專利名稱：用于治療代謝疾病的組合物和方法
本申請要求2007年2月2日提交的美國臨時專利申請第60/887,994號以及2007年12月7日提交的美國臨時專利申請第61/012,310號的優(yōu)先權(quán)，這兩份申請的內(nèi)容被納入本文作為參考。
本發(fā)明獲得國立衛(wèi)生機構(gòu)資助號GM-63115的聯(lián)邦資助以及國防部資助號DAMD17-03-1-0228的資助。美國政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。并且，本發(fā)明還獲得Ibrahim El-Hefni技術(shù)培訓(xùn)基金會的資助。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及醫(yī)藥、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。具體說，本發(fā)明的領(lǐng)域涉及用于治療代謝疾病(例如肥胖)的特定組合物。在某些方面，組合物包含法圖他汀A(fatostatin A)及其類似物或衍生物的組合物。

背景技術(shù)：
代謝綜合征涉及許多心血管危險因子，包括高血壓、血脂障礙、肥胖、2型糖尿病、胰β-細(xì)胞功能障礙和動脈粥樣硬化。飲食中各種含量的脂肪或碳水化合物有利于動物(包括人)的能量代謝。長鏈脂肪酸是主要的能量來源和構(gòu)成細(xì)胞膜的重要脂質(zhì)成分。它們來源于食物，也可通過復(fù)雜的反應(yīng)集合由乙酰輔酶A從頭合成。膽固醇也來源于食物以及通過同樣復(fù)雜的反應(yīng)由乙酰輔酶A合成。碳水化合物通過脂肪酸和膽固醇的從頭合成轉(zhuǎn)化為?；视王シ謩e涉及至少12種和23種酶反應(yīng)。編碼這些酶的基因的表達水平受到三種轉(zhuǎn)錄因子的控制，稱為甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)，SREBP-1a、-1c和SREBP-2(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000)。這些膜結(jié)合蛋白質(zhì)屬于轉(zhuǎn)錄因子的基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨基酸拉鏈家族的類型(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000；Tontonoz等，1993)。和轉(zhuǎn)錄因子的其他亮氨基酸拉鏈成員不同，合成的SREBP為ER-膜結(jié)合前體形式，需要由兩種結(jié)合高爾基體膜的蛋白酶(位點-1和位點-2蛋白酶)通過蛋白水解釋放，以激活靶基因在細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄(Brown和Goldstein，1997；Sakai等，1996)。
SREBP的蛋白水解激活受到甾醇的緊密調(diào)控，通過與SREBP裂解激活蛋白(SCAP)，一種SREBP的ER-膜結(jié)合護衛(wèi)蛋白的相互作用來實現(xiàn)調(diào)控(Goldstein等，2006；Hua等，1996)。當(dāng)甾醇在ER膜中蓄積時，SCAP/SREBP復(fù)合物沒能離開ER到達高爾基體，因而SREBP的蛋白水解加工受到抑制。SREBP是控制脂肪代謝體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及一種或多種個體代謝疾病的治療和/或預(yù)防，所述個體尤其是哺乳動物，例如人、狗、貓、馬、牛、山羊或綿羊等。具體說，本發(fā)明涉及向個體遞送一種或多種組合物用于治療，在特定實施方式中，組合物是法圖他汀A和/或其類似物或衍生物。代謝疾病可以是任何類型，只要至少一種疾病癥狀可以用有效量的本發(fā)明化合物進行治療和/或預(yù)防。
在本發(fā)明的某些方面，代謝綜合征涉及許多心血管危險因子，包括高血壓、血脂障礙、肥胖、2型糖尿病、胰β-細(xì)胞功能障礙和動脈粥樣硬化。在本發(fā)明的其他方面，提供了內(nèi)臟脂肪的治療和/或預(yù)防，包括脂肪肝。脂肪酸和膽固醇來源于食物，或者由乙酰輔酶A通過復(fù)雜的反應(yīng)集合從頭合成，即，涉及碳水化合物轉(zhuǎn)化為酰基甘油酯的脂肪生成過程。脂肪酸和膽固醇的磁體合成分別涉及至少12種和23種酶反應(yīng)。編碼這些酶的基因的表達水平受到三種轉(zhuǎn)錄因子的控制，稱為甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)，SREBP-1a、-1c和SREBP-2(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000)。這些膜結(jié)合蛋白質(zhì)屬于轉(zhuǎn)錄因子的基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨基酸拉鏈家族的類型。和轉(zhuǎn)錄因子的其他亮氨基酸拉鏈成員不同，合成的SREBP為ER-膜結(jié)合前體形式，需要由兩種結(jié)合高爾基體膜的蛋白酶(位點-1和位點-2蛋白酶)通過蛋白水解釋放，以激活靶基因在細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄。
SREBP的蛋白水解激活受到甾醇的緊密調(diào)控，通過與SREBP裂解激活蛋白(SCAP)，一種SREBP的ER-膜結(jié)合護衛(wèi)蛋白的相互作用來實現(xiàn)調(diào)控。當(dāng)甾醇在ER膜中蓄積時，SCAP/SREBP復(fù)合物沒能離開ER到達高爾基體，因而SREBP的蛋白水解加工受到抑制。合成的藥物樣噻唑衍生物在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中導(dǎo)致兩種獨特的表型3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成的抑制；和DU145人前列腺癌細(xì)胞中血清非依賴性生長的阻抑。全合成的藥物樣噻唑衍生物(稱為法圖他汀A或125B11)在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中引起兩種獨特的表型DU145人前列腺癌細(xì)胞中血清非依賴性生長的阻抑和3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成的抑制。催化長鏈脂肪酸從頭合成的胰島素導(dǎo)致的脂肪酸合酶(FAS)的誘導(dǎo)取決于FAS基因啟動子上游的SREBP結(jié)合位點。
在具體的方面，提供了一種或多種小分子，它們能阻斷3T3-L1細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成和前列腺癌細(xì)胞中IGF1誘導(dǎo)的細(xì)胞生長。機械學(xué)研究表明，這些分子能抑制SREBP的蛋白水解激活，從而抑制其定位到細(xì)胞核中。SREBP是控制人細(xì)胞中脂肪酸和甾醇生物合成的主轉(zhuǎn)錄因子，功能為介入的小分子可導(dǎo)致治療許多代謝疾病(包括肥胖和高脂血癥)的藥物的開發(fā)。DNA微陣列分析顯示，分子選擇性降低SREBP-靶基因的表達數(shù)量，包括LDL受體和HMB-CoA還原酶。給予小鼠該分子能降低血中甘油三酯和膽固醇的水平而不影響食物攝取。在本發(fā)明的具體方面，本發(fā)明化合物是削弱SREBP途徑的非天然合成分子。
在這里證實法圖他汀A和示例性的類似物能選擇性阻斷SREBP的活化。法圖他汀A被鑒定為SREBP的抑制劑解釋了其需要從頭合成細(xì)胞膜構(gòu)成模塊脂肪酸和膽固醇的血清非依賴性癌細(xì)胞生長的阻抑作用。
還顯示法圖他汀A在實驗小鼠中阻斷SREBP-1的活化。給予小鼠法圖他汀A可導(dǎo)致體重減輕，成熟SREBP下調(diào)，結(jié)果脂肪生成酶、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和FAS的水平和活性降低。最后，在某些實施方式中，法圖他汀可用于代謝疾病的藥物介入，作為工具用于脂肪酸合成的控制和作用的進一步研究。
過去通過小有機分子的化學(xué)文庫的表型篩選發(fā)現(xiàn)了法圖他汀A。合成的藥物樣噻唑衍生物在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中引起兩種獨特的表型3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞中抑制胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成；和DU145人前列腺癌細(xì)胞中血清非依賴性生長的阻抑。本文表明，法圖他汀A能夠選擇性阻斷SREBP的活化。法圖他汀A被鑒定為SREBP的抑制劑與其抗脂肪生成特性一致，解釋了其需要從頭合成細(xì)胞膜構(gòu)成模塊脂肪酸和膽固醇的血清非依賴性癌細(xì)胞生長的阻抑作用。
在本發(fā)明的一個實施方式中，化合物選自下組4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；其藥學(xué)上可接受的鹽；其立體異構(gòu)體；以及它們的任意組合或混合物。在一個具體的實施方式中，化合物選自N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺或N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺。在另一具體的實施方式中，進一步限定化合物包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。
在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了治療個體代謝疾病的方法，該方法包括給予個體治療有效量的至少一種具有以下通式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體A-B-C，式中A、B和C相同或不同，各自代表5-、6-或7-元環(huán)，所述環(huán)可以是雜環(huán)或非雜環(huán)、取代的環(huán)、或非取代的環(huán)，A、B和C中的任一個、任兩個或所有三個都是未取代或具有一個或多個取代基，任何取代與任何其他取代之間可相同或不同，所述取代基選自下組a)羥基；b)C1-10烷基；c)C2-10烯基；d)C2-10炔基；e)C3-6環(huán)烷基；f)芳基；g)雜芳基；其中所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的取代基所取代1)羥基；2)(C＝O)Ra；3)(C＝O)ORa；4)(C＝O)H；5)(C＝O)OH；6)O(CH2)nCOORa，其合作n＝1-10；7)鹵素；8)氰基；9)羧基；10)氨基；11)單取代的氨基；12)二取代的氨基；13)酰氨基；14)單取代的酰氨基；15)二取代的酰氨基；和16)它們的任意組合，在2)、3)或6)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；h)-(C＝O)Ra；i)(C＝O)ORa；j)(C＝O)H；k)(C＝O)OH；l)O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，在h)、i)或1)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；m)鹵素；n)氰基；o)羧基；p)氨基；q)單取代的氨基；r)二取代的氨基；s)酰氨基；t)單取代的酰氨基；和u)二取代的酰氨基；其中所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，u)中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的取代基所取代i)羥基；ii)(C＝O)Ra；iii)(C＝O)ORa；iv)(C＝O)H；v)(C＝O)OH；vi)O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，在ii)、iii)或vi)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；vii)鹵素；viii)氰基；ix)羧基；x)氨基；xi)單取代的氨基；xii)二取代的氨基；xiii)酰氨基；xiv)單取代的酰氨基；xv)二取代的酰氨基；和xvi)它們的任意組合。在一個具體的實施方式中，A被取代，包括1-5個原子的側(cè)鏈，在另一具體的實施方式中，所述1-5個原子的側(cè)鏈?zhǔn)?-5個碳原子的側(cè)鏈。
在本發(fā)明另一實施方式中，至少一種化合物選自下組2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；2-苯基-4-對甲苯基噻唑；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶；4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑；2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4′-甲基[1，1′-聯(lián)苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸；2-乙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸甲酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯；N-環(huán)己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺?；桨?；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8-喹啉磺酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2-噻吩磺酰胺；和它們的任意組合。
在另一具體的實施方式中，至少一種化合物選自4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；其藥學(xué)上可接受的鹽；其立體異構(gòu)體；和它們的任意組合。
在另一具體的實施方式中，至少一種化合物選自2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；其藥學(xué)上可接受的鹽；其立體異構(gòu)體；和它們的任意組合。
在本發(fā)明的具體方面，所述代謝疾病是肥胖。在其他方面，代謝疾病選自肥胖、高脂血癥、糖尿病、脂肪肝、高血壓、前列腺癌和心血管病。
在具體實施方式
中，向個體提供額外的治療。在具體病例中，代謝疾病是肥胖，額外治療包括選自下組的療法飲食療法、物理療法、行為療法、外科手術(shù)、藥物療法以及它們的組合。在其他具體病例中，代謝疾病是糖尿病，額外治療包括選自下組的療法飲食療法、物理療法和藥物療法。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了一種藥盒，其包括至少一種本發(fā)明的化合物，所述化合物被裝在合適的容器中。在特定實施方式中，藥盒還包括用于代謝疾病的額外治療。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了抑制個體SREBP途徑成員的方法，該方法包括向個體提供治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物的步驟。在特定實施方式中，SREBP途徑的成員是SREBP-1、SREBP-2或兩者。
下面相當(dāng)廣泛地描述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)勢，目的是更好地理解下面的發(fā)明詳述。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將在下面描述，構(gòu)成本發(fā)明權(quán)利要求的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述概念和具體實施方式
可容易地用作改進或設(shè)計用于實現(xiàn)本發(fā)明相同目的的其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，這些等價結(jié)構(gòu)并不背離所附權(quán)利要求書所提出的本發(fā)明的精神和范圍。結(jié)合附圖，通過以下內(nèi)容將更好地理解本發(fā)明的組織結(jié)構(gòu)和操作方法中本發(fā)明特征性的新特征，以及其他目的和優(yōu)勢。然而應(yīng)清楚地理解，每幅附圖僅僅是闡述和說明的目的，不應(yīng)解釋為構(gòu)成本發(fā)明的限制。
附圖簡要說明 為了更全面地理解本發(fā)明，現(xiàn)在將結(jié)合附圖進行以下描述。


圖1A-1C顯示了RT-PCR微陣列結(jié)果的驗證。(A)法圖他汀A的結(jié)構(gòu)。(B)用DMSO(道1)和5mM法圖他汀A(道2)處理6小時的DU145細(xì)胞。然后提取總RNA進行RT-PCR。(C)RT-PCR和微陣列數(shù)據(jù)的總結(jié)。ACL，ATP檸檬酸裂解酶；HMG CoAR，3-羥基-3-甲基-戊二酰-CoA還原酶；LDLR，低密度脂蛋白受體，MVD，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶；SCD，硬脂酰輔酶A去飽和酶；INSIG1，胰島素誘導(dǎo)基因1；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
圖2A-2C顯示法圖他汀A抑制內(nèi)源性SREBP激活報道基因的能力。用SRE-1-驅(qū)動的熒光素酶報道分子(pSRE-Luc)(A)和肌動蛋白啟動子控制下的β-gal報道分子(B)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在不含脂質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中用各種濃度的法圖他汀A或僅用DMSO處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培育20小時后，測定熒光素酶活性，數(shù)據(jù)通過β-半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。(C)用pCMV-SREBP-1c(1-436)和pSRE-Luc轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，在不含脂質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中用或不用20mM法圖他汀A處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所有值代表三次獨立實驗的平均值。
圖3A-3H顯示了法圖他汀A對SREBP-1和-2的作用。單用DMSO或用法圖他汀A(1和5μM)處理DU145細(xì)胞6小時。Western印跡檢查SREBP-1(A)或SREBP-2(B)的前體和成熟形式的水平。下側(cè)的圖代表肌動蛋白的Western印跡，作為加載對照。(C-H)免疫染色檢查SREBP-1的單位。單用DMSO(C-E)或用5mM法圖他汀A處理細(xì)胞(F-H)，然后用DAPI(C和F)或抗-SREBP-1(D和G)染色。
圖4A-4G顯示了通過敲減SREBP-1的siRNA可抑制胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成。建立敲減SREBP-1的表達的3T3-L1細(xì)胞的兩個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，并誘導(dǎo)其分化形成脂肪細(xì)胞。敲減細(xì)胞不分化(D和F)，而用空白載體(neo)轉(zhuǎn)染的3T3-L1細(xì)胞幾乎全部分化形成脂肪細(xì)胞(B)。A、C和E顯示不進行胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞。(G)克隆的Western印跡分析表明成功敲減SREBP-1。
圖5A-5B表明，敲減SREBP-1的siRNA可阻斷DU145前列腺癌細(xì)胞的血清非依賴性生長。(A)建立SREBP-1表達被敲減的DU145細(xì)胞的兩個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，在無血清、含2％胎牛血清(FBS)、含2％無脂肪胎牛血清、或含1μg/mL IGF1的MEM培養(yǎng)基中培育3天。WST-1試驗測定生長速率。敲減細(xì)胞在無血清、含2％無脂肪FB或1μg/mL IGF1的MEM培養(yǎng)基中不生長，但在血清存在下和對照細(xì)胞一樣生長。一式三份進行試驗。(B)Western印跡表明，克隆1和2中SREBP-1敲減的程度。
圖6A-6G顯示禁食/重新給予無脂肪飲食后法圖他汀A對小鼠的作用。整個試驗期間，禁食48小時，然后再給予無脂肪飲食48小時，從前一天開始每天腹膜內(nèi)注射給予小鼠30mg/kg法圖他汀A。48小時攝食結(jié)束時測定體重減輕(A)和食物攝取(B)。(C)處理和對照小鼠的血清成分。(D)代表性的來自對照組和法圖他汀處理組的2只不同小鼠的肝臟提取物中SREBP-1的Western印跡。蛋白質(zhì)的加載量標(biāo)準(zhǔn)化。(E)表明FAS表達的代表性的Western印跡(上圖)和肝臟提取物中考馬斯染色凝膠的加載對照(下圖)。(F和G)是肝臟提取物中的FAS和ACC活性。數(shù)據(jù)表示為均值+SD(n＝5)；*P＜0.05。
圖7A-7E顯示法圖他汀處理兩周對小鼠的作用。每天注射給予5-6個月齡的小鼠30mg/kg法圖他汀A或10％DMSO，持續(xù)兩周。(A)用法圖他汀A處理之前和之后的體重。(B)處理后體重減輕的量。(C)處理和對照小鼠中葡萄糖、膽固醇和甘油三酯(TG)的血清水平。(D)肝臟提取物中的FAS活性。(E)代表性的來自對照組和處理組的三只小鼠的肝臟提取物的Western印跡分析。蛋白質(zhì)的加載量標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為均值+SD(n＝5)；*P＜0.05。
圖8A-8C顯示了法圖他汀A對體重和食物消耗的影響。每天腹膜內(nèi)注射給予兩組ob/ob雄性小鼠(n＝5)法圖他汀A或10％DMSO(對照組)的PBS溶液，持續(xù)四周。小鼠用正常飼料飼養(yǎng)，實驗第一天以及隨后的每一天，測定小鼠重量和消耗的食物量。(8A)，代表性的對照和法圖他汀A處理小鼠的圖；(8B)，每天測定的各組內(nèi)每只小鼠的重量；顯示了重量均值和方差。(8C)，每天測定食物攝取，表示為28天內(nèi)每只小鼠的累積攝食。
圖9A-9H顯示了對照和法圖他汀A處理的ob/ob小鼠的血清成分。從禁食過夜的小鼠尾靜脈取血，分離細(xì)胞后收集血清。根據(jù)材料和方法部分所述測定血成分。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，每組5只小鼠。
圖10A-10D顯示了法圖他汀對ob/ob小鼠的肝臟和脂肪組織的影響。(10A)A表示法圖他汀A處理小鼠(左)和對照(右)的肝臟。(10B)用油紅O(Oil-Red O)染色以檢測脂肪滴和用邁爾(Mayer)蘇木精反向染色的對照和法圖他汀A處理ob/ob小鼠的肝臟冷凍切片的組織學(xué)分析。用法圖他汀處理的三只不同小鼠的肝臟中染成紅色的脂肪滴顯著減少(上圖)，與處理小鼠相比對照小鼠富含紅色脂肪滴(下圖)。(10C)從法圖他汀A處理的ob/ob小鼠(左)和對照小鼠(右)分離的附睪脂肪墊。(10D)從ob/ob對照和法圖他汀A處理小鼠分離的肝臟和附睪脂肪墊的平均重量。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，每組5只小鼠(*P＜0.05)。
圖11顯示對照和法圖他汀A處理的ob/ob小鼠肝臟中的甘油三酯和膽固醇水平。從肝臟提取脂質(zhì)，根據(jù)實施例示例性材料和方法部分中所述定量甘油三酯和膽固醇。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，每組5只小鼠(*P＝0.0004；

圖12A-12D表明法圖他汀能降低脂肪生成酶的表達水平和活性。根據(jù)實施例示例性的材料和方法部分所述測定ob/ob小鼠肝臟提取物中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)(12A)和脂肪酸合酶(12B)的活性。(12C)，通過4-12％NuPAGEMES凝膠分離，用不同抗體探測，用ECL檢測(材料和方法部分)的三只單獨的ob/ob小鼠的肝臟粗提物的Western印跡分析。(12D)，標(biāo)準(zhǔn)化為肌動蛋白后，法圖他汀A與對照小鼠的不同脂肪生成酶的特定帶的強度的比率。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，每組5只小鼠(

