)切 為30 μ m厚的矢狀切片，并如前所述(Wyss-Coray et al. ,2001)用硫代黃素S進(jìn)行染色。 利用抗突觸泡蛋白抗體(Chemicon，Temecula, CA)進(jìn)行腫大變性的神經(jīng)突的形成的觀察。通過在40倍放大率下觀察來自每個(gè)小鼠左半腦的四或五個(gè)切片來計(jì)數(shù)硫代黃素S陽(yáng)性斑 點(diǎn)數(shù)與突觸泡蛋白陽(yáng)性的腫大變性神經(jīng)突數(shù)。為觀察Αβ沉著，將連續(xù)切片用甲酸或蛋白 酶K短暫地預(yù)處理，再用A β免疫染色試劑盒(Sigma，St. Louis, MO)進(jìn)行染色，使用ABC elite試劑盒(Vector Laboratories)顯現(xiàn)免疫陽(yáng)性的信號(hào)。使用與顯微鏡連接的數(shù)字 照相機(jī)記錄大腦皮層與海馬的圖像，并用簡(jiǎn)單的PCI軟件(Compixlmaging System, Lake Oswego,OR)進(jìn)行分析。使用共聚焦激光顯微鏡(CarlZeiss LSM510)觀察抗體的腦內(nèi)移行 (translocation)。硫代黃素S陽(yáng)性的菌斑數(shù)與突觸泡蛋白陽(yáng)性的腫大變性神經(jīng)突數(shù)以雙 盲的方式確定。被動(dòng)免疫療法與行為分析三月齡的雌性非轉(zhuǎn)基因(non-Tg)小鼠以及攜帶并過表達(dá)突變體人類APP基因的 Tg2576小鼠購(gòu)自Taconics (Germantown，NY, USA)，所述突變體基因具有家族性AD的瑞典 型(Swedish-type)雙重突變(K670N與M671L)。這些小鼠在本發(fā)明人的動(dòng)物設(shè)施中養(yǎng)育直 至13月齡。為確定類阿爾茨海默氏病表型是否受被動(dòng)免疫預(yù)防，將1A9或2C3(0. 4mg/kg/ 周)，或PBS施用于四月齡的Tg2576的尾靜脈中，并延續(xù)該給藥直至13月齡。在第十三個(gè) 月，如前人所述(Mouri A,FASEB J，21 :2135_2148，2007)進(jìn)行記憶功能評(píng)估，基于下列四個(gè) 行為范式(I)Y-迷宮測(cè)試中的短期記憶；(2)新物體識(shí)別測(cè)試；(3)Morris水迷宮測(cè)試；以及(4)附線索的恐懼條件測(cè)試(contextual fear conditioning test)在行為測(cè)試三日后，將所述小鼠處死以供生化與組織學(xué)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過單向 與雙向ANOVA分析。事后(post-hoc)分析使用Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行。脂蛋白的分離與移除自12個(gè)AD患者與13個(gè)NC個(gè)體收集CSF。然后，從600 μ 1的每個(gè)CSF試樣中 通過制備性連續(xù)密度梯度超離心方法根據(jù)先前報(bào)道的規(guī)程(Matsubara E，et al.，Ann Neurol,45 =537-541,1999)移除脂蛋白。CSF的密度用KBr調(diào)整為1. 25g/ml。將所述CSF 在100000rpm、16°C下使用HitachiRPlOOAT離心機(jī)超離心8小時(shí)。對(duì)漂浮于密度1. 25g/ml 處的脂蛋白與除去了脂蛋白的CSF使用3kDa截留膜(Microcon 3 ；Arnicon, Inc)進(jìn)行超 濾，然后將其凍結(jié)儲(chǔ)藏或于4°C下儲(chǔ)藏直至使用。亦通過親和層析法使用PHML-LIP0S0RB(Calbiochem，La Jolla，CA)移除脂蛋白。 每個(gè)試樣(血漿或腦)與 PHML-LIP0S0RB(Calbiochem，La Jolla, CA)以 1· 5 1 的比例合 并，并混合60秒。隨后將混合物在3000rpm下離心10分鐘。對(duì)所得上清(無脂蛋白的試 樣)進(jìn)行6E10寡聚體ELISA。與PHML-LIP0S0RB結(jié)合的脂蛋白結(jié)合試樣使用20mM脫氧膽 酸鈉洗脫。使用瓊脂糖凝膠電泳(Beckmarm)，繼以用FAST-RED 7B (ffako, Osaka, Japan) 染色，來確證特異性的脂蛋白移除。人類A β的定量通過夾心ELISA 如前人所詳述(Matsubara E, et al.，Ann Neurol, 537-541, 1999 ；Matsubara Ε, et al.，Neurobiol Aging, 25 :833_841，2004)特異性地對(duì)全血漿與 LPDP Αβ種類進(jìn)行定量。為分析腦Αβ種類，對(duì)溶于ΙΟΟμΙ緩沖液的可溶性Αβ種類直接進(jìn)行ELISA，而對(duì)于以70%甲酸提取物形式存在的不可溶A β試樣，在ELISA前用IM Tris-HCKpH 8.0)中和，并稀釋1000倍。通過該分析獲得的值用腦濕重校正，最終表達(dá)為 pmol/g。板之間的標(biāo)準(zhǔn)化通過在所有三個(gè)板中包括三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清試樣來實(shí)現(xiàn)。A β寡聚體特異件ELISA為了特異性的檢測(cè)寡聚Αβ而非單體Αβ，使用了化學(xué)發(fā)光ELISA，即利用化學(xué)發(fā) 光的夾心固相酶免疫測(cè)定。將微孔板用單克隆lA9(IgG2b同種型)或2C3(IgG2b同種型)， 或1A9與2C3的混合物包被。添加100 μ 1的不同試樣(腦或腦脊液)并在4°C下連續(xù)培育 24小時(shí)。然后，添加辣根過氧化物酶綴合的BA27 Fab，片段(特異于A β 40的抗A β 1-40 ； Wako pure chemical, Osaka, Japan)或辣根過氧化物酶綴合的BC05 Fab，片段(特異于 Αβ 42 的抗 Αβ 35-43 ；Wako pure chemical，Osaka，Japan)，并在 4°C下培育 24 小時(shí)。使用 SuperSignal ELISA Pico Chemi luminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA),用 Veritas Microplate Luminometer (Promega)對(duì)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光定量。為評(píng)估用單克隆1A9與2C3外周給藥的體內(nèi)效用，自經(jīng)給藥的小鼠采集血漿與器 官試樣，并使用特異于人類寡聚體的HRP標(biāo)記6E10(SenetekPLC，Napa，CA，USA)通過ELISA 對(duì)Αβ寡聚體進(jìn)行分析。為了提高敏感度，使用上述的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。為避免脂 蛋白結(jié)合性Αβ單體的干擾，本發(fā)明人使用PHML-LIP0S0RB以與前述相同的方法預(yù)處理了 血漿或器官試樣。所得的除去了脂蛋白的試樣用于所述分析。實(shí)施例1制各A β寡聚彳本特異丨牛單克降杭體(1Α9與2C3)Αβ寡聚體與單體在溶液中共存。因而，Αβ單體的移除對(duì)于為產(chǎn)生Αβ寡聚體特 異性抗體的抗原制備而言非常關(guān)鍵。如圖IA所示，本發(fā)明人成功的通過SDS-PAGE分離了 不含A β單體污染的SDS穩(wěn)定性A β四聚體。在用分離所得的A β四聚體進(jìn)行體內(nèi)免疫接 種后，通過先進(jìn)行點(diǎn)印跡分析再進(jìn)行免疫沉淀的兩步篩選法，選取了陽(yáng)性雜交瘤克隆。在進(jìn) 行點(diǎn)印跡分析的400個(gè)克隆中，16個(gè)克隆被確定為陽(yáng)性(陽(yáng)性率=4%)。