專利名稱：：結(jié)核分枝桿菌持留基因的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及用于預(yù)防分枝桿菌感染、特別是持續(xù)性感染的組合物和方法。具體來說，本發(fā)明提供了使用新鑒定的分枝桿菌在宿主內(nèi)生存/持留所必需的分枝桿菌基因(和/或相應(yīng)的基因產(chǎn)物)的疫苗組合物和方法。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是世界上發(fā)病率和死亡率的主導(dǎo)性感染病因之一，據(jù)估計每年有八百八十萬發(fā)生結(jié)核病的新患者[1]。人類通過呼吸途徑感染到結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。在成功植入后，結(jié)核分枝桿菌在肺中復(fù)制。這種最初的感染可能引起疾病；但是，它通常被宿主的免疫系統(tǒng)所控制，引起潛伏性感染。鑒定結(jié)核分枝桿菌在哺乳動物組織中的存活/持留所需的基因，可以導(dǎo)致用于藥物和疫苗開發(fā)的關(guān)鍵靶的鑒定[2]。通過研究結(jié)核分枝桿菌突變株在小鼠中的體內(nèi)生長情況，已經(jīng)描述了幾種缺陷生長表型[2，3]。但是，這些表型還沒有在其它動物模型中進(jìn)行廣泛的表征，特別是表現(xiàn)出干酪樣壞死的表型，干酪樣壞死是人類中對結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答的標(biāo)志。以前已經(jīng)開發(fā)了高通量技術(shù)例如TraSH(轉(zhuǎn)座子位點雜交)，用于在微陣列分析的基礎(chǔ)上差減鑒定減毒的轉(zhuǎn)座子(Tn)突變株[4，5]。最近，Lamichhane等已經(jīng)描述了用于確定的突變體分析的設(shè)計者陣列(DesignerArraysforDefinedMutantAnalysis(DeADMAn))，這是一種高通量、高靈敏度的方法，用于差減鑒定以前存檔的、基因型確定的減毒結(jié)核分枝桿菌HimarlTn突變株在小鼠靜脈感染后的存活[6]。對于提供用于成功預(yù)防分枝桿菌感染、特別是用于預(yù)防持續(xù)性的、潛伏性的分枝桿菌感染的建立和維持的組合物和方法，一直存在著需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于成功預(yù)防分枝桿菌感染、特別是用于預(yù)防持續(xù)性的、潛伏性的分枝桿菌感染的建立和維持的組合物和方法。本發(fā)明是基于結(jié)核分枝桿菌(Mtb)在宿主內(nèi)存活/持留所必需的Mtb基因的鑒定。這些必需基因為Mtb所需，以便細(xì)菌在宿主內(nèi)建立和維持感染，特別是為了建立和維持持續(xù)性的、潛伏性的感染。例如，可以給個體施用含有基因編碼的一種或多種重組蛋白的組合物，以便引發(fā)針對蛋白的免疫應(yīng)答(體液的和/或細(xì)胞的)?；蛘撸虮旧砜梢灾苯幼鳛镈NA疫苗施用，在這種情況下在宿主內(nèi)翻譯出蛋白?；蛞部梢哉显谒拗骰蚪M中或宿主中的質(zhì)粒中，在那里基因被宿主表達(dá)，并出于接種和免疫刺激的目的給宿主施用(例如重組BCG)。此外，這些基因的鑒定允許開發(fā)出減毒的分枝桿菌用作接種劑。在這樣的減毒分枝桿菌中，與持留性有關(guān)的基因被突變，使得它們的基因產(chǎn)物完全或部分失活。蛋白的失活產(chǎn)生了非致病性的細(xì)菌，其缺少在宿主內(nèi)建立和維持感染的能力，但仍然能夠引發(fā)針對其它抗原性決定簇的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的目標(biāo)是提供適用于接種或引發(fā)免疫應(yīng)答的組合物，含有a.至少一種由下列基因編碼的重組蛋白由i)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500和2884的MT編號、或ii)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c和2817c的Rv編號所表示的基因，或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白的至少一種核酸分子；或c.包含至少一種所述核酸分子的宿主。在一個實施方案中，至少一種上面列出的核酸序列是載體例如質(zhì)粒或病毒載體的一部分。在另一個實施方案中，宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的至少一種核酸分子。組合物還可以含有生理相容的載體。宿主可以是例如酵母、細(xì)菌(例如大腸桿菌(Escherichiacoli)、BCG、其它分枝桿菌等)，或任何其它的核酸投送或蛋白表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了預(yù)防接種以對抗持續(xù)性分枝桿菌感染的組合物。組合物含有a.至少一種由下列基因編碼的重組蛋白由i)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號、或ii)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號所表示的基因，或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白的至少一種核酸分子；或c.包含至少一種所述核酸分子的宿主。在一個實施方案中，至少一種核酸是載體例如質(zhì)粒或病毒載體的一部分。在另一個實施方案中，宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的至少一種核酸分子。組合物可以含有生理相容的載體。宿主可以是例如酵母、細(xì)菌(例如大腸桿菌、BCG、其它分枝桿菌等)，或任何其它的核酸投送或蛋白表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了給個體預(yù)防接種以對抗持續(xù)性分枝桿菌感染的方法。方法包括給所述個體施用疫苗組合物的步驟，該組合物含有a.至少一種由下列基因編碼的重組蛋白由i)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號、或ii)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號所表示的基因，或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白的至少一種核酸分子；或c.帶有至少一種所述核酸分子的宿主。在一個實施方案中，至少一種核酸是載體例如質(zhì)?；虿《据d體的一部分。在另一個實施方案中，宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的至少一種核酸分子。組合物還可以含有生理相容的載體。宿主可以是例如酵母、細(xì)菌(例如大腸桿菌、BCG、其它分枝桿菌等)，或任何其它的核酸投送或蛋白表達(dá)系統(tǒng)。用藥步驟可以通過各種不同的途徑來進(jìn)行，包括但不限于靜脈內(nèi)、氣溶膠、皮下、皮內(nèi)和口服途徑。本發(fā)明還提供了減毒的、非致病性分枝桿菌。減毒的分枝桿菌在選自下列基因的至少一個基因中含有至少一個突變i)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號；ii)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號；以及iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因；其中所述至少一個突變導(dǎo)致所述至少一個基因編碼的蛋白或多肽的生物學(xué)活性或功能降低或消除。在一個實施方案中，分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明還提供了給個體預(yù)防接種以對抗分枝桿菌感染的方法，方法包括給所述個體施用含有減毒的、非致病性分枝桿菌的組合物的步驟，其中所述減毒的分枝桿菌在選自下列基因的至少一個基因中含有至少一個突變i)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號；ii)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號；以及iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因；其中所述至少一個突變導(dǎo)致所述至少一個基因編碼的蛋白或多肽的生物學(xué)活性或功能降低或消除。在一個實施方案中，分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明還提供了藥理劑和/或用于鑒定藥理劑的機(jī)制，所述藥理劑抑制或阻止下述基因編碼的蛋白的生物學(xué)活性或功能i)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號、或ii)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號所表示的基因；或iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因。本發(fā)明還提供了在需要的患者中治療分枝桿菌感染的方法，包括給所述患者施用藥理劑的步驟，所述藥理劑抑制或阻止下述基因編碼的蛋白的生物學(xué)活性或功能i)選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號、或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號所表示的基因；或iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因。本發(fā)明還提供了給個體預(yù)防接種以對抗分枝桿菌感染的方法。方法包括給所述個體施用疫苗組合物的步驟，所述組合物含有a.至少一種由下列基因編碼的重組蛋白由i)選自0361、1102、2050、2500和2884的MT編號、或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c和2817c的Rv編號所表示的基因，或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白的至少一種核酸分子；或c.