*P＜0.05)。
圖13顯示了相對于對照的法圖他汀A處理ob/ob小鼠中肝脂肪生成酶的轉(zhuǎn)錄水平。每種基因的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為肌動蛋白。從對照和法圖他汀A處理小鼠(n＝5)分離RNA，通過實時定量RT-PCR測定。相對于對照，P＜0.05。
圖14顯示了示例性的本發(fā)明化合物。
圖15顯示了示例性類似物2-18的標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶報道基因試驗。
圖16顯示了示例性類似物19-34的標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶報道基因試驗。
圖17提供了示例性類似物35-44的標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶報道基因試驗。
圖18a-18g顯示了法圖他汀如何阻斷SREBP。(a)法圖他汀的結(jié)構(gòu)。(b)RT-PCR證實受影響基因的下調(diào)。用DMSO(道1)或5mM法圖他汀(道2)處理DU145細(xì)胞6小時。然后提取總RNA并進行RT-PCR，測定ATP檸檬酸裂解酶(ACL)，3-羥基-3-甲基-戊二酰-CoA還原酶(HMG-CoAR)，低密度脂蛋白受體(LDLR)，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MVD)，硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)，胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。(c)用法圖他汀處理引起選定基因的下降。(d)在含無脂血清的培養(yǎng)基中法圖他汀抑制內(nèi)源性SREBP激活熒光素酶報道基因的能力。用SRE-1-驅(qū)動的熒光素酶報道分子(pSRE-Luc)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。在含有無脂質(zhì)血清的培養(yǎng)基中，用各種濃度的法圖他汀處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞。(e)在含有無脂質(zhì)血清的培養(yǎng)基中，法圖他汀對用pCMV-SREBP-1c(1-436)和pSRE-Luc共轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞的作用。(f)轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞中PLAP-BP2保持膜結(jié)合，直到高爾基體中S1P使其裂解并分泌到培養(yǎng)基中(左)。與EtOH對照相比，用法圖他汀(20μM)或甾醇(10μg/mL膽固醇和1μg/mL 25-羥基膽固醇)處理實現(xiàn)PLAP-BP2的裂解。(g)用法圖他汀處理的CHO-K1細(xì)胞的Western印跡分析。P和N分別表示SREBP-2的未切割膜前體和切割的核形式。
圖19a-19c顯示法圖他汀能夠阻斷SREBP從ER易位到高爾基體。(a)Western印跡分析表明，布雷菲德菌素A對僅用EtOH、甾醇(10μg/ml膽固醇和1μg/ml 25-羥基膽固醇)或20μM法圖他汀處理的CHO-K1細(xì)胞有影響。(b)SCAP含有免遭胰蛋白酶蛋白水解且能識別抗-SCAP IgG-9D5的糖基化的腔環(huán)(luminal loop)。當(dāng)SCAP滯留在ER上時，環(huán)中兩種寡糖對內(nèi)切糖苷酶H敏感。當(dāng)SCAP轉(zhuǎn)運至高爾基體，糖變得耐受內(nèi)切糖苷酶H的消化。(c)在有或沒有20μM法圖他汀或甾醇(10μg/mL膽固醇和1μg/mL 25-羥基膽固醇)存在下生長的細(xì)胞中抗-SCAP IgG-9D5的Western印跡分析。右側(cè)數(shù)字表示蛋白酶-保護的SCAP片段上存在的N-連接糖鏈。
圖20a-20d顯示了(a)丹酰法圖他汀和法圖他汀-聚脯氨酸接頭-生物素偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)。插入聚脯氨酸接頭以使法圖他汀分子更好延伸(Sato等，2007)。(b)用丹酰法圖他汀和ER-追蹤紅處理的CHO-K1細(xì)胞，顯示丹酰法圖他汀在ER中的定位。比例尺＝10μm。(c)在CHO-K1膜提取物中，用結(jié)合于用生物素化法圖他汀飽和的中性鏈親和素(Neutravidine)-瓊脂糖珠的蛋白質(zhì)的抗-SCAP，抗-SREBP-1，抗-SREBP-2和抗-ATF6抗體，通過Western印跡分析測定，法圖他汀與SCAP的相互作用。(d)對于競爭試驗，將膜提取物與單獨的EtOH、膽固醇或法圖他汀進行預(yù)孵育。
圖21a-21c顯示了法圖他汀對雄性ob/ob小鼠的體重、食物消耗和血成分的影響。表示為均值±SD(n＝5)。(a)表示對照和法圖他汀處理小鼠。(b)28天處理后每只小鼠的重量和累積食物攝取。(c)對照和法圖他汀處理小鼠的血成分。
圖22a-22d顯示了法圖他汀對ob/ob小鼠的肝臟和脂肪組織的影響。(a)表示法圖他汀處理和對照小鼠的肝臟。(b)法圖他汀處理和對照小鼠的肝臟和附睪脂肪墊的重量(均值±SD，n＝5，*P＜0.05)。(c)法圖他汀處理和對照小鼠的肝臟切片，顯示了紅色脂質(zhì)滴。(d)法圖他汀處理和對照小鼠肝臟中的甘油三酯和膽固醇水平(均值±SD，n＝5，*p＝0.0004；
圖23顯示了法圖他汀導(dǎo)致SREBP-效應(yīng)基因表達減少的微陣列結(jié)果。用法圖他汀或僅用DMSO處理DU145細(xì)胞，通過Affymetrix DNA微陣列分析提取的mRNA樣品。在下調(diào)超過35％的63種基因中，34種與脂肪或甾醇合成直接相關(guān)。粉紅色標(biāo)記表示已報道受SREBP控制的18種基因，橘紅色表示與脂肪或甾醇合成有關(guān)。
圖24顯示了用法圖他汀處理的CHO-K1細(xì)胞的Western印跡分析。P和N分別表示SREBP-1的未切割膜前體和切割的核形式。
圖25提供了法圖他汀、丹酰法圖他汀和法圖他汀-聚脯氨酸接頭-生物素的示例性合成方案。
圖26顯示了在含有無脂質(zhì)血清的培養(yǎng)基中，法圖他汀類似物抑制內(nèi)源性SREBP激活熒光素酶報道基因的能力。用pSRE-Luc轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。在含有無脂質(zhì)血清的培養(yǎng)基中用各種濃度的法圖他汀、丹酰法圖他汀或異丙胺衍生物處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
圖27提供了丹酰法圖他汀或丹酰酰胺在ER中的定位。用5μM丹酰法圖他汀或丹酰酰胺處理CHO-K1細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察。比例尺10μm。
圖28a-28c顯示法圖他汀能降低脂肪生成酶的表達水平和活性。(a)測定ob/ob小鼠肝臟提取物中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶(FAS)的活性。(b)肝臟粗提物的Western印跡分析。(c)標(biāo)準(zhǔn)化為肌動蛋白后法圖他汀和對照小鼠中不同脂肪生成酶的特定帶的強度的比率。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，每組5只小鼠(