為評(píng)估分離所 得陽(yáng)性克隆針對(duì)寡聚體的特異性，對(duì)源自AD腦的不溶于磷酸緩沖液但可溶于甲酸(FA)的 淀粉樣蛋白級(jí)分(Matsubara E et al. ,Neurobiol Aging, 25 :833_841，2004)，使用所述陽(yáng) 性雜交瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清通過免疫沉淀進(jìn)行了分析(圖1B)。使用抗Αβ單克隆抗體4G8 的免疫印跡分析檢出了 Αβ 二聚體、較前者少量的三聚體、以及具有聚集Αβ分子種類的更 高分子量的彌散(smear)。亦檢出了非常少量的在SDS存在下解離出的A β單體。為了進(jìn) 一步確證天然1Α9或2C3三維結(jié)構(gòu)(亦即，寡聚體)的存在，本發(fā)明人試圖在經(jīng)突變體PSl cDNA轉(zhuǎn)染的人類胚胎腎(HEK) 293細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基(CM)中檢出所述寡聚體(Nakaya Y et al.，J Biol Chem，280 :19070_19077，2005)。本發(fā)明人嘗試通過 SEC 對(duì) HEK293 CM 進(jìn) 行分級(jí)分離，并然后鑒定出寡聚體。如之前報(bào)道(Matsubara E et al. ,Neurobiol Aging, 25 833-841,2004 ；Yamamoto N, et al. ,JBiol Chem，282 :2646_2655，2007)，該方法可有效 的從單體(級(jí)分14到20)中分離出寡聚體(級(jí)分8到13)。當(dāng)使用單克隆1A9進(jìn)行免疫沉 淀時(shí)，分泌入CM的SDS穩(wěn)定性A β 二聚體在級(jí)分8中被沉淀出來(> 680kDa) ；SDS穩(wěn)定性 Αβ 二聚體與三聚體在級(jí)分13中被沉淀出來(17到44kDa)；還有非常少量的二聚體在級(jí)分 16中被沉淀出來(圖1C)。當(dāng)使用2C3進(jìn)行免疫沉淀時(shí)獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。 這些數(shù)據(jù)說明1A9與2C3對(duì)Αβ寡聚體具有確切的特異性，而不識(shí)別Aβ單體。
實(shí)施例2單克降1A9與2C3的抗神經(jīng)毒件活件為評(píng)估單克隆認(rèn)9或203是否能夠預(yù)防々0誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，將NGF-分化的PC12 細(xì)胞(PC12N)與25 μ M無種子(seed free)的A β 1-42 (ThT陰性540000x g上清)在所述 單克隆抗體(mAb)存在或不存在的條件下在37°C下培育48小時(shí)。神經(jīng)細(xì)胞的生存力通過 LIVE/DEAD分析來確定(圖2)。在Αβ 1-42存在時(shí)，較之對(duì)照測(cè)定(圖2Α)，以顯著的高水 平檢出了神經(jīng)細(xì)胞死亡(圖2Β與2G)。非特異性IgG2b(圖2C與2D)無法在相同條件下 抑制Αβ 1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性?？墒匈?gòu)的Αβ特異性單克隆抗體4G8(IgG2b同種型；圖2D 與2G)具有增強(qiáng)毒性的傾向。單克隆2C3(IgG2b同種型；圖2F與2G)以濃度依賴性方式幾 乎完全中和了 Αβ 1-42的神經(jīng)毒性。因此推測(cè)從頭形成(de novo-formed)性的神經(jīng)毒性 2C3三維結(jié)構(gòu)為寡聚體形式。與此同時(shí)，lA9(IgG2b同種型；圖2E與2G)的抗神經(jīng)毒性活性 落在2C3與非特異性IgG2b的抗神經(jīng)毒性活性之間。這表明由1A9三維結(jié)構(gòu)與2C3寡聚體 具有結(jié)構(gòu)上不同的三維結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3當(dāng)下，確定神經(jīng)毒性A β 1-42寡聚體的準(zhǔn)確大小與構(gòu)象是最緊要的課題之一，對(duì) 此競(jìng)爭(zhēng)激烈。本發(fā)明人成功的分離出可溶性神經(jīng)毒性Αβ 1-42分子種類，并通過超濾與分 子篩(UC/MS)將該種類分級(jí)分離為下述五個(gè)級(jí)分(圖3Α)級(jí)分1，< 3kDa的濾出物(泳道1)；級(jí)分2，3到IOkDa的濾出物(泳道2)；級(jí)分3，10到30kDa的濾出物(泳道3)；級(jí)分4，30到IOOkDa的濾出物(泳道4)；以及級(jí)分5，> IOOkDa的保留溶液(泳道5)。使用單克隆4G8的免疫印跡分析(圖3A)揭示
級(jí)分1不含有A β (泳道1)；級(jí)分2含有A β單體(泳道2)；級(jí)分3 (泳道3)含有A β單體與少量A β 二聚體；級(jí)分4 (泳道4)含有A β單體到五聚體；以及級(jí)分5 (泳道5)含有A β單體到五聚體，以及45到160kDa的條帶。這些數(shù)據(jù)表明，2% SDS可將高分子量(HMW)的Αβ寡聚體解聚成Aβ單體與低分 子量(LMW)Aii寡聚體。為評(píng)估毒性Αβ 1-42的尺寸分布，本發(fā)明人測(cè)定了各個(gè)級(jí)分在37°C 下與PC12N培育48小時(shí)后的生物學(xué)活性。如圖3B與3C所示，說明了 級(jí)分1不具毒性，級(jí) 分2毒性很弱，表明Αβ單體與二聚體具有毒性的可能性不高。級(jí)分3到5具有顯著的毒 性(單向ANOVA ；ρ < 0. 0001)，表明神經(jīng)毒性寡聚體的尺寸理論上相當(dāng)于三聚體或更高。使 用寡聚體特異性All抗體的點(diǎn)印跡分析也發(fā)現(xiàn)，上述三個(gè)神經(jīng)毒性級(jí)分(3到5)對(duì)All為 陽(yáng)性的，這為神經(jīng)毒性分子為寡聚的提供了旁證(圖3D)。2C3識(shí)別的寡聚體在級(jí)分4與5 中檢出(圖3D)。從而說明2C3實(shí)際上與神經(jīng)毒性A β寡聚體(> 30kDa)反應(yīng)。進(jìn)一步， 大部分2C3識(shí)別的寡聚體在毒性最高的級(jí)分5(> IOOkDa)中檢出，因此我們認(rèn)為具有超過 IOOkDa的分子量的2C3識(shí)別的寡聚體顯示強(qiáng)神經(jīng)毒性(圖3D)。同時(shí)，僅僅極少量的1A9 識(shí)別寡聚體分布于最具毒性的級(jí)分5中。這與1A9對(duì)神經(jīng)毒性的中和作用不足的結(jié)果(圖
292E與2G)相符。與之相對(duì)的是，不具有抗神經(jīng)毒性活性的單克隆4G8可檢出分布于所有級(jí) 分中的Αβ種類(圖3D)。這表明在相同的尺寸下寡聚體也可能作為非毒性聚合體共存。為進(jìn)一步評(píng)估毒性_結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，對(duì)每個(gè)級(jí)分進(jìn)行原子力顯微鏡(AFM)觀 察。只有在三個(gè)呈神經(jīng)毒性的級(jí)分中檢出了與其級(jí)分大小對(duì)應(yīng)的球狀顆粒形態(tài)的存在。圖 3Ε顯示非毒性級(jí)分2 (Fr. 2)，毒性級(jí)分3 (Fr. 3)與4 (Fr. 4)，以及最具毒性的級(jí)分5 (Fr. 5) 的原子力顯微鏡圖像。毒性級(jí)分中清楚可見許多顆粒多聚物分子的形成。具體而言，可見 級(jí)分5除了大小不同的粒狀分子外，還包括珠形、環(huán)形分子等混在的不均一的毒性分子。實(shí)施例41Α9將2C3陽(yáng)抑A β淀粉樣蛋白原纖維形成的活件然后，本發(fā)明人評(píng)估了 1Α9與2C3是否具有阻抑Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成的活 性。