包含至少一種所述核酸分子的宿主。在一個實施方案中，至少一種核酸是載體例如質(zhì)粒或病毒載體的一部分。在另一個實施方案中，宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的至少一種核酸分子。組合物還含有生理相容的載體。宿主可以是例如酵母、細(xì)菌(例如大腸桿菌、BCG、其它分枝桿菌等)，或任何其它的核酸投送或蛋白表達(dá)系統(tǒng)。用藥步驟可以通過各種不同的途徑來進(jìn)行，包括但不限于靜脈內(nèi)、氣溶膠、皮下、皮內(nèi)和口服途徑。附圖簡述圖1A和B微陣列和實時PCR分析后的結(jié)果。A、在微陣列分析后發(fā)現(xiàn)了34種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株，在豚鼠或小鼠氣溶膠模型中減毒存活。比較豚鼠與小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的減毒存活(attenuatedforsurvivall)的突變株，它們之間存在高度的一致性(κ系數(shù)＝0.63，一致性＝0.83)，以及B、在實時PCR分析后發(fā)現(xiàn)了18種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株，在豚鼠或小鼠氣溶膠模型中減毒存活。同樣，比較豚鼠與小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的減毒存活的突變株，它們之間存在高度的一致性(κ系數(shù)＝0.63，一致性＝0.83)。注解JHU2583c-322(陽性對照)，JHU2675c-564(陰性對照)，JHU0842-1196和JHU3833-375A和B兩個集合中均存在，在這兩個集合和兩種模型中都產(chǎn)生同樣的結(jié)果。圖2A和B減毒突變株的KaplanMeyer存活性比較。A、豚鼠或小鼠氣溶膠模型中，減毒的18種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株的存活曲線分析。在豚鼠中Tn突變株的中值存活時間明顯短于小鼠模型中的(LogRank檢驗，p值＜0.0001)；以及B、在豚鼠和小鼠模型中，減毒的10種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株的存活曲線分析。在豚鼠中Tn突變株的中值存活時間明顯少于小鼠模型中的(LogRank檢驗，p值＝0.0003)。這些數(shù)據(jù)顯示出豚鼠模型檢測到減毒存活比小鼠氣溶膠模型早。圖3疫苗的保護(hù)性功效的評估。圖4缺失持留基因的Mtb菌株的保護(hù)性功效的評估。圖5A-D從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株分離到的示例性核酸和相應(yīng)的蛋白序列。本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述小鼠和豚鼠模型已被用于鑒定在哺乳動物肺中體內(nèi)減毒存活/持留的結(jié)核分枝桿菌突變株。使用了DeADMAn，一種用于基因型確定的結(jié)核分枝桿菌突變株的高通量差減競爭分析方法，比較了結(jié)核分枝桿菌突變株的相同集合在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中的存活性。此外，也在小鼠中空纖維模型中分析了在兩種氣溶膠模型中都被發(fā)現(xiàn)減毒的選定突變株。測試了顯示74個基因的結(jié)核分枝桿菌突變株。發(fā)現(xiàn)18種結(jié)核分枝桿菌突變株在這兩種氣溶膠模型中減毒存活，其中選定的突變株中70％也在小鼠中空纖維模型中減毒了。小鼠氣溶膠模型中大多數(shù)減毒突變株在感染90天后才檢測到。相反，大多數(shù)小鼠晚期存活突變株在豚鼠中被明顯更早檢測到，提示結(jié)核病誘導(dǎo)的肺病理學(xué)的差異可以解釋這種加快的檢測。(與小鼠不同，結(jié)核分枝桿菌感染的豚鼠形成了干酪性肉芽腫，可以更接近地模擬人類的疾病)。在通過兩種氣溶膠模型鑒定到的基因之間存在高度相似性(p＜0.0003)。物種的比較能夠直接評估在豚鼠結(jié)核病中存在而在小鼠結(jié)核病中不存在的干酪性壞死的影響[7]。存活/持留基因的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了開發(fā)用于引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答和/或?qū)λ拗鬟M(jìn)行預(yù)防接種的組合物，以對抗分枝桿菌感染和分枝桿菌的持續(xù)性、潛伏性感染的建立和/或維持。在本文中“持留”的意義，是指結(jié)核分枝桿菌具有長期保持靜止?fàn)顟B(tài)、在幾個月到幾十年后“重新活化”產(chǎn)生臨床疾病的能力。有各種不同的術(shù)語、包括持久性、潛伏性、休眠、非復(fù)制性持留(NRP)等，被用于描述結(jié)核分枝桿菌的這種靜止的生理狀態(tài)。潛伏性一般是指臨床感染而不是細(xì)菌本身。據(jù)估計，世界人口中有三分之一(大約20億人)被結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染。在臨床上，這個感染階段是無癥狀的，只能通過使用結(jié)核菌素皮膚試驗或離體(exvivo)類似物例如QuantiFERON-TB等檢測。潛伏性可以被看作是宿主和生物體之間存在的平衡。潛伏性結(jié)核病在個體暴露于結(jié)核分枝桿菌后發(fā)生，感染已經(jīng)建立，產(chǎn)生免疫應(yīng)答以控制病原體，導(dǎo)致了靜止?fàn)顟B(tài)。盡管還不清楚結(jié)核分枝桿菌是否能夠發(fā)展出真正代謝無活性的狀態(tài)，但有大量病理學(xué)、流行病學(xué)和臨床數(shù)據(jù)確證，潛伏在臨床上確實發(fā)生了。因此，簡而言之，持留可以被定義成一種生理狀態(tài)，其中結(jié)核分枝桿菌能夠在組織中存活幾個月到幾十年而不明顯復(fù)制，而仍具有在幾個月到幾十年后恢復(fù)生長并活化以引起疾病的能力。在本發(fā)明的某些實施方案中，被治療的感染是由結(jié)核分枝桿菌引起的感染。但是，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，本發(fā)明的實踐不是需限于治療由這種分枝桿菌引起的感染，因為存活/持留基因?qū)τ谄渌种U菌和放線菌(Actinomycetes)感染的建立和維持來說可能也是需要的。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了含有存活(持留)基因的一種或多種基因產(chǎn)物(蛋白、多肽或肽)或其抗原性片段的組合物。這些組合物可以被施用，以引發(fā)針對基因產(chǎn)物的免疫應(yīng)答(例如體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。在優(yōu)選實施方案中，免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。這樣的免疫應(yīng)答可以在預(yù)防接種的宿主中預(yù)防或減輕與感染相關(guān)的疾病癥狀，并優(yōu)選將防止持久的、潛伏的分枝桿菌感染的建立和維持。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，蛋白的抗原性片段是一個區(qū)域(通常為連續(xù)的一級結(jié)構(gòu))，它引發(fā)的免疫應(yīng)答至少有完整蛋白引發(fā)強(qiáng)度的大約一半，并優(yōu)選等于或超過完整蛋白。通常，蛋白的抗原性片段或區(qū)域是暴露于表面，并可含有例如外部環(huán)、轉(zhuǎn)角等或其它可以被免疫系統(tǒng)接近的二級結(jié)構(gòu)。這樣的決定簇，當(dāng)在完整蛋白的框架之外合成時，可能天然保留了足夠的天然結(jié)構(gòu)以引發(fā)免疫應(yīng)答，或者可以按照眾所周知的方法來設(shè)計，以保留足夠的二級結(jié)構(gòu)來引發(fā)免疫應(yīng)答。在另一個實施方案中，通過施用編碼存活/持留蛋白、多肽或肽、或其抗原性片段的核酸序列來進(jìn)行預(yù)防接種。例如，編碼蛋白的DNA可以作為DNA疫苗，以載體例如質(zhì)粒、病毒載體(例如腺病毒載體)或其它本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的載體的形式進(jìn)行給藥。此外，編碼存活/持留蛋白、多肽或肽、或其抗原性片段的基因，可以包含在宿主例如細(xì)菌宿主內(nèi)，宿主施用于需要預(yù)防接種的個體?；蚩梢源嬖谟谶@樣的宿主中的染色體外元件上(例如質(zhì)粒)，或者可以整合到宿主的遺傳物質(zhì)中。適合的宿主包括但不限于細(xì)菌(例如分枝桿菌、大腸桿菌和本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員熟知的其它細(xì)菌)、酵母等。這樣的載體和宿主可以用作疫苗的組分，并可以起到存活/持留蛋白的源的作用，在接種的宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答?；蛘撸@樣的載體和宿主可用于其它目的，例如用于實驗研究。以這種方式利用的基因包括但不限于由1)MtbCDC1551基因組中選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MT編號所表示的基因；2)MtbH37Rv基因組中選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的Rv編號所表示的基因；以及3)對應(yīng)于1)或2)的同源基因?！巴椿颉蔽覀兪侵笍腗tb之外分枝桿菌、或從放線菌類中的其它細(xì)菌(例如天藍(lán)色鏈霉菌Streptomycescoelicolor)、和/或從H37RV(“Rv編號”的來源)和CDC1551(“MT編號”的來源)之外的結(jié)核分枝桿菌菌株中分離到的或源自于它們的相應(yīng)蛋白、多肽或肽的編碼基因。