*P＜0.05)。
發(fā)明詳述 如本說明書所用，“一”或“一個”可表示一個或多個。如權(quán)利要求書中所述，與術(shù)語“包含”聯(lián)用時，“一”或“一個”可表示一個或不止一個。如本文所用，“另一”可表示至少第二或更多個。在特定實施方式中，本發(fā)明的各個方面可“基本上由本發(fā)明的一個或多個序列構(gòu)成”或“由本發(fā)明的一個或多個序列構(gòu)成”。本發(fā)明的一些實施方式可以由或基本上由本發(fā)明的一個或多個元素、方法步驟和/或方法構(gòu)成。考慮本文所述的任何方法或組合物可以相對于本文所述的任何其他方法或組合物實現(xiàn)。
I.本發(fā)明的通用實施方式 用本發(fā)明化合物治療和/或預(yù)防代謝疾病。例如，脂肪酸和膽固醇生物合成的失調(diào)以及飲食脂肪的過度攝取與許多醫(yī)療并發(fā)癥有關(guān)，至少包括肥胖、糖尿病、高血壓和心血管病，在某些方面這些疾病可用本發(fā)明的化合物治療和/或預(yù)防。流行病學(xué)證據(jù)表明，包括肥胖在內(nèi)的代謝疾病還能促進侵襲性形式前列腺癌的發(fā)展。
脂肪消耗時，甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)從膜蛋白水解釋放并易位到細(xì)胞核內(nèi)，它們在核內(nèi)激活參與膽固醇和脂肪酸生物合成的基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明鑒定了過去已知能阻斷脂肪形成和癌細(xì)胞生長的合成小分子作為SREBP激活的選擇性抑制劑，也提供了該分子的類似物和衍生物。藥物樣分子法圖他汀A削弱SREBP的蛋白水解激活，從而降低其效應(yīng)基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。在小鼠中，法圖他汀A阻斷肝中SREBP-1的激活，減輕體重，降低血膽固醇和葡萄糖的水平，并下調(diào)脂肪生成酶。經(jīng)過處理的小鼠的肝中脂肪酸合酶和乙酰輔酶A羧化酶活性及其表達水平降低。法圖他汀A用作理解細(xì)胞途徑的工具，在某些方面提供了一種通用分子至少作為代謝疾病藥物介入的起點。
在特定實施方式中，調(diào)控代謝相關(guān)表型的小分子可用作剖析復(fù)雜相關(guān)因素的工具。法圖他汀A在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中導(dǎo)致兩種獨特的表型3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成完全被抑制；和DU145人前列腺癌細(xì)胞中不醫(yī)療血清的胰島素樣生長因子1(IGF1)-依賴性生長的選擇性阻抑。
在本發(fā)明的某些方面，法圖他汀A選擇性阻斷甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)的活化，SREBP是激活參與膽固醇和脂肪酸合成的特定基因的關(guān)鍵脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子。法圖他汀A被鑒定為SREBP的抑制劑與其抗脂肪形成性質(zhì)一致，指明SREBP在前列腺癌的IGF1-依賴性生長中的作用。
本發(fā)明考慮法圖他汀A用作阻斷至少SREBP-1的活化的化合物，例如如實驗小鼠中所示。給予肥胖ob/ob小鼠法圖他汀A可導(dǎo)致體重減輕和內(nèi)臟脂肪的顯著減少。
II.代謝疾病 本發(fā)明考慮代謝疾病的至少一種癥狀的治療和/或預(yù)防。代謝疾病可以是任何類型，只要用本發(fā)明的化合物能夠改善或防止其癥狀之一。具體說，代謝疾病源自一種或多種先天性代謝缺陷(可稱為遺傳性障礙)，例如不完全代謝酶(例如具有一個或多個突變或無序的酶，包括調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)運機制中的突變)引起的遺傳性狀。
通常，代謝疾病可定義為影響細(xì)胞能量產(chǎn)生的病癥。雖然大多數(shù)代謝疾病是遺傳性的，一些病癥可能是一種或多種因素導(dǎo)致的獲得性疾病，這些因素包括飲食、毒素、感染等。遺傳性代謝疾病可能是遺傳缺陷引起的，導(dǎo)致細(xì)胞代謝過程中的某一步驟所必需的酶的缺失或不當(dāng)構(gòu)建。最大類別的代謝疾病包括1)糖原貯積病(也稱為糖原病或糊精聚積病)，包括影響糖代謝的病癥；2)脂肪氧化病癥，影響脂肪代謝和脂肪組分的代謝；和3)線粒體病癥，影響線粒體。糖原貯積病(GSD)至少包括I型GSD(葡萄糖-6-磷酸酶缺乏；馮吉爾克氏病(von Gierke′s disease))；II型GSD(酸性麥芽糖酶缺乏；蓬珀氏病)；III型GSD(糖原脫支酶缺乏；柯里氏病或弗碧氏病(Forbe′s disease))；IV型GSD(糖原分支酶缺乏；安德森病)；V型GSD(肌糖原磷酸化酶缺乏；麥卡德爾病)；VI型GSD(肝磷酸化酶缺乏，赫斯氏病)；VII型GSD(肌磷酸果糖激酶缺乏；塔里氏病)；IX型GSD(磷酸化酶激酶缺乏)；和XI型GSD(葡萄糖轉(zhuǎn)運體缺乏；法-碧病(Fanconi-Bickel disease))。
在某些實施方式中，脂肪酸代謝缺乏可描述為脂肪氧化病或脂質(zhì)貯積病。它們可涉及影響身體氧化脂肪酸以在肌肉、肝臟和其他細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的酶缺乏所導(dǎo)致的一種或多種先天性代謝缺陷。脂肪酸代謝缺乏的例子至少包括輔酶A脫氫酶缺乏；其他輔酶A酶缺乏；肉毒堿相關(guān)疾病；或脂質(zhì)貯積病。輔酶A脫氫酶缺乏的例子至少包括極長鏈?；?輔酶A脫氫酶缺乏(VLCAD)；長鏈3-羥基酰基-輔酶A脫氫酶缺乏(LCHAD)；中鏈酰基-輔酶A脫氫酶缺乏(MCAD)；短鏈?；?輔酶A脫氫酶缺乏(SCAD)；和短鏈L-3-羥基?；?輔酶A脫氫酶缺乏(SCHAD)。其他輔酶A酶缺乏的例子至少包括2，4-二烯酰輔酶A還原酶缺乏；3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA裂合酶缺乏；和丙二酸單酰輔酶A脫羧酶缺乏。肉毒堿相關(guān)缺乏的例子至少包括原發(fā)性肉毒堿缺乏；肉毒堿-酰基肉毒堿轉(zhuǎn)位酶缺乏；肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I缺乏(CPT)；和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶II缺乏(CPT)。脂質(zhì)貯積病的例子包括酸性脂酶疾?。晃譅柭。荒懝檀减コ练e?。桓曛x??；尼曼-皮克病；法布里??；法伯氏病(Farber’s disease)；神經(jīng)節(jié)苷脂貯積??；克拉碧氏病(Krabbédisease)；和異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。其他脂肪酸代謝疾病至少包括線粒體三功能性蛋白質(zhì)缺乏；電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(ETF)脫氫酶缺乏(GAII和MADD)；丹吉爾??；和妊娠急性脂肪肝。線粒體病的例子至少包括進行性外眼肌麻痹(PEO)；糖尿病和耳聾(DAD)；雷伯(Leber)遺傳性視神經(jīng)病(LHON)，線粒體腦肌病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣綜合征(MELAS)；肌陣攣性癲癇癥和蓬毛樣紅纖維(MERRF)；雷氏綜合征(Leigh syndrome)；亞急性硬化性腦??；神經(jīng)病，共濟失調(diào)，視網(wǎng)膜色素變性和下垂(NARP)；卡恩斯-塞爾綜合征(KSS)；肌神經(jīng)源性胃腸腦病(Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy，MNGIE)。
在本發(fā)明的具體方面，代謝疾病是或者患有以下病癥作為其并發(fā)癥之一肥胖、高脂血癥、糖尿病、脂肪肝、高血壓和心血管病。
III.本發(fā)明的示例性組合物 在一個實施方式中，提供了代謝疾病的治療方法，該治療方法包括給予具有以下通式的至少一種化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽和立體異構(gòu)體 A-B-C 其中A，B和C可相同或不同，各自可以是5-、6-或7-元環(huán)，所述環(huán)是雜環(huán)或非雜環(huán)，取代的環(huán)或非取代的環(huán)。
優(yōu)選地，A環(huán)是具有一個雜原子的6元雜環(huán)。A環(huán)可被取代。在優(yōu)選實施方式中，該環(huán)是吡啶環(huán)；更優(yōu)選地，吡啶環(huán)的氮原子相對于B環(huán)位置在4位。最優(yōu)選地，吡啶環(huán)的氮雜原子α位的碳上被正丙基取代。在其他優(yōu)選的實施方式中，A環(huán)上存在1-5個原子的側(cè)鏈，更優(yōu)選地1-5個碳的側(cè)鏈。在其他示例性且非限制性的實施方式中，A環(huán)可以是苯基、吡咯、噻吩、呋喃、嘧啶、異喹啉、喹啉、苯并呋喃、吲哚、噁唑或萘基。
優(yōu)選地，B環(huán)是具有至少兩個雜原子的5-元環(huán)。B環(huán)可被取代。在優(yōu)選實施方式中，B環(huán)是噻唑環(huán)。在其他示例性且非限制性的實施方式中，B環(huán)可以是噁唑、咪唑、異噁唑、咪唑、噻吩、呋喃、嘧啶、吡唑或異噻唑。
優(yōu)選地，C環(huán)是6-元環(huán)，最優(yōu)選苯環(huán)。C環(huán)可被取代。在優(yōu)選實施方式中，C環(huán)被甲基取代。在其他示例性且非限制性的實施方式中，C環(huán)可以是苯基、吡啶、吡咯、噻吩、呋喃、嘧啶、異喹啉、喹啉、苯并呋喃、吲哚、噁唑或萘基。
示例性的化合物如圖14所示。參考圖14的化合物1，正丙基取代的吡啶環(huán)對應(yīng)于通式的A環(huán)，2，4-取代的噻唑環(huán)對應(yīng)于通式的B環(huán)，甲基取代的苯環(huán)對應(yīng)于通式的C環(huán)。
應(yīng)理解，取代可以是A、B和C環(huán)中任何一個的任意位置，任何取代基可以與任何其他取代基相同或者不同。除了圖14所示之外，取代基的非限制性例子包括下組H(即，未取代)；羥基；C1-10烷基；C2-10烯基；C2-10炔基；C3-6環(huán)烷基；芳基；雜芳基；其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團所取代羥基；-(C＝O)Ra；-(C＝O)ORa；-(C＝O)H；-(C＝O)OH；O(CH2)nCOORa其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6環(huán)烷基；芳基；雜芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；單取代的氨基和二取代的氨基；單取代的酰氨基和二取代的酰氨基以及它們的任意組合；-(C＝O)Ra；-(C＝O)ORa；-(C＝O)H；-(C＝O)OH；-O(CH2)nCOORa其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6環(huán)烷基，芳基或雜芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；酰氨基；單取代或二取代的氨基，具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合；其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基任選地被1-5個選自下組的取代基所取代羥基，-(C＝O)Ra，-(C＝O)ORa，-(C＝O)H，-(C＝O)OH，-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6環(huán)烷基，芳基和雜芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；單取代或二取代的氨基，具有一個或多個C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基和它們的任意組合；以及單取代和二取代的酰氨基，具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合；其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基任選地被1-5個選自下組的取代基所取代羥基；-(C＝O)Ra；-(C＝O)ORa；-(C＝O)H；-(C＝O)OH；-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；單取代和二取代的氨基，具有一個或多個C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基和它們的任意組合。
在具體實施方式
中，提供了具有以下通式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體 A-B-C 其中A、B和C相同或不同，各自包括5-、6-或7-元環(huán)，所述環(huán)是雜環(huán)或非雜環(huán)，取代的環(huán)，或非取代的環(huán)， 所述A、B和C中的任一個、任六個或全部三個都未取代或具有一個或多個取代基，任何取代基可與任何其他取代基相同或不同，所述取代基選自下組 a)羥基； b)C1-10烷基； c)C2-10烯基； d)C2-10炔基； e)C3-6環(huán)烷基； f)芳基； g)雜芳基； 所述b)、c)、d)、e)、f)、和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的取代基進一步取代 1)羥基； 2)-(C＝O)Ra； 3)-(C＝O)ORa； 4)-(C＝O)H； 5)-(C＝O)OH； 6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10； 7)鹵素； 8)氰基； 9)羧基； 10)氨基； 11)單取代的氨基； 12)二取代的氨基； 13)酰氨基； 14)單取代的酰氨基； 15)二取代的酰氨基；和 16)它們的任意組合， 2)、3)或6)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基； h)-(C＝O)Ra； i)-(C＝O)ORa； j)-(C＝O)H； k)-(C＝O)OH； l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10， h)、i)或l)中，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基； m)鹵素； n)氰基； o)羧基； p)氨基； q)單取代的氨基； r)二取代的氨基， s)酰氨基； t)單取代的酰氨基；和 u)二取代的酰氨基； 其中所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合， u)中，所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的取代基進一步取代 i)羥基； ii)-(C＝O)Ra； iii)-(C＝O)ORa； iv)-(C＝O)H； v)-(C＝O)OH； vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10， ii)、iii)或vi)中，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基； vii)鹵素； viii)氰基； ix)羧基； x)氨基； xi)單取代的氨基； xii)二取代的氨基； xiii)酰氨基； xiv)單取代的酰氨基； xv)二取代的酰氨基；和 xvi)它們的任意組合。
具體化合物的例子包括2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；2-苯基-4-對甲苯基噻唑；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶；4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑；2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4′-甲基[1，1′-聯(lián)苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸；2-乙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸甲酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯；N-環(huán)己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺酰基苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8-喹啉磺酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2-噻吩磺酰胺。
優(yōu)選的化合物是2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶，N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺。
本文所用術(shù)語“烷基”表示從直鏈或支鏈無環(huán)飽和烴概念性去除一個氫原子所得到的取代的單價基團(即-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-C(CH3)3等)。
本文所用術(shù)語“烯基”表示從含有至少一個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈無環(huán)不飽和烴概念性去除一個氫原子所得到的取代的單價基團(即-CH＝CH2、-CH＝CHCH3、-C＝C(CH3)2、-CH2CH＝CH2等)。
本文所用術(shù)語“炔基”表示從含有至少一個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈無環(huán)不飽和烴概念性去除一個氫原子所得到的取代的單價基團(即-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CCH(CH3)2、-CH2C≡CH等)。
本文所用術(shù)語“芳氧基”表示具有橋接氧原子的芳基，如苯氧基(-OC6H5)或苯甲酰氧基(-OCH2C6H5)?！胺蓟被北硎揪哂袠蚪影饭倌軋F的芳基，例如-NHCH2C6H5?！胺蓟０被北硎揪哂袠蚪吁０坊鶊F的芳基，例如-(C＝O)NHCH2C6H5。
本文所用術(shù)語“亞烷基”表示從直鏈或直鏈無環(huán)飽和烴的同一碳原子概念性去除兩個氫原子所得到的取代的二價基團(即＝CH2，＝CHCH3，＝C(CH3)2等)。
本文所用術(shù)語“環(huán)烷基”表示從飽和單環(huán)烴概念性去除一個氫原子所得到的取代的單價基團(即，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基)。
本文所用術(shù)語“芳基”表示從單環(huán)或雙環(huán)芳族烴概念性去除一個氫原子所得到的取代的單價基團。芳基的例子有苯基、茚基和萘基。
本文所用術(shù)語“雜芳基”表示從含有1、2、3或4個選自N、O或S的雜原子的單環(huán)或雙環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)概念性去除一個氫原子所得到的取代的單價基團。雜芳基的例子包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基，異噁唑基，噻唑基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，苯并咪唑基，吲哚基和嘌呤基。雜芳基取代基可連接于碳原子或通過雜原子連接。單環(huán)雜芳基的例子包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、異噁噁唑基、噻唑基和吡啶基。雙環(huán)雜芳基的例子包括嘧啶基、吡嗪基、苯并咪唑基、吲哚基和嘌呤基。單個環(huán)可具有5或6個原子。因此，這包括4元單環(huán)雜芳基和5-元單環(huán)雜芳基。也包括具有一個5-元環(huán)和一個6-元環(huán)的雙環(huán)雜芳基和具有2個6-元環(huán)的雙環(huán)雜芳基。
術(shù)語“鹵素”包括碘、溴、氯和氟。
術(shù)語“取代的”應(yīng)理解為包括取代基的多重取代度?；瘜W(xué)基團或部分上的原子價被除氫之外的原子或官能團滿足時可發(fā)生取代。如果是多重取代，取代的化合物可被一個或多個所述或聲稱的取代基部分以單數(shù)或復(fù)數(shù)形式獨立地取代。獨立取代表示所述(兩個或更多個)取代基可以相同或不同。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”表示具有母體化合物所需的藥理學(xué)活性的藥學(xué)上可接受的鹽。這種鹽包括(1)酸加成鹽，與無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或與有機酸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或(2)母體化合物中存在的酸性質(zhì)子被金屬離子如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子取代；或是與有機堿如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等配位。
術(shù)語“立體異構(gòu)體”表示原子連接性與一種或多種其他分子相同但原子空間排列不同的異構(gòu)分子。該定義包括對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、順式異構(gòu)體、反式異構(gòu)體、構(gòu)象異構(gòu)體。
術(shù)語“未取代”表示化學(xué)基團或部分上的所有原子價被氫飽和。
本發(fā)明還包括本文所述化合物受保護的衍生物。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包含諸如羥基或羰基的基團時，這基團可用適當(dāng)?shù)谋Ｗo基進行保護。合適的保護基的綜合列表參見T.W.Greene，《有機合成中的保護基》(ProtectiveGroups in Organic Synthesi)，約翰威利父子公司(John Wiley & Son，Inc.)1981，其內(nèi)容被納入本文作為參考。本發(fā)明化合物受保護的衍生物可通過本領(lǐng)域所熟知的方法進行制備。
本發(fā)明化合物可具有不對稱中心，手性軸和手性平面，形成外消旋物、外消旋混合物和單獨的非對映異構(gòu)體，及其所有可能的異構(gòu)體和混合物，包括光學(xué)異構(gòu)體，都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，本文所述的化合物可以互變異構(gòu)體形式存在，兩種互變異構(gòu)體形式都涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即時只描述了一致互變異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。
IV.SREBP 在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，本發(fā)明的組合物靶向甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)途徑的一種或多種成員。該途徑涉及膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的蛋白水解釋放，在具體方面，促進SREBP從胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運。在細(xì)胞核中，SREBP與編碼脂質(zhì)制備相關(guān)酶的基因的調(diào)控區(qū)域中存在的甾醇調(diào)控元件(SRE)結(jié)合。SREBP與DNA結(jié)合后，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，例如上調(diào)。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的膜和核被膜通過蛋白中間的兩個跨膜螺旋容納SREBP前體蛋白。膜中前體蛋白的發(fā)夾取向使得氨基端轉(zhuǎn)錄因子區(qū)和羧基端調(diào)控區(qū)都面向胞漿。蛋白裂解釋放起效并釋放轉(zhuǎn)錄的活性氨基端區(qū)域，前體蛋白的裂解在位點-1蛋白酶(S1P)和位點-2蛋白酶(S2P)進行。裂解蛋白的激活通過SREBP裂解激活蛋白(SCAP)進行，通過其各自的羧基端區(qū)域之間的相互作用與SREBP形成復(fù)合物。
SREBP三種不同的亞型(SREBP-1a、-1c和-2)在哺乳動物基因組的兩個單獨的SREBP基因中存在。SREBP-1a和-1c的區(qū)別在于其第一外顯子，利用SREBP-1的不同轉(zhuǎn)錄起始位點。認(rèn)為SREBP-1與脂肪酸合成的基因調(diào)節(jié)有關(guān)，而SREBP-2調(diào)節(jié)膽固醇代謝的基因。
一般，認(rèn)為SREBP是含有甾醇調(diào)控元件(SRE)的靶基因的激活劑(Shimano 2001)。這些基因至少包括1)脂肪酸代謝途徑，例如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合酶、硬酯酰輔酶A脫羧酶-1和2蘋果酸酶、PPARγ、乙酰輔酶A合酶、ATP檸檬酸裂解酶、?；?輔酶A結(jié)合蛋白；2)膽固醇合成，例如HMG-CoA還原酶、LDL受體、HMG-CoA合酶、法呢基-二磷酸合酶、角鯊?fù)楹厦福?)甘油三酯合成，例如甘油-3磷酸?；D(zhuǎn)移酶；和4)血漿脂蛋白代謝，例如脂蛋白脂肪酶和HDL受體。已報道，SREBP通過置換這些基因的特異性正調(diào)節(jié)劑可用作其他含SRE的基因的阻抑物(Shimano 2001)。這些基因，例如微粒體轉(zhuǎn)移蛋白和小窩蛋白參與細(xì)胞膽固醇含量的調(diào)節(jié)。
V.藥物制劑 本發(fā)明藥物組合物包含溶解或分散在藥學(xué)上可接受的載體中的有效量的一種或多種本發(fā)明組合物(適當(dāng)時也包含其他試劑)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”表示適當(dāng)給予動物(例如人)不會產(chǎn)生副作用、過敏或其他不良反應(yīng)的分子實體和組合物。根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，含有至少一種法圖他汀A類似物或衍生物或其他活性成分的藥物組合物的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，參見雷明登藥物科學(xué)(Remington′s Pharmaceutical Science)，第18版，馬克印刷公司(MackPrinting Company)，1990，其內(nèi)容被納入本文作為參考。而且，對于動物(例如人)給藥，應(yīng)理解制劑應(yīng)符合無菌性、致熱原性、廣泛安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)，如FDA生物標(biāo)準(zhǔn)所要求的那樣。
如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料、類似物質(zhì)以及它們的組合，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知(參見例如，雷明登藥物科學(xué)，第18版，馬克印刷公司，1990，第1289-1329頁，納入本文作為參考)。只要排除任何與活性成分不相容的常規(guī)載體，其在藥物組合物中的應(yīng)用有待考慮。
根據(jù)是以固體、液體或是氣溶膠形式給藥，以及對于該給藥途徑(例如注射)是否需要滅菌，法圖他汀A類似物或衍生物可包含不同類型的載體。本發(fā)明可以靜脈內(nèi)給藥、皮內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、外用、肌內(nèi)、皮下、粘膜、口服、外用、局部、吸入(如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接局部灌注浴靶細(xì)胞、經(jīng)導(dǎo)管、經(jīng)灌洗、乳霜、液體組合物(如脂質(zhì)體)，或通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他方法或上述方法的任意組合進行給藥(參見例如，雷明登藥物科學(xué)，第18版，馬克印刷公司，1990，納入本文作為參考)。
可將法圖他汀A類似物或衍生物配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質(zhì)性組合物的游離氨基形成的鹽，或與無機酸，例如鹽酸或磷酸，或有機酸，例如醋酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽可源自無機堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機堿如異丙胺，三甲胺，組氨酸或普魯卡因。配制后，將溶液以與劑型相容的方式和治療有效量進行給予。制劑可容易地以各種劑型進行給藥，例如配制用于胃腸外給藥，例如可注射溶液，或遞送至肺的氣溶膠，或配制用于消化給藥，例如釋藥膠囊等。
進一步根據(jù)本發(fā)明，適用于給藥的本發(fā)明組合物是以含或不含惰性稀釋劑的藥學(xué)上可接受的載體的形式提供。載體應(yīng)可同化，包括液體、半固體(即糊劑)或固體載體。雖然任何常規(guī)介質(zhì)、試劑、稀釋劑或載體對接受者有害或者對本文所包含的組合物的治療有效性有害，其用于實施本發(fā)明方法的給藥組合物形式的應(yīng)用是合適的。載體或稀釋劑的離子包括脂肪、油、水、鹽溶液、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、粘合劑、填充劑等，或它們的組合。組合物還可包含各種抗氧化劑以延緩一種或多種組分的氧化。此外，微生物的預(yù)防作用可通過防腐劑，例如各種抗菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，包括但不限于對羥基苯甲酸酯類(如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它們的組合。
根據(jù)本發(fā)明，以任何常規(guī)和實施方式將組合物與載體組合，例如通過溶液、混懸液、乳化、混合、包封、吸收等方式。這些方法可本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，將組合物與半固體或固體載體充分組合或混合?；旌峡梢匀魏纬Ｒ?guī)方式進行，例如研磨。混合過程中也可加入穩(wěn)定劑以保護組合物避免治療活性損失，即在胃中變性。組合物中可使用的穩(wěn)定劑的例子包括緩沖液、氨基酸如甘氨酸和賴氨酸、糖如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露醇等。
在其他實施方式中，本發(fā)明考慮使用包含法圖他汀A類似物或衍生物、一種或多種脂質(zhì)和水性溶劑的藥物脂質(zhì)運載體組合物。如本文所用，術(shù)語“脂質(zhì)”定義為包括在水中特征性不溶并且可用有機溶劑提取的廣泛物質(zhì)中的任一種。該廣泛類型的化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如術(shù)語“脂質(zhì)”在這里所用，并不限于任何具體的結(jié)構(gòu)。例子包括含有長鏈脂肪烴的化合物及其衍生物。脂質(zhì)可以是天然產(chǎn)生的或合成的(即人為設(shè)計或制備)。然而，脂質(zhì)通常是一種生物物質(zhì)。生物脂質(zhì)是本領(lǐng)域所熟知的，包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜、溶血脂質(zhì)、鞘糖脂、糖脂、硫脂(sulphatide)、含有醚和酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)和聚合脂質(zhì)、以及它們的組合。當(dāng)然，本發(fā)明的組合物和方法也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的除本文具體描述之外的化合物。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉用于將組合物分散到脂質(zhì)運載體中的技術(shù)范圍。例如，法圖他汀A類似物或衍生物可分散到含脂質(zhì)的溶液中，用脂質(zhì)溶解，用脂質(zhì)乳化，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)組合，共價結(jié)合于脂質(zhì)，作為助懸劑包含在脂質(zhì)中，用膠束或脂質(zhì)體包封或復(fù)合，或者通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方式與脂質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)合。分散體可能導(dǎo)致或不導(dǎo)致脂質(zhì)體的形成。
給予動物對象的本發(fā)明組合物的實際劑量可通過物理和生理學(xué)因素確定，例如體重、疾病嚴(yán)重性、治療疾病的類型，過去或并行的治療干預(yù)手段，對象特發(fā)性以及給藥途徑。根據(jù)給藥劑量和途徑，優(yōu)選的劑量和/或有效量的給藥次數(shù)可根據(jù)對象的響應(yīng)而變化。在任何事件中，負(fù)責(zé)給藥的人員將確定組合物中活性成分的濃度以及個體對象的適當(dāng)劑量。
在某些實施方式中，藥物組合物可包含例如至少約0.1％的活性化合物。在其它實施方式中，活性化合物的含量可約為2-75重量％，或者約25-60重量％，以及其中的任意范圍。當(dāng)然，每個治療有效組合物中活性化合物的量可制備成在化合物的任何給定單位劑量中可獲得適當(dāng)劑量。諸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、給藥途徑、產(chǎn)品儲存期等因素以及其他藥理學(xué)考慮因素是制備這種藥物制劑的領(lǐng)域中技術(shù)人員所考慮的，這樣，需要各種劑量和治療方案。
在其他非限制性的例子中，劑量也可以是每次給藥約1微克/千克/體重、約5微克/千克/體重、約10微克/千克/體重、約50微克/千克/體重、約100微克/千克/體重、約200微克/千克/體重、約350微克/千克/體重、約500微克/千克/體重、約1毫克/千克/體重、約5毫克/千克/體重、約10毫克/千克/體重、約50毫克/千克/體重、約100毫克/千克/體重、約200毫克/千克/體重、約350毫克/千克/體重、約500毫克/千克/體重、到約1000毫克/千克/體重或更高，以及可推導(dǎo)出的任何范圍。在從上述數(shù)字推導(dǎo)出的范圍的非限制性例子中，基于上述數(shù)字，可給予約5毫克/千克/體重到約100毫克/千克/體重，約5微克/千克/體重到約500毫克/千克/體重等。
A.消化組合物和制劑 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，可將法圖他汀A類似物或衍生物配置成經(jīng)消化途徑給藥。消化途徑包括組合物與消化道直接接觸的所有可能的給藥途徑。具體說，本文所述的藥物組合物可口服、含服、經(jīng)直腸或舌下給藥。這樣，這些組合物可用惰性稀釋劑或用可同化的食用載體配制，或者它們可包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或者它們可壓制成片，或者它們可直接摻入飲食食物中。
在某些實施方式中，活性化合物可摻入賦形劑中，以可攝取片劑、口頰片、含片、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、紙囊劑等形式使用(Mathiowitz等，1997；Hwang等，1998；美國專利5,641,515；5,580,579；和5,792,451，其內(nèi)容各自被具體納入本文作為參考)。片劑、含片、丸劑、膠囊等也可包含以下物質(zhì)粘合劑，例如黃芪樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠或其組合；賦形劑，例如磷酸二鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組合；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸或其組合；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；甜味劑，例如蔗糖、乳糖、糖精或其組合；調(diào)味劑，例如薄荷、冬青油、櫻桃香料、橘子香料等。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時，除上述類型的材料外，還可包含液體載體。各種其他材料可以包衣形式存在或改變劑量單位的物理形式。例如，可用蟲膠、糖或兩者對片劑、丸劑或膠囊進行包衣。當(dāng)劑量形式是膠囊時，除上述類型的材料外，還可包含載體如液體載體?？蓪γ髂z膠囊、片劑或丸劑進行腸包衣。腸包衣可防止組合物在pH為酸性的胃或腸道上部的變性。參見例如，美國專利5,629,001。到達小腸后，其中的堿性pH溶解包衣，使組合物釋放并被特定細(xì)胞吸收，例如上皮腸細(xì)胞和派伊爾氏淋巴集結(jié)M細(xì)胞。酏劑糖漿劑可包含活性化合物蔗糖作為甜味劑，對羥基苯甲酸甲酯和丙酯作為防腐劑，染料和調(diào)味劑，例如櫻桃或橘子香料。當(dāng)然，制備任何劑量單位形式中使用的任何材料應(yīng)藥學(xué)純并且在所用劑量下基本上無毒。此外，活性化合物可摻入緩釋制劑或配方中。
對于口服給藥，本發(fā)明的組合物可任選地結(jié)合一種或多種賦形劑，形成漱口劑、牙膏、口頰片、口服噴霧劑、或舌下口服給藥制劑。例如，將所需量的活性成分摻入合適的溶劑如硼酸鈉溶液(多貝耳氏液)中制備漱口劑?；蛘?，活性成分可摻入口服溶液如含硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的溶液中，或分散到牙膏中，或以治療有效量加入包含水、粘合劑、磨料、調(diào)味劑、發(fā)泡劑和致濕劑的組合物中。或者，可將組合物配制成置于舌下或在口腔中溶解的片劑或溶液形式。
適用于其他消化給藥模式的其他制劑包括栓劑。栓劑是各種重量和形狀的固體劑型，通常含藥，用于插入直腸。插入后，栓劑在腔液中軟化、熔化或溶解。通常，對栓劑而言，傳統(tǒng)的載體可包括例如，聚亞烷基二醇、甘油三酯或其組合。在某些實施方式中，栓劑可由包含例如約0.5-10％，優(yōu)選約1-2％活性成分的混合物形成。
B.胃腸外組合物和制劑 在其他實施方式中，法圖他汀A類似物或衍生物可通過胃腸外途徑給予。如本文所用，術(shù)語“胃腸外”包括繞過消化道的途徑。具體說，本文所述藥物組合物的給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)。美國專利6,537,514，6,613,308，5,466,468，5,543,158；5,641,515；和5,399,363(各自的內(nèi)容被納入本文作為參考)。
可以在適當(dāng)混入表面活性劑如羥丙基纖維素的水中制備游離堿或藥理學(xué)上可接受的鹽形式的活性化合物的溶液。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體。在普通的存儲和使用調(diào)節(jié)性，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長。適用于注射使用的藥物形式包括無菌水性溶液或分散體以及用無菌注射用溶液或分散體臨用配制的無菌粉末(美國專利5,466,468，其內(nèi)容被特別納入本文作為參考)。在所用情況下，制劑必須無菌，并且必須是在一定程度上可流動以便于注射。它必須在制造和儲存條件下穩(wěn)定，必須能夠?qū)刮⑸?例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(即，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們合適的化合物、和/或植物油。例如，使用涂層如卵磷脂，對于分散體則通過維持所需的粒度，以及使用表面活性劑，可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。防止微生物的作用可通過各種抗菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如，對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物的延遲吸收可通過使用延遲吸收試劑如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。
對于水性溶液的胃腸外給藥，必要時溶液必須適當(dāng)緩沖并用足夠的鹽水或葡萄糖先使液體稀釋劑等滲。這些具體的水性溶液尤其施用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。在這方面，可使用的無菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容已知的。例如，可將一個劑量溶解在1毫升NaCl等滲溶液中，加入1000毫升皮下輸液中，或者在所建議的適當(dāng)輸注部位進行注射(參見例如，″雷明登藥物科學(xué)″，第15版，第1035-1038頁和第1570-1580頁)。根據(jù)所需治療的對象的狀態(tài)，需要對劑量進行一些改變。在任何事件中，負(fù)責(zé)給藥的人將絕決定個體對象的適當(dāng)劑量。而且，對于人體給藥，制劑應(yīng)符合無菌性、致熱原性、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)，如FDA生物標(biāo)準(zhǔn)所要求的那樣。
無菌注射用溶液的制備包括將所需量的活性化合物結(jié)合到適當(dāng)溶劑中，需要時結(jié)合有上述各種其他成分，然后過濾除菌。通常，分散體的制備包括將各種無菌活性成分結(jié)合到含有基本分散介質(zhì)和上述所需的其他成分的無菌運載體中。對于制備無菌注射用溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是采用真空干燥和凍干技術(shù)形成活性劑加選自上述無菌過濾溶液的任何其他所需添加劑的粉末。粉末組合物與含有或不含穩(wěn)定劑的液體載體，例如水或鹽水溶液組合。
C.各種藥物組合物和制劑 在本發(fā)明其他優(yōu)選的實施方式中，可將活性化合物法圖他汀A類似物或衍生物配制成經(jīng)各種各樣的途徑給藥，例如外用(即透皮)給藥、粘膜給藥(鼻內(nèi)、陰道等)和/或吸入給藥。
外用給予的藥物組合物可包括配制成含藥應(yīng)用的活性化合物，例如軟膏、糊劑、乳膏或粉末。軟膏包括所有外用施加的油脂、吸附、乳劑和水溶性基質(zhì)的組合物，而乳膏和洗劑是僅包含乳劑基質(zhì)的組合物。外用給予的藥物可包含滲透促進劑以利于活性成分經(jīng)皮膚的吸收。合適地滲透促進劑包括甘油，醇，烷基甲基亞砜，吡咯烷酮和月桂氮

酮。外用施加的組合物的可能的基質(zhì)包括聚乙二醇，羊毛脂，冷霜和礦脂以及任何其他合適的吸收、乳劑或水溶性軟膏基質(zhì)。需要時，外用制劑可還包含乳化劑、膠凝劑和抗微生物防腐劑以保存活性成分并提供均一的混合物。本發(fā)明透皮給藥也可包括采用“貼片”。例如，貼片可以在固定的時間范圍內(nèi)以預(yù)定的速率和連續(xù)方式提供一種或多種活性物質(zhì)。
在某些實施方式中，藥物組合物可通過滴眼劑、鼻腔噴霧劑、吸入劑和/或其他氣溶膠遞送運載體的形式遞送。通過鼻腔氣霧劑使組合物直接遞送至肺的方法已在美國專利5,756,353和5,804,212中描述(各自的內(nèi)容被納入本文作為參考)。類似地，用鼻內(nèi)微粒樹膠(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美國專利5,725,871，其內(nèi)容被納入本文作為參考)遞送藥物也是藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。類似地，以聚四氟乙烯載體基質(zhì)的形式經(jīng)粘膜藥物遞送在美國專利5,780,045中描述(其內(nèi)容被納入本文作為參考)。
術(shù)語氣溶膠指分散在液化或加壓空氣推進劑中的液體顆粒的細(xì)分固體的膠體系統(tǒng)。本發(fā)明用于吸入的典型的氣溶膠包括活性成分在液體推進劑中或在液體推進劑和適當(dāng)溶劑的混合物中的混懸劑。合適的推進劑包括烴和烴醚。合適的容器取決于推進劑的壓力要求。氣溶膠的給予將根據(jù)對象年齡、體重以及癥狀的嚴(yán)重性和反應(yīng)而變化。
IV.組合療法 為了提高本發(fā)明組合物的有效性，向患有代謝疾病的個體輸送其他療法。例如，可給予肥胖個體本發(fā)明組合物以及治療肥胖的其他療法。其他肥胖療法包括飲食療法、物理療法(運動)、藥物療法、手術(shù)、行為學(xué)療法等。示例性的藥物療法包括例如賽尼可(Xenical)、奧利司他