Αβ 1-42淀粉樣蛋白原纖維的形成(在0，10，25與50μΜ下)通過在37°C下測(cè)定ThT 熒光度72小時(shí)來評(píng)估。在本發(fā)明人使用的條件下，無種子的Αβ 1-42(通過在540000X g 下獲取的ThT陰性上清級(jí)分)通過成核依賴性聚合作用聚合為淀粉樣蛋白原纖維(圖4A)。 為評(píng)估1A9與2C3阻抑A β淀粉樣蛋白原纖維形成的活性，本發(fā)明人將25 μ M無種子的 A β 1-42在所述抗體存在或不存在的條件下在37°C下培育48小時(shí)。如圖4B所示，ThT熒光 強(qiáng)度以2C3濃度依賴性形式改變，而在單克隆1A9與4G8與非特異性IgG2b存在下均未見 變化。與此同時(shí)，當(dāng)Αβ通過培育兩小時(shí)進(jìn)行聚合時(shí)，1Α9及2C3都顯示幾乎完全阻抑所述 原纖維形成的活性(圖4C)。由于2C3即使在對(duì)Αβ的分子比例低的時(shí)候亦檢出阻抑Αβ 淀粉樣蛋白原纖維形成的活性，暗示2C3具有在Αβ 1-42淀粉樣蛋白原纖維形成早期階段 抑制從頭開始形成的聚合核或種子功能(seed function)的能力。通過形態(tài)學(xué)觀察也獲得 了相似的結(jié)果。如圖4Ε(Αβ42自身)與圖4F(Ai3 42+2C3，25 3)所示，電子顯微鏡(EM)觀 察說明Αβ淀粉樣蛋白纖維的形成在單克隆2C3的存在下受部分抑制，而在1Α9存在下僅 發(fā)生微弱的抑制作用(圖4G)。與此同時(shí)，所述測(cè)試抗體對(duì)于通過24小時(shí)培育預(yù)先形成的 A β 1-42淀粉樣蛋白原纖維均不顯示裂解或解聚作用(圖4D)。實(shí)施例51Α9與2C3靶向的毒性相關(guān)寡聚體為說明Αβ 1-42寡聚化與淀粉樣蛋白原纖維形成間的結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)聯(lián)系，通過使 用Al 1，1Α9，2C3與4G8的點(diǎn)印跡分析了聚合的時(shí)間進(jìn)程。如圖5Α所示，大部分Al 1抗體-反 應(yīng)性寡聚體在聚合作用的時(shí)滯(lag time)期(0_8小時(shí))形成，ThT熒光強(qiáng)度相對(duì)較弱。在 接下來的纖維延伸期(8到24小時(shí))中，A-Il免疫應(yīng)答性寡聚體的水平達(dá)到平臺(tái)，并然后 保持恒定(大約為峰值水平的20%)直至72小時(shí)(平臺(tái)期)。有人表明，抗寡聚體All抗 體并不識(shí)別淀粉樣蛋白原纖維，可使用該抗體特異性地觀察Αβ寡聚體形成(Kayed R，et al. ,Science 300，486-489，2003)。因此，現(xiàn)在的結(jié)果表明A β寡聚體形成發(fā)生于淀粉樣蛋 白原纖維形成之前，且存在一個(gè)不直接進(jìn)入淀粉樣蛋白原纖維形成通路的寡聚化狀態(tài)。2C3 識(shí)別的寡聚體與All識(shí)別的寡聚體在動(dòng)力學(xué)上類似，但1Α9識(shí)別的寡聚體的動(dòng)力學(xué)不同。 1A9識(shí)別的寡聚體在四個(gè)小時(shí)后方檢出，隨后可見1A9的免疫反應(yīng)性隨時(shí)間增加到兩倍。這 就表明1A9識(shí)別的寡聚體形成較慢。與此相對(duì)的是，揭示了 2C3識(shí)別寡聚體在時(shí)滯期(0到 8小時(shí))瞬時(shí)出現(xiàn)，然后在8到72小時(shí)以非常微量的寡聚狀態(tài)(少于5%)存在。由本發(fā) 明人獲取的上述數(shù)據(jù)表明All-，1A9-與2C3識(shí)別寡聚體可能具有結(jié)構(gòu)上和免疫學(xué)上不同的三維結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性，而且2C3識(shí)別的寡聚體較之1A9識(shí)別的寡聚體而言相對(duì)不穩(wěn)定。為鑒定所述從頭合成的毒性聚合狀態(tài)，將PC12N在37 °C下暴露于無種子的 A β 1-42(0小時(shí))，或經(jīng)2、4或24小時(shí)預(yù)培育的A β 1-42 48小時(shí)(圖5Β)，并檢驗(yàn)其神經(jīng) 毒性活性。如圖5Β所示，使用4G8的免疫印跡分析揭示在0小時(shí)時(shí)點(diǎn)已經(jīng)存在了單體到三 聚體。所述2或4小時(shí)的預(yù)培育導(dǎo)致形成除所述單體到五聚體外，還得到了 45到160kDa 的高分子量(HMW)彌散物。在24小時(shí)的時(shí)點(diǎn)，所述HMW彌散物急驟減少，且形成了兩類主 要組分無法進(jìn)入凝膠而殘留于孔中高分子量種類，與少量單體。所述HMW彌散物在進(jìn)一 步在37°C下培育48小時(shí)后消失。如圖3A與5C所示，分子篩實(shí)驗(yàn)揭示，無種子的A β 1-42 被轉(zhuǎn)化為IOOkDa或更大的分子種類，并顯示最強(qiáng)的毒性。在SDS-PAGE上顯示，所述毒性 分子除所述單體到五聚體種類外，亦包括呈現(xiàn)45到160kDa的高分子量(HMW)彌散形式的 分子種類，且毒性多聚物在SDS的存在下可輕易的解離為低分子量種類。然而當(dāng)將無種子 的Αβ 1-42預(yù)培育2小時(shí)與4小時(shí)時(shí)，從頭開始形成的Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性活性分別減 少了約12. 5%與26% (圖5C)。該結(jié)果表明在Αβ聚合作用早期階段從頭開始形成的Aβ 寡聚體水平為神經(jīng)毒性的決定性因素，且所述形成在0-2小時(shí)的期間內(nèi)達(dá)到峰值，然后隨 著時(shí)間推移形成的Αβ寡聚體量減少?；蛘?，也存在這樣的可能，即Αβ淀粉樣蛋白原纖維 的從頭開始聚合的核或淀粉樣蛋白原纖維自身具有中和神經(jīng)毒性的效果。本發(fā)明人培育 Αβ 1-42兩小時(shí)，然后通過在540000Χ g下超離心3小時(shí)移除不可溶的A β聚合核與淀粉樣 蛋白原纖維。在540000Χ g下超離心所得的上清與沉淀展示相似水平的硫代黃素T信號(hào)， 表明540000X g上清中也含有可溶性ThT陽(yáng)性可溶性A β聚合體(表明ThT結(jié)合帶來形成 富含β片層的結(jié)構(gòu)變化而非原纖維形成)。當(dāng)僅將該可溶性聚合體暴露于PC12N時(shí)，所述 神經(jīng)毒性恢復(fù)且增強(qiáng)(圖5D)。這表明不可溶的Αβ 1-42自身具有抗毒性活性。在上述狀 況下，單克隆1Α9完全中和了由富含β片層結(jié)構(gòu)的可溶性Αβ寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，且 該中和活性較之2C3的為高。與此同時(shí)，非特異性的IgG2b自身對(duì)培養(yǎng)PC12N的生存無影 響。由此，推測(cè)神經(jīng)毒性1A9識(shí)別的聚合體本質(zhì)上為可溶性毒性寡聚體，其由于一些結(jié)構(gòu)變 化略微穩(wěn)定化，而神經(jīng)毒性2C3識(shí)別的多聚物本質(zhì)上為短命的寡聚中間體，其由于在聚合 過程早期巨大的結(jié)構(gòu)變化而非常的不穩(wěn)定。實(shí)施例6單克隆1A9與2C3在腦實(shí)質(zhì)中識(shí)別A β寡聚體在實(shí)證了 1Α9與2C3的特異性與生物學(xué)活性之后，本發(fā)明人進(jìn)一步在腦中通過免 疫組織化學(xué)檢出了 1Α9與2C3聚合體。本發(fā)明人實(shí)施了常規(guī)免疫組織化學(xué)方法以通過甲醛 固定，以及甲酸，SDS或微波處理腦切片以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。所有所述增強(qiáng)方法都無法使所述 兩個(gè)抗體展示任何針對(duì)AD腦的免疫反應(yīng)性。從而，本發(fā)明人用蛋白酶K預(yù)處理所述切片，該 酶已知可改善免疫染色(ffrzolek MA, et al. ,Am J Pathol, 141 =343-355,1992) 其結(jié)果， 許多老年斑被1A9(圖6A)，2C3(圖6B)與All (圖6C)所染色。與從本發(fā)明人進(jìn)行的體外 實(shí)驗(yàn)獲得的發(fā)現(xiàn)，即Αβ淀粉樣蛋白原纖維可中和Αβ寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性結(jié)合起來看， 上述結(jié)果表明老年斑充當(dāng)隔離并儲(chǔ)藏Αβ寡聚體的防御性倉(cāng)庫(kù)，因此該倉(cāng)庫(kù)的內(nèi)部抗體難 以到達(dá)。確實(shí)，使用1Α9與2C3的免疫沉淀確認(rèn)，由老年斑構(gòu)成的淀粉樣蛋白級(jí)分中存在由 所述兩種抗體識(shí)別的Αβ寡聚體。從而，證明了本發(fā)明人的假說與體內(nèi)證據(jù)一致(參見圖 1Β)。