示例性的來源還包括但不限于被分類為屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌(結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌(M.bovis)，非洲分枝桿菌(M.africanum)，田鼠分枝桿菌(M.microti)和卡氏分枝桿菌(M.canetti))。此外，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，不是必須利用在原初的分枝桿菌中最初鑒定到的精確核苷酸序列。由于遺傳密碼的冗余性，許多可選的核酸序列可用于編碼本文中鑒定到的存活/持留蛋白。此外，編碼存活/持留蛋白的核酸包括DNA、RNA及其各種不同的雜合體。示例性的核酸序列以及相應(yīng)的基因產(chǎn)物顯示在圖5A-D中。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，為了成功地實踐本發(fā)明，本文使用的存活/持留蛋白的精確一級序列也不是必須保留的。在存活/持留蛋白的一級氨基酸序列中可以耐受各種變化，而不損害蛋白作為抗原的效力。例如，可以接受保守的(或甚至是不保守的)氨基酸取代，或可以耐受缺失或添加(例如在蛋白序列的氨基和/或羧基末端或內(nèi)部)。所有這樣的變異體都打算包含在本發(fā)明的實踐中，只要產(chǎn)生的變異體蛋白保留了在體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答、包括體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力即可。此外，重組蛋白可以提供成嵌合或融合蛋白，含有例如源于其它生物體或完全人造的其它異源氨基酸區(qū)段。例子包括但不限于用于蛋白分離的區(qū)段(例如His標(biāo)簽)、用于將蛋白導(dǎo)向細(xì)胞內(nèi)特定位置的區(qū)段(例如前導(dǎo)序列)、檢測標(biāo)簽(例如S-標(biāo)簽或Flag-標(biāo)簽)、其它的抗原性氨基酸序列例如已知的含有T-細(xì)胞表位的序列和蛋白穩(wěn)定化基序等。此外，嵌合蛋白可以被化學(xué)修飾，例如通過酰胺化、磺?；?、脂化或本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員已知的其它技術(shù)。此外，在單個翻譯產(chǎn)物中可以包含七種鑒定到的蛋白中的一種以上，或一種以上的蛋白可以被單個核酸編碼，并仍然按照本文的描述使用?；蛘撸瑤讉€含有抗原性決定簇但是源于不同蛋白的區(qū)段可以被單個核酸編碼，從而被包含在單個翻譯產(chǎn)物中。在其它的實施方案中，幾種不同的蛋白、或幾種編碼不同蛋白的核酸，在“雞尾酒”中一起給藥。所有這樣的組合都包涵在本發(fā)明中。因此，本發(fā)明提供了含有一種或多種本文描述的基本純化的重組蛋白或核酸、以及藥理學(xué)適合的載體的組合物。用于體內(nèi)給藥的這類組合物的制備對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來說是眾所周知的。通常，這樣的組合物被制備成液體溶液或懸浮液，但是固體形式例如片劑、丸劑、粉末等也可以考慮。也可以制備適合在給藥前溶解或懸浮在液體中的固體形式。制備物也可以被乳化。可以將活性成分與可藥用的并與活性成分相容的賦形劑混合。適合的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其組合。此外，組合物可以含有少量的輔助性物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等。本發(fā)明的制劑還可以含有佐劑，其適合的例子包括不限于Seppic、QuilA、Alhydrogel等。如果需要施用口服形式的組合物，可以加入各種增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑等。本發(fā)明的組合物可以含有任何這樣的附加成分，以便將組合物提供成適合給藥的形式。配方中蛋白或核酸的最終量是可變的。但是，一般來說，配方中的量將為大約0.01-99％，重量/體積。方法包括將這種在可藥用載體中的組合物給藥于哺乳動物。本發(fā)明的制劑可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員熟知的許多適合的方法中的任何一種來給藥，包括但不限于注射、吸入、口服、鼻內(nèi)、通過攝取含有活性成分的食品等。在優(yōu)選實施方案中，給藥模式是皮下或肌內(nèi)。此外，組合物可以與其它治療形式結(jié)合給藥，例如增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的物質(zhì)、抗生素等。本發(fā)明的組合物可以給藥于處于被分枝桿菌感染的風(fēng)險下的個體，或已經(jīng)暴露于分枝桿菌的個體，或甚至已知感染了分枝桿菌的個體。本發(fā)明的組合物和方法可以被特別用于治療免疫受損的個體(例如AIDS患者、接受化療的患者、藥物上癮者等)，或用于治療已知被已知具有藥物抗性的分枝桿菌菌株感染的人。一般來說，使用本發(fā)明的組合物和方法治療的個體是哺乳動物，例如人類。但是，絕不排除治療非人類的哺乳動物。本發(fā)明還提供了減毒的、非致病性的分枝桿菌，其中通過例如基因的突變或缺失，使至少一種存活/持留基因或基因產(chǎn)物失活。失活是指細(xì)菌不在宿主中引起疾病癥狀。這可以通過例如缺失基因、或用無害的或失活的基因代替基因、或略微改變基因使得基因產(chǎn)物失活或無害來完成。但是，這樣修飾的細(xì)菌可用作減毒的接種劑，因為它們提供了抗原性決定簇的豐富來源，而不在宿主中引起疾病。在某些實施方案中，只有存活/持留基因被失活。但是，在其它實施方案中，除了存活/持留基因之外，其它的基因也可以被失活/缺失，例如ΔsigF突變。本文描述的存活/持留基因和蛋白也可用于篩選候選藥理劑/藥物，以及鑒定能夠用于治療或預(yù)防分枝桿菌感染的藥理劑/藥物。抑制蛋白活性的藥劑可用于抑制分枝桿菌在體內(nèi)的生長和感染性。本文描述的存活/持留基因和蛋白還可以用于各種診斷應(yīng)用中，例如用于證實在懷疑被感染的宿主中或在懷疑被污染的環(huán)境中分枝桿菌的存在，和/或用于細(xì)菌的鑒定/分類。實施例實施例1、與小鼠相比，加快檢測到在豚鼠中對于細(xì)菌存活必需的結(jié)核分枝桿菌基因材料與方法結(jié)核分枝桿菌Himar1轉(zhuǎn)座子突變株和培養(yǎng)基作為全面插入誘變研究的一部分，在我們的實驗室中使用Himar1轉(zhuǎn)座子(Tn)進(jìn)行了結(jié)核分枝桿菌CDC1551菌株的隨機(jī)插入誘變。Tn插入位點按照以前的描述[8，9]，通過對插入連接點進(jìn)行測序來鑒定。每種突變株分別在37℃下，在添加有Dubos培養(yǎng)基白蛋白(BectonDickinson，Sparks，MD)、5％甘油、0.01％丙酮酸鈉和20μg/ml卡那霉素的Dubos基礎(chǔ)肉湯(BectonDickinson，Sparks，MD)中生長。所有在本研究中使用的突變株，除了陽性和陰性對照之外，都是隨機(jī)選擇的。通過將每種生長到OD600為0.8的突變株的純培養(yǎng)物進(jìn)行混合，制備了分別含有30種和50種突變株的集合(A，B)。只有體外生長與野生型相似的突變株用于本研究。在末端100bp上游的區(qū)域中(或者如果基因的長度小于500bp，在基因的5’端80％之內(nèi))包含Tn的突變株被考慮用于篩選，以降低篩選到可能不破壞基因產(chǎn)物功能的遠(yuǎn)端突變的可能性。此外，也篩選了7株在末端100bp中(或者如果基因的長度小于500bp，在基因的3’端的20％之內(nèi))包含Tn的結(jié)核分枝桿菌Tn突變株。在每個集合中包括結(jié)核分枝桿菌Tn突變株JHU2583c-322和JHU2675c-564，分別作為陽性和陰性對照，因為以前的研究顯示出JHU2583c-322(基因MT2660中的Tn突變株)在小鼠中是減毒存活的，而JHU2675c-564(基因MT2749中的Tn突變株)是毒力完整的[6]。此外，在兩個集合A和B中都存在結(jié)核分枝桿菌Tn突變株JHU0842-1196和JHU3833-375(分別為基因MT0864和MT3941中的Tn突變株)。所有在本研究中使用的突變株，包括對照，都在隨后被發(fā)現(xiàn)具有ΔsigF背景[10]。豚鼠感染使用UniversityofWisconsinEngineeringShops的最新版Madison氣溶膠室[11]，通過氣溶膠途徑對250-300克Hartley種系豚鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)進(jìn)行感染。在感染后第1、21和42天(A集合)和第1、21、49和63天(B集合)將每組5只豚鼠處死，并分析每種突變株在肺中的存活性。這兩種情況的肺在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中整體勻漿，并將整個勻漿液的相當(dāng)比例鋪于Middlebrook7H10固體培養(yǎng)基(BectonDickinson，Sparks，MD)上。對于第1天的CFU計數(shù)來說，將這兩種肺整體勻漿，將一半的勻漿液按照上述鋪板。通過將這些結(jié)果乘以系數(shù)2，獲得CFU計數(shù)。小鼠感染使用Glas-Col吸入暴露系統(tǒng)(Glas-Col，TerreHaute，IN)，通過氣溶膠途徑對5-6周齡的雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)進(jìn)行感染。對于集合A和B來說，在感染后第1、21、49、96、147和360天將每組3只小鼠處死，并分析每種突變株在肺中的存活性。這兩種情況的肺在PBS中整體勻漿，并鋪于添加有Dubos培養(yǎng)基白蛋白(BectonDickinson，Sparks，MD)、1.5％瓊脂、5％甘油、0.01％丙酮酸鈉和20μg/ml卡那霉素的Dubos基礎(chǔ)肉湯(BectonDickinson，Sparks，MD)上。對于第1天的CFU計數(shù)來說，將兩種肺整體勻漿，將所有的勻漿液按照上述鋪板。將所有的板在37℃下溫育至少3周，然后對菌落進(jìn)行計數(shù)或用于DNA制備。微陣列和實時PCR分析對于每個時間點來說，從平板刮取菌落，合并，并用標(biāo)準(zhǔn)方法[12]制備基因組DNA。微陣列將兩種定制的微陣列組(每個集合一種)印刷在聚L-賴氨酸包被的玻璃載片上。