苯丁胺和西布曲明

示例性的手術(shù)包括吸脂和胃旁路術(shù)。
對于糖尿病患者，例如，示例性的其他治療化合物包括以下一種或多種奧克拓(Actos)(吡格列酮)；ACTOSPlus Met；阿美里爾(Amaryl)(格列美脲)；阿凡達里(Avandaryl)(文迪雅+格列美脲)；文迪雅(Avandia)(羅格列酮)；阿凡達美(Avandamet)(馬來酸羅格列酮和鹽酸二甲雙胍)；拜他普(Byettap)；度他克(Duetact)(鹽酸吡格列酮和格列美脲)；蓋爾弗(Galvus)(維他里迪(Vildagliptin))；格列吡嗪(磺酰脲(Sulfonlyurea))；格華止(二甲雙胍)；格列美脲；格魯凡絲(Glucovance)(格列本脲/二甲雙胍)；瑞易寧(Glucotrol XL)(格列吡嗪延遲釋放)；格列本脲；格里塞(Glyset)(米格列醇)糖苷酶抑制劑；佳紐維亞(Januvia)(磷酸西塔里迪(sitagliptin phosphate))；麥塔里普(Metaglip)(格列吡嗪+二甲雙胍)；二甲雙胍-雙胍；普拉迪(Prandin)(瑞格列奈)；普里考(Precose)(阿卡波糖)；瑞祖林(Rezulin)(曲格列酮)；斯塔里克(Starlix)(那格列奈)。其他糖尿病療法包括改善飲食和運動。
V.示例性的代謝疾病治療的測量 在本發(fā)明的具體方面，給予個體一種或多種本發(fā)明組合物，并評價個體至少一種代謝疾病癥狀的改善。例如，在代謝疾病是肥胖的具體實施方式
中，確定用本發(fā)明一種或多種組合物治療期間和/或治療后肥胖的改善。肥胖的改善可通過任何標(biāo)準(zhǔn)方式進行測量，但在具體方面，通過體重測量、體重指數(shù)(BMI)測量、和/或身體局部尺寸測量(如腰圍測量)等確定肥胖的改善。計算BMI的示例性方法包括體重(千克)除以高度(米)的平方(體重[kg]高度[m]2)。認(rèn)為BMI等于或大于30是肥胖，BMI在25到29.9之間為超重。
在本發(fā)明的其他方面，測定糖尿病患者在給予本發(fā)明療法后的改善。在一個具體實施方式
中，通過血試驗來監(jiān)測糖尿病。例如，血試驗可測定化學(xué)物質(zhì)A1C。血糖越高，A1C水平越高。美國糖尿病協(xié)會推薦糖尿病患者的A1C維持在7.0％以下以減少糖尿病相關(guān)并發(fā)癥。(美國臨床內(nèi)分泌學(xué)協(xié)會推薦等于或小于6.5％)。
在一些情況下，例如通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，測定膽固醇(包括HDL和/或LDL膽固醇)和/或甘油三酯。在具體情況下，例如通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法繪制禁食脂蛋白分布圖。
VI.本發(fā)明的藥盒 任何本文所述的組合物可包含在藥盒中。在非限制性例子中，藥盒包括適用于治療和/或防止一種或多種代謝疾病的組合物。
在本發(fā)明的其它實施方式中，藥盒包括一種或多種用于從對象取樣的器械。該器械可以是拭子，例如棉花拭子、牙簽、解剖刀、刮勺、注射器等器械中的一種或多種。
在另一實施方式中，藥盒中包含其他化合物，例如用于治療和/或防止代謝疾病的其他化合物。藥盒中提供的任何組合物可以在水性介質(zhì)中或以凍干形式包裝。藥盒的容器通常包括至少一種管形瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器，可將組分置于其中，優(yōu)選經(jīng)適當(dāng)?shù)确?。藥盒中存在一種以上的組分時，通常藥盒還包括第二、第三或其他容器，這些額外的組分可分別置于其中。
實施例 下面的實施例是為了闡述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，下面的實施例中描述的技術(shù)逮捕了本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實施中運行良好的技術(shù)，因而被認(rèn)為構(gòu)成其實施的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對所述具體實施方式
進行許多改變，仍然獲得類似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例1 法圖他汀A降低血清效應(yīng)基因的表達 藥物處理和未處理細(xì)胞的基因表達分布比較可揭示受法圖他汀A影響的特定分子途徑。用法圖他汀A或僅DMSO處理DU145細(xì)胞，提取的mRNA樣品通過Affimetrix DNA微陣列進行分析，得到33,000種基因的圖譜(表1)。