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為進(jìn)一步評(píng)估“可溶性” 1A9-與2C3-識(shí)別的聚合體在腦內(nèi)的存在，本發(fā)明人使用 所述兩種抗體進(jìn)行了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。使用Tris緩沖鹽水(TBS)制備腦勻漿以避免在提取可 溶性寡聚體過程中的化學(xué)修飾。用1A9從來自AD腦大腦皮層的TBS試樣中免疫沉淀出了 具有四聚體，五聚體，八聚體與十二聚體分子量的寡聚體(圖6D，泳道2)，而在對(duì)照健康腦 中所述寡聚體的水平低于檢測(cè)限(泳道3)。四聚體，五聚體與八聚體的強(qiáng)度雖在1A9(泳道 2)與單克隆4G8/6E10混合物(泳道1)間相似，1A9似較之4G8/6E10回收了較多量的十二 聚體。用2C3進(jìn)行的免疫沉淀顯示了相似的結(jié)果(圖6，第4-6道)。然后，本發(fā)明人鑒定 了在人類內(nèi)嗅皮質(zhì)中導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)毒性的分子。眾所周知在一般高齡人群中，該病變中神 經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)與神經(jīng)細(xì)胞喪失發(fā)生于老年斑形成之前。本發(fā)明人提出這樣的假說， 即針對(duì)1A9與2C3識(shí)別的聚合體有功能的倉(cāng)庫(kù)(例如老年斑)的缺乏對(duì)內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元是 有害的，而且是記憶紊亂的可能原因。通過使用單克隆1A9與2C3的免疫印跡確定了之前 報(bào)道的50個(gè)尸體剖檢病例中可溶于緩沖液的級(jí)分中的十二聚體水平。所述50個(gè)病例包括 兩個(gè)AD病例，35個(gè)Braak NFT I到II期的病例與13個(gè)NFT III到IV期的病例(Katsuno et al.，Neurology，64 :687-692，2005)。如圖 6E(1A9)與 6F(2C3)所示，1A9 或 2C3 免疫 反應(yīng)性十二聚體相對(duì)于肌動(dòng)蛋白的免疫活性在AD患者中較之健康對(duì)照組(Braak NFT I到 II期)與輕度認(rèn)知障礙組(Braak NFT III到IV期)顯著為高。有趣的是，所述十二聚體 在健康對(duì)照組(Braak NFT I到II期)與輕度認(rèn)知障礙組(Braak NFT III到IV期)的內(nèi) 嗅皮質(zhì)中分別以約40%與60%的水平積聚(在AD比例中該水平為100% )(圖6E與6F)。 該結(jié)果表明12聚體的積聚發(fā)生于認(rèn)知機(jī)能障礙病發(fā)之前，且隨Braak NFT分期的推進(jìn)而增 加，暗示1A9與2C3免疫反應(yīng)性十二聚體是導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)毒性的聚合體。實(shí)施例7Ml^M 1A9與2C3在腦脊液中iR另I丨A β寡聚體導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)毒性的A β聚合體(可溶性1Α9與2C3免疫反應(yīng)性十二聚體)在腦 實(shí)質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)。據(jù)此，本發(fā)明人推測(cè)，CSF亦含有所述聚合體。為證實(shí)這一點(diǎn)，本發(fā)明人將自 十個(gè)AD患者與作為對(duì)照的十個(gè)年齡匹配的健康個(gè)體匯集的CSF通過SEC進(jìn)行分級(jí)分離，并 通過A β寡聚體特異性?shī)A心ELISA對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行分析，其中在捕獲與檢測(cè)系統(tǒng)中使用單 克隆BC05或ΒΑ27。BC05/BC05寡聚體ELISA在級(jí)分13中檢測(cè)出可溶性A β 1-42，而ΒΑ27/ BA27ELISA在級(jí)分7_14中檢測(cè)出可溶性A β 1-40 (數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在每個(gè)ELISA中，吸 光度(45011!11處的0.0.)低至無法敏感地在05 中檢測(cè)出少量4 0寡聚體。在相同級(jí)分中通 過BNT77ELISA檢測(cè)出Αβ單體，顯示結(jié)合有脂蛋白的A β單體(級(jí)分7到14)與無脂蛋白 的A β單體(級(jí)分15到17)在所述級(jí)分中與A β寡聚體共存(圖7-1Α與7_1B) (Matsubara Ε，et al.，Neurobiol Aging, 25 =833-841,2004) 在 AD 中結(jié)合有脂蛋白的 A β 單體的水 平與健康對(duì)照相似，而在AD中無脂蛋白的A β -40單體(圖7-1Α)與A β 42單體(圖7-1Β) 較之年齡匹配的健康對(duì)照為低。本發(fā)明人亦發(fā)現(xiàn)在將ELISA設(shè)計(jì)為使用HRP標(biāo)記的BC05 或ΒΑ27作為捕獲抗體時(shí)，除所述寡聚體外，與脂蛋白結(jié)合的Αβ單體亦可被檢出。該問題 在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中未被注意(Lee EB, et al. ,J Biol Chem，281 :4292_4299，2006)，后者描 述了與本文所述方法相似的分析方法(例如，6E10/6E10 ELISA)。因?yàn)樗龉丫垠w和與脂 蛋白結(jié)合的Αβ單體在SEC中洗脫的保留時(shí)間相似，無法通過寡聚體ELISA在捕獲與檢測(cè) 中使用相同的抗體對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分。從而，揭示了在使用Αβ寡聚體-非選擇性抗體分析Αβ寡聚體時(shí)，含脂蛋白的CSF不適于用作測(cè)試試樣。為克服這些現(xiàn)有技術(shù)方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明人改進(jìn)了用于ELISA的檢測(cè)抗體與試 樣。原先CSF中去除脂蛋白，將所得的去除了脂蛋白的CSF(LPD-CSF)用作測(cè)定試樣。Αβ 寡聚體特異性1Α9與2C3用作ELISA的檢測(cè)抗體。進(jìn)一步，建立了化學(xué)發(fā)光ELISA以增強(qiáng) 敏感度。