對應(yīng)于每個Tn插入片段連接處序列的60個堿基寡核苷酸在微陣列上被前后排列點樣4次。將基因組DNA用AluI消化，連接上接頭，使用轉(zhuǎn)座子特異性引物對Tn插入位點的連接處進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增，并按照以前的描述[6]用Cy3和Cy5單熒光染料(AmershamPharmacia)進(jìn)行標(biāo)記。將從輸入集合物(感染后1天)和輸出集合物制備的探針與定制的微陣列共雜交，并使用GenepixAxon4000B(AxonInstrumentsInc.)進(jìn)行掃描。對于每個時間點，微陣列分析進(jìn)行至少雙份。使用定制開發(fā)的程序[6]分析數(shù)據(jù)。在給定的時間點，輸入/輸出集合物比率明顯高于或等于陰性和陽性對照的平均值的突變株，被認(rèn)為是減毒了的。實時PCR進(jìn)行了實時PCR分析，以便對發(fā)現(xiàn)通過DeADMAn被減毒的突變株的微陣列結(jié)果進(jìn)行證實和定量。設(shè)計了使用Tn和基因特異性引物的突變株特異性引物組，用于擴(kuò)增150-200bp的DNA片段。使用常規(guī)的PCR測試這些引物組。所有成功的引物組被用于突變株特異性實時PCR，使用iCyclerIQ3.1.7050版(Bio-Rad，Hercules，CA)。將輸入集合物(感染后1天)的循環(huán)閾值與輸出集合物基因組DNA的循環(huán)閾值進(jìn)行比較。對于通過微陣列分析表明在該時間點沒有發(fā)現(xiàn)被減毒的突變株來說，在該集合物可用的所有后續(xù)時間點都進(jìn)行實時PCR。對于每種突變株來說，實時PCR的進(jìn)行至少重復(fù)三次。小鼠中空纖維感染將含有50種突變株的B集合培養(yǎng)物包裹在PVDF中空纖維中，并按照以前的描述[13]皮下植入到6-8周齡的SKH1無毛小鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)中。在感染后第1和56天，將4只小鼠(每只含有兩個中空纖維)處死?；厥罩锌绽w維的內(nèi)含物并鋪于Middlebrook7H10固體培養(yǎng)基(BectonDickinson，Sparks，MD)上。對于每個時間點，從平板刮取菌落，合并，并用標(biāo)準(zhǔn)方法[12]制備基因組DNA。對于在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中發(fā)現(xiàn)的減毒存活的所有集合B中的突變株，進(jìn)行了實時PCR分析。將輸入集合物(感染后1天)的循環(huán)閾值與輸出集合物(感染后56天)基因組DNA的循環(huán)閾值進(jìn)行比較。對于每種突變株來說，實時PCR的進(jìn)行至少重復(fù)三次。統(tǒng)計學(xué)分析施用Prism4版4.01(GraphPadSoftwareInc.，SanDiego，CA)進(jìn)行了KaplanMeyer存活曲線分析。結(jié)果被測試的和減毒的結(jié)核分枝桿菌Tn突變株在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中的存活使用了總共80種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株，通過氣溶膠途徑感染豚鼠和小鼠(表1)。在氣溶膠感染后，對于小鼠肺來說，第1天的log10CFU對于集合A和B來說分別為3.48±0.06和3.40±0.28，對于豚鼠肺來說，組合A和B分別為2.07±0.17和2.29±0.07。表1、在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中測試的結(jié)核分枝桿菌Tn突變株76種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株被用于通過氣溶膠途徑感染豚鼠和小鼠肺。在末端100bp中(或者如果基因的長度小于500bp，在基因3’端的20％之內(nèi))包含Tn的7種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株，以及陽性和陰性對照突變株被加上陰影。功能分類檢索關(guān)鍵[14]0，毒力、脫毒、適應(yīng)；1，脂類代謝；2，信息途徑；3，細(xì)胞壁和細(xì)胞過程；5，插入序列和噬菌體；6，PE/PPE；7，中間代謝和呼吸；8，未知；9，調(diào)控蛋白；10，保守的假設(shè)蛋白；16，在牛分枝桿菌中具有直系同源物的保守的假設(shè)蛋白。在第1天(輸入集合物)進(jìn)行的DeADMAn篩選證實了在所用的兩種集合和模型中每種突變株的肺植入。正如預(yù)期，在兩種集合和模型中，發(fā)現(xiàn)陽性和陰性對照分別是減毒存活的和具有完全毒力的。同樣地，結(jié)核分枝桿菌Tn突變株JHU0842-1196和JHU3833-375被發(fā)現(xiàn)在這兩種集合和模型中產(chǎn)生了同樣的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)了34種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株減毒存活在豚鼠或小鼠肺中。其中，26種被發(fā)現(xiàn)減毒存活在豚鼠中，而29種在小鼠中是減毒的(圖1A)。比較在豚鼠與小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的減毒存活的突變株，它們之間存在高度的一致性(κ系數(shù)＝0.63，一致性＝0.83)。為了對DeADMAn結(jié)果進(jìn)行證實和定量，對34種減毒存活的結(jié)核分枝桿菌Tn突變株進(jìn)行了實時PCR。用于5種突變株(JHU1021-27，JHU1127c-10，JHU2202c-74，JHU3447a-419和JHU3352c-22)的引物組不能成功地擴(kuò)增特定的PCR產(chǎn)物，從進(jìn)一步的分析中被除去。發(fā)現(xiàn)了18種突變株被在豚鼠或小鼠氣溶膠模型中減毒存活。其中，15種被發(fā)現(xiàn)減毒存活在豚鼠中，而13種在小鼠中被減毒(表2)。同樣地，比較豚鼠與小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的減毒存活的突變株，它們之間存在高度的一致性(κ系數(shù)＝0.64，一致性＝0.89)，表明兩個模型之間結(jié)核分枝桿菌生長的遺傳需求的高度相似性(圖1B)。表2、被發(fā)現(xiàn)被減毒以在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中存活的結(jié)核分枝桿菌Tn突變株。發(fā)現(xiàn)了18種結(jié)核分枝桿菌Tn突變株被減毒以在豚鼠或小鼠氣溶膠模型中存活。15種被發(fā)現(xiàn)減毒存活在豚鼠中，而13種在小鼠氣溶膠模型中被減毒，在兩種模型之間具有高度相似性。其中，在中空纖維模型中測試的10種突變株中的7種也被發(fā)現(xiàn)被減毒存活。加上陰影的基因代表在感染90天后才能在小鼠肺中檢測到的晚期存活基因。NA*＝直到第42天時沒有被減毒，NA**＝直到第56天時沒有被減毒，NA#＝直到第63天時沒有被減毒，NA##＝直到第360天時沒有被減毒。減毒倍數(shù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。功能分類關(guān)鍵[14]0，毒力、脫毒、適應(yīng)；1，脂類代謝；2，信息途徑；3，細(xì)胞壁和細(xì)胞過程；7，中間代謝和呼吸；9，調(diào)控蛋白；10，保守的假設(shè)蛋白；16，在牛分枝桿菌中具有直系同源物的保守的假設(shè)蛋白。在小鼠中減毒存活的13個基因中的9個的突變株在感染90天后才檢測到。此外，正如預(yù)期，7個在基因的遠(yuǎn)端部分具有Tn插入片段的Tn突變株中的6個，在豚鼠或小鼠氣溶膠模型中沒有被發(fā)現(xiàn)減毒。但是，突變株JHU1742a-175被發(fā)現(xiàn)在豚鼠和小鼠模型中都減毒了。該突變株包含的Tn插入片段剛好位于本研究中使用的80％截留值的遠(yuǎn)端(80.5％)，因此可能是Tn插入片段成功地失活了該基因。小鼠中空纖維模型作為原理的驗證，也使用實時PCR在小鼠中空纖維模型[13]中分析了發(fā)現(xiàn)在豚鼠或小鼠氣溶膠模型中減毒存活的選定突變株。在這個新的體內(nèi)模型中，在皮下植入到小鼠中的半可擴(kuò)散的中空纖維中包裹的桿菌周圍，發(fā)展出肉芽腫狀病變。在這種微環(huán)境中，生物體被證明具有改變的生理狀態(tài)，其特征為定態(tài)的菌落形成單位計數(shù)和降低的代謝活性。到感染后第56天為止，在該模型中測試的10種突變株中，7種被發(fā)現(xiàn)是減毒的(表2)，表明這些基因?qū)τ诮Y(jié)核分枝桿菌在肉芽腫狀病變中的細(xì)胞外存活可能是重要的。結(jié)核分枝桿菌Tn突變株所代表的基因的功能分類表3總結(jié)了結(jié)核分枝桿菌Tn突變株所代表的基因的功能分類。測試了跨越11種結(jié)核分枝桿菌遺傳功能類別[14，15]的74個獨特基因的突變株。41％是保守的假設(shè)蛋白，16％參與了細(xì)胞壁/細(xì)胞過程，16％參與了中間代謝/呼吸，剩余的27％分布在其它功能類別中。在被發(fā)現(xiàn)減毒存活的基因中，42％(5/12)的基因參與了細(xì)胞壁/過程，25％(3/12)的基因參與了中間代謝/呼吸，20％是保守的假設(shè)蛋白。在小鼠肺中鑒定到的用于晚期存活(90天后)的基因中有33％(3/9)參與了細(xì)胞壁/細(xì)胞過程。表3、結(jié)核分枝桿菌Tn突變株所代表的基因的功能分類。測試了跨越11種結(jié)核分枝桿菌遺傳功能類別的74個獨特基因的突變株。41％是保守的假設(shè)蛋白，16％參與了細(xì)胞壁/過程，16％參與了中間代謝/呼吸，剩余的27％分布在其它功能類別中。在被發(fā)現(xiàn)減毒存活的基因中，42％(5/12)的基因參與了細(xì)胞壁/過程，25％(3/12)的基因參與了中間代謝/呼吸，20％是保守的假設(shè)蛋白。0，毒力、脫毒、適應(yīng)；1，脂類代謝；2，信息途徑；3，細(xì)胞壁和細(xì)胞過程；5，插入序列和噬菌體；6，PE/PPE；7，中間代謝和呼吸；8，未知；9，調(diào)控蛋白；10，保守的假設(shè)蛋白；16，在牛分枝桿菌中具有直系同源物的保守的假設(shè)蛋白。