結(jié)果表明，被法圖他汀A下調(diào)(＜0.7倍)的基因中55％是已知或很可能是由甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)控制的，包括LDL受體、HMG-CoA還原酶和脂肪酸合酶(Horton等，2003)。RT-PCR實驗了證實代表性的SREBP-效應(yīng)基因的下調(diào)(圖1B和1C)。這些結(jié)果表明，法圖他汀A是SREBP途徑的選擇性抑制劑。
為了說明法圖他汀A削弱SREBP的功能，在存在或不存在法圖他汀A時測定HEK293細(xì)胞中內(nèi)源性SREBP激活SREBP-效應(yīng)性報道基因的轉(zhuǎn)錄的能力(圖2AB)。法圖他汀A以濃度依賴性方式降低報道基因的激活，其中熒光素酶的表達受三個甾醇調(diào)控元件的重復(fù)單元的控制。相反，法圖他汀A不能削弱SREBP-1的外源性表達成熟形式(氨基酸1-500)激活報道基因活性的能力(圖2C)。這些結(jié)果表明，法圖他汀A能選擇性阻斷細(xì)胞中SREBP的激活過程。
實施例2 法圖他汀A阻斷SREBP的蛋白水解激活 SREBP經(jīng)蛋白水解加工而易位到核內(nèi)，在核中激活脂肪生成基因的轉(zhuǎn)錄(Brown和Goldstein，1997)。為了鑒定法圖他汀A是否影響SREBP的蛋白水解激活，用針對SREBP-1 NH2末端的抗體，通過Western印跡分析用法圖他汀A處理的DU145細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物(圖3A)。法圖他汀A能夠以劑量依賴性方式降低SREBP-1的68KDa成熟形式的量，而125KDa前體形式的量增加。用針對COOH末端的抗體分析SREBP-2得到類似結(jié)果(圖3B)。這些結(jié)果表明，法圖他汀A能夠直接或間接削弱兩種SREBP同種型的蛋白水解激活。
抑制SREBP的蛋白水解激活作用可能損害SREBP的核易位。用針對SREBP-1NH2末端的抗體，通過免疫熒光顯微鏡分析法圖他汀A對SREBP-1亞細(xì)胞定位的影響。僅用DMSO處理細(xì)胞時，在無血清(無脂肪)培養(yǎng)基中，SREBP-1幾乎排他性地定位在核中(圖3C-3E)。相反，用法圖他汀A處理細(xì)胞時，核中SREBP-1的免疫熒光降低而核外相應(yīng)增加(圖3F-3H)，表明法圖他汀A能夠抑制SREBP-1的核定位。
實施例3 通過敲減SREBP-1確認(rèn)法圖他汀表型 法圖他汀A在培養(yǎng)細(xì)胞中導(dǎo)致兩種表型(i)3T3-L1細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成的抑制和(ii)DU145前列腺癌細(xì)胞血清非依賴性生長的阻抑(Choi等，2003)。第一種表型與我們得出的結(jié)論完全一致，即因為SREBP-1在脂肪形成中的已知作用，法圖他汀A是SREBP-1的阻斷劑(Tontonoz等，1993；Kim和Spiegelman，1996)。為了證實在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)染SREBP-1特異性小干擾RNA(siRNA)表達載體導(dǎo)致3T3-L1細(xì)胞中SREBP-1表達的沉默(圖4G)，檢測對胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成的沉默作用。正如預(yù)期，敲減SREBP-1表達完全阻斷了3T3-L1細(xì)胞中油滴的形成(圖4D和4F，克隆1和2)，而用空白載體(neo)轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞表現(xiàn)出與親代3T3-L1細(xì)胞一樣多的脂肪累積(圖4B)。這些結(jié)果表明，3T3-L1細(xì)胞中法圖他汀A-誘導(dǎo)表型是通過抑制SREBP-1介導(dǎo)的。
為了測試法圖他汀A對SREBP-1的抑制是否介導(dǎo)DU145細(xì)胞中血清非依賴性生長的阻抑作用，類似地通過轉(zhuǎn)染SREBP-1-特異性siRNA的表達載體使DU145細(xì)胞中SREBP-1表達沉默(圖5B)。用空白載體(neo)轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞在血清或IGF1的存在下生長，正如親代DU145細(xì)胞那樣。相反，SREBP-1表達沉默的敲減細(xì)胞(克隆1和2)表現(xiàn)為血清非依賴性IGF1-驅(qū)動的生長降低，而對其依賴血清的生長影響極少(圖5A)。
血清非依賴性生長中對SREBP-1的需求可能是因為無血清培養(yǎng)基中外源性脂肪源的缺乏。當(dāng)血清中不存在外源性脂肪酸時，細(xì)胞需要合成膜構(gòu)建模塊脂肪酸和膽固醇以維持細(xì)胞生長。為了測試脂肪酸在細(xì)胞生長中的重要性，監(jiān)測無脂肪血清培養(yǎng)基中SREBP-1敲減細(xì)胞的生長(圖5A)。SREBP-1沉默降低細(xì)胞在無脂肪培養(yǎng)基中的生長和無血清含IGF1-培養(yǎng)基中一樣多。這些結(jié)果表明，法圖他汀A通過抑制SREBP-1阻斷癌細(xì)胞血清非依賴性生長。
實施例4 法圖他汀A減輕小鼠體重、降低其膽固醇和葡萄糖水平并下調(diào)脂肪生成酶 法圖他汀A類似藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)促使發(fā)明者探索其抑制完整動物肝臟中的SREBP-1的能力。檢測了在長時間禁食(48小時)，然后再給予無脂肪高糖飲食48小時的脂肪生成條件下，法圖他汀A對肝SREBP-1的作用。以30毫克/千克/天的劑量小鼠腹膜內(nèi)注射法圖他汀持續(xù)5天，從48小時禁食階段的前一天開始。禁食48小時后，相對于對照組，處理組體重減輕更多(6.12±0.6克/小鼠，而對照組為4.9±0.3克/小鼠；p＝0.01)(圖6A)。處理期間未觀察到食物攝取減少或明顯毒性(圖6B)。有趣的是，重新給予無脂肪高糖飲食48小時后，法圖他汀A-處理小鼠的血清中出現(xiàn)葡萄糖水平降低趨勢(110±23mg/dl，而對照是137±14mg/dl；P＝0.06)和膽固醇(93±20mg/dl，而對照是120±19mg/dl；P＝0.12)(圖6C)。處理組小鼠中HDL和LDL均降低。然而，LDL水平的降低似乎更顯著(16±5，相對于30±6mg/d1)(圖6C)。
通過Western印跡檢測肝臟提取物中SREBP-1的表達水平。與細(xì)胞培養(yǎng)物的結(jié)果一致，用法圖他汀A處理的小鼠肝臟提取物中SREBP-1的68KDa成熟形式的量降低，而125KDa前體形式的量增加(圖6D)。處理后還測定脂肪酸合酶(FAS)的肝表達，其中脂肪酸合酶(FAS)是一種代表性的SREBP-1-響應(yīng)性脂肪生成酶(Boizard等，1998)。肝臟提取物的Western印跡分析表明，法圖他汀A處理導(dǎo)致FAS的表達水平降低最高達30％(圖6E)。與表達減少相一致，提取物中的酶活性也相應(yīng)地降低(圖6F)。和FAS觀察到的結(jié)果相同，肝臟提取物中也受到SREBP-1調(diào)控的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的活性降低(圖6G)。這些結(jié)果表明，和培養(yǎng)細(xì)胞中一樣，法圖他汀A阻斷了小鼠肝臟中SREBP-1的激活。
另一組正常飲食的小鼠較長時間的處理(2周)導(dǎo)致體重減輕10％，而對照組的體重?zé)o變化(圖7AB)。兩組間食物攝取類似(處理組和對照組分別為3.8和3.5g/小鼠/天)。與禁食/重新給予無脂肪飲食的小鼠中觀察到的結(jié)果一致，正常飲食的小鼠的血中表現(xiàn)為顯著較低的葡萄糖水平和較低甘油三酯(TG)和膽固醇水平的趨勢(圖7C)。FAS活性及其蛋白質(zhì)水平也降低約30％(圖7D和7E)。
實施例5 本發(fā)明的意義 已證明生物活性小分子是探索復(fù)雜細(xì)胞過程(包括代謝途徑)的有價值工具。脂肪穩(wěn)態(tài)和胰島素作用的關(guān)鍵調(diào)控子是SREBP轉(zhuǎn)錄因子家族(Brown和Goldstein，1997)。發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)SREBP功能的小分子可用于治療代謝疾病，可用作進一步理解疾病分子機制的工具。我們基于細(xì)胞和動物的研究數(shù)據(jù)提示，法圖他汀A通過下調(diào)核中成熟SREBP-1形式的量能夠降低脂肪生成基因的表達。據(jù)本發(fā)明者所知，法圖他汀A是能夠在培養(yǎng)細(xì)胞和小鼠肝臟中抑制SREBP蛋白水解激活的第一種非甾醇樣合成分子。
葛蘭素史克(GlaxoSmithKline)的一個小組報道了能夠激活SREBP-1和-2的小分子(Grand-Perret等，2001)。這些降低LDL的分子通過刺激SREBP的蛋白水解激活而上調(diào)LDL受體的表達。雖然作用的分子機制尚未完全明了，但數(shù)據(jù)提示SCAP是該分子的主要靶點。與這些分子不同，法圖他汀A抑制SREBP的激活并下調(diào)SREBP-效應(yīng)基因，包括LDL受體基因的表達(表1)。
似乎SREBP-1和-2的激活在體內(nèi)受到不同的調(diào)控(Rader，2001；Sheng等，1995)。因此，在體內(nèi)條件下，有可能開發(fā)選擇性抑制SREBP-1或-2的小分子。不幸的是，因為目前沒有適合免疫染色的針對人SREBP-2的NH2-末端片段的抗體，法圖他汀A對SREBP-2核定位的影響的研究有限。雖然法圖他汀A確定能阻斷培養(yǎng)細(xì)胞和小鼠肝臟中SREBP-1的激活，關(guān)于對SREBP-2的影響的結(jié)論仍需進一步探索。
法圖他汀A動物試驗的數(shù)據(jù)與細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果一致。已報道，響應(yīng)禁食后重新給予低脂高糖飲食，催化脂肪生成關(guān)鍵步驟的ACC和FA的mRNA增加(Liang等，2002)。ACC和FAS表達的增加取決于核SREBP，尤其是SREBP-1，而由單獨基因編碼的SREBP-2參與激活膽固醇生物合成中的基因。在重新給予無脂飲食的條件下，用法圖他汀A處理的小鼠的肝臟提取物中，成熟SREBP-1形式的水平顯著較低而其前體形式的水平較高(圖6)。另一方面，正如預(yù)期，對照組的肝臟提取物中，成熟形式的水平高于前體形式(Horton等，1998)。有趣的是，兩種形式的總量似乎無變化，唯一的差異在與核(成熟)和胞漿(前體)間的分布(圖6)。這些數(shù)據(jù)表明，法圖他汀A可能不改變SREBP-1的表達水平，而是提高前體切割過程，導(dǎo)致其量的降低以及成熟活性形式的增加。使用缺乏SCAP的小鼠進行實驗已證明脂肪合成中SREBP-1切割的重要性在重新飲食條件下，小鼠肝臟不能誘導(dǎo)ACC和FAS的表達(Liang等，2002)。
為了評價核SREBP-1水平降低的生理學(xué)意義，測定ACC和FAS的水平和活性。法圖他汀A處理導(dǎo)致肝臟提取物中它們的活性發(fā)生下調(diào)(圖6和7)。該結(jié)果與SREBP-1作為脂肪酸合成途徑調(diào)節(jié)子的作用相一致(Shimano，2000)。Shimano等揭示，用高糖飲食飼養(yǎng)SREBP-1-/-小鼠時不能誘導(dǎo)FAS和ACC的水平(Shimano等，1997)，證實SREBP-1在調(diào)節(jié)脂肪生成酶的表達中的作用。
法圖他汀A處理小鼠中的一種有趣發(fā)現(xiàn)是體重和血糖水平的降低(圖6和7)。體重降低的一種可能性是因為脂肪生成酶如ACC和FAS下調(diào)導(dǎo)致的較低的脂肪生成速率。此外，作為ACC產(chǎn)物和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的強效抑制劑，丙二酸單酰輔酶A的減少可導(dǎo)致脂肪酸氧化提高和脂肪燃燒。過去已揭示，Acc2-/-突變小鼠瘦小，并且肌肉、肝臟和脂肪中的脂肪酸氧化速率較高，血中葡萄糖水平較低(Abu-Elheiga等，2001；Abu-Elheiga等，2003；Oh等，2005)。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，法圖他汀A抑制SREBP-1切割可下調(diào)脂肪生成酶，提高脂肪酸氧化，減輕體重和增加胰島素敏感性而降低葡萄糖。
實施例6 實施例1-5中的示例性材料和方法 在本發(fā)明的實施例中，提供了以下示例性材料和方法。
材料根據(jù)文獻所述制備脂肪缺失的血清(Goldstein等，1983)。不含脂肪的FBS購自費氏公司(Fisher)。兔抗-SREBP-1(sc-8984)和羊抗-肌動蛋白(sc-1616)多克隆抗體購自桑塔克魯茨生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)。小鼠抗-SREBP-2多克隆抗體和小鼠抗-FAS抗體購自BD生物科學(xué)公司(BDBiosciences)?？?羊IgG HRP和抗-兔IgG HRP購自普美加公司(Promega)。含DAPI的ProLong Gold抗退色反應(yīng)試劑購自分子探針英吉檢測技術(shù)公司(Molecular Probes Invitrogen Detection Technologies)?？?兔IgG FITC購自凱米康國際公司(Chemicon International)。地塞米松(DEX)和1-甲基-3-異丁基花黃素(MIX)購自西格瑪公司(Sigma)。
法圖他汀A的制備攪拌的同時，將2-溴-4’-甲基苯乙酮(1.22g，5.70mmol)和丙硫異煙胺(1.03g，5.70mmol)在乙醇(20ml)中的混合物在70℃加熱0.5小時，然后冷卻至0℃。將形成的黃色沉淀過濾，用冷乙醇洗滌，干燥后得到黃色針狀法圖他汀A氫溴酸鹽(1.78g，83％)1H NMR(DMSO-d6，600MHz)δH 8.88(d，J＝6.2Hz，1H)，8.54(，1H)，8.46(d，J＝1.4Hz，1H)，8.36(dd，J＝1.4，6.2Hz，1H)，7.99(d，J＝7.6Hz，2H)，7.31(d，J＝7.6Hz，2H)，3.03(t，J＝7.6Hz，2H)，2.35(s，3H)，1.80(m，2H)，0.96(t，J＝7.6，3H)；HRMS(FAB)精確質(zhì)量C18H18N2S+H計算值m/z 295.1269，實測值m/z 295.1269。
細(xì)胞培養(yǎng)DU145人雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞(ATCC)在含有2mML-谷胺酰胺、1.0mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸和1.5g/L碳酸氫鈉、10％胎牛血清、100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的伊格爾最少必需培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下進行培養(yǎng)。3T3-L1成纖維細(xì)胞(ATCC)在含有5.5mM葡萄糖、10％胎牛血清、50μg/mL慶大霉素，0.5mM谷胺酰胺和0.5μg/mL兩性霉素B的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中，37℃進行培養(yǎng)。人胚腎293細(xì)胞(ATCC)在含有10％胎牛血清，100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下進行培養(yǎng)。
寡核苷酸微陣列分析在1μg/mL IGF1的存在下，在無血清培養(yǎng)基中，用5μM法圖他汀A或僅用DMSO處理DU145前列腺癌細(xì)胞6小時，將總RNA提取到TRI反應(yīng)試劑中(分子研究中心(Molecular Research Center))并通過RNeasy微量試劑盒(Mini Kit)(恰根公司(Qiagen))進一步分離。在醫(yī)學(xué)微陣列核心實驗室的拜爾學(xué)院(Baylor College of Medicine Microarray Core Facility)通過Affymetrix人類基因組U133Plus 2.0分析純化的mRNA。代表超過39,000種轉(zhuǎn)錄物的由大約45,000種探針組構(gòu)成的陣列來源于大約33,000種已證實的人類基因(阿弗麥特有限公司(Affymetrix，Inc.))。
熒光素酶報道分子分析第0天，將HEK293細(xì)胞以5x103/孔的密度一式三份接種到96-孔板中，在含有10％胎牛血清、100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。第2天，采用脂轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine reagent)(英吉公司(Invitrogen))用以下質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞0.4μg/孔pSRE-Luc(一種SRE-1-驅(qū)動的熒光素酶報道分子構(gòu)建物；Hua，X.，Sakai，J.，Ho，Y.K.，Goldstein，J.L.&Brown，M.S.1995 J Biol Chem 270，29422-7)和0.1μg/孔β-gal報道分子，其中β-gal的表達受到肌動蛋白啟動子的控制，最終體積150μL。在37℃培養(yǎng)5小時后，用磷酸緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，然后在有或沒有法圖他汀A存在下，在含有10％無脂質(zhì)血清、100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的100μlDulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)20小時后，用20μL of 1xReporter Lysis緩沖液(普美加)裂解各個孔中的細(xì)胞，用等分試樣測定熒光素酶(10μL)和β-半乳糖苷酶(10μL)活性。對于熒光素酶的分析，在Wallac 1420 ARVOsx多標(biāo)記計數(shù)器(PerkinElmer)中檢測光子產(chǎn)生，以每秒計數(shù)表示。對于β-半乳糖苷酶的分析，37℃培養(yǎng)0.5小時后，通過微板讀數(shù)儀(Tecan)在405nm波長處測定O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶的水平。由β-半乳糖苷酶的活性(OD單位)對熒光素酶活性(每秒計數(shù))進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對于SREBP-1c的N-末端成熟形式的過度表達，用pSRE-Luc共轉(zhuǎn)染pCMV-SREBP-1c(1-436)。pSRE-Luc和pCMV-SREBP-1c(1-436)由J.L.Goldstein和M.S.Brown提供(得克薩斯西南醫(yī)學(xué)中心(University ofTexas Southwestern Medical Center)(Hua，X.，Sakai，J.，Ho，Y.K.，Goldstein，J.L.和Brown，M.S.1995 J BiolChem 270，29422-7)。
RT-PCR實驗從DU145細(xì)胞將總RNA提取到TRI反應(yīng)試劑(分子研究中心)中并用RNeasy微量試劑盒(恰根公司)進行分離。采用Access RT-PCR系統(tǒng)(普美加)對RNA樣品進行RT-PCR分析。RT-PCR反應(yīng)液包含總RNA，1μM的各種引物，0.2mM dNTP，1mM MgSO4，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(2單位)和Tf1DNA聚合酶(2單位)，終體積25μL。所用引物對如下對于低密度脂蛋白受體(LDLR)是5′-TCA GAC CGG GAC TGC TTG GAC GGC TCA GTC-3′(SEQ ID NO1)和5′-CCA CTT AGG CAG TGG AAC TCG AAG GCC G-3′(SEQ ID NO2)；對于硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)是5′-GCC TGC TTGATA ATA TAT AAA C-3′(SEQ ID NO3)和5′-CAC TTG AAT TGA GCT TTAG-3′(SEQ ID NO4)；對于ATP檸檬酸裂解酶(ACL)是5′-AAG AAA AAGTGT CAG ACA GCT GG-3′(SEQ ID NO5)和5′-TGG ACT GAA GGG GTGTTA GC-3′(SEQ ID NO6)；對于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCoA R)是5′-GCC CGA CAG TTC TGA ACT GGA ACA-3′(SEQ ID NO7)和5′-GAA CCT GAG ACC TCT CTG AAA GAG-3′(SEQ ID NO8)；對于甲羥戊酸激酶(MVD)是5′-CTG CCT GAC TGC CTC AGC-3′(SEQ IDNO9)和5′-ACC TCT CCT GAC ACC TGG G-3′(SEQ ID NO10)；對于胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)是5′-AAG ACT TCA GGG TAA GTC ATC A-3′(SEQ ID NO11)和5′-CGT GTA TAA TGG TGT CTA TCA G-3′(SEQ IDNO12)。擴增條件如下在94℃1次循環(huán)持續(xù)4分鐘，然后在94℃變性40秒，在50℃退火40秒，在68℃延長2分鐘，對于SCD和HMG CoA R是22次循環(huán)，對于LDLR和INSIG1是在58℃退火并進行24次循環(huán)，或者對于ATP檸檬酸裂解酶(ACL)是在60℃退火并進行24次循環(huán)，對于MVD是在55℃退火并進行30次循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠分析擴增的DNA并用Scion-image軟件(版本4.02)進行定量。
Western印跡將DU145前列腺癌細(xì)胞以2x105個細(xì)胞/孔的密度接種到6-孔板中，在37℃無血清MEM中培養(yǎng)過夜。然后在IGF1(1μg/mL)的存在下，用DMSO或法圖他汀A(1或5mM)處理細(xì)胞。培育6小時后，將細(xì)胞收集到PBS中并在SDS緩沖液中裂解。樣品在10％SDS-PAGE凝膠上分離并用兔抗-SREBP-1和抗-SREBP-2抗體印跡。用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑(安瑪西亞(Amersham))可觀察到特定的帶。
免疫熒光實驗將DU145前列腺癌細(xì)胞接種到蓋玻片上，在無血清MEM中培養(yǎng)過夜，然后用含有IGF1(1μg/mL)的5μM法圖他汀A或僅DMSO的無血清MEM處理細(xì)胞。培養(yǎng)6小時后，細(xì)胞在-20℃的甲醇中固定20分鐘，在含有5％牛奶和0.1％吐溫20的PBS中封閉1小時。樣品與兔多克隆抗-SREBP-1(桑塔克魯茨(Santa Cruz)sc-8984)培育，然后與熒光素異硫氰酸酯-偶聯(lián)的抗-兔IgG抗體(開米肯公司(Chemicon Inc))一起培育。采用適用于熒光檢測的濾波片，以×400的放大倍數(shù)在尼康(Nikon)TE200熒光顯微鏡下觀察蓋玻片。
SREBP的siRNA敲減將源自SREBP-1基因序列(512-531)的互補寡核苷酸，5′-GAT CCC CGC CAC ATT GAG CTC CTC TCT TCA AGA GAGAGA GGA GCT CAA TGT GGC TTT TTG GAAA-3′(SEQ ID NO13)和5′-AGCTTT TCC AAA AAG CCA CAT TGA GCT CCT CTC TCT CTT GAA GGAGGA GCT CAA TGT GGC GGG-3′(SEQ ID NO14)插入pSUPER載體(OligoEngine)中。用Fugene 6(羅氏(Roche))將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到3T3-L1或DU145細(xì)胞中。為構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，使用濃度500μg/mL的新霉素-衍生物G418(基博科公司(Gibco))，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。通過Western印跡評價SREBP-1的表達水平。對于脂肪形成實驗，將3T3-L1細(xì)胞接種到96-孔板中，在含有10％胎牛血清的DMEM中再培養(yǎng)2天以實現(xiàn)完全匯合。第0天，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基含10％胎牛血清、5μg/mL胰島素、0.5mM 1-甲基-3-異丁基花黃素(MIX)和1μM地塞米松(DEX)的DMEM。第2天，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)換成含有10％胎牛血清和5μg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)基。第10天，用油紅O對脂肪油滴進行染色。對于細(xì)胞生長實驗，將DU145細(xì)胞以2,000個細(xì)胞/孔的密度接種到96-孔板中，無血清、或含1μg/mL IGF1、2％無脂胎牛血清、或2％胎牛血清的MEM中進行培養(yǎng)。3天后通過WST-1試驗評價細(xì)胞生長。該實驗一式三份進行。
法圖他汀A的動物實驗將雄性小鼠(129Sv背景)在拜爾醫(yī)學(xué)院動物研究中心的受控條件下(12小時白天/晚上循環(huán)；25℃)進行飼養(yǎng)，小鼠可隨意食用標(biāo)準(zhǔn)實驗飼料(PM公司(Purina Mills))和水。根據(jù)美國國立衛(wèi)生機構(gòu)出版的實驗動物的護理和使用指導(dǎo)(NIH出版編號85-23，1996年修訂)進行動物實驗。采用兩種不同的方案對5-6個月的雄性小鼠(129Sv背景)腹膜內(nèi)給予(30mg/kg；150mL)法圖他汀A。第一終方案包括小鼠禁食48小時，然后重新給予無脂飲食48小時。除SREBP外，該處理還能誘導(dǎo)脂肪生成酶如ACC和FAS的活性和水平。禁食前給予對照組(n＝5)法圖他汀A或10％DMSO的PBS溶液并繼續(xù)每天給予直到實驗結(jié)束。
在第二種方案中，用30mg/kg法圖他汀A或10％DMSO的PBS溶液每天處理兩組雄性小鼠(n＝5)，持續(xù)2周。每天測定食物攝取和體重。在實驗結(jié)束時，小時暫時禁食4-5小時，取血檢測血清成分。然后處死小鼠，快速取其干燥并在液氮中研磨成粉末。將粉末化組織重新懸浮在含有0.1mM PMSF、5mM苯甲脒和5mg/mL蛋白酶抑制劑混合物(羅氏)的10ml PBS中，用Polytron(3x30秒，高速)勻漿化，短時超聲以降解DNA。在16,000xg離心20分鐘分離提取物。然后用市售抗FAS和SREBP-1的抗體對樣品進行Western印跡分析。如過去所述測定FAS和ACC活性。
實施例7 在肥胖OB/OB小鼠中法圖他汀A防止脂肪肝、減輕高血糖癥并誘導(dǎo)體重減輕 文獻中已很好地記載了遺傳修飾的小鼠模型的藥物開發(fā)中的重要性和作用(Zambrowicz和Sand，2003)。在這些小鼠模型中，認(rèn)為缺乏瘦激素的小鼠Lepob/Lepob是研究肥胖及其相關(guān)綜合征如胰島素耐性和脂肪肝疾病尤其有價值的模型(Ktorza等，1997)。純合的ob/ob肥胖小鼠中體脂沉積增加、血糖過高、高胰島素血癥且生育力受損(Ingalis等，1950)。肥胖導(dǎo)致的結(jié)果之一代謝綜合征涉及許多心血管風(fēng)險因子，包括高血壓、血脂障礙、2型糖尿病、胰β-細(xì)胞功能障礙和動脈粥樣硬化(Moller和Kaufman，2005)。
雖然努力探索調(diào)節(jié)食物攝取和能量平衡的網(wǎng)絡(luò)，肥胖如何導(dǎo)致這些疾病仍未完全了解。研究法圖他汀A對雄性ob小鼠的作用，尤其是其通過減少白色脂肪粒以防止體重增加、防止糖尿病和脂肪肝的作用。如過去所述，法圖他汀A通過抑制SREBP-1的作用，是轉(zhuǎn)錄主控制的抑制劑。用法圖他汀A處理的正常小鼠體重減輕，并且葡萄糖和膽固醇水平較低。還發(fā)現(xiàn)，與對照相比，法圖他汀A能減少處理小鼠肝臟中SREBP-1的活性成熟形式。
SREBP-1和-2在脂肪酸和膽固醇的生物合成中發(fā)揮相關(guān)但獨特的作用。SREBP-1優(yōu)先激活脂肪酸合成所需的基因，而SREBP-2有利于膽固醇產(chǎn)生。由于法圖他汀A能阻斷SREBP-1的激活并且可能阻斷SREBP-2，在本發(fā)明的具體實施方式
中，給予肥胖ob/ob小鼠法圖他汀A能暫時調(diào)制脂肪酸和膽固醇的生物合成，揭示肥胖小鼠中感興趣的表型。
法圖他汀A對體重和食物攝取的影響 研究采用4-5周齡的雄性ob/ob小鼠，小鼠平均體重約23克。每天腹膜內(nèi)給予法圖他汀A(30毫克/千克/天)，測定體重和食物攝取。如圖8A和8B所示，處理小鼠體重的增加顯著低于對照組。在第一周處理結(jié)束時，給予DMSO的ob對照小鼠體重增加平均4.82克(從23.58±0.62到28.40±1.45)，而法圖他汀處理組的體重增加約為3.37克(從23.08±1.53到26.45±1.2g/小鼠)，(p＝0.03)。用法圖他汀A處理28天后，處理組體重比對照組低約12％(32.1±1.4相對于36.2±2.2g/小鼠)(P＝0.02)。兩組間總的食物攝取類似(圖8C)。平均來說，處理組和對照組的食物攝取沒有顯著性差異，分別為5.4±1.5和5.9±1.4g/小鼠。
法圖他汀A對血中葡萄糖和脂質(zhì)分布的影響 ob/ob小鼠中一種最獨特的表型是胰島素耐性病癥所導(dǎo)致的高血糖癥。為了測定法圖他汀A對血中葡萄糖和脂質(zhì)的影響，測定標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)的ob/ob小鼠中的葡萄糖、甘油三酯和膽固醇的血清水平。
如圖9所示，禁食過夜后，處理動物血清中的培養(yǎng)基水平比對照低約70％；分別為153.2±30.5和429.4±87mg/dl(P＝0.003)。處理動物血清中的葡萄糖水平與具有功能性ob基因的wt小鼠相當(dāng)，而給予DMSO的對照小鼠正如預(yù)期血糖過高。有趣的是，與對照相比，處理動物中酮體(ketond bodies)(β-羥基丁酸酯)增加約7倍；分別為3.62±1.41和0.5±0.37mg/dl(P＝0.004)(圖9)。法圖他汀A動物中酮體的高水平說明肝臟中脂肪酸氧化顯著增加，其中主要產(chǎn)物是分泌入血的酮體。并且，處理小鼠中增加的血成分是血清中測定的非酯化的游離脂肪酸(NEFA)，比對照高約70％；分別為1.93±0.26和0.7±0.2mEq/l(P＝0.028)(圖9)。NEFA水平的增加可能是因為脂肪酸氧化需求提高導(dǎo)致的脂肪組織脂解作用增加。已知動物和人體中FFA與胰島素耐性有關(guān)(Chalkley等，1998；Boden等，1994)。然而，雖然法圖他汀A處理的ob/ob小鼠血清中FFA水平提高，但葡萄糖水平顯著低于對照，表明胰島素敏感性的改善，可能是因為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改善。此外，近來發(fā)現(xiàn)，隨著突變的乙酰輔酶A羧化酶小鼠(Acc2-/-突變小鼠)中脂肪酸氧化的增加，脂肪細(xì)胞脂解作用增加導(dǎo)致血中酮體較高且NEFA增加(Abu-Elheiga等，2001；Abue-Elheiga等，2003；Oh等，2005)。與對照相比，處理小鼠血清中的甘油三酯(TG)水平提高約30％，分別為115±11和79±12(P＝0.006)，表明法圖他汀A能提高肝臟TG的分泌和轉(zhuǎn)移?？偰懝檀嫉难逅皆诜▓D他汀處理動物中表現(xiàn)為較低趨勢，183±16相對于219±18mg/dl(P＝0.06)。然而，LDL顯著降低約35％(31±3相對于48±8；P＝0.02)，HDL降低程度較小，約為22％(144±11和183±12；P＝0.02)。由于法圖他汀A處理小鼠血清中LDL水平比HDL下降更多，表明用法圖他汀A處理的小鼠獲得所需的結(jié)果?；赥G水平計算，轉(zhuǎn)運甘油三酯、磷脂和膽固醇的VLDL的水平增加約50％(23.1±2.3相對于15.8±2.4mg/dl)。