將匯集的LPD-CSF (圖7-1C到D)通過SEC分級(jí)分離，且對(duì)于每一級(jí)分通過化學(xué)發(fā) 光ELISA分析其Αβ寡聚體分布，其中使用1Α9或2C3作為檢測(cè)抗體。如圖7-1C到D所示， A β寡聚體在SEC級(jí)分12到15 (相對(duì)較大的A β，其分子量范圍為18到108kDa，其對(duì)應(yīng)于 四聚體到二十四聚體的尺寸)。在所有AD患者來源的、其中所述寡聚體可檢出的級(jí)分中， 1A9與2C3識(shí)別的寡聚體水平均變高。為評(píng)估所述Αβ寡聚體作為治療標(biāo)志的有用性，對(duì)來 自AD患者LPD-CSF中與來自年齡匹配健康對(duì)照中的Αβ寡聚體水平進(jìn)行比較，盡管僅分析 了少數(shù)病例。如圖7-2G所示，由Αβ χ-42組成的2C3識(shí)別的寡聚體在AD患者組中較之正 常對(duì)照組顯著增加(非參數(shù)分析；P = 0. 0103)。與之相對(duì)，對(duì)于由Αβ χ-40組成的2C3識(shí) 別的寡聚體，在所述兩組間并無顯著差異。另一方面，由Αβ χ-42組成的1Α9識(shí)別的寡聚體 的水平在AD中較之在對(duì)照中為高，盡管該差異在統(tǒng)計(jì)上并非顯著。對(duì)于由Αβ χ-40組成的 1Α9識(shí)別的寡聚體，兩組之間并無顯著差異(圖7-2Ε)。自Αβ單體變?yōu)楣丫垠w的結(jié)構(gòu)變化 發(fā)生在Αβ聚合過程的最早階段。Αβ寡聚體與單體間的比例(0/Μ指數(shù))可用作反映AD 病理特征的臨床指標(biāo)。如圖7-2F與7-2Η所示，A β 42與A β 40的0/Μ指數(shù)在AD患者組中 較之健康對(duì)照組均有顯著提高(1Α9，對(duì)A β 42為ρ = 0. 0137，而對(duì)A β 40為ρ = 0. 0429 ； 2C3，對(duì)A β 42為ρ = 0. 0012而對(duì)A β 4-0為ρ = 0. 0051)。上述結(jié)果顯示1Α9與2C3陽(yáng)性 的三維結(jié)構(gòu)不但以Αβ寡聚體的形式存在于LPD-CSF中，且在AD患者中增加。此外，本發(fā) 明人獲取的結(jié)果說明從不帶脂蛋白的可溶性Αβ到寡聚中間體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換發(fā)生于AD患者 的CSF中，且所述寡聚體可作為有用于診斷散發(fā)性AD的生物學(xué)標(biāo)志。實(shí)施例8Wm^M 1Α9與2C3 動(dòng)免鹿m去陽(yáng).1卜在Tg2576中記,憶紊亂的發(fā)病為評(píng)估基于1Α9(η = 13)或2C3 (η = 11)給藥的被動(dòng)免疫療法的體內(nèi)預(yù)防/治療 效果，本發(fā)明人將1Α9或2C3 (0. 4mg/kg/周)或PBS通過尾靜脈在4到13個(gè)月齡期間施用 于Tg2576小鼠。對(duì)13個(gè)月齡時(shí)的記憶功能以以下四種類型的學(xué)習(xí)/行為范式加以評(píng)估(1) Y迷宮測(cè)試中的短期記憶(圖8A)；(2)新物體識(shí)別測(cè)試中的物體認(rèn)識(shí)記憶(圖8B)；(3)水迷宮測(cè)試中的空間記憶(圖8C)；以及(4)附線索的恐懼條件測(cè)試中的聯(lián)想情感記憶(圖8D)。較之施用1A9與2C3的Tg2576小鼠，施用PBS的Tg2576小鼠顯示顯著的學(xué)習(xí)與 行為障礙(圖8A到8D)。與施用PBS的Tg2576小鼠(n = 10)不同，施用1A9或2C3的 Tg2576小鼠的記憶功能與之前測(cè)得的其年齡匹配的未經(jīng)施用的野生型同齡組小鼠的記憶 功能之間不能區(qū)分。由此可見，在施用1A9或2C3的Tg2576小鼠中，本應(yīng)發(fā)生減損的短期 與長(zhǎng)期記憶——在施用PBS的組中發(fā)生了這樣的減損——得以保持。亦即，發(fā)明人獲得了 支持下述觀點(diǎn)的證據(jù)，即如果在記憶障礙發(fā)病之前進(jìn)行靶向Αβ寡聚體的被動(dòng)免疫療法， 可能預(yù)防記憶障礙發(fā)病，特別是AD發(fā)病。進(jìn)一步，上述結(jié)果代表了首次發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)證據(jù)，其 直接指明Αβ寡聚體是記憶障礙發(fā)病分子。
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實(shí)施例9單克降1A9在Tg2576的腦中阻丨h(huán)AP積聚對(duì)經(jīng)施用PBS的Tg2576小鼠(η = 10)與在4到13月齡期間經(jīng)被動(dòng)免疫療法處 理的Tg2576小鼠(1A9給藥組，n= 13;2C3給藥組，η= 11)在所述學(xué)習(xí)/行為實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行 解剖。積聚于腦中(大腦皮層海馬)的Αβ量在下述三個(gè)通過連續(xù)提取制備的級(jí)分(每 個(gè)提取物150mg)中測(cè)定在含蛋白酶抑制劑的Tris緩沖液中的可溶性級(jí)分；2% SDS可溶 性淀粉樣蛋白級(jí)分；以及2% SDS-不可溶但70%甲酸可溶性淀粉樣蛋白級(jí)分。我們認(rèn)為， Tris緩沖液級(jí)分中包含非積聚性的生理性A β分子，而2% SDS可溶性A β中包含在淀粉樣 蛋白原纖維形成之前的散在老年斑、免疫細(xì)胞化學(xué)上無法檢出的Αβ、以及經(jīng)過三維結(jié)構(gòu)變 化的、積聚性的可溶性寡聚A β。利用A β 40-與A β 42末端特異性ELISA (特異于A β 40的 ΒΝΤ77/ΒΑ27,特異于A β 42的BNT77/BC05，WAKO試劑盒)分別對(duì)A β進(jìn)行定量。主要組分 為非積聚性生理性Αβ分子的Tris緩沖液級(jí)分中的Αβ濃度在這三組之間并無顯著差別 (圖9Α與9C，A0 χ-40 ；圖9B與9 ，Αβ x_42)。在腦中可溶性A β的積聚量(SDS級(jí)分)方 面，僅于1Α9給藥組中確認(rèn)了顯著的針對(duì)Aβ χ-40和Αβ χ-42在大腦皮層中積聚的阻抑作 用(圖9Ε，Αβ χ-40 ；圖9F，Αβ χ-42)。未在海馬中觀察到積聚阻抑作用(圖9G，Αβ χ_40 ； 圖9Η，Αβχ-42)。與此同時(shí)，在腦中不可溶Αβ的積聚量(FA級(jí)分)方面，僅于1Α9給藥 組中觀察到了顯著的針對(duì)Αβχ-40在大腦皮層中積聚的阻抑作用(圖91，Αβχ-40 ；圖9J， Αβχ-42)。未在海馬中觀察到積聚阻抑作用(圖9Κ，Αβχ-40 ；圖9L，Ai3x-42)。對(duì)SDS可 溶性級(jí)分的All免疫印跡分析顯示在所述兩個(gè)抗體處理組中對(duì)大腦皮層中A-Il陽(yáng)性寡聚 體(四聚體)積聚的阻抑作用(圖9M)。實(shí)施例10用1A9與2C3的被動(dòng)免疫療法增加血漿A β下列三組間在血漿Αβ濃度方面并無顯著差異施用PBS的Tg2576小鼠(η = 10)，以及在4到13月齡期間經(jīng)被動(dòng)免疫療法處理的Tg2576小鼠(1A9給藥組，η = 13 ；2C3 給藥組，η = 11)(圖10Α，Αβχ-40 ；圖10Β，Αβχ-42)。A β 40/42比例亦無顯著差異(圖 10C)。為了說明在Tg2576小鼠中使用1A9與2C3的被動(dòng)免疫療法針對(duì)AD樣表型的預(yù) 防作用背后隱藏的機(jī)理，本發(fā)明人在匯集的腦勻漿中評(píng)估了可溶于與不可溶于生理鹽水的 Αβ寡聚體的存在，以及Αβ寡聚體在外周血與血漿中的存在。在所述處理組之間在匯集 的腦勻漿中可溶于生理鹽水的A β寡聚體的量方面并無差異(圖10D)，另一方面，不可溶 Aβ寡聚體的量在1Α9與2C3處理組中顯示為減少(圖10Ε)。