對于結(jié)核分枝桿菌Tn突變株來說檢測到減毒存活的時間在13種在小鼠氣溶膠模型中被發(fā)現(xiàn)被減毒的結(jié)核分枝桿菌Tn突變株中，不到三分之一(4/13)到第49天時被檢測到。我們假設(shè)由于存在干酪性壞死[7]，豚鼠氣溶膠模型與小鼠模型在免疫學(xué)上有差別。確實，87％(13/15)的在豚鼠氣溶膠模型中被發(fā)現(xiàn)減毒的Tn突變株到第49天時被檢測到。圖2顯示了減毒的Tn突變株的KaplanMeyer存活曲線的比較。在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中Tn突變株的中值存活時間分別為49天和360天(LogRank檢驗，p值＜00001)。當(dāng)對于在豚鼠和小鼠氣溶膠模型中都減毒的10種Tn突變株進(jìn)行這種比較時，豚鼠中的中值突變株存活時間仍然明顯較短(LogRank檢驗，p值＝0.0003)。這些數(shù)據(jù)顯示，豚鼠模型檢測到結(jié)核分枝桿菌突變株的減毒存活的時間要早于小鼠模型。討論結(jié)核分枝桿菌是廣泛宿主適應(yīng)性病原體，已經(jīng)發(fā)展出在細(xì)胞內(nèi)(巨噬細(xì)胞、非專門的吞噬細(xì)胞)存活、在肺外傳播、以及抵抗先天性和適應(yīng)性免疫機(jī)制的策略，后者在人類中是發(fā)展出干酪性肉芽腫所必需的。通過在小鼠中進(jìn)行的結(jié)核分枝桿菌突變株研究，已經(jīng)描述了至少4類結(jié)核分枝桿菌存活缺陷；這些包括體內(nèi)減毒缺陷生長(giv)、體內(nèi)急劇生長(sgiv)、持留(per)和病理學(xué)(pat)或免疫病理學(xué)(imp)表型[2，16]。但是，表現(xiàn)出這些表型的突變株還沒有在形成干酪性壞死作為其對結(jié)核分枝桿菌適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一部分的動物模型例如豚鼠中進(jìn)行深入的表征。以前的研究顯示，結(jié)核分枝桿菌ΔsigC突變株被發(fā)現(xiàn)在豚鼠中具有g(shù)iv表型[17]，但是在小鼠中具有imp表型[18]。最近，Converse等顯示，結(jié)核分枝桿菌ΔdosR突變株被發(fā)現(xiàn)在豚鼠中具有g(shù)iv表型，但是在較高的感染劑量下，在小鼠中具有imp表型(P.Converse等，已提交)。這些數(shù)據(jù)提示，結(jié)核分枝桿菌突變株在豚鼠和小鼠模型中具有不同的細(xì)菌存活動力學(xué)。因此，在本研究中，我們在兩種氣溶膠模型中比較了同樣的結(jié)核分枝桿菌集合在哺乳動物肺中的細(xì)菌存活動力學(xué)，以直接評估在豚鼠結(jié)核病中看到[7]但在小鼠結(jié)核病中不存在的干酪性壞死的影響。此外，也在中空纖維休眠小鼠肉芽腫模型中，評估了在哺乳動物肺中存活所需的選定基因的突變株。DeADMAn是一種高通量的差減鑒定篩選工具，用于確定的突變株集合的競爭性存活。該方法已經(jīng)顯示出對每個集合多達(dá)100種突變株具有高靈敏度[6]。在本研究中，我們使用了最多50種突變株的較小集合，因為只有有限數(shù)量的桿菌可以通過氣溶膠途徑植入到肺中。應(yīng)該指出，DeADMAn使用集合的突變株感染，由于缺陷的突變株被同一集合中的其它突變株分泌的細(xì)胞外因子互補(bǔ)，因此這可能使結(jié)果混淆。此外，因為DeADMAn是對菌落形成單位的間接量度，它不能用于鑒定imp/pat突變株。所有在本研究中使用的突變株都具有ΔsigF背景[10]。但是，因為將突變株對具有同樣ΔsigF背景的對照進(jìn)行了歸一化，因此可能是Tn破壞的基因而不是sigF缺失造成了所觀察到的表型。但是，不能夠完全排除sigF缺失與Tn破壞的基因的可能相互作用。最后，在本研究中使用了結(jié)核分枝桿菌CDC1551菌株，某些動物模型已經(jīng)顯示出該菌株的毒力低于H37Rv菌株[19]。但是，我們相信這兩種菌株是高度可比的。此外，因為比較是針對具有同樣背景的對照而進(jìn)行的，因此是Tn破壞的基因而不是背景菌株造成了所觀察到的表型。然而，有可能在H37Rv背景中進(jìn)行同樣的分析可以產(chǎn)生與本研究中發(fā)現(xiàn)的略有不同的減毒存活的突變株名單。在本研究中鑒定到了18個結(jié)核分枝桿菌基因是在哺乳動物肺中存活所需要的。這包括以前已經(jīng)描述過的分別用于在小鼠肺部和脾臟中體內(nèi)存活的MT1847(Rv1798)和MT3648(Rv3544c)[5，6]，以及其缺失突變株在靜脈感染后已經(jīng)顯示出在小鼠肺部和脾臟中被減毒的MT3594(otsA，Rv3490)[20]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MT1847(Rv1798)、MT3236(nuoD，Rv3148)和MT3594(otsA，Rv3490)在營養(yǎng)饑餓過程中被上調(diào)了，表明了它們在分枝桿菌對宿主環(huán)境的應(yīng)答中的作用[21]。在本研究鑒定到的基因中，有9個是在小鼠肺中體內(nèi)存活超過90天所需要的。我們相信這些基因是晚期存活所需的，代表了在成熟中的肉芽腫狀病變中存活所需的關(guān)鍵毒力因子。這些晚期存活基因包括MT1102(Rv1072)和MT2050(Rv1994c)，它們已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)饑餓和氧化脅迫過程中被上調(diào)了[21，22]。MT1102(Rv1072)和MT2050(Rv1994c)都是SigH依賴性基因[16，23]，表明了它們在對宿主免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性應(yīng)答中的作用。同樣地，MT0361(Rv0346c)和MT2174(Rv2114)被發(fā)現(xiàn)在不同的脅迫條件下上調(diào)，包括厭氧/微好氧環(huán)境[24]和/或營養(yǎng)饑餓[21]，表明了它們在對抗宿主免疫應(yīng)答而存活中的可能作用。MT1698(pks10，Rv1660)為分枝菌蠟二結(jié)核蠟酸酯(phthioceroldimycocerosate，PDIM)合成所需，該基因缺陷的突變株被減毒以在小鼠肺中存活[25]。此外，它在營養(yǎng)饑餓過程中也被上調(diào)[21]。MT3978(Rv3864)在以前已經(jīng)被描述是在小鼠脾臟中體內(nèi)存活所需的[5]，并且也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)饑餓過程中上調(diào)[21]。與小鼠不同，豚鼠中的結(jié)核分枝桿菌疾病引起形成良好的干酪性肉芽腫[7]。因此，假設(shè)小鼠晚期存活突變株可能缺少在成熟中的肉芽腫狀病變中存活所需的關(guān)鍵毒力途徑，而豚鼠肉芽腫中干酪性壞死的存在可以加快它們的檢測。換句話說，在豚鼠中形成良好的肉芽腫，與在小鼠中觀察到的形成差的肉芽腫相比，可能施加了盡管相似，但是強(qiáng)度更大的應(yīng)激物，并導(dǎo)致了這些晚期存活突變株的加快檢測。確實，正如假設(shè)的，發(fā)現(xiàn)在豚鼠模型中檢測到大部分Tn突變株的減毒存活比小鼠肺模型要早。此外，在中空纖維小鼠肉芽腫模型中評估了在哺乳動物肺中存活所需的10種突變株，發(fā)現(xiàn)有7種在該模型中減毒存活，表明這些突變株所代表的基因?qū)τ诮Y(jié)核分枝桿菌在肉芽腫狀病變內(nèi)的存活是重要的。我們的假說被下列事實所加強(qiáng)，即與小鼠模型相比，在豚鼠中最早檢測到的幾個基因[MT0361(Rv0346c)，MT1102(Rv1072)，MT2050(Rv1994c)和MT3978(Rv3864)]，可能參與了對由宿主免疫應(yīng)答產(chǎn)生的應(yīng)激物例如肉芽腫的應(yīng)答[16，21-24]。概括來說，使用競爭性存活分析，我們鑒定了在氣溶膠感染后細(xì)菌在哺乳動物肺中存活所需的基因。在通過每種使用的模型鑒定到的基因之間存在高度的一致性。長期小鼠感染顯示出某些晚期存活細(xì)菌突變株存活了超過90天，但是后來在第150到360天之間被集合中的其它突變株競爭出去。在豚鼠模型中，大部分這些小鼠晚期存活突變株在少于65天內(nèi)被鑒定到。小鼠晚期存活突變株可能缺少在成熟中的肉芽腫狀病變中存活所需的關(guān)鍵毒力途徑，在豚鼠肉芽腫中干酪性壞死的存在可以加快它們的檢測。背景和實施例1的參考文獻(xiàn)1.WorldHealthOrganization.8thWHOannualreportonglobalTBcontrol.Globaltuberculosiscontrol-surveillance，planning，financing.(世界衛(wèi)生組織，關(guān)于全球TB控制的第八次WHO年度報告，全球結(jié)核病控制--監(jiān)督、計劃和資金籌措)?？梢栽趆ttp://www.who.int/tb/publications/globalreport/en/獲得。2006年11月1日存取。2.Hingley-WilsonSM，SambandamurthyVK和JacobsWR，Jr.Survivalperspectivesfromtheworld′smostsuccessfulpathogen，Mycobacteriumtuberculosis.(從世界最成功的病原體——結(jié)核分枝桿菌的存活展望)，NatImmunol2003；4949-55.3.NuermbergerE，BishaiWR和GrossetJH.Latenttuberculosisinfection.(潛伏性結(jié)核病感染)，SeminRespirCritCareMed2004；25317-36.4.SassettiCM，BoydDH和RubinEJ.Genesrequiredformycobacterialgrowthdefinedbyhighdensitymutagenesis.(通過高密度誘變確定的分枝桿菌生長所需的基因)，MolMicrobiol2003；4877-84.5.SassettiCM，RubinEJ.Geneticrequirementsformycobacterialsurvivalduringinfection.