法圖他汀A減小附睪脂肪大小并改善脂肪肝 由于不受控制的食物攝取，ob/ob小鼠變成病態(tài)肥胖，脂肪組織和其他器官如肝中蓄積了過高的脂肪水平，導(dǎo)致非酒精性脂肪肝疾病和胰島素耐性(Hookman和Barkin，2003)。約8-9周齡時，與用法圖他汀A處理組相比，對照未處理小鼠的肝臟尺寸變大且脂肪蓄積，從其蒼白顏色可見(圖10A)。法圖他汀A處理小鼠肝臟的平均重量比對照組小約32％(1.59±0.2相對于2.34±0.15；P＝0.06)(圖10D)。用脂滴油紅染色的對照小鼠肝臟切片顯示包含豐富的脂滴，而法圖他汀A處理小鼠沒有脂滴，脂滴主要是甘油三酯(圖10B)。已表明，過度表達SREBP 1的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生脂肪肝(Horton等，2003)。然而，在缺乏SREBP-1的ob/ob小鼠(lepob/ob X Srebp 1-/-)中，脂肪肝得到小鼠改善，提示SREBP 1是導(dǎo)致ob/ob小鼠脂肪肝的主要作用因素(Yahagi等，2002)。
如上所述，法圖他汀A處理4周結(jié)束時，處理小鼠體重比對照輕。通過測定作為主要白色脂肪組織的附睪脂肪墊發(fā)現(xiàn)，法圖他汀A處理小鼠的脂肪墊顯著較小(圖10C)。脂肪墊的平均重量比對照小約20％(2.7±0.1相對于3.6±0.2；P＝0.02)(圖10D)。脂肪墊較小可能是因為脂質(zhì)儲量減少和/或脂肪生成減少和脂肪組織中的脂肪酸氧化增加。過去對Acc2-/-突變小鼠的研究表明，缺乏ACC2也可導(dǎo)致肝臟中脂肪減少、附睪脂肪墊減小并且包括肝臟在內(nèi)的不同組織中脂肪酸氧化增加(Abu-Elheiga等，2001；Abu-Elheiga等，2003；Oh等，2005)。在這里指出，由于缺乏ACC2-產(chǎn)生的丙二酸單酰輔酶A對肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的抑制，脂肪酸氧化增加，小鼠變得高度胰島素敏感并避免飲食誘導(dǎo)的肥胖和糖尿病。在具體的方面，法圖他汀A下調(diào)ACC酶能增加脂肪酸氧化并抑制不同組織如肝臟、脂肪組織和肌肉中的脂肪酸合成。測定法圖他汀A儲量的ob/ob小鼠肝臟中的TG和膽固醇水平并與ob/b對照進行比較。如圖11所示，處理小鼠肝臟中的TG水平下降約65％(分別為14.8±3.7和38.7±6.0毫克/克肝臟；P＝0.0004)。法圖他汀A還能使肝臟中的膽固醇水平下降超過20％(2.8±0.5和3.6±0.1；P＝0.03)(圖11)。這些結(jié)果進一步證實了油紅O染色，表明部分地由肝脂肪生成增加引起的ob/ob小鼠脂肪肝可通過法圖他汀A治療完全防止。在本發(fā)明的具體方面，處理的ob/ob小鼠肝臟中這些脂質(zhì)的下降是因為合成TG和膽固醇或其前體所需的脂肪生成酶的顯著抑制。此外，由于不同小鼠組織(包括肝臟)中脂肪酸氧化需求的提高，脂肪酶肝臟活性提高，并且還促進脂質(zhì)從肝臟轉(zhuǎn)移到循環(huán)中，由各種脂肪酸氧化組織如心臟和肌肉利用。在具體的方面，與法圖他汀A處理的ob/ob小鼠血中較高水平的TG有關(guān)。
法圖他汀A下調(diào)ob/b小鼠肝臟中的脂肪生成酶 脂肪生成途徑中的酶受到轉(zhuǎn)錄因子如PPAR和SREBP的調(diào)節(jié)。測定處理的ob/ob小鼠中法圖他汀A對脂肪生成酶水平和活性的影響。測定執(zhí)行脂肪酸合成限速步驟的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的活性。ACC催化乙酰輔酶A的羧化而產(chǎn)生丙二酸單酰輔酶A，即脂肪酸合成中的構(gòu)建模塊，而脂肪酸的合成由另一種多功能酶脂肪酸合酶(FAS)執(zhí)行。丙二酸單酰輔酶A除了在脂肪酸合成的作用之外，還能抑制肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT 1)而在脂肪酸氧化中發(fā)揮重要作用。ob/ob小鼠中脂肪生成酶得到顯著誘導(dǎo)，部分地解釋了這些小鼠的病態(tài)肥胖表型。法圖他汀A處理小鼠肝臟提取物中ACC的活性下降約40％(3.44±0.44相對于5.55±0.57納摩爾/分鐘.毫克)(圖12A)。法圖他汀A處理ob/ob小鼠肝臟提取物中的脂肪酸合酶活性也顯著下調(diào)。處理小鼠中FAS活性下降超過70％(8.64±1.91相對于22.6±1.37納摩爾/分鐘.毫克)(圖12B)。ACC和FAS活性的下降是由于兩種酶表達水平的下降，如兩種酶的Western印跡分析所示(圖12C)。法圖他汀處理ob/ob小鼠肝臟中的產(chǎn)物脂肪酸C14:0和C16:0明顯較少，相對于未處理對照小鼠約為50％(見表2)。
ACC受到磷酸化/去磷酸化機制的急劇調(diào)節(jié)，分別導(dǎo)致酶的抑制和活化。如圖12C所示，對照組中磷酸-ACC的水平較高，但因為ACC的表達水平也較高且升高程度相同，說明法圖他汀A沒有改變特定的磷酸化水平(P-ACC/ACC蛋白質(zhì))。這些結(jié)果表明，ACC活性的下調(diào)僅僅是因為酶水平下降，而不是磷酸化狀態(tài)的下降(圖12C)。過去表明，肝臟中存在兩種ACC同種型；ACC1(肝臟中的主要同種型)和ACC2(肌肉中的主要同種型)，頹靡在調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和氧化中分別發(fā)揮獨特功能(Abu-Elheiga等，2001，Abu-Elheiga等，1997；Abu-Elheiga等，2000；Abu-Elheiga等，1995)。ACC和FAS活性的下降表明脂肪生成減少，而法圖他汀A處理小鼠肝臟中脂肪燃燒顯著提高，這與法圖他汀A處理ob/ob小鼠中酮體增加7倍一致，如圖9所示。測定脂肪酸代謝中兩種關(guān)鍵酶的水平，這兩種酶也受到SREBP-1、ATP檸檬酸裂解酶(ACL)和硬脂酸輔酶A去飽和酶1(SCD1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。法圖他汀A處理小鼠肝臟提取物中使胞漿檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的ACL的蛋白質(zhì)水平下降約70％。脂肪生成組織如肝臟中ACL水平的這種下調(diào)被法圖他汀A對脂肪生成過程中降低的影響進一步擴大。SCD1催化單不飽和脂肪酸生物合成中的限速步驟，通過在脂肪?；o酶A如棕櫚酰-CoA和硬脂酰輔酶A的A9位引入順式雙鍵。產(chǎn)物棕櫚油酰輔酶A(16:1)和油酰輔酶A(18:1)是甘油三酯和膽固醇酯的重要成分，包括ob/ob小鼠在內(nèi)的小鼠SCD1的刪除導(dǎo)致代謝速率增加，肥胖減輕，防止脂肪肝并避免飲食對糖尿病的誘導(dǎo)作用(Cohen等，2002；Ntambi等，2002；Miyazaki等，2000)。如圖12C所示，與對照相比，法圖他汀A處理小鼠肝臟提取物中SCD1的蛋白質(zhì)水平下降約50％。這可通過以下結(jié)果證實單不飽和脂肪酸C16:1、C18:1和C20:1下降約70％以及其延長產(chǎn)物(C18:2)N-6、(C18:3)N-6、(C20:2)N-6和(C20-3)N-6的變性減少約50％(見表2)。這種對SCD1的減少的影響是體重減輕的重要因素，在本發(fā)明的具體實施方式
中，降低肝臟中的TG水平并避免脂肪酸。有趣的是，法圖他汀A處理不會導(dǎo)致FADS1或Δ5去飽和酶的蛋白質(zhì)水平的變化。去飽和酶是高度不飽和脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶，主要酯化形成細(xì)胞膜磷脂成分(Marquardt等，2000；Hastings等，2001；Nakamura和Nara，2004)。
表2OB/OB處理小鼠和未處理對照小鼠肝臟中的脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析 圖例肝臟樣品(100mg)從法圖他汀A處理的ob/ob小鼠和未處理對照小鼠獲取，在-80℃儲存直到進行脂肪酸含量分析。根據(jù)Folch方案提取脂肪酸并用氣相色譜-質(zhì)譜檢測(GC-SM)進行定量。如上表所示，脂肪酸從頭合成產(chǎn)物C14:0和C16:0下降約50％，單不飽和脂肪酸C16:1，C18:1和C20:1及其延長變性產(chǎn)物(C18:2)N-6、(C18:3)N-6、(C20:2)N-6、(C20-3)N-6和(C20:5)N-3下降約70％。FAS產(chǎn)物肉豆蔻酸酯(C14:0)和棕櫚酸酯(C16:0)下降約50％(P＜0.05)。不僅是FAS脂肪酸從頭合成中的C18，而且包括食物鏈延長系統(tǒng)中的C18水平均無變化。有趣的是，存在C20:0下降約15％(P+0.059)而C24:0增加(P＝0.05)的強烈趨勢。與長鏈飽和脂肪酸的顯著減少平行，結(jié)果表明單不飽和脂肪酸C16:1、C18:1和C20:1的水平顯著減少約70％(P＜0.004)。并且，多不飽和長鏈脂肪酸(18:2)N-6、(18:3)N-6、(20:2)N-6、(20:3)N-6和(20:5)N-3的水平下降30-60％。這些減少是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平脂肪生成途徑中關(guān)鍵酶(FAS，ACC和SCD，ACL)的下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)果。這些結(jié)果有助于解釋法圖他汀A通過降低肝臟中合成的甘油三酯的水平來改善脂肪肝的效果。
脂肪生成酶mRNA水平的下調(diào) 蛋白質(zhì)水平下降可能是因為轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控。采用實時PCR除測定脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子PPARγ外，還測定代表性的脂肪生成基因ACC1、FAS和SCD1的mRNA水平。ACC1、FAS和SCD1的mRNA水平下降約80％(圖13)。這些結(jié)果與較低的酶蛋白水平和活性相一致，強烈提示法圖他汀A能通過抑制SREBP-1的成熟降低脂肪生成。在具體實施方式
中，脂肪生成酶的下調(diào)涉及其主要轉(zhuǎn)錄因子PPARγ之一。在法圖他汀A處理小鼠的提取物中，該轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平下降約40％(圖13)。涉及從ob/ob小鼠肝臟刪除PPARγ的研究還導(dǎo)致脂肪肝的改善(Matsusue等，2003)。然而，如果PPAR γ僅從肝臟刪除，這些小鼠中糖尿病表型加劇(Matsusue等，2003)。其他研究表明，肝PPAR γ-/-小鼠血中葡萄糖較低，具有提示該結(jié)果的功能性瘦激素基因在高脂飲食15周后可避免胰島素耐性(Kubota等，1999)。由于用法圖他汀A處理的小鼠高血糖降低且防止脂肪肝，這就提示在具體的方面，肝臟中的PPARγ是可能影響這些病理學(xué)病癥的一些因素之一。此外，其他問題如白色脂肪粒可能在抗高血糖效果中起作用，當(dāng)肝臟中脂肪生成受抑制時通過提高脂肪生成進行補償。
總之，法圖他汀A能夠在處理的ob/ob小鼠中減少肝TG儲量，緩解肥胖并降低高血糖癥，通過其對SREBP-1的作用改善脂肪肝。這些研究提示，法圖他汀A及其類似物是有用的對抗肥胖、脂肪肝和糖尿病的藥物。
示例性的材料和方法 動物研究過程 4-5周齡的純合雄性肥胖(ob/ob)小鼠(C57BL/6J，杰克遜實驗室(TheJackson Laboratory)，緬因州巴港(Bar Harbor，ME))在拜爾醫(yī)學(xué)院動物研究中心的受控條件下(12小時白天/晚上循環(huán)；25℃)進行飼養(yǎng)。根據(jù)美國國立健康機構(gòu)出版的實驗動物的護理與使用指導(dǎo)(NIH出版號85-23，1996修訂)進行動物實驗。每只籠子飼養(yǎng)5只小鼠，分配后1周小鼠自由攝取標(biāo)準(zhǔn)實驗飼料(印第安納州雷明德的PM公司(Purina Mill，Richmond IN))和水。實驗第一天以及隨后的每一天，測定小鼠重量以及消耗的食物量。ip注射法圖他汀A(30mg/kg；150mL)之前每天下午3-5點間測定小鼠重量和剩余的食物。
每天繼續(xù)給予法圖他汀A或給予對照組(n＝5)10％DMSO的PBS溶液，持續(xù)4周直到實驗結(jié)束。
血成分 每天注射法圖他汀A 28天后，小鼠禁食過夜，取血，用極高精度的血糖測計儀(Glucometer Precision Xtra，Abbott)測定全血葡萄糖和β-羥基丁酸酯。通過比較病理學(xué)實驗(拜爾醫(yī)學(xué)院)進行血清成分、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇的測定。采用NEFA C試劑盒(弗吉尼亞州里士滿的WC公司(WakoChemical，Richmond，VA))測定血清非酯化脂肪酸(NEFA)。
肝臟分析 處死小鼠，測定肝臟和脂肪墊。用油紅O染色來自各個動物的肝臟凍干切片以觀察肝臟切片中的脂肪滴(TG)，如先前所述(Abu-Elheiga等，2001)。剩余的肝臟組織在液氮中凍干并在-80℃保存以備進一步分析。
組織甘油三酯和膽固醇含量 采用適配成適合96-孔板模式的比色分析的膽固醇E試劑盒(Wako)和無限度甘油三酯試劑盒(澳大利亞墨爾本的TE公司(Thermo Electron，Melbourne，Australia))，如文獻中所述測定肝臟甘油三酯和膽固醇的含量(Chandler等，2003)。
酶活性和Western印跡分析 在液氮中將凍干的肝臟部分研磨成粉末。將粉末化組織懸浮在含有0.1mM PMSF、5mM苯甲脒和5mg/ml蛋白酶抑制劑混合物(羅氏(Roche))的10ml PBS中，并用Polytron(3x30秒，高速)勻漿化，短時超聲以降解DNA。16,000xg離心20分鐘分離提取物。測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度并用針對以下酶的市售抗體進行Western印跡分析FAS(BD生物科學(xué)公司)、檸檬酸裂解酶SCD1、FADS1、ACC和磷酸-ACC抗體。用安瑪西亞ECL PlusTMWestern印跡檢測試劑觀察蛋白質(zhì)。掃描感興趣的特定蛋白質(zhì)帶的強度并針對β-肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)化進行定量。
如上所述測定肝臟提取物的FAS和ACC活性(Mao等，2006)。
定量實時PCR 用TRIzol試劑(英吉公司)從小鼠組織制備總RNA。從5只小鼠收集等量RNA并用DNA酶I(Turbo DNA-free，安百公司(Ambion，Inc.))處理。用Superscript II RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(英吉公司)以隨機六聚體引物從2μg DNA酶I-處理的總RNA合成第一鏈cDNA。實時PCR在20μl的終體積中包含10ng逆轉(zhuǎn)錄的總RNA、0.5μM正向和反向引物、10μl來自DyNAmo HS SYBRGreen qPCR試劑盒(飛酶公司(Finnzymes))的2x主混合物。采用DNA EngineOpticon系統(tǒng)(MJ研究有限公司(MJ Research，Inc))，在96-孔板中進行PCR。所有反應(yīng)一式三份進行，用比較C(t)方法計算mRNA的相對量。用Opticon監(jiān)測軟件2.02(MJ研究公司)計算循環(huán)閾值C(t)。小鼠β-肌動蛋白mRNA用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。
統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)表示為均值±SD。組間差異用未配對的雙尾斯氏t-檢驗進行評價。
實施例8 法圖他汀A目標(biāo)分子及其類似物或衍生物的鑒定 在本發(fā)明的某些方面，鑒定了一種或多種法圖他汀A的目標(biāo)分子或其類似物或衍生物。雖然可采用任何合適的方法進行這種鑒定，但在具體的實施方式中，對法圖他汀A或其類似物或衍生物進行標(biāo)記。示例性的標(biāo)記包括例如生物素。
實施例9 示例性的化合物及其修飾 圖14顯示了本發(fā)明的示例性化合物，它們的名稱如表3所示。圖15-17顯示了根據(jù)圖2A所示的相同方法，以20μM對這些示例性化合物進行的示例性的熒光素酶報道基因試驗結(jié)果。如上所述進行脂肪形成試驗(Choi等，2003)。完全抑制細(xì)胞油滴形成的類似物記為脂肪形成抑制性類似物。
表3本發(fā)明示例性的化合物 脂肪形成 名稱 條目 Luc/Gal標(biāo)準(zhǔn)差的抑制無 9.4426 1.0577 2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶 16.2297 1.1014+ 4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 24.5130 0.6176- 4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 37.4643 2.2215- 4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 46.3808 2.0425- 4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶 57.6190 1.6221- 4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶 613.46891.6735- 脂肪形成 名稱 條目 Luc/Gal 標(biāo)準(zhǔn)差的抑制 4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶7 18.3174 2.9172- 4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸 酯 8 7.7585 1.6193+ 4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚 9 14.5234 2.7276+ 2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙 酸甲酯 1010.7717 0.8662- 4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑 125.9214 1.2693- 4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶135.2391 0.4021- 4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 149.6605 0.9824- 4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶1510.8383 1.7661- 4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺 1610.3338 2.0763+ N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯 胺 174.7079 1.2781+ N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰 胺 1811.7685 6.8358+無15.0759 0.8305 2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶 1 7.5537 0.9784+ N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺 酰胺 194.1981 0.4653+ N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺 205.6748 0.0613+ N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4- 基)苯胺 216.4378 1.2736+ 4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸 2221.5911 0.8383- 4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸 甲酯 238.1137 2.5369+ 4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 2411.0367 2.1112- 4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 257.8536 1.2799- 4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶 268.3046 2.6780+ 2-苯基-4-對甲苯基噻唑2713.8222 1.3938- 3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚 2812.7791 1.1429- 2-(2-(2-丙基吡啶4-基)噻唑-4-基)苯酚 298.2379 1.9501- 4-(4-溴苯基)N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻 唑-5-羧酰胺 3016.0226 2.1917- 4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶3116.9971 2.6512- 4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶 329.5798 0.8524- 4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑 3317.8175 3.7158- 2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶3412.1593 1.5587+無18 2 2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶 1 9.413845 0.840651 + 4-(4′-甲基[1，1′-聯(lián)苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶 3511.35866 0.881475 + 2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸3618.98889 2.082093 2-乙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶 379.869906 0.71108 4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸3822.65811 3.898667 2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸甲 3914.92978 2.600443 脂肪形成 名稱 條目 Luc/Gal 標(biāo)準(zhǔn)差 的抑制 酯 無 8.2181 0.5097 2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶1 3.4437 0.2720 4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲 酸叔丁酯 40 2.4390 0.4730 N-環(huán)己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯 胺41 6.5229 0.8638 4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺酰 基苯胺42 3.3957 0.3619 N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8- 喹啉磺酰胺43 2.8506 0.6396 N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2- 噻吩磺酰胺44 1.8538 0.1240 而且，技術(shù)人員應(yīng)理解，適合修飾示例性化合物的一個或多個方面以助于鑒定其他合適的化合物。例如，通過確定特定化合物對于一種或多種代謝疾病的治療和/或預(yù)防的適當(dāng)性，可修飾化合物以鑒定適用于相同或不同代謝疾病的其他相關(guān)化合物。在具體的實施方式中，這些改變可根據(jù)本文所述示例性的化學(xué)基團進行。
實施例10 通過抑制SREBP的活性阻斷脂肪合成 細(xì)胞中脂肪消耗后，甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)由膜蛋白水解釋放而易位進入核，在核中它們激活參與膽固醇和脂肪酸生物合成的基因的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中，阻斷脂肪形成的小合成分子是SREBP激活的選擇性抑制劑。二芳基噻唑衍生物，現(xiàn)稱為法圖他汀，能夠削弱SREBP的蛋白水解激活，從而降低細(xì)胞中脂肪形成基因的轉(zhuǎn)錄。法圖他汀的分子靶點似乎是SREBP切割激活蛋白(SCAP)。法圖他汀阻斷肥胖ob/ob小鼠中體重增加、血糖和肝脂蓄積，即使在不受控制的食物攝取統(tǒng)計學(xué)。法圖他汀可用作對SREBP的調(diào)控進行進一步研究的工具，可提供新型代謝疾病藥理學(xué)干預(yù)的起點。
代謝綜合征常常歸因于長期攝入過量富含脂肪或碳水化合物的飲食。碳水化合物通過脂肪酸和膽固醇從頭合成轉(zhuǎn)化為酰基甘油酯的過程涉及許多酶反應(yīng)。編碼這些酶的基因的表達水平受到三種轉(zhuǎn)錄因子的控制SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000)。SREBP合成作為ER-膜結(jié)合前體，需要由結(jié)合到高爾基體膜的兩種蛋白酶，位點-1和位點-2蛋白酶(S1P和S2P)蛋白水解釋放，以產(chǎn)生激活核中靶基因的轉(zhuǎn)錄的活性形式(Brown和Goldstein，1997；Sakai等，1996)。SREBP的蛋白水解激活通過與SREBP切割激活蛋白(SCAP)，一種SREBP的ER-膜結(jié)合護衛(wèi)蛋白相互作用而受到甾醇的密切調(diào)控(Goldstein等，2006；Hua等，1996)。當(dāng)甾醇在ER膜中累積時，SCAP/SREBP復(fù)合物不能從ER轉(zhuǎn)移至高爾基體膜，SREBP的蛋白水解加工過程受到抑制。因此，SREBP是控制脂肪代謝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子。
如本文所述，法圖他汀(圖18a)抑制3T3-L1細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成以及DU145細(xì)胞血清非依賴性生長(Choi等，2003)。對經(jīng)藥物處理和未處理細(xì)胞的基因表達分布圖進行比較以獲取關(guān)于法圖他汀作用特定分子途徑的信息。用法圖他汀或僅DMSO處理DU145細(xì)胞，通過描繪33,000種基因的Affymetrix DNA微陣列分析mRNA樣品。在這些基因中(所有都從互聯(lián)網(wǎng)生物技術(shù)信息GenBank數(shù)據(jù)庫的國立中心獲得，其全部內(nèi)容被納入本文作為參考)，法圖他汀處理導(dǎo)致63種基因的轉(zhuǎn)錄水平下降至少35％(圖23)。24種受影響基因與脂肪或甾醇合成直接相關(guān)，例如編碼生物合成酶的基因，并且已報道18種受影響基因受到SREBP的控制(Horton等，2003)。受影響的SREBP-效應(yīng)基因的下調(diào)在RT-PCR實驗中得到證實(圖18b和18c)。下調(diào)的基因列表中已知SREBP效應(yīng)基因和脂肪/膽固醇生物合成基因的高發(fā)生率預(yù)示著法圖他汀直接或間接地作用于SREBP途徑。
為了證實法圖他汀削弱SREBP的功能，在有或沒有法圖他汀存在的情況下，測定CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性SREBP激活SREBP-效應(yīng)性報道基因的能力(圖18d)。法圖他汀減少報道基因的激活，其中熒光素酶的表達受到甾醇調(diào)控元件的控制。法圖他汀對外源性表達的SREBP-1的成熟形式(氨基酸1-436)激活報道基因的能力的影響有限(圖18e)，表明法圖他汀削弱SREBP激活過程。
為了測定法圖他汀是否影響ER-高爾基體易位和SREBP的蛋白水解過程，我們采用Sakai等(1998)開發(fā)的報道分子試驗。在該試驗中，與缺乏NH2-末端DNA-結(jié)合域的SREBP-2片段融合的分泌型堿性磷酸酶(PLAP-BP2513-1141)能夠通過產(chǎn)生熒光的磷酸酶底物的變化監(jiān)測易位和加工過程(圖18f)。當(dāng)用編碼PLAP-BP2513-1141和SCAP的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，PLAP磷酸酶分泌，產(chǎn)生熒光信號。加入法圖他汀或甾醇可類似地減少分泌(圖18f)。法圖他汀介導(dǎo)的SREBP激活的抑制通過SREBP的Western印跡分析得到證實。用法圖他汀處理CHO-K1細(xì)胞可降低SREBP-268KDa成熟形式的量并增加125KDa前體形式的量(圖18g)。SREBP-1獲得類似結(jié)果(圖24)。這些結(jié)果共同表明，法圖他汀能夠阻斷兩種SREBP同種型的激活過程。
本發(fā)明者認(rèn)為，法圖他汀可削弱高爾基體中的SREBP蛋白水解切割或SCAP/SREBP復(fù)合物的ER-高爾基體易位。已知布雷菲德菌素A，一種阻斷蛋白質(zhì)ER順行轉(zhuǎn)移至高爾基體的天然產(chǎn)物，可導(dǎo)致SREBP對甾醇無應(yīng)答，通過使S1P從高爾基體重新配置到ER導(dǎo)致SREBP在ER中結(jié)構(gòu)性加工(DeBose-Boyd等，1999)。在布雷菲德菌素A的存在下，法圖他汀對SREBP加工過程無影響(圖19a)，提示法圖他汀不能阻斷其自身蛋白水解。
為了測定法圖他汀是否阻斷SCAP/SREBP復(fù)合物的ER-高爾基體易位，本發(fā)明者分析高爾基體中SCAP的N連接糖基化的程度。與EF結(jié)合SCAP相比，已易位的SCAP具有較高的糖基化水平，對內(nèi)切糖苷酶H的耐受性更強。甾醇通過抑制ER-高爾基體易位可防止SCAP變得耐受內(nèi)切糖苷酶H(圖19b)(Nohturfft等，1998)。細(xì)胞在有或沒有法圖他汀或甾醇的存在下生長，相繼用胰蛋白酶和內(nèi)切糖苷酶H處理膜片段。在不含法圖他汀和甾醇的情況下生長的細(xì)胞中，SCAP胰蛋白酶片段對內(nèi)切糖苷酶H的耐受性較強，具有一或兩條糖鏈(圖19c，道1)。細(xì)胞在法圖他汀或甾醇的存在下生長時，SCAP片段對內(nèi)切糖苷酶H的耐受性較小，具有零或一條糖鏈(圖19c，道2和3)。因此，法圖他汀似乎能夠抑制SCAP從ER到高爾基體的易位。
法圖他汀構(gòu)效關(guān)系的研究表明，用各種烷基或芳基磺酰胺基團修飾甲苯部分時，分子的生物學(xué)活性被保留或者甚至提高。一種熒光衍生物，丹酰法圖他汀(圖20a)保留其阻斷SREBP激活的能力(圖26)，可用作顯微探針。共聚焦顯微鏡分析揭示了用ER-追蹤紅(一種ER特異性標(biāo)記物)覆蓋的丹酰法圖他汀的位置(圖20b)。相反，缺少法圖他汀的丹酰分子不能定位到任何細(xì)胞群(圖27)。選擇性ER定位預(yù)示著，法圖他汀能結(jié)合ER中的蛋白質(zhì)；最有可能的候選物是SCAP，它是控制SREBP的膽固醇靶點(Radhakrishnan等，2004)。為檢驗這種假設(shè)，從細(xì)胞裂解物純化結(jié)合于法圖他汀-聚脯氨酸接頭-生物素偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)(圖20a)(Sato等，2007)并用針對SCAP、SREBP-1、SREBP-2和ATF6(一種不相關(guān)的ER結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子)的抗體通過Western印跡進行分析(Ye等，2000)。結(jié)果表明，法圖他汀結(jié)合于SCAP，但不結(jié)合其他蛋白質(zhì)(圖20c)。加入過量法圖他汀后結(jié)合喪失，過量膽固醇卻不能(圖20d)，提出一種有趣的可能性，即法圖他汀可能在不同于膽固醇的位點與SCAP相互作用。
已建立SREBP在脂肪生成中的關(guān)鍵作用，在不受控制的食物攝取統(tǒng)計學(xué)，檢查法圖他汀對ob/ob小鼠(一種肥胖小鼠模型)的作用。每天腹膜內(nèi)給予法圖他汀，監(jiān)測攝食和體重。處理小鼠每天的平均食物攝取與對照組無限制性差異(分別為