進(jìn)一步，對(duì)各處理組內(nèi)匯集 的血漿(除去白蛋白的血菜，小圖F上段；除去白蛋白/脂蛋白的血菜，小圖F的下段)通 過All點(diǎn)印跡分析其所含的Αβ寡聚體。其結(jié)果顯示來自PBS給藥Tg2576小鼠的血漿中 存在所述寡聚體(圖10F)。在在被動(dòng)免疫治療組中，血漿中的Al 1-陽(yáng)性寡聚體較之PBS給 藥組清楚地增加(圖10F)。2C3識(shí)別的寡聚體以脂蛋白結(jié)合形式存在的比例較之1A9識(shí)別 的寡聚體為高(小圖F的下段)。進(jìn)一步，通過All免疫沉淀考察血漿Αβ寡聚體。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，與PBS給藥組相比，接受被動(dòng)免疫治療的Tg2576小鼠中約200kDa的寡聚體發(fā)生了增 加(圖10G)。血漿Αβ寡聚體在被動(dòng)免疫治療組中的這種增加可視為直接反映了腦內(nèi)清 除(cerebral clearance)的增加。從而，本發(fā)明人獲得了下述證據(jù)，即靜脈內(nèi)被動(dòng)免疫療法的直接靶分子不但存在于腦中，亦存在于血液中，可通過在外周位點(diǎn)的作用增強(qiáng)寡聚體 的選擇性腦內(nèi)清除。亦即，本發(fā)明人顯示了靜脈內(nèi)被動(dòng)免疫療法在臨床上的有用性。實(shí)施例11#用1A9與2C3 動(dòng)免鹿m去可陽(yáng)摘淀粉樣蛋白老年斑與腫大剩牛神經(jīng)突形成在被動(dòng)免疫療法組中免疫組織化學(xué)A β沉著受阻抑(圖11Α)。硫代黃素S染色陽(yáng) 性老年斑淀粉樣蛋白數(shù)在大腦皮層與海馬中也均顯著受阻抑(圖11Β，上段)；該減少在組 織學(xué)上也是明顯的(圖11Β，下段)。突觸泡蛋白陽(yáng)性腫大變性神經(jīng)突形成在被動(dòng)免疫治療 組中亦顯著的受阻抑(圖11C)。實(shí)施例12使用抗突觸泡蛋白或抗腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白抗體的免疫染餼分析1Α9與2C3在大腦新皮質(zhì)中阻抑了前突觸與后突觸的變性(圖12)。實(shí)施例13抗體的腦內(nèi)移行使用共焦聚激光顯微鏡評(píng)估了 A β沉著與腦內(nèi)小鼠IgG的存在/位置。其結(jié)果顯 示，在散在老年斑存在的區(qū)域中，小鼠IgG存在的位置幾乎與沉著Αβ無關(guān)。該小鼠IgG僅 見于被動(dòng)免疫療法組(1Α9(圖13Α)與2C3(圖13B))中，但非PBS給藥組(圖13C)中。由 此可見，施用于血液的抗體中一部分轉(zhuǎn)移到了腦中。該結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)的抗體直接中 和可溶性A β聚合體毒性的，且進(jìn)一步可溶性A β聚合體以與所述抗體的復(fù)合物的形式被 清除到血中，來發(fā)揮預(yù)防記憶障礙的效果。因而認(rèn)為其治療系基于復(fù)合作用機(jī)制。實(shí)施例14不識(shí)別其它A β單體但為寡聚體特異性的抗體(Ε12，IClO與4D3)IClO與4D3是來自在386個(gè)含通過對(duì)小鼠重新免疫接種所得的雜交瘤的孔中 24個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞孔的兩種強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞。自合成A β 1-40 (HCl形式)制備50μΜ無種子的 A β 1-40 (單體)，其可容易地從無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)形成β片層結(jié)構(gòu)；將其在37°C下培育0到96 小時(shí)以產(chǎn)生寡聚體，并通過點(diǎn)印跡法來檢查所述抗體的寡聚體特異性。經(jīng)確證，如同上述 2C3的結(jié)果，E12，IClO與4D3(均為IgM同種型)并不與單體反應(yīng)，但對(duì)寡聚體是特異性的 (圖 14)。實(shí)施例15同種型變?yōu)镮甙2b的E12抗體的免疫點(diǎn)印跡分析對(duì)E12進(jìn)行免疫點(diǎn)印跡分析，其同種型通過常規(guī)方法變?yōu)镮gG2b。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所 得E12抗體(IgG2b同種型)是不識(shí)別A β單體(0小時(shí))，但可特異性地結(jié)合A β寡聚體 (圖15)的抗體。進(jìn)一步，確證該抗體的特征并未因同種型變化而改變。實(shí)施例16同種型變?yōu)镮gG2b的E12抗體的Aβ淀粉樣蛋白原纖維形成阻抑活件為評(píng)估所述Ε12抗體(IgG2b同種型)是否具有阻抑A β淀粉樣蛋白原纖維形成 的活性，Αβ淀粉樣蛋白原纖維形成通過上述ThT熒光強(qiáng)度分析方法在溶液(培養(yǎng)基)中 檢測(cè)，溶液組成與用于Αβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)的相同。其結(jié)果，觀察到Αβ淀粉樣蛋白原纖 維形成在1. 5 μ M所述Ε12抗體的存在下受阻抑(圖16)。討論
本發(fā)明人所得數(shù)據(jù)顯示單克隆1A9與2C3特異性地識(shí)別導(dǎo)致毒性活性與神經(jīng)纖維 形成活性的可溶性A β的“神經(jīng)毒性表位”與“聚合作用表位”。因?yàn)閱慰寺?Α9與2C3不 與為生理性分子的可溶性Αβ單體反應(yīng)，可得出下述結(jié)論，即具有由1Α9或2C3識(shí)別的表位 的三維結(jié)構(gòu)是可溶性寡聚聚合體特有的。使用超濾與分子篩的實(shí)驗(yàn)揭示，1Α9與2C3免疫反 應(yīng)性寡聚體的尺寸大于100kDa( > 20聚體)。通過AFM的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果說明毒性多聚體 在形態(tài)學(xué)上為異質(zhì)的(顆粒狀，珠形與環(huán)形)。為實(shí)證所述毒性聚合體實(shí)際上為展示體內(nèi)突觸毒性的生物活性分子，本發(fā)明人用 靶向1A9與2C3識(shí)別的毒性聚合體的抗Αβ寡聚體被動(dòng)免疫療法對(duì)幼Tg2576小鼠在其記憶 障礙發(fā)生之前進(jìn)行處理。本發(fā)明人首次提出了支持下述結(jié)論的證據(jù)，即在Tg2576小鼠中天 然發(fā)生的年齡依賴性記憶惡化可通過被動(dòng)免疫療法使用抗A β寡聚體特異性抗體(1Α9與 2C3)來預(yù)防。在本文中，通過Y迷宮測(cè)試評(píng)估的短期記憶障礙類似于在輕度認(rèn)知障礙(MCI) 與早期AD中觀察到的Αβ積聚相關(guān)記憶障礙。對(duì)經(jīng)1Α9與2C3分別給藥的Tg2576小鼠， 所述Y-迷宮測(cè)試顯示良好的、幾乎正常的結(jié)果。當(dāng)通過新物體識(shí)別任務(wù)，Morris水迷宮與 附線索的恐懼條件任務(wù)評(píng)估時(shí)，依賴所述抗A β寡聚體抗體長(zhǎng)期記憶保持近乎正常。較之PBS處理組，抗體處理的小鼠組中見到了血液中All陽(yáng)性寡聚體的選擇性增 加，該現(xiàn)象與所述抗體預(yù)防記憶障礙發(fā)病的能力(記憶保持能力)相一致。1A9抗體處理亦 展示了阻抑大腦Αβ積聚的作用。2C3抗體處理顯示了較之1Α9抗體處理較高的A-Il陽(yáng)性 寡聚體血液水平。然而2C3抗體處理的大腦A β積聚阻抑功能并不清楚。相應(yīng)的，1Α9識(shí) 別的寡聚體視為較之2C3識(shí)別的寡聚體對(duì)大腦Aβ積聚具有更大的作用。所述聚合體在大 腦Αβ積聚中所起的作用可基于下述假定加以解釋神經(jīng)毒性1Α9聚合體是構(gòu)象較為穩(wěn)定 的可溶性有毒寡聚體，而神經(jīng)毒性2C3聚合體為非常不穩(wěn)定、短命的寡聚中間體，其出現(xiàn)于 聚合過程的早期階段，其構(gòu)象非常易于變化。