(感染過程中分枝桿菌存活的遺傳需求)，ProcNatlAcadSciUSA2003；10012989-94.6.LamichhaneG，TyagiS和BishaiWR.DesignerarraysfordefinedmutantanalysistodetectgenesessentialforsurvivalofMycobacteriumtuberculosisinmouselungs.(確定的突變株分析的設(shè)計者陣列，用于檢測結(jié)核分枝桿菌在小鼠肺中存活所必需的基因)，InfectImmun2005；732533-40.7.TurnerOC，BasarabaRJ和OrmeIM.ImmunopathogenesisofpulmonarygranulomasintheguineapigafterinfectionwithMycobacteriumtuberculosis.(在結(jié)核分枝桿菌感染后豚鼠中肺部肉芽腫的免疫發(fā)病機(jī)理)，InfectImmun2003；71864-71.8.LamichhaneG，ZignolM，BladesNJ等，ApostgenomicmethodforpredictingessentialgenesatsubsaturationlevelsofmutagenesisapplicationtoMycobacteriumtuberculosis.(在亞飽和的誘變水平下預(yù)測必需基因的后基因組方法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌)，ProcNatlAcadSciUSA2003；1007213-8.9.RubinEJ，AkerleyBJ，NovikVN，LampeDJ，HussonRN和MekalanosJJ.Invivotranspositionofmariner-basedelementsinentericbacteriaandmycobacteria.(在腸細(xì)菌和分枝桿菌中基于mariner元件的體內(nèi)轉(zhuǎn)座)，ProcNatlAcadSciUSA1999；961645-50.10.ChenP，RuizRE，LiQ，SilverRF和BishaiWR.ConstructionandcharacterizationofaMycobacteriumtuberculosismutantlackingthealternatesigmafactorgene，sigF.(缺少替代性σ因子基因sigF的結(jié)核分枝桿菌突變株的構(gòu)建和表征)，InfectImmun2000；685575-80.11.WiegeshausEH，McMurrayDN，GroverAA，HardingGE和SmithDW.Host-parasiterelationshipsinexperimentalairbornetuberculosis.3.Relevanceofmicrobialenumerationtoacquiredresistanceinguineapigs.(實驗性空氣傳播的結(jié)核病中宿主-寄生物關(guān)系.3、豚鼠中微生物計數(shù)與獲得性抗性的關(guān)聯(lián)性)，AmRevRespirDis1970；102422-9.12.LarsenM.SomeCommonMethodsinMycobacterialGenetics.InJacobsJrW，HatfullG，eds.MolecularGeneticsofMycobacteria.(分枝桿菌遺傳學(xué)中的一些常用方法，在JacobsJrW，HatfullG主編的《分枝桿菌分子遺傳學(xué)》中)，Washington，DCASMPress，2000316-17.13.KarakousisPC，YoshimatsuT，LamichhaneG等，DormancyphenotypedisplayedbyextracellularMycobacteriumtuberculosiswithinartificialgranulomasinmice.(小鼠人工肉芽腫內(nèi)細(xì)胞外結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出的休眠表型)，JExpMed2004；200647-57.14.ColeST.TubercuList.WWWserverv3.1.可以從http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/獲得，2006年11月1日存取。15.TIGR.MycobacteriumtuberculosisCDC1551GenomePage.(結(jié)核分枝桿菌CDC1551基因組頁)，2006卷TheInstituteforGenomicResearch，2005-06.16.KaushalD，SchroederBG，TyagiS等，ReducedimmunopathologyandmortalitydespitetissuepersistenceinaMycobacteriumtuberculosismutantlackingalternativesigmafactor，SigH.(在缺少替代性σ因子SigH的結(jié)核分枝桿菌突變株中，盡管存在組織持留，但免疫病理學(xué)和死亡率降低)，ProcNatlAcadSciUSA2002；998330-5.17.KarlsRK，GuarnerJ，McMurrayDN，BirknessKA和QuinnFD.ExaminationofMycobacteriumtuberculosissigmafactormutantsusinglow-doseaerosolinfectionofguineapigssuggestsaroleforSigCinpathogenesis.(使用低劑量氣溶膠感染豚鼠檢測結(jié)核分枝桿菌σ因子突變株表明SigC在發(fā)病機(jī)理中的作用)，Microbiology2006；1521591-600.18.SunR，ConversePJ，KoC，TyagiS，MorrisonNE和BishaiWR.MycobacteriumtuberculosisECFsigmafactorsigCisrequiredforlethalityinmiceandfortheconditionalexpressionofadefinedgeneset.(結(jié)核分枝桿菌ECFσ因子SigC是小鼠致死性和確定基因群的條件性表達(dá)所需的)，MolMicrobiol2004；5225-38.19.BishaiWR，DannenbergAM，Jr.，ParrishN等，VirulenceofMycobacteriumtuberculosisCDC1551andH37RvinrabbitsevaluatedbyLurie′spulmonarytuberclecountmethod.(通過Lurie′s肺部結(jié)核計數(shù)方法評估結(jié)核分枝桿菌CDC1551和H37Rv在兔中的毒力)，InfectImmun1999；674931-4.20.MurphyHN，StewartGR，MischenkoVV等，TheOtsABpathwayisessentialfortrehalosebiosynthesisinMycobacteriumtuberculosis.(OstAB途徑是結(jié)核分枝桿菌中海藻糖生物合成所必需的)，JBiolChem2005；28014524-9.21.BettsJC，LukeyPT，RobbLC，McAdamRA和DuncanK.EvaluationofanutrientstarvationmodelofMycobacteriumtuberculosispersistencebygeneandproteinexpressionprofiling.(通過基因和蛋白表達(dá)情況評估結(jié)核分枝桿菌持留的營養(yǎng)饑餓模型)，MolMicrobiol2002；43717-31.22.SchnappingerD，EhrtS，VoskuilMI等，TranscriptionalAdaptationofMycobacteriumtuberculosiswithinMacrophagesInsightsintothePhagosomalEnvironment.(結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄適應(yīng)對吞噬體環(huán)境的了解)，JExpMed2003；198693-704.23.ManganelliR，VoskuilMI，SchoolnikGK，DubnauE，GomezM和SmithI.Roleoftheextracytoplasmic-functionsigmafactor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(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)作用，其等效于或好于現(xiàn)有的BCG方法。產(chǎn)生了分別表達(dá)7個來自于結(jié)核分枝桿菌的與持留相關(guān)基因(表4)中每一個的DNA疫苗，并在小鼠和豚鼠中測試了它們的免疫原性，以及它們提供針對結(jié)核分枝桿菌的毒力菌株的氣溶膠激惹的保護(hù)作用的能力。表5、最近鑒定到的與結(jié)核分枝桿菌持留有關(guān)的基因。為了測試結(jié)合了上面列出的基因的DNA疫苗，將每個基因克隆到pJW4303(或類似的)質(zhì)粒載體中，生長至足夠的數(shù)量，并純化無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。I.對于這些疫苗的體內(nèi)評估來說，雌性6-8周齡的BALB/c小鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)(每組20只動物)肌內(nèi)接種3劑100μgDNA，給藥間隔為3周(圖3)。一組小鼠(第1組，圖3)使用同樣的劑量和時間表，用沒有分枝桿菌基因的質(zhì)粒DNA免疫，代表“陰性對照”組。另一組(第2組，圖2)在第0周時用標(biāo)準(zhǔn)的參比菌株BCG皮下接種一次，用作“陽性對照”組。通過與該BCG標(biāo)準(zhǔn)引發(fā)的保護(hù)作用進(jìn)行比較，確定候選DNA疫苗的保護(hù)功效。最后一次免疫后4周(即研究的第13周)，通過測量IFN-y產(chǎn)生的免疫分析測定這些疫苗方案的免疫原性，因為該細(xì)胞因子對于針對結(jié)核病的保護(hù)作用是關(guān)鍵的。