1.5和

1.4克/小鼠/天，p＞0.05)，處理期間未觀察到明顯毒性(圖4a，b)。用法圖他汀處理28天后，處理小鼠體重比未處理對照組小約12％(分別為32.1+1.4和36.2 2.2克/小鼠，p＝0.02)。ob/ob小鼠中最獨特的表型之一是胰島素耐性導(dǎo)致的高血糖癥。血成分檢查(圖21c)揭示，處理小鼠平均葡萄糖水平比未處理小鼠低約70％(分別為

30.5和

87mg/dl，p＝0.003)，在正常葡萄糖水平的范圍內(nèi)。這些結(jié)果與肝胰島素耐性發(fā)病機理中報道的SREBP-1c的作用相一致(Ide等，2004)。
ob/ob小鼠的另一種表型是器官中脂肪過度蓄積，包括非酒精性脂肪肝。由未處理ob/ob小鼠蒼白顏色可知肝臟膨大和脂肪肝，而用法圖他汀處理的小鼠肝臟表現(xiàn)正常(圖22a)。處理小鼠肝臟體重平均下降約32％，脂肪墊比未處理小鼠小(圖22b)。肝臟切片油紅染色表明，未處理ob/ob小鼠的肝臟含有豐富的脂肪滴，而處理小鼠肝臟包含較低水平的脂質(zhì)蓄積(圖22c)。處理小鼠肝臟中的甘油三酯和膽固醇水平也下降(圖22d)。法圖他汀防止ob/ob小鼠脂肪肝的結(jié)果符合報道的SREBP-1在脂肪肝發(fā)生中的作用過度表達SREBP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生脂肪肝(Horton等，2003)，而缺乏SREBP-1的ob/ob小鼠(lepob/obX Srebp1-/-)具有健康的肝臟(Yahagi等，2002)。
認(rèn)為處理小鼠中肝脂質(zhì)水平的下降是因為SREBP-響應(yīng)性脂肪生成酶的肝表達降低。因此，檢查法圖他汀對代表性SREBP-響應(yīng)性脂肪生成酶，包括脂肪酸合酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)和ATP檸檬酸裂解酶(ACL)的肝蛋白質(zhì)水平和酶活性的作用。生物化學(xué)分析表明，法圖他汀-處理小鼠的肝臟提取物中脂肪生成酶的蛋白質(zhì)水平和活性下降(圖28)。因此，法圖他汀能夠阻斷肝臟SREBP-1的加工，下調(diào)脂肪生成酶和降低肝甘油三酯儲量。
小分子對SREBP途徑的調(diào)節(jié)并非新發(fā)現(xiàn)。葛蘭素史克的研究人員發(fā)現(xiàn)能夠激活SREBP和通過表達LDL降低血膽固醇水平的小分子(Grand-Perret等，2001)。然而，法圖他汀是第一種能夠抑制SREBP活性的非甾醇樣合成分子。法圖他汀和葛蘭素史克的分子都能靶向SCAP并調(diào)節(jié)其功能，導(dǎo)致對實驗底物的脂肪酸和/或膽固醇代謝的獨特影響。雖然這些分子如何結(jié)合SCAP和調(diào)節(jié)其功能尚未明了，SCAP可能是順應(yīng)簡單合成分子正負(fù)控制的關(guān)鍵受體。法圖他汀和SCAP配體可用作對SCAP-介導(dǎo)的SREBP途徑的調(diào)控進行進一步研究的工具并最終用作代謝綜合征藥理學(xué)干預(yù)的種子分子。
示例性材料和方法 熒光素酶報道分子試驗。第0天，將CHO-K1細(xì)胞接種到含培養(yǎng)基A(含5％胎牛血清、100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的Ham’s F-12培養(yǎng)基與Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基的1∶1混合物)的96-孔板上。第2天，采用脂轉(zhuǎn)染試劑(英吉公司)，用pSRE-Luc(一種SRE-1-驅(qū)動的熒光素酶報道分子構(gòu)建物)(Hua等，1995)和pAc-β-gal(β-gal報道分子，其中β-gal受到肌動蛋白啟動子控制)瞬時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培育5小時后，用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞，然后在有或沒有法圖他汀的存在下，在培養(yǎng)基B(含5％無脂質(zhì)血清，100單位/毫升青霉素，100μg/mL硫酸鏈霉素，50μM制甲羥素和50μM甲羥戊酸鈉的Ham’s F-12培養(yǎng)基與Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基的1∶1混合物)中進行培育。培育20分鐘后，溶解每孔中的細(xì)胞，試樣用于測定熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性。由β-半乳糖苷酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性。對于SREBP-1c的N末端成熟形式的過度表達，用pSRE-Luc和pAc-β-gal共轉(zhuǎn)染pCMV-SREBP-1c(1-436)。
SREBP加工過程的Western印跡分析。第0天，將CHO-K1細(xì)胞接種到100mm含培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中。第2天，用PBS洗滌細(xì)胞，然后在有或沒有法圖他汀的存在下，在培養(yǎng)基B中進行培育。第3，細(xì)胞用冷的PBS洗滌一次，然后用含10mM Tris-HCl，pH7.6，100mMNaCl，1％(w/v)SDS和蛋白酶抑制劑混合物(1μg/ml抑胃酶肽A、10μg/ml亮抑酶肽、200μM苯基甲磺?；?的緩沖液處理。測定每個全細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)濃度(BCA試劑盒；皮爾斯公司(Pierce))，然后22-33μg細(xì)胞提取物的等分試樣與0.25體積的緩沖液(250mM Tris-HCl，pH 6.8，10％SD，25％甘油，0.2％(w/v)溴苯酚藍(lán)和5％(v/v)2-巰基乙醇)混合，在95℃加熱7分鐘。樣品在10％SDS-PAGE凝膠上進行分離，用抗SREBP-2的小鼠單克隆抗體(IgG-7D4)印跡(Yang等，1995)。用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑(安瑪西亞公司)觀察特定的帶。
SCAP寡糖的修飾。如本文其他部分所述制備細(xì)胞膜片段。將膜團粒重懸于含有10mM Hepes·KOH(pH 7.4)，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mMEDTA鈉和100mM NaCl的0.1mL緩沖液中。然后，蛋白質(zhì)試樣在30℃、總體積58μL、有或沒有1μg胰蛋白酶存在下培育30分鐘，加入2μL(400單位)大豆胰酶抑制劑終止反應(yīng)。對于用內(nèi)切糖苷酶H的后續(xù)處理，各個樣品接受10μl含有3.5％(重量/體積)SDS和7％(體積/體積)2-巰基乙醇的溶液。在100℃加熱10分鐘，各個樣品相繼接受9μl 0.5M檸檬酸鈉(pH 5.5)，5μL含有17□蛋白酶抑制劑的溶液(濃度1x，對應(yīng)于10μg/mL亮抑酶肽，5μg/mL抑胃酶肽A和2μg/mL抑蛋白酶肽)，然后是1μL(5單位)內(nèi)切糖苷酶H。反應(yīng)在37℃進行過夜，加入20μL含有0.25MTris·HCl(pH 6.8)，2％SD，10％(v/v)甘油，0.05％(重量/體積)溴苯酚藍(lán)和4％2-巰基乙醇的緩沖液終止反應(yīng)。然后將混合物在100℃加熱5分鐘，進行SDS/PAGE(12％凝膠)。
共聚焦顯微鏡分析。將匯合約70％的玻璃底96孔板(Grainer)上的CHO-K1細(xì)胞與0.2μM ER-追蹤紅(英吉公司)和5μM丹酰法圖他汀培育1小時。用配備CSU10轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀(橫濱電子公司(Yokogawa Electric Corporation))和ORCA-CCD相機(濱松光電設(shè)備公司(Hamamatsu Photonics))的卡爾蔡司LSM 510共聚焦顯微鏡獲取和分析熒光圖像。用IPLab軟件(溶液系統(tǒng)公司(Solution Systems))分析圖像。
結(jié)合試驗。如輔助方法中所述制備細(xì)胞膜片段。用含有0.1％FOS-膽堿10(漢普頓研究公司(Hampton Research))的PBS提取膜片段。將提取物與用生物素化法圖他汀飽和的中性鏈親和素-瓊脂糖珠(10μL)混合并培育1小時。結(jié)合蛋白用含有0.1％FOS-膽堿10的PBS洗滌四次，在25μL SDS樣品緩沖液中煮沸，并進行Western印跡。對于競爭試驗，將飽和量的膽固醇或法圖他汀加入膜提取物中，然后與所述珠培育。
動物研究過程。4-5周齡的雄性肥胖(ob/ob)小鼠(C57BL/6J，杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory)，緬因州巴港(Bar Harbor，ME))在拜爾醫(yī)學(xué)院動物研究中心的受控條件下(12小時白天/晚上循環(huán)；25℃)進行飼養(yǎng)。根據(jù)美國國立健康機構(gòu)出版的實驗動物的護理與使用指導(dǎo)(NIH出版號85-23，1996修訂)進行動物實驗。每只籠子飼養(yǎng)5只小鼠，分配后1周小鼠自由攝取標(biāo)準(zhǔn)實驗飼料(印第安納州雷明德的PM公司(Purina Mill，Richmond IN))和水。實驗第一天以及隨后的每一天，下午3-5點間測定每只小鼠的重量以及食物攝取量。重量測定后，處理小鼠接受ip注射法圖他汀(30mg/kg；150mL)，對照小鼠接受10％DMSO的PBS溶液。每天注射持續(xù)4周，直到實驗結(jié)束。
血成分。每天注射法圖他汀A 28天后，小鼠禁食5-6小時，用極高精度的血糖測計儀(Glucometer Precision Xtra，Abbott)測定全血葡萄糖和β-羥基丁酸酯。通過比較病理學(xué)實驗(拜爾醫(yī)學(xué)院)進行血清成分、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇的測定。采用NEFA C試劑盒(弗吉尼亞州里士滿的WC公司(Wako Chemical，Richmond，VA))測定血清非酯化脂肪酸(NEFA)。
肝臟分析。處死小鼠，測定肝臟和附睪脂肪墊重量。用油紅O染色來自各個動物的肝臟凍干切片以觀察肝臟切片中的脂肪滴(甘油三酯)，如先前所述(Abu-Elheiga等，2001)。剩余的肝臟組織在液氮中凍干并在-80℃保存以備進一步分析。
組織甘油三酯和膽固醇含量。采用膽固醇E試劑盒(Wako)和無限度甘油三酯試劑盒(澳大利亞墨爾本的TE公司(Thermo Electron，Melbourne，Australia))，如Chandler等，2003所述測定肝臟甘油三酯和膽固醇的含量。
合成法圖他汀(1)，丹酰法圖他汀(2)和法圖他汀-聚脯氨酸接頭-生物素 偶聯(lián)物(3)。合成法圖他汀(1)2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶。攪拌的同時將丙硫異煙胺(5)(1.03g，5.70mmol)和2-溴-4’-甲基苯乙酮(6)(1.22g，5.70mmol)的乙醇(20ml)混合物在70℃加熱0.5小時，然后冷卻至0℃。對形成的黃色沉淀進行過濾，用冷乙醇洗滌，干燥后得到黃色針狀法圖他汀(1)HBr鹽(1.78g，83％)。熔點190-193℃；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.88(d，J＝6.2Hz，1H)，8.54(s，1H)，8.46(d，J＝1.4Hz，1H)，8.36(dd，J＝1.4，6.2Hz，1H)，7.99(d，J＝7.6Hz，2H)，7.31(d，J＝7.6Hz，2H)，3.03(t，J＝7.6Hz，2H)，2.35(s，3H)，1.80(m，2H)，0.96(t，J＝7.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ161.3，158.5，156.9，146.2，143.2，138.4，130.4，129.5，126.3，122.3，120.3，119.5，35.0，22.4，20.9，13.4；HRMS(m/z)[M+H]+理論值C18H19N2，295.1269；實測值，295.1269。
合成4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺(9)。在壓力管中加入7(1.08g，3.0mmol)、苯甲酮亞胺(0.57g，3.3mmol)、Pd2dba3(86mg，0.15mmol)、BINAP(280mg，0.45mmol)、叔丁醇鈉(1.44g，9.0mmol)和無水甲苯(30mL)并用氬氣吹掃。將壓力管密封并在100℃浴中加熱20小時。冷卻至室溫后，反應(yīng)混合物經(jīng)色譜分離(SiO2，4∶1己烷∶EtOAc)，得到1.35g黃色油狀產(chǎn)物8(98％)。然后，在8(1.35g，2.9mmol)的THF(20mL)溶液中加入2N HCl水溶液(15mL)。室溫下攪拌2小時后，反應(yīng)混合物進行減壓濃縮，然后用EtOAc(100mL)稀釋，用飽和Na2CO3(50mL)溶液洗滌。含水洗滌液用EtOAc(3x40mL)萃取，合并的EtOAc層在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，4∶1己烷∶EtOAc)，得到0.73g白色結(jié)晶9(82％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.61(d，J＝4.8Hz，1H)，7.80(d，J＝8.9Hz，2H)，7.75(d，J＝1.4Hz，1H)，7.67(dd，J＝1.4，4.8Hz，1H)，7.36(s，1H)，6.75(d，J＝8.9Hz，2H)，3.82(br，1H)，2.85(t，J＝7.6Hz，2H)，1.83(m，2H)，1.01(t，J＝7.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ164.9，163.4，157.3，150.0，146.8，140.8，127.7，124.8，119.2，117.8，115.1，111.3，40.4，23.1，13.9；HRMS(m/z)[M+H]+理論值C17H18N3，296.1221；實測值，296.1228。
合成丹酰法圖他汀(2)。向磁力攪拌的9(50mg，0.17mmol)和吡啶(27mg，0.34mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中加入丹酰氯(50mg，0.18mmol)。攪拌17小時后，反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘留物在EtOAc(50mL)和飽和NH4Cl溶液(20mL)間進行分配。水相用EtOAc(2x20mL)提取。合并的提取物用飽和NaHCO3溶液洗滌，在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到黃色結(jié)晶2(65mg，73％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.60(d，J＝4.8Hz，1H)，8.50(d，J＝8.2Hz，1H)，8.36(d，J＝8.3Hz，1H)，8.21(d，J＝8.3Hz，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，2H)，7.70(d，J＝1.5Hz，1H)，7.62(dd，J＝1.5，4.8Hz，1H)，7.61(t，J＝8.3Hz，1H)，7.44(s，1H)，7.43(dd，J＝7.5，8.2Hz，1H)，7.19(d，J＝7.5Hz，1H)，7.04(d，J＝8.6Hz，2H)，6.97(br，1H)，2.87(s，6H)，2.84(t，J＝7.6Hz，2H)，1.81(m，2H)，1.00(t，J＝7.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)

165.5，163.5，156.1，152.2，150.0，140.5，136.7，134.0，131.1，131.0，130.5，129.8，129.7，128.7，127.3，123.1，121.6，119.2，118.3，117.8，115.3，113.8，45.4，40.4，23.1，13.9；HRMS(m/z)[M+H]+理論值 C29H29N4O2S2，529.1732；實測值，529.1733。
合成4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(10)。向磁力攪拌的9(0.57g，1.92mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(5mg，0.4mmol)的THF(20mL)溶液中加入二(叔丁基)碳酸氫酯(0.49g，2.21mmol)。攪拌17小時后，反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘留物在EtOAc(100mL)和飽和NH4Cl溶液(30mL)間進行分配。水相用EtOAc(2x50mL)提取。合并的提取物用飽和NaHCO3溶液洗滌，在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到黃色泡沫狀10(0.33g，43％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.68(d，J＝5.1Hz，1H)，7.93(d，J＝8.4Hz，2H)，7.79(s，1H)，7.72(d，J＝5.1Hz，1H)，7.52(s，1H)，7.47(d，J＝8.4Hz，2H)，6.58(s，1H)，2.90(t，J＝7.5Hz，2H，)，1.87(m，2H)，1.55(s，9H)，1.03(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ163.1，156.5，152.3，149.6，140.6，138.5，128.7，128.1，127.0，118.3，117.7，114.3，112.9，80.6，41.0，28.4，24.1，13.7；HRMS(m/z)[M+H]+理論值C22H26N3O2，396.1746；實測值396.1738。
合成中間體12。在N2氣氛中，將10(200mg，0.51mmol)加入NaH(60％在礦物油中的分散體，24mg，0.6mmol)在DMF(5mL)的懸浮液中，將該混合物在室溫下攪拌2小時。然后，加入用DMF(2mL)配制的NaI(91mg，0.6mmol)和4-溴丁酸乙酯(0.12g，0.6mmol)。攪拌18小時后，將該反應(yīng)混合物倒入水(20mL)中，用EtOAc(2x50mL)提取。合并的提取物在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，2∶1己烷∶AcOEt)，得到黃色油狀11(35mg，13％)。然后在11(30mg，2.9mmol)的THF(1mL)和MeOH(0.5mL)的溶液中加入2N NaOH水溶液(0.2mL)。室溫下攪拌18小時后，將該反應(yīng)混合物減壓濃縮，然后用EtOAc(10mL)稀釋，用飽和NH4Cl溶液(5mL)洗滌。含水洗滌液用EtOAc(2×10mL)提取，合并的EtOAc層在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，EtOAc)，得到14mg白色泡沫狀12(50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.69(d，J＝5.1Hz，1H)，7.95(d，J＝8.4Hz，2H)，7.80(s，1H)，7.73(d，J＝5.1Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.51(d，J＝8.4Hz，2H)，6.58(s，1H)，2.92(m，4H)，2.33(m，2H)，1.90(m，4H)，1.50(s，9H)，1.02(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)

174.2，162.9，156.3，152.9，149.6，140.6，138.5，129.3，128.9，127.2，119.0，117.9，114.8，113.3，80.8，41.0，40.3，32.1，28.4，24.1，21.1，13.7；HRMS(m/z)[M+H]+理論值 C26H32N3O4，482.2114；實測值，482.2120。
合成4-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基)-N-異丙基丁酰胺(14)。在12(17mg，0.035mmol)、三乙胺(17μl，0.14mmol)和異丙基胺(4μL，0.046mmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入HATU(16mg，0.042mmol)。攪拌18小時后，將該反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘留物在EtOAc(20mL)和飽和NH4Cl溶液(10mL)間進行分配。水相用EtOAc(2x10mL)提取。合并的提取物用飽和NaHCO3溶液洗滌，在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到黃色油狀13(14mg，77％)。然后在13(12mg，2.9mmol)的THF(1mL)溶液中加入TFA(0.2mL)。室溫下攪拌18小時后，將該反應(yīng)混合物減壓濃縮，然后用EtOAc(20mL)稀釋，用飽和NH4Cl溶液(10mL)洗滌。含水洗滌液用EtOAc(2×5mL)提取，合并的EtOAc層在Na2SO4上干燥并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)色譜純化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到6.2mg黃色泡沫狀14(63％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.69(d，J＝5.4Hz，1H)，8.04(1H，s)，7.96(d，J＝8.7Hz，2H)，7.96(s，1H)，7.72(d，J＝5.4Hz，1H)，7.51(s，1H)，6.65(d，J＝8.7Hz，2H)，3.95(m，1H)，3.03(m，4H，)，2.35(m，2H)，1.92(m，4H)，1.25(d，J＝6.3Hz，6H)，1.03(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)