本發(fā)明人在本文中公開了抗寡聚體抗體對(duì)阿爾茨海默氏病的體內(nèi)預(yù)防作用，這是 第一個(gè)直接證明體內(nèi)形成的有毒Αβ寡聚體能抑制神經(jīng)細(xì)胞的功能，由此誘導(dǎo)阿爾茨海默 氏病的癥狀的證據(jù)。本發(fā)明人獲取的數(shù)據(jù)也是支持Αβ在人類大腦中展示體內(nèi)神經(jīng)毒性這一觀點(diǎn)的 第一個(gè)證據(jù)。眾所周知人類內(nèi)嗅皮層為易受AD影響的區(qū)域。在此區(qū)域內(nèi)，NFT形成與神經(jīng) 細(xì)胞喪失發(fā)生于老年斑形成之前。因此，內(nèi)嗅皮層是被普遍接受的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說無 法適用的一個(gè)例外區(qū)域。然而該不一致長(zhǎng)期以來受人忽略，無人研究。本發(fā)明人提出并驗(yàn)證了下述假說，即迄今為止未被鑒定的、不可見的Αβ寡聚體， 在內(nèi)嗅皮質(zhì)中有害于神經(jīng)細(xì)胞并導(dǎo)致記憶障礙。為驗(yàn)證該假說，本發(fā)明人針對(duì)主要為Braak NFT IilJIII期的高齡人，半定量地分析了他們內(nèi)嗅皮層中的1Α9與2C3免疫反應(yīng)性十二聚 體。1Α9與2C3免疫反應(yīng)性12聚體在Braak NFT I到II期的健康個(gè)體的內(nèi)嗅皮質(zhì)中已經(jīng) 存在，且隨著BraakNFT分期的進(jìn)展而增加。在AD中發(fā)現(xiàn)所述12聚體顯著增加。從而，說 明1Α9與2C3免疫反應(yīng)性12聚體的出現(xiàn)發(fā)生于人類大腦中認(rèn)知機(jī)能障礙發(fā)病之前。另一 方面，通過生物化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)，闡明了老年斑含有1Α9與2C3免疫反應(yīng)性A β寡 聚體。而且，揭示了不溶化的淀粉樣蛋白原纖維自身具有中和神經(jīng)毒性的活性。這些發(fā)現(xiàn) 表明，當(dāng)存在Αβ寡聚體但無老年斑形成時(shí)，Aβ寡聚體發(fā)揮體內(nèi)毒性，從而可為記憶障礙 的原因。
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如上所述，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)首次了直接證明記憶障礙的原因?yàn)樵隗w內(nèi)由內(nèi)源Αβ 寡聚體造成的突觸功能障礙。盡管之前使用過主動(dòng)免疫療法(Janus D，2000，Nature; Morgan D，2000，Nature)與被動(dòng)免疫療法(Bard F，2222，Nat med ；DeMattos RB, PNAS, 2001)，如何阻止學(xué)習(xí)能力喪失與記憶障礙的機(jī)理仍然僅為猜測(cè)。一個(gè)廣泛提出的可能性是 所述抗體通過血腦屏障到達(dá)腦部，并在體內(nèi)直接中和作為記憶缺陷原因的可溶性Αβ寡聚 體。第二個(gè)可能性，即所謂“庫(kù)理論(sink theory)”，認(rèn)為所述抗體在外周耗盡外周血A β 池，并從而激活Αβ自腦中的清除。DeMattos等人報(bào)道外周施用的抗A β抗體不僅運(yùn)輸大 腦Αβ單體，且亦運(yùn)輸Αβ 二聚體進(jìn)入血漿，并亦將腦Aβ運(yùn)輸入CSF(DeMattos RB et al.， PNAS，98 ;8850-8855，2001)。本發(fā)明人亦揭示A β寡聚體存在于人類CSF中，且在AD患者 中增加。從而確認(rèn)了 Αβ寡聚體可用作AD的診斷標(biāo)記。進(jìn)一步，本發(fā)明人首次提供了支持 下述觀點(diǎn)的證據(jù)，即Αβ寡聚體存在于Tg2586小鼠的血漿中，并且，在特異性捕獲并中和 Αβ寡聚體的通過靜脈內(nèi)注射的被動(dòng)免疫療法中，無需向腦內(nèi)遞送抗體，且在外周位點(diǎn)亦即 血管作用即可實(shí)現(xiàn)Αβ寡聚體從腦到血液中的清除。此外，本發(fā)明人首次提出了下述證據(jù)， 即被動(dòng)免疫療法不但可阻抑老年斑形成，而且還可阻抑淀粉樣蛋白老年斑介導(dǎo)的間接神經(jīng) 細(xì)胞損傷(腫大變性的神經(jīng)突形成)。這些結(jié)果確證所述Aβ寡聚體為阿爾茨海默氏病發(fā) 病的分子基礎(chǔ)，且使用寡聚體特異性抗體的選擇性控制使人們不但可能從治療性的視點(diǎn)控 制阿爾茨海默氏病，從預(yù)防性的視點(diǎn)控制阿爾茨海默氏病也成為可能。進(jìn)一步，我們證實(shí)了 所施用抗體的一部分轉(zhuǎn)移入腦部。這表明阻抑記憶障礙的效果是多種作用聯(lián)合施加的，這 些作用例如對(duì)腦中可溶性Αβ寡聚體的直接中和，通過新生Fc受體將抗體-Aβ寡聚體免 疫復(fù)合物運(yùn)輸?shù)窖褐?DeaneR，2005，J Neurosci)，以及上述“庫(kù)”作用。建立準(zhǔn)確的發(fā)病前診斷以識(shí)別具有罹患AD高風(fēng)險(xiǎn)的病例對(duì)涉及預(yù)防/治療策略 而言非常重要。本文所報(bào)道的在AD中CSF中0/M比例的顯著增加，期望其為發(fā)病前診斷標(biāo) 志的有力候選。產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明所提供的抗體可用于，例如，對(duì)阿爾茨海默氏病基于靜脈內(nèi)注射的預(yù)防性 被動(dòng)免疫治療，并作為對(duì)該疾病發(fā)病前診斷，疾病監(jiān)視，藥物功效監(jiān)視/評(píng)價(jià)等的生物學(xué)標(biāo)
ο進(jìn)一步，本發(fā)明所述的抗體可望對(duì)阿爾茨海默氏病預(yù)防/治療方法以及早期診斷 標(biāo)志的建立產(chǎn)生極大的貢獻(xiàn)，其中上述預(yù)防/治療方法對(duì)引發(fā)該疾病的病理學(xué)狀況的分子 具有選擇性。本發(fā)明人獲取了支持下述結(jié)論的證據(jù)抗體療法，即使其以腦內(nèi)病理學(xué)狀況 為靶標(biāo)，亦可令人滿意地通過外周靜脈內(nèi)給藥來達(dá)成，而無需考慮所述抗體的腦內(nèi)轉(zhuǎn)移。此 外，本發(fā)明人獲得了證據(jù)顯示即使在外周靜脈內(nèi)給藥療法中，被施用的抗體的一部分轉(zhuǎn)移 到腦內(nèi)，并產(chǎn)生直接效應(yīng)，同樣無需考慮所述抗體的腦內(nèi)轉(zhuǎn)移。從而，本發(fā)明可望大大加快 阿爾茨海默氏病抗體療法的進(jìn)展。
3權(quán)利要求
一種結(jié)合Aβ寡聚體的抗體，其中所述抗體不結(jié)合Aβ單體。
2.一種結(jié)合Αβ寡聚體的抗體，該Αβ寡聚體結(jié)合包含具有SEQ ID Ν0:1的氨基酸序 列的H鏈與具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L鏈的抗體。
3.一種結(jié)合Αβ寡聚體的抗體，所述Αβ寡聚體結(jié)合包含具有SEQ IDN0:21的氨基酸 序列的H鏈與具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L鏈的抗體。
4.一種結(jié)合A β寡聚體的抗體，所述A β寡聚體結(jié)合于包含具有SEQ IDNO :41的氨基 酸序列的H鏈與具有SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L鏈的抗體。
