專利名稱：：1-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸類化合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機化學(xué)、藥物化學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一類式(I)所示結(jié)構(gòu)的l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸類化合物和其中間體式(II)化合物，即l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l，5-內(nèi)酯，和它們的可藥用鹽以及它們的制備方法和醫(yī)藥用途。該類化合物被發(fā)現(xiàn)具有降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表達、抑制乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)復(fù)制的功能；可以預(yù)期用于制備治療相關(guān)的乙肝病毒感染性疾病藥物的用途。
背景技術(shù)：
：病毒感染引起人和動物多種疾病，嚴(yán)重危害健康和生命，約60%的傳染病是由病毒引起的。迄今，全世界發(fā)現(xiàn)的病毒己經(jīng)達3000多種，新的病毒不斷被發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)80年代醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)的人類免疫缺陷病毒(HIV)所致艾滋病是危害性極大，死亡率很高的傳染病。2003年又發(fā)現(xiàn)了一種由新的冠狀病毒所致嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(severeacuterespiratorysyndome，SARS)，具有高度傳染性，致死率高。然而目前對病毒性疾病的治療仍缺乏專屬性強的藥物，理想的抗病毒藥物應(yīng)是僅干擾病毒的復(fù)制而不影響正常細胞的代謝，但是由于病毒和宿主細胞相互作用的復(fù)雜性，大多數(shù)抗病毒的藥物在發(fā)揮治療作用時，對人體易產(chǎn)生毒性?；蛘咚幬锉旧砜共《咀饔幂^低而無法達到抑制的作用。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的選擇性高的強效抗病毒藥物是世界范圍內(nèi)的研究熱點。我們也致力于抗病毒藥物的研究。乙型病毒型肝炎(HepatitisB)是中國多發(fā)和常見重型傳染性疾病，其,病原體是乙型肝炎病毒(HBV)。全國約1.2億HBV攜帶者，每年死于原發(fā)性肝癌的15萬人中，絕大多數(shù)與乙型肝炎感染有關(guān)。目前，臨床上對HBV病患的治療方案只能達到抑制HBV復(fù)制和繼發(fā)感染，最主要藥物仍是核苷類藥物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韋、阿德福韋(ADV)等，它們雖然能有效地控制病情，但一則售價昂貴，二則長期使用均可出現(xiàn)耐藥性，以及不同程度的反跳，三是長期使用核苷類藥物出現(xiàn)的較為明顯的眾所周知的不良作用。所以從民族民間長期使用的藥物中發(fā)現(xiàn)新的非核苷類乙肝病毒抑制劑有著很大的意義，選擇乙肝病毒抑制劑主要的判斷指標(biāo)在于該類新穎的非核苷類藥物必須具有對乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)和/或乙肝表面抗原(HBsAg)的抑制活性。單咖啡?？崴犷愒谥参锝绶植驾^廣，最常見的是5-氧-咖啡?？崴?，即氯原酸。另外在奎尼酸的l位，3位和4位被咖啡?；鶈稳〈目Х弱？崴犷惢衔镆苍谥参镏蟹蛛x得到，此類化合物與氯原酸一樣具有對HIV抑制等活性。5-氧-沒食子酰奎尼酸(5-0-galloylquinicacid)是一類生理活性很強的化合物，其被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和報道出的活性包括病毒轉(zhuǎn)錄酶抑制劑[MedicinalChemistryResearch(1997)，7(3),168-179]、脂肪酶抑制劑[WO2006022227]、對體外培養(yǎng)小鼠B-16黑色素瘤細胞株之黑色素生成的抑制活性[SaengyakHakhoechi(2004),35(2),157-163]、抗氧化[FreeRadicalResearch(2004)，38(1)，97-103;Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry(2003)，67(2),396-401;PhytotherapyResearch(1998),12(3)，159-162]等。l國氧一咖啡?？