將每組4只小鼠處死，取出它們的脾臟。從每個脾臟制備細(xì)胞懸浮液，測試得到的脾細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答。將一組細(xì)胞用結(jié)核分枝桿菌蛋白(包括純化的蛋白衍生物，培養(yǎng)物濾液蛋白和摻入到疫苗載體中的基因編碼的重組蛋白)培養(yǎng)3天，在3天后通過ELISA測量培養(yǎng)上清液中IFN-γ的量。第二組脾細(xì)胞用源于結(jié)核分枝桿菌抗原的肽刺激6小時，然后對細(xì)胞內(nèi)IFN-γ進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。然后使用Glas-Col吸入暴露系統(tǒng)(Glas-Col，TerreHaute，IN)，用大約200CFU的有毒力的結(jié)核分枝桿菌CDC1551(或Erdman)菌株對剩余的小鼠(每組16只動物)進(jìn)行產(chǎn)氣激惹。4周后(即研究的第17周)，將每組8只小鼠處死，取出它們的肺臟和脾臟。將每個器官的一部分用蘇木精和曙紅染色，以評估組織病理學(xué)。將剩余的組織勻漿并鋪于瓊脂上，以確定這些器官中每一個的細(xì)菌負(fù)荷。跟蹤剩余的每組8只小鼠的存活，以建立平均存活時間。使用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計學(xué)檢驗分析免疫原性和保護(hù)性的數(shù)據(jù)，以評估這些新的結(jié)合了這些與分枝桿菌持留有關(guān)的基因的DNA疫苗。II.對250-300克的Hartley種系豚鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)(每組16只動物)肌內(nèi)接種3劑100μgDNA，給藥間隔為3周。一組豚鼠使用同樣的劑量和時間表，用沒有分枝桿菌基因的質(zhì)粒DNA免疫，代表“陰性對照”組。另一組在第0周時用標(biāo)準(zhǔn)的參比菌株BCG皮下接種一次，用作“陽性對照”組。通過與該BCG標(biāo)準(zhǔn)引發(fā)的保護(hù)作用進(jìn)行比較，確定了候選DNA疫苗的保護(hù)功效。最后一次免疫后4周(即研究的第13周)，使用UniversityofWisconsinEngineeringShops的最新版Madison氣溶膠室[7]，用大約5-10CFU的毒力結(jié)核分枝桿菌CDC1551(或Erdman)菌株對豚鼠進(jìn)行產(chǎn)氣激惹。4周后(即研究的第17周)，將每組8只豚鼠處死，取出它們的肺臟和脾臟。將每個器官的一部分用蘇木精和曙紅染色，以評估組織病理學(xué)。將剩余的組織勻漿并鋪于瓊脂上，以確定這些器官中每一個的細(xì)菌負(fù)荷。跟蹤剩余的每組8只豚鼠的存活以建立平均存活時間。使用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計學(xué)檢驗分析免疫原性和保護(hù)性的數(shù)據(jù)，以評估這些新的結(jié)合了這些與分枝桿菌持留有關(guān)的基因的DNA疫苗。b.過量表達(dá)列出的靶基因的重組BCG對這7個基因的每一個的編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分別克隆到帶有hsp60——一種強(qiáng)的組成型表達(dá)的分枝桿菌啟動子[12]——的分枝桿菌-大腸桿菌穿梭載體pMV261中。然后用這些質(zhì)粒的每一個分別轉(zhuǎn)化BCG1331，獲得了7種不同的重組BCG菌株。使用重組BCG菌株(每組1個菌株)，通過皮下或氣溶膠途徑[13]接種7組250-300克的Hartley種系豚鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)(每組16只動物)。一組豚鼠在第0周時用標(biāo)準(zhǔn)的參比菌株BCG皮下接種一次，用作“陽性對照”組。通過與該BCG標(biāo)準(zhǔn)引發(fā)的保護(hù)作用進(jìn)行比較，確定了候選DNA疫苗的保護(hù)功效。免疫6周后，使用UniversityofWisconsinEngineeringShops最新版Madison氣溶膠室[7]，用大約5-10CFU的有毒力的結(jié)核分枝桿菌CDC1551(或Erdman)菌株對豚鼠進(jìn)行產(chǎn)氣激惹。4周后(即研究的第10周)，將每組8只豚鼠處死，取出它們的肺臟和脾臟。將每個器官的一部分用蘇木精和曙紅染色，以評估組織病理學(xué)。將剩余的組織勻漿并鋪于瓊脂上，以確定這些器官中每一個的細(xì)菌負(fù)荷。跟蹤剩余的每組8只豚鼠的存活以建立平均存活時間。使用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計學(xué)檢驗，分析免疫原性和保護(hù)性的數(shù)據(jù)，以評估這些新的結(jié)合了這些與分枝桿菌持留有關(guān)的基因的DNA疫苗。c.在豚鼠氣溶膠激惹模型中評估作為疫苗候選物的結(jié)核分枝桿菌持留基因突變株。已經(jīng)鑒定了許多結(jié)核分枝桿菌基因，它們在突變時引起分枝桿菌在小鼠和豚鼠感染模型中持留的減弱(表6)。這些基因代表了該病原體在宿主中的持留所需的重要毒力因子，不能產(chǎn)生這些關(guān)鍵基因的分枝桿菌可以用作減毒的活疫苗。表6、最近鑒定到的與結(jié)核分枝桿菌持留有關(guān)的基因。為了證實該結(jié)論，使用所述的結(jié)核分枝桿菌突變株、即不能產(chǎn)生Rv0346c、Rv1072c、Rv1994c、Rv2427c、Rv2817c、Rv3017c或Rv3864的7種結(jié)核分枝桿菌突變菌株，接種了7組豚鼠(圖4)。陰性對照豚鼠組(第1組，圖3)用鹽水免疫，陽性對照組(第2組，圖3)用BCGDanish1331皮下接種。免疫6周后，使用UniversityofWisconsinEngineeringShops的最新版Madison氣溶膠室[7]，用大約5-10CFU的有毒力的結(jié)核分枝桿菌CDC1551(或Erdman)菌株對豚鼠進(jìn)行產(chǎn)氣激惹。4周后(即研究的第10周)，將每組10只豚鼠處死，取出它們的肺臟和脾臟。將每個器官的一部分用蘇木精和曙紅染色，以評估組織病理學(xué)。將剩余的組織勻漿并鋪于瓊脂上，以確定這些器官中每一個的細(xì)菌負(fù)荷。跟蹤剩余的每組10只動物的存活以建立平均存活時間和殺死曲線。使用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計學(xué)檢驗，分析組織病理學(xué)和保護(hù)性的數(shù)據(jù)，以評估這些減毒的結(jié)核分枝桿菌疫苗菌株的保護(hù)功效。如果生長在具有野生型結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物的平板上的疫苗菌株(重組BCG菌株和晚期基因的突變株)在指定的主要終點時CFU計數(shù)估計過高，那么將肺和脾臟勻漿液也鋪于只有疫苗菌株可以生長的卡那霉素選擇性平板上。然后通過從野生型結(jié)核分枝桿菌的CFU計數(shù)中減去從卡那霉素平板獲得的CFU計數(shù)，來確定最終的CFU計數(shù)。實施例5、評估7個小鼠晚期基因作為藥物靶的潛力背景為了有效治療結(jié)核病并減少結(jié)核分枝桿菌的傳播，迫切需要新的對抗結(jié)核病的藥物。多重抗藥和廣泛抗藥的結(jié)核分枝桿菌菌株的快速出現(xiàn)，使得該疾病成為具有最高公共衛(wèi)生重點的疾病之一，特別是在發(fā)展中國家。由于需要長時間的治療周期以及抗藥性的出現(xiàn)，現(xiàn)有的藥物在許多情況下變得無效。因此，新的、有效的治療感染個體和防止結(jié)核分枝桿菌傳播的藥物，對于全球健康來說是必需的。未來的TB藥物可能通過合理的藥物設(shè)計來鑒定，其中以必需基因作為靶并使用先進(jìn)的結(jié)構(gòu)模擬來產(chǎn)生抑制劑。在表7中鑒定到的7個基因用作合理設(shè)計抗結(jié)核病藥物的藥靶。表7、最近鑒定到的與結(jié)核分枝桿菌持留有關(guān)的基因。研究設(shè)計重組蛋白的產(chǎn)生從結(jié)核分枝桿菌CDC1551基因組DNA通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增了這7個基因的編碼序列，并作為C-末端帶有6個組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白克隆到重組蛋白表達(dá)載體pET-22b(+)(Novagen，SanDiego，CA)中。在通過測序證實了符合讀框的融合后，將重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，并使用標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)用金屬親和層析進(jìn)行純化。對這些重組蛋白的功能，例如ATP酶、蛋白酶、酯酶、水解酶、脫氫酶等，進(jìn)行生物化學(xué)評估。對分子文庫進(jìn)行測試，鑒定出抑制重組蛋白的生物化學(xué)功能的分子。還對結(jié)合的親和性、溶解性、穿透組織的可能性等進(jìn)行了進(jìn)一步分析。如果含有疏水性或膜相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白分配到標(biāo)準(zhǔn)的裂解緩沖液的不溶性級份中，那么使用可商購的利用非離子和兩性離子去污劑的制劑(蛋白提取試劑，試劑)來使那些蛋白增溶而不變性。在大腸桿菌中不表達(dá)的分枝桿菌蛋白按照Choudhuri等[11]的描述在恥垢分枝桿菌中表達(dá)。實施例2-5的參考文獻(xiàn)1.Hingley-WilsonSM，SambandamurthyVK和JacobsWR，Jr.Survivalperspectivesfromtheworld′smostsuccessfulpathogen，Mycobacteriumtuberculosis.(世界最成功的病原體結(jié)核分枝桿菌的存活展望)，NatImmunol2003；4949-55.2.LamichhaneG，TyagiS和BishaiWR.DesignerarraysfordefinedmutantanalysistodetectgenesessentialforsurvivalofMycobacteriumtuberculosisinmouselungs.