5.下述(1)到(20)中任一項(xiàng)的抗體(1)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列作為⑶Rl、SEQ ID NO 11的氨 基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 13的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(2)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列作為⑶Rl、SEQ ID NO 17的氨 基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 19的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(3)一種抗體，其包含⑴的H鏈與⑵的L鏈；(4)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列作為VH的H鏈；(5)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列作為VL的L鏈；(6)一種抗體，其包含⑷的H鏈與(5)的L鏈；(7)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO :29的氨基酸序列作為⑶Rl，SEQ ID NO :31的氨 基酸序列作為⑶R2，與SEQ ID NO 33的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(8)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列作為⑶Rl，SEQ ID NO 37的氨 基酸序列作為⑶R2，與SEQ ID NO 39的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(9)一種抗體，其包含(7)的H鏈與⑶的L鏈；(10)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 25的氨基酸序列作為VH的H鏈；(11)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 27的氨基酸序列作為VL的L鏈；(12)一種抗體，其包含(10)的H鏈與(11)的L鏈；(13)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列作為⑶Rl、SEQ ID NO :51的 氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 53的氨基酸序列作為⑶R3的H鏈；(14)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列作為⑶Rl、SEQ ID NO 57的 氨基酸序列作為⑶R2、以及SEQ ID NO 59的氨基酸序列作為⑶R3的L鏈；(15)一種抗體，其包含(13)的H鏈與(14)的L鏈；(16)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 45的氨基酸序列作為VH的H鏈；(17)一種抗體，其包含具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列作為VL的L鏈；(18)一種抗體，其包含(16)的H鏈與(17)的L鏈；(19)一種抗體，其是在(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體中替換、缺失、添加和/或插入一個(gè) 或多個(gè)氨基酸而得到的，其具有與所述(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體等價(jià)的活性；和(20)一種抗體，其結(jié)合(1)到(18)中任一項(xiàng)的抗體所結(jié)合的表位。
6.權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體或人源化抗體。
7.一種組合物，其包含權(quán)利要求1到6任一所述的抗體與藥用載體。
8.—種抗認(rèn)知機(jī)能障礙劑，其包含權(quán)利要求1到6任一所述的抗體或權(quán)利要求7的組 合物作為活性成分。
9.一種阿爾茨海默氏病治療劑，其包含權(quán)利要求1到6任一所述的抗體或權(quán)利要求7 的組合物作為活性成分。
10.一種阿爾茨海默氏病進(jìn)展阻抑劑，其包含權(quán)利要求1到6中任一所述的抗體或權(quán)利 要求7的組合物作為活性成分。
11.一種老年斑形成阻抑劑，其包含權(quán)利要求1到6任一所述的抗體或權(quán)利要求7的組 合物作為活性成分。
12.—種A β積聚阻抑劑，其包含權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求7的 組合物作為活性成分。
13.一種抗神經(jīng)毒性劑，其包含權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求7的組 合物作為活性成分。
14.一種Αβ淀粉狀蛋白纖維形成抑制劑，其包含權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體 或權(quán)利要求7的組合物作為活性成分。
15.一種抗突觸毒性劑，其包含權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求7的組 合物作為活性成分。
16.一種檢測(cè)A β寡聚體的方法，其包括使用權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體檢測(cè) 自受試者收集的試樣中所含的Aβ寡聚體的步驟。
17.—種診斷受試者是否為可能的阿爾茨海默氏病患者的方法，其包括使用權(quán)利要求 1到6中任一項(xiàng)所述的抗體檢測(cè)收集自受試者的試樣中的Αβ寡聚體。
18.—種診斷受試者是否為可能的阿爾茨海默氏病患者的方法，其包括下述步驟(a)使收集自受試者的試樣與權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體接觸；和(b)測(cè)量所述試樣中Αβ寡聚體的量，其中當(dāng)步驟(b)中測(cè)得的量大于健康個(gè)體時(shí)，確定所述受試者為可能的阿爾茨海默氏 病患者。
19.一種診斷受試者是否為可能的阿爾茨海默氏病患者的方法，其包括下述步驟(a)使收集自受試者的試樣與權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的抗體以及結(jié)合Aβ單體 的抗體接觸；以及(b)測(cè)量所述試樣中Αβ寡聚體對(duì)Αβ單體的比例，其中當(dāng)步驟(b)中測(cè)得的比例大于健康個(gè)體時(shí)，確定所述受試者為可能的阿爾茨海默 氏病患者。
20.權(quán)利要求16到19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述試樣為血液或腦脊液。
21.一種用于權(quán)利要求16到19中任一項(xiàng)所述的方法的藥劑。
22.一種用于權(quán)利要求16到19中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明人成功地生產(chǎn)了僅特異識(shí)別可溶性Aβ寡聚體(其為生理性分子)而不識(shí)別可溶性Aβ單體的單克隆抗體。發(fā)現(xiàn)該抗體作為針對(duì)阿爾茨海默氏病診斷/治療的單克隆抗體是有用的。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101965365SQ20088012221
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日
發(fā)明者松原悅朗, 柴田昌夫, 橫關(guān)達(dá)己 申請(qǐng)人:伊繆納斯制藥株式會(huì)社;獨(dú)立行政法人國(guó)立長(zhǎng)壽醫(yī)療研究中心