崴?1-O-Caffeoylquinicacid)近來也有報道從Foem'c"/"wvw/gare分離f尋歪U[ParejoI等,Separationandcharacterizationofphenoliccompoundsinfennel(Fo抓'cw/腦vw/gore)usingliquidchromatography-negativeelectrospmyionizationtandemmassspectrometry,JAgricFoodChem，(2004)，52(12),3679]?？紤]到抗HIV藥物和HBV藥物的高同源性，并為尋找更多樣的能對乙肝病毒復(fù)制產(chǎn)生抑制作用的1-氧-取代?；?奎尼酸及其類似物，本發(fā)明對上述化合物進行了合成和結(jié)構(gòu)改造，即在奎尼酸1位引入與咖啡?；愃频娜〈Х弱；?，再引入五元雜環(huán)烯丙?；捅郊柞Ｏ┍；取Ｓ纱酥苽涑鲆幌盗衛(wèi)-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸類化合物，并測試了其對HBVDNA和HBsAg的抑制活性，據(jù)此完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類新的抗乙肝病毒藥物，具體而言，本發(fā)明提供了一類式(I)所示結(jié)構(gòu)的l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸類化合物及其可藥用鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(I)其中R是苯甲酰基，取代或未取代的苯環(huán)或五元芳雜環(huán)；所述苯環(huán)或五元芳雜環(huán)上的取代基可以相同或不同，分別選自氫，羥基，鹵素，含18個碳的烷氧基，其條件是當(dāng)R為苯環(huán)時，苯環(huán)上的取代基不能全為氫，也不能是4-羥基取代或3，4-二f圣基取代或3，5-二羥基取代或3，4-二甲氧基取代，還不能是3-甲氧基-4-羥基取代。本發(fā)明的另一目的是提供了式(I)化合物的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供了式(I)化合物的用于制備抗乙肝病毒藥物的用途。本發(fā)明的再一個目的是提供了一種含有式(I)化合物的用于抗乙肝病毒疾病的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加入各種藥用賦形劑，添加劑及載體。本發(fā)明優(yōu)選的式(I)化合物列舉如下I-a.l-氧-[3-(2，6-二氯苯)-烯丙酰]-奎尼酸；pb.1-氧-[3-(2，4-二氯苯)-烯丙酰]-奎尼酸；I-c.1-氧-(3-苯甲酰基-烯丙酰)-奎尼酸；I~d.l-氧-[3-(2-呋喃基)-烯丙酰]-奎尼酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>此外，本發(fā)明提供了一種具有式(II)所示的制備式(I)化合物的關(guān)鍵中間體l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l，5-內(nèi)酯及其可藥用式(II)其中R是苯甲?；?，取代或未取代的苯環(huán)或五元芳雜環(huán)；所述苯環(huán)或五元芳雜環(huán)上的取代基可以相同或不同，分別選自氫，羥基，鹵素，含18個碳的烷氧基，其條件是當(dāng)R為苯環(huán)時，苯環(huán)上的取代基不能全為氫，也不能是4-羥基取代或3，4-二羥基取代或3，5-二羥基取代或3，4-二甲氧基取代，還不能是3-甲氧基-4-羥基取代。本發(fā)明優(yōu)選的式(II)化合物選自n_a.1-氧-[3-(2，6-二氯苯)-烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-1,5-內(nèi)酯；II-b.1-氧-[3-(2,4-二氯苯)-烯丙酰]-3,4-氧-異丙叉奎尼酸-1,5-內(nèi)酯；II~c.l-氧-(3-苯甲?；?烯丙酰)-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l,5-內(nèi)酯；114.l-氧-[3-(2-呋喃基)烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l,5-內(nèi)酯。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>具體實施方式-本發(fā)明還提供了一種由中間體式(II)化合物制備式(I)化合物的方法，其中，由中間體式(II)化合物制備式(I)化合物的合成工藝路線特征是咖啡?？鼘幩犷惢衔锖铣申P(guān)鍵是得到合適的中間體，要對除反應(yīng)部位的其他羥基進行合理的保護，使其與各種取代苯甲酸或苯丙烯酸縮合時，反應(yīng)能有較高的選擇性，然后再脫去保護基，得到所需的化合物。