171.6，162.9，156.3，152.9，140.6，138.5，129.3，128.9，127.2，119.0，117.9，114.8，113.3，42.2，41.0，40.3，32.1，24.1，23.2，21.1，13.7；HRMS(m/z)[M+H]+理論值C24H31N4O，423.2219；實測值423.2216。
合成法圖他汀-聚脯氨酸接頭-生物素偶聯(lián)物(3)法圖他汀-KPGQFLYELKKPPPPPPPPPKK(SEQ ID NO15)-氨基己酸-生物素。在Rink-Amide MBHA樹脂上使N-α-Fmoc-保護的氨基酸、N-ε-Fmoc-ε-氨基己酸、12、生物素偶聯(lián)合成偶聯(lián)物3和4，如上所述反相HPLC進行純化(Sato等，2007)。偶聯(lián)物3理論值C155H238N35O29S2+為3119.9.實測值(MALDI-TOF-MS)3119.7[M+H]+。
質(zhì)粒。pSRE-Luc，pCMV-SREBP-1c(1-436)，pCMV-PLAP-BP2(513-1141)和pCMV-SCAP由J.L.Goldstein和M.S.Brown(德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心(University of Texas Southwestern Medical Center))(Sakai等，1998；Hua等，1995)贈送。
抗體。單克隆抗-SREBP-1 IgG(2A4)、抗-SCAP IgG(9D5)和抗-ATF6IgG(H-280)購自桑塔克魯茨生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)。單克隆抗-SREBP-2 IgG-7D4由J.L.Goldstein和M.S.Brown(德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心)贈送。多克隆抗-FA、抗-ACC、抗-SCD1和抗-ACL IgG購自BD生物科學(xué)公司(BD Biosciences)。
細(xì)胞培養(yǎng)。中國倉鼠卵巢細(xì)胞K1(CHO-K1)細(xì)胞在含有5％胎牛血清、100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基/Ham′s F12培養(yǎng)基[1∶1]中，37℃、5％CO2下進行培養(yǎng)。人雄激素-非依賴性前列腺癌細(xì)胞(DU145)在含有2mM L-谷胺酰胺，1.0mM丙酮酸鈉，0.1mM非必需氨基酸和1.5g/L碳酸氫鈉以及10％胎牛血清，100單位/mL青霉素和100μg/mL硫酸鏈霉素的伊格爾氏最少必需培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2下進行培養(yǎng)。
細(xì)胞膜片段的制備。收集細(xì)胞，然后重新懸浮在緩沖液(10mMHepes·KOH(pH 7.4)、10mM KCl、1.5mM MgCl2和1mM EDTA鈉)中，通過22-號針頭，并在1,000×g離心5分鐘。然后將核后上清液在15,000xg離心30分鐘，去除上清液。
寡核苷酸微陣列分析。在1μg/mL IGF1的存在下，在無血清培養(yǎng)基中用5μM法圖他汀或僅DMSO處理DU145前列腺癌細(xì)胞，在TRI反應(yīng)試劑(分子研究中心)中提取總RNA并通過RNeasy微量試劑盒(恰根公司)進一步分離。在醫(yī)學(xué)微陣列核心實驗室的拜爾學(xué)院(Baylor College of Medicine MicroarrayCore Facility)通過Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0分析純化的mRNA。代表超過39,000種轉(zhuǎn)錄物的由大約45,000種探針組構(gòu)成的陣列來源于大約33,000種已證實的人類基因(阿弗麥特有限公司(Affymetrix，Inc.))。
RT-PCR實驗。從DU145細(xì)胞將總RNA提取到TRI反應(yīng)試劑(分子研究中心)中并用RNeasy微量試劑盒(恰根公司)進行分離。采用Access RT-PCR系統(tǒng)(普美加)對RNA樣品進行RT-PCR分析。RT-PCR反應(yīng)液包含總RNA，1μM的各種引物，0.2mM dNTP，1mM MgSO4，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(2單位)和Tf1DNA聚合酶(2單位)，終體積25μL。所用引物對如下對于低密度脂蛋白受體(LDLR)是5′-TCA GAC CGG GAC TGC TTG GAC GGC TCA GTC-3′(SEQ ID NO16)和5′-CCA CTT AGG CAG TGG AAC TCG AAG GCC G-3′(SEQ ID NO17)；對于硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)是5′-GCC TGC TTGATA ATA TAT AAA C-3′(SEQ ID NO18)和5′-CAC TTG AAT TGA GCTTTA G-3′(SEQ ID NO19)；對于ATP檸檬酸裂解酶(ACL)是5′-AAG AAAAAG TGT CAG ACA GCT GG-3′(SEQ ID NO20)和5′-TGG ACT GAA GGGGTG TTA GC-3′(SEQ ID NO21)；對于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoAR)是5′-GCC CGA CAG TTC TGA ACTGGA ACA-3′(SEQ ID NO22)和5′-GAA CCT GAG ACC TCT CTG AAA GAG-3′(SEQ ID NO23)；對于甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MVD)是5′-CTG CCT GACTGC CTC AGC-3′(SEQ ID NO24)和5′-ACC TCT CCT GAC ACC TGG G-3′(SEQ ID NO25)；對于胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)是5′-AAG ACT TCA GGGTAA GTC ATC A-3′(SEQ ID NO26)和5′-CGT GTA TAA TGG TGT CTA TCAG-3′(SEQ ID NO27)。擴增條件如下在94℃1次循環(huán)持續(xù)4分鐘，然后在94℃變性40秒，在50℃退火40秒，在68℃延長2分鐘，對于SCD和HMGCoA R是22次循環(huán)，對于LDLR和INSIG1是在58℃退火并進行24次循環(huán)，或者對于ACL是在60℃退火并進行24次循環(huán)，對于MVD是在55℃退火并進行30次循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠分析擴增的DNA并用Scion-image軟件進行定量。
PLAP-BP2切割。第0天，將CHO-K1細(xì)胞接種到含培養(yǎng)基A的96孔板上。第2天，采用脂轉(zhuǎn)染試劑(英吉公司)，用pCMV-PLAP-BP2(513-1141)、pCMV-SCAP和pAc-β-gal瞬時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培育5小時后，細(xì)胞用PBS洗滌，然后在有或沒有法圖他汀(20μM)或甾醇(10μg/mL膽固醇和1μg/mL 25-羥基膽固醇)的存在下，在培養(yǎng)基B中培育。培養(yǎng)20小時后，測定培養(yǎng)基試樣中分泌的堿性磷酸酶活性。溶解每孔中的細(xì)胞，用于測定β-半乳糖苷酶活性。通過β-半乳糖苷酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化堿性磷酸酶活性。
酶活性和Western印跡分析。在液氮中將凍干的肝臟部分研磨成粉末。將粉末化組織懸浮在含有0.1mM PMSF、5mM苯甲脒和5mg/ml蛋白酶抑制劑混合物(羅氏(Roche))的10ml PBS中，并用Polytron(3x30秒，高速)勻漿化，短時超聲以降解DNA。16,000xg離心20分鐘分離提取物。測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度并用針對FAS、ACC、SCD1和ACL的抗體進行Western印跡分析。掃描感興趣的特定蛋白質(zhì)帶的強度并針對β-肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)化進行定量。如上所述測定肝提取物中FAS和ACC的活性(Mao等，2006)。
參考文獻 說明書中提到的所有專利和出版物表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物的內(nèi)容被納入本文作為參考，如同每份出版物單獨且特定地納入本文作為參考。
專利 美國專利US 5,399,363 美國專利US 5,466,468 美國專利US 5,543,158 美國專利US 5,580,579 美國專利US 5,629,001 美國專利US 5,641,515 美國專利US 5,725,871 美國專利US 5,756,353 美國專利US 5,780,045 美國專利US 5,792,451 美國專利US 5,804,212 美國專利US 6,537,514 美國專利US 6,613,308 出版物 Abu-Elheiga，L.，Matzuk，M.M.，Abo-Hashema，K.A.& Wakil，S.J.(2001)Science 291，2613-6. Abu-Elheiga，L.，Oh，W.，Kordari，P.& Wakil，S.J.(2003)Proc Natl Acad SciUSA 100，10207-12. Abu-Elheiga，L.，Almarza-Ortega，D.B.，Baldini，A.和Wakil，S.J.(1997)JBiol Chem 272，10669-10677 Abu-Elheiga，L.，Brinkley，W.R.，Zhong，L.，Chirala，S.S.，Woldegiorgis，G.和Wakil，S.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，1444-1449. Abu-Elheiga，L.，Jayakumar，A.，Baldini，A.，Chirala，S.S.和Wakil，S.J.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4011-4015. Boden G，C.X.，Ruiz J，White JV，Rossetti L.(1994)J Clin Invest.；93(6)2438-46 93(6)，2438-2446. Boizard，M.，Le Liepvre，X.，Lemarchand，P.，F(xiàn)oufelle，F(xiàn).，F(xiàn)erre，P.&Dugail，I.(1998)J Biol Chem 273，29164-71. Brown，M.S.&Goldstein，J.L.(1997)Cell 89，331-40. Chalkley，S.M.，Hettiarachchi，M.，Chisholm，D.J.和Kraegen，E.W.(1998)Metabolism 47(9)，1121. Choi，Y.，Kawazoe，Y.，Murakami，K.，Misawa，H.&Uesugi，M.(2003)JBiol Chem 278，7320-4. Cohen，P.，Miyazaki，M.，Socci，N.D.，Hagge-Greenberg，A.，Liedtke，W.，Soukas，A.A.，Sharma，R.，Hudgins，L.C.，Ntambi，J.M.和Friedman，J.M.(2002)Science 297(5579)，240-243. Goldstein，J.L.，Basu，S.K.&Brown，M.S.(1983)Methods Enzymol(酶學(xué)方法)98，241-60. Goldstein，J.L.，DeBose-Boyd，R.A.&Brown，M.S.(2006)Cell 124，35-46. Grand-Perret，T.，Bouillot，A.，Perrot，A.，Commans，S.，Walker，M.&Issandou，M.(2001)Nat Med 7，1332-8. Hastings，N.，Agaba，M.，Tocher，D.R.，Leaver，M.J.，Dick，J.R.，Sargent，J.R.和Teale，A.J.(2001)PNAS 98(25)，14304-14309. Hookman，P.和Barkin，J.S.(2003)The American Journal ofGastroenterology(美國腸胃病學(xué)雜志)98(9)，2093-2097. Horton，J.D.，Bashmakov，Y.，Shimomura，I.& Shimano，H.(1998)Proc NatlAcad Sci USA 95，5987-92. Horton，J.D.，Shah，N.A.，Warrington，J.A.，Anderson，N.N.，Park，S.W.，Brown，M.S.& Goldstein，J.L.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100，12027-32. Horton，J.D.，Shimomura，I.，Ikemoto，S.，Bashmakov，Y.和Hammer，R.E.(2003)J.Biol.Chem.278(38)，36652-36660. Hua，X.，Nohturfft，A.，Goldstein，J.L.&Brown，M.S.(1996)Cell 87，415-26. Hua，X.，Sakai，J.，Ho，Y.K.，Goldstein，J.L.and Brown，M.S.1995 J BiolChem 270，29422-7. Ingalis，A.M.Dickie，M.M.和Snell，G.D.(1950)J.Hered 41，317-318 Kim，J.B.&Spiegelman，B.M.(1996)Genes Dev 10，1096-107. Ktorza A，B.C.，Parent V，Penicaud L，F(xiàn)roguel P，Lathrop M，Gauguier D.(1997)Diabetes Metab.增刊2，38-46. Kubota N，T.Y.，Miki H，Tamemoto H，Yamauchi T，Komeda K，Satoh S，Nakano R，Ishii C，Sugiyama T，Eto K，Tsubamoto Y，Okuno A，Murakami K，Sekihara H，Hasegawa G，Naito M，Toyoshima Y，Tanaka S，Shiota K，Kitamura T，F(xiàn)ujita T，Ezaki O，Aizawa S，Kadowaki T等，(1999)Mol.Cell 4，597-609. Liang，G.，Yang，J.，Horton，J.D.，Hammer，R.E.，Goldstein，J.L.&Brown，M.S.(2002)J Biol Chem 277，9520-8. Mao，J.，DeMayo，F(xiàn).J.，Li，H.，Abu-Elheiga，L.，Gu，Z.，Shaikenov，T.E.，Kordari，P.，Chirala，S.S.，Heird，W.C.&Wakil，S.J.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103，8552-7. Marquardt，A.，Stohr，H.，White，K.和Weber，B.H.F.(2000)Genomics 66(2)，175. Matsusue，K.，Haluzik，M.，Lambert，G.，Yim，S.-H.，Gavrilova，O.，Ward，J.M.，Brewer，B.，Jr.，Reitman，M.L.和Gonzalez，F(xiàn).J.(2003)J.Clin.Invest.111(5)，737-747. Miyazaki，M.，Kim，Y.-C.，Gray-Keller，M.P.，Attie，A.D.和Ntambi，J.M.(2000)J.Biol.Chem.275(39)，30132-30138. Moller，D.E.和Kaufman，K.D.(2005)Annual Review of Medicine(醫(yī)學(xué)年度綜論)56(1)，45-62. Nakamura，M.T.和Nara，T.Y.(2004)Annual Review of Nutrition(營養(yǎng)學(xué)年度綜論)24(1)，345-376. Ntambi，J.M.，Miyazaki，M.，Stoehr，J.P.，Lan，H.，Kendziorski，C.M.，Yandell，B.S.，Song，Y.，Cohen，P.，F(xiàn)riedman，J.M.和Attie，A.D.(2002)PNAS99(17)，11482-11486. Oh，W.，Abu-Elheiga，L.，Kordari，P.，Gu，Z.，Shaikenov，T.，Chirala，S.S.&Wakil，S.J.(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102，1384-9. Osborne，T.F.(2000)J Biol Chem 275，32379-82. Rader，D.J.(2001)Nat Med 7，1282-4. Remingtoh′s Pharmaceutical Sciences(《雷明登藥物科學(xué)》)，第18版，馬克印刷公司，1990。
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。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，通過本發(fā)明的內(nèi)容，可開發(fā)執(zhí)行基本相同功能或?qū)崿F(xiàn)基本相同結(jié)果的過程、機器、制造、物質(zhì)組成、方式、方法或步驟，可根據(jù)本發(fā)明利用這里所述相應(yīng)的實施方式。因此，所附權(quán)利要求書表示包括在這些過程、機器、制造、物質(zhì)組成、方式、方法或步驟的范圍內(nèi)。
序列表
<110>上杉 志成(Uesugi，Motonari)
S.J.瓦基爾(Wakil，Salih)
L.阿布-艾海格(Abu-Elheiga，Lutfi)
毛謙(Mao，Qian)
紙透 伸治(Kamisuki，Shinji)
釘宮 啟(Kugimiya，Akira)
<120>用于治療代謝疾病的組合物和方法
<130>HO-P03413WO0
<140>未指定
<141>2008-02-01
<150>US 60/887,994
<151>2007-02-02
<150>US 61/012,310
<151>2007-12-07
<160>27
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>1
tcagaccggg actgcttgga cggctcagtc 30
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>2
ccacttaggc agtggaactc gaaggccg 28
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>3
gcctgcttga taatatataa a21
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>4
cacttgaatt gagctttag 19
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>5
aagaaaaagt gtcagacagct gg 23
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>6
tggactgaag gggtgttagc 20
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>7
gcccgacagt tctgaactgg aaca 24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>8
gaacctgaga cctctctgaa agag 24
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>9
ctgcctgact gcctcagc18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>10
acctctcctg acacctggg 19
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>11
aagacttcag ggtaagtcat ca 22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>12
cgtgtataat ggtgtctatc ag 22
<210>13
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>13
gatccccgcc acattgagct cctctcttca agagagagag gagctcaatg tggctttttg 60
gaaa 64
<210>14
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>14
agcttttcca aaaagccaca ttgagctcct ctctctcttg aaggaggagc tcaatgtggc 60
ggg63
<210>15
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>15
Lys Pro Gly Gln Phe Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Lys Lys
20
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>16
tcagaccggg actgcttgga cggctcagtc 30
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>17
cttaggcagt ggaactcgaaggccg 25
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>18
gcctgcttga taatatataa ac 22
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>19
cacttgaatt gagctttag 19
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>20
aagaaaaagt gtcagacagc tgg 23
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>21
tggactgaag gggtgttagc 20
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>22
gcccgacagt tctgaactgg aaca 24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>23
gaacctgaga cctctctgaa agag 24
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>24
ctgcctgact gcctcagc18
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>25
acctctcctg acacctggg 19
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>26
aagact tcag ggtaagtcat ca 22
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工引物
<400>27
cgtgtataat ggtgtctatc ag 2權(quán)利要求
1.一種選自下組的化合物4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；其藥學(xué)上可接受的鹽；其立體異構(gòu)體；以及它們的任意組合或混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物選自N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，所述化合物進一步限定為包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。
4.一種治療個體代謝疾病的方法，所述方法包括給予所述個體治療有效量的具有以下通式的至少一種化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體
A-B-C
式中，A、B和C相同或不同，各自包括5-、6-或7-元環(huán)，所述環(huán)為雜環(huán)或非雜環(huán)、取代的環(huán)或未取代的環(huán)，
A、B和C中的任一個、任兩個、或所有三個都未取代或具有一個或多個取代基，任意取代基可與任何其他取代基相同或不同，所述取代基選自下組
a)羥基；
b)C1-10烷基；
c)C2-10烯基；
d)C2-10炔基；
e)C3-6環(huán)烷基；
f)芳基；
g)雜芳基；
其中所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，u)中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基可任選地被1-5個選自下組的取代基進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，A被取代，包括1-5個原子的側(cè)鏈。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述1-5個原子的側(cè)鏈?zhǔn)?-5個碳原子的側(cè)鏈。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一種化合物選自2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；2-苯基-4-對甲苯基噻唑；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶；4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑；2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4′-甲基[1，1′-聯(lián)苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸；2-乙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-對甲苯基噻唑-5-羧酸甲酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯；N-環(huán)己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺?；桨罚籒-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8-喹啉磺酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2-噻吩磺酰胺；和它們的任意組合。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述至少一種化合物選自4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-芐基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(環(huán)丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-異丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；藥學(xué)上可接受的鹽；其立體異構(gòu)體；和它們的任意組合。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述至少一種化合物選自2-丙基-4-(4-對甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶，N-異丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；藥學(xué)上可接受的鹽；其立體異構(gòu)體；和它們的任意組合。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述代謝疾病是肥胖。
11.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述代謝疾病選自肥胖、高脂血癥、糖尿病、脂肪肝、高血壓、前列腺癌和心血管病。
12.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，給予所述個體另一種療法。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述代謝疾病是肥胖，所述另一種療法包括選自下組的療法飲食療法、物理療法、行為療法、外科手術(shù)、藥物療法和它們的組合。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述代謝疾病是糖尿病，所述另一種療法包括選自下組的療法飲食療法、物理療法和藥物療法。
15.一種藥盒，其包含如權(quán)利要求1所述的化合物，所述化合物裝在合適的容器中。
16.如權(quán)利要求15所述的藥盒，其特征在于，所述藥盒還包括代謝疾病的另一種療法。
17.一種抑制個體SREBP途徑的成員的方法，所述方法包括以下步驟向個體提供治療有效量的具有以下通式的至少一種化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體
A-B-C
式中，A、B和C相同或不同，各自包括5-、6-或7-元環(huán)，所述環(huán)為雜環(huán)或非雜環(huán)、取代的環(huán)或未取代的環(huán)，
A、B和C中的任一個、任兩個、或所有三個都未取代或具有一個或多個取代基，任意取代基可與任何其他取代基相同或不同，所述取代基選自下組
a)羥基；
b)C1-10烷基；
c)C2-10烯基；
d)C2-10炔基；
e)C3-6環(huán)烷基；
f)芳基；
g)雜芳基；
其中所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，u)中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基可任選地被1-5個選自下組的取代基進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述SREBP途徑的成員是SREBP-1、SREBP-2或兩者。
19.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是氫、甲基、乙基或丙基；
R2、R3和R4相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基可任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa ；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
R5是取代的烷基、芳基、雜芳基或-SO2R，其中R是取代的烷基、芳基或雜芳基；和
Y1是氮，Y2和Y3相同或不同，是硫或亞甲基。
20.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
R2、R3和R4相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
R5是取代的烷基、芳基、雜芳基或-SO2R，其中R是取代的烷基、芳基或雜芳基；
X是-CH2-、氧、硫、取代的氨基、-(C＝O)-或-(C＝O)NH-；和
Y1是氮，Y2和Y3相同或不同，是硫或亞甲基。
21.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是氫、甲基、乙基或丙基；
R2、R3和R4相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
Y1是氮，Y2和Y3相同或不同，是硫或亞甲基。
22.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
R2、R3和R4相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa ；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；和
其中，Y1是氮，Y2是硫，Y3是-CH-；或者Y1是氮，Y2是-CH-，Y3是硫；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是-CH-和Y3是-CH-。
23.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是氫、甲基、乙基或丙基；
R2、R3和R4相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合、
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
Z是-CH＝CH-、硫、氧或烷基取代的氨基。
24.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是氫、甲基、乙基或丙基；
R2、R3和R4相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
其中，Y1是氮，Y2是烷基取代的碳，Y3是硫；或者Y1是氮，Y2是氧，Y3是烷基取代的碳；或者Y1是氮，Y2是烷基取代的碳，Y3是氧；或者Y1是烷基取代的碳，Y2是硫，Y3是氮；或者Y1是烷基取代的碳，Y2是氮，Y3是硫；或者Y1是烷基取代的碳，Y2是烷基取代的碳氮，Y3是氧；或者Y1是烷基取代的碳，Y2是氧，Y3是氮；或者Y1是烷基取代的碳，Y2是氮，Y3是硫；或者Y1是氮，Y2是氮，Y3是氧；或者Y1是氮，Y2是氧，Y3是氮；或者Y1是氮，Y2是氮，Y3是硫；或者Y1是氮，Y2是硫，Y3是氮；或者Y1是氮，Y2是-CH-，Y3是烷基取代的氨基；或者Y1是氮，Y2是烷基取代的氨基，Y3是-CH-；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是氮，Y3是-CH-；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是_CH_，Y3是氮；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是氮，Y3是氮；或者Y1是-CH＝N-，Y2是-CH-，Y3是氮；或者Y1是-CH＝N-；Y2是氮，Y3是-CH-。
25.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
X是-CH2-、氧、硫、-(C＝O)-、-(C＝O)NH-；
R2、R3相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
Y1是氮，Y2是硫，Y3是-CH-；或者Y1是氮，Y2是-CH-，Y3是硫；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是-CH-，Y3是-CH-；和
Z是-CH＝CH-、硫、氧、或烷基取代氨基。
26.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是氫、甲基、乙基或丙基；
R2和R3相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
X1是氮，X2是-CH-，X3是-CH-；或者X1是-CH-，X2是氮，X3是-CH-；或者X1是-CH-，X2是-CH-，X3是氮。
27.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是氫、甲基、乙基或丙基；
R2和R3相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合；
Y1是氮，Y2是硫，Y3是-CH-；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是-CH-，Y3是-CH-；或者Y1是氮，Y2是-CH-，Y3是硫；和
Z是-CH＝CH-、硫、氧、或烷基取代的氨基。
28.一種具有以下通式的化合物
式中，R1是取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
X是-CH-、氧、硫、烷基取代的氨基、-(C＝O)-或-(C＝O)NH-；
Y1是氮，Y2是硫，Y3是-CH-；或者Y1是-CH＝CH-，Y2是-CH-，Y3是-CH-；或者Y1是氮，Y2是-CH-，Y3是硫；和
Z是-CH＝CH-、硫、氧、或烷基取代的氨基；和
R2和R3相同或不同，選自下組
a)羥基；
b)取代或未取代的C1-10烷基；
c)取代或未取代的C2-10烯基；
d)取代或未取代的C2-10炔基；
e)取代或未取代的C3-6環(huán)烷基；
f)取代或未取代的芳基；
g)取代或未取代的雜芳基；
其中，所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任選地被1-5個選自下組的基團取代
1)羥基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)鹵素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)單取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)單取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它們的任意組合，
其中，2)、3)或6)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，h)、i)或l)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
m)鹵素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)單取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)單取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中，所述單取代的氨基、二取代的氨基、單取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一個或多個具有選自下組的取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基、雜芳基、亞砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它們的任意組合，
其中，所述u)中的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基任選地被1-5個選自下組的基團進一步取代
i)羥基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
其中，ii)、iii)或vi)中的Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
vii)鹵素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)單取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)單取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它們的任意組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用法圖他汀A和/或其衍生物和/或類似物的一種或多種代謝疾病的治療和/或預(yù)防。在其他方面，用于治療和/或預(yù)防一種或多種代謝疾病的化合物采取A-B-C三部分結(jié)構(gòu)，其中A、B和C是相同或不同結(jié)構(gòu)，如本文詳述。在具體方面，代謝疾病包括例如肥胖或糖尿病。
文檔編號A61K31/425GK101674730SQ200880008035
公開日2010年3月17日 申請日期2008年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者上杉志成, S·J·瓦基爾, L·阿布-艾海格, 謙 毛, 紙透伸治, 釘宮啟 申請人:貝勒醫(yī)學(xué)院