(確定的突變株分析的設(shè)計者陣列，用于檢測結(jié)核分枝桿菌在小鼠肺中存活所必需的基因)，InfectImmun2005；732533-40.3.TurnerO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技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，本發(fā)明可以在所附的利要求書的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行修改而仍然能夠?qū)嵤?。因此，本發(fā)明將不限于上面描述的實施方案，而是應(yīng)該進(jìn)一步包含在本文提供的說明書的精神和范圍內(nèi)的所有修改及其等價物。權(quán)利要求1.適用于接種或引發(fā)免疫應(yīng)答的組合物，含有a.至少一種重組蛋白或其抗原性片段，其中所述至少一種重組蛋白由下列基因編碼以下所表示的基因i)選自0361、1102、2050、2500和2884的MtbCDC1551基因組MT編號，或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c和2817c的MtbH37Rv基因組Rv編號；或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白或其抗原性片段的至少一種核酸分子；或c.帶有至少一種所述核酸分子的宿主。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一種核酸是載體的一部分。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述載體選自質(zhì)粒和病毒載體。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的所述至少一種核酸分子。6.權(quán)利要求1的組合物，還含有生理相容的載體。7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述宿主是細(xì)菌。8.用于接種以對抗持續(xù)分枝桿菌感染的組合物，含有a.至少一種重組蛋白或其抗原性片段，其中所述至少一種重組蛋白由下列基因編碼以下所表示的基因i)選白0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MtbCDC1551基因組MT編號，或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的MtbH37Rv基因組Rv編號；或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白或其抗原性片段的至少一種核酸分子；或c.帶有至少一種所述核酸分子的宿主。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述至少一種核酸是載體的一部分。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述載體選自質(zhì)粒和病毒載體。11.權(quán)利要求8的組合物，其中所述宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的所述至少一種核酸分子。12.權(quán)利要求8的組合物，還含有生理相容的載體。13.權(quán)利要求8的組合物，其中所述宿主是細(xì)菌。14.給個體接種以對抗持續(xù)分枝桿菌感染的方法，包括下列步驟給所述個體施用疫苗組合物，所述組合物含有a.至少一種重組蛋白或其抗原性片段，其中所述至少一種重組蛋白由下列基因編碼以下所表示的基因i)選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MtbCDC1551基因組MT編號，或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的MtbH37Rv基因組Rv編號；或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白或其抗原性片段的至少一種核酸分子；或c.帶有至少一種所述核酸分子的宿主。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種核酸是載體的一部分。16.權(quán)利要求15的方法，其中其中所述載體選自質(zhì)粒和病毒載體。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的所述至少一種核酸分子。18.權(quán)利要求14的方法，還含有生理相容的載體。19.權(quán)利要求14的方法，其中所述宿主是細(xì)菌。20.權(quán)利要求14的方法，其中所述施用步驟通過靜脈內(nèi)或通過施用氣溶膠來進(jìn)行。21.減毒的、非致病性的分枝桿菌，其中所述減毒的分枝桿菌在選自下列的至少一個基因中含有至少一個突變i)選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MtbCDC1551基因組MT編號；ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的MtbH37Rv基因組Rv編號；以及iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因；其中所述至少一個突變導(dǎo)致由所述至少一個基因編碼的蛋白或多肽的生物學(xué)活性或功能的降低或消除。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。23.給個體接種以對抗分枝桿菌感染的方法，包括下述步驟給所述個體施用組合物，所述組合物含有減毒的、非致病性的分枝桿菌，其中所述減毒的分枝桿菌在選自下列的至少一個基因中含有至少一個突變i)選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MtbCDC1551基因組MT編號；ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的MtbH37Rv基因組Rv編號；以及iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因；其中所述至少一個突變導(dǎo)致由所述至少一個基因編碼的蛋白或多肽的生物學(xué)活性或功能的降低或消除。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌。25.藥理劑，其抑制或阻止由下列所表示的基因編碼的蛋白或多肽的生物學(xué)活性或功能i)選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MtbCDC1551基因組MT編號；或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的MtbH37Rv基因組Rv編號；或iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因。26.治療有所需要的患者的分枝桿菌感染的方法，包括下述步驟給所述患者施用抑制或阻止由下列所表示的基因編碼的蛋白或多肽的生物學(xué)活性或功能的藥理劑i)選自0361、1102、2050、2500、2884、3097和3978的MtbCDC1551基因組MT編號；或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c、2817c、3017c和3864的MtbH37Rv基因組Rv編號；或iii)對應(yīng)于i)或ii)的同源基因。27.給個體接種以對抗分枝桿菌感染的方法，包括下述步驟給所述個體施用疫苗組合物，所述組合物含有a.至少一種重組蛋白或其抗原性片段，其中所述至少一種重組蛋白由下列基因編碼以下所表示的基因i)選自0361、1102、2050、2500和2884的MtbCDC1551基因組MT編號，或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c和2817c的MtbH37Rv基因組Rv編號，或；對應(yīng)于i)或ii)的同源基因；或b.編碼所述至少一種重組蛋白或其抗原性片段的至少一種核酸分子；或c.帶有至少一種所述核酸分子的宿主。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述至少一種核酸是載體的一部分。29.權(quán)利要求28的方法，其中其中所述載體選自質(zhì)粒和病毒載體。30.權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主含有整合在其基因組中或作為質(zhì)粒的所述至少一種核酸分子。31.權(quán)利要求27的方法，還含有生理相容的載體。32.權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主是細(xì)菌。33.權(quán)利要求27的方法，其中所述施用步驟通過靜脈內(nèi)或通過施用氣溶膠來進(jìn)行。34.鑒定用于預(yù)防或治療由分枝桿菌引起的感染的藥物的方法，包括下列步驟將候選藥物暴露于由下列基因編碼的重組蛋白以下所表示的基因i)選自0361、1102、2050、2500和2884的MtbCDC1551基因組MT編號，或ii)選自0346c、1072、1994c、2427c和2817c的MtbH37Rv基因組Rv編號；或?qū)?yīng)于i)或ii)的同源基因；以及確定所述候選藥物是否抑制所述重組蛋白的生物學(xué)活性或功能；以及選擇抑制所述生物學(xué)活性或功能的候選藥物，作為用于預(yù)防或治療由分枝桿菌引起的感染的藥物。全文摘要本發(fā)明提供了用于預(yù)防分枝桿菌(Mycobacterium)感染、特別是持續(xù)性的、潛伏性的分枝桿菌感染的組合物和方法。組合物和方法利用了新鑒定的分枝桿菌在宿主中生存所必需的分枝桿菌基因(和/或相應(yīng)的基因產(chǎn)物)。文檔編號A61K38/00GK101646447SQ200880008005公開日2010年2月10日申請日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日發(fā)明者桑賈伊·K·賈殷,莫伊賽斯·S·赫南德斯-阿班圖,加努·拉米查恩,威廉·R·比什艾申請人:約翰斯霍普金斯大學(xué)