制備1位取代的化合物，我們需要的是除1位以外的其他羥基均被保護的中間體，故先用丙酮與其縮合，在酸性條件下1位羧酸與5位羥基同時也生成內(nèi)酯環(huán)，因此可得到1位羥基裸露的3,4-氧-異丙叉奎尼酸內(nèi)酯中間體，將此中間體與各種不同取代的芳基取代烯丙酸在N,N-二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在下或在l，l'-羰基二咪唑(CDI)和1，8-二氮雜雙環(huán)[5,4，0]11烷-7-烯(DBU)存在下通過酯化反應(yīng)制備得到。本發(fā)明中我們采用了CDI,DBU禾BDCC，DMAP兩種體系。反應(yīng)中使用了無水硫酸鈉作除水劑，丙酮必需作嚴(yán)格的無水處理。由于奎尼酸極性較大，在丙酮等中等極性的溶劑中溶解性不好，所以可適當(dāng)延長反應(yīng)時間，運用以上改進的方法可使產(chǎn)率提高到60%左右。反應(yīng)條件及試劑a)無水丙酮，濃硫酸，回流，65%;b)N,N-二環(huán)己基羰二亞胺DCC，4-二甲氨基吡啶DMAP,二氯甲垸，室溫，6小時；l,l'-羰基二咪唑CDI，l，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]ll烷-7-烯DBU,四氫呋喃，45。C，24小時；c)1.5N鹽酸，甲醇，回流5小時。本發(fā)明的式(I)化合物及其關(guān)鍵中間體式(II)化合物或其可藥用鹽對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有良好的抑制作用。根據(jù)本發(fā)明，該類化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到可以用于防治病毒引起的疾病的藥物組合物。下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例給出了代表性化合物的合成及相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)。必須說明，下述實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1:化合物3，4-氧-異丙叉奎尼酸1，5-內(nèi)酯的制備反應(yīng)瓶中，加入奎尼酸(500毫克，2.6毫摩爾)，無水硫酸鈉(2.5克，17.6毫摩爾)，15毫升無水丙酮，攪拌數(shù)分鐘，再向反應(yīng)瓶中滴加3微升濃硫酸，加熱回流5小時。冷卻到室溫，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH約為7，抽濾除去不溶物，濾液濃縮。脫溶所得固體分散在3毫升氯仿和3毫升蒸餾水中，水層再用氯仿萃取3次(5毫升x3)，合并所有有機相，用水洗，飽和食鹽水洗滌數(shù)次，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾除去溶劑得白色固體，在乙酸乙酯中重結(jié)晶得白色粉末350毫克，產(chǎn)率為63.2%。""T"u3，4-氧-異丙叉奎尼酸1，5-內(nèi)酯熔點120~122°C;核磁共振氫譜。HNMR,400MHz，氖代甲醇)S1.29(3H,單峰)，1.46(3H，單峰)，2.00~2.49(4H，多重峰)，4.27(1H，雙雙峰)，4.50(1H，多重峰)，4.65(1H，雙雙峰)。實施例2:化合物II-a即l-氧-[3-(2，6-二氯苯)烯丙酰]-3,4-氧-異丙叉奎尼酸-1，5-內(nèi)酯的制備方法一向反應(yīng)瓶中加入2,6-二氯苯-3-烯丙酸(125毫克，0.58毫摩爾)，羰基二咪唑(190毫克，1.17毫摩爾)，無水四氫呋喃10毫升，加熱回流反應(yīng)2小時，再向其中加入3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l，5-內(nèi)酯(83毫克,0.47毫摩爾),1,8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]11烷-7-烯(DBU，90毫克，0.58毫摩爾)，整個溶液在回流條件下反應(yīng)8小時。減壓蒸除溶劑后得淡黃色粘稠狀固體，經(jīng)柱層析純化(石油醚乙酸乙酯=10:1，粗品硅膠=1:40)分離得到'黃色固體73.6毫克，產(chǎn)率為38%。方法二向反應(yīng)瓶中加入2,6-二氯苯-3-烯丙酸(30.2毫克，0.14毫摩爾)，二環(huán)己基碳二亞胺(29毫克，0.14毫摩爾)，無水二氯甲烷8毫升，在室溫下攪拌20分鐘，出現(xiàn)白色混濁后，再向其中加入3，4-丙酮叉奎尼酸l，5-內(nèi)酯(20.5毫克，0.093毫摩爾),4-二甲氨基吡啶(DMAP，1.7毫克，0.014毫摩爾)，整個溶液在室溫下反應(yīng)過夜，抽濾除去不溶物，蒸去溶劑，脫溶得到白色固體，柱層析純化(石油醚乙酸乙酯-10:1，粗品/硅膠=1:40)分離得到白色固體17.6毫克，產(chǎn)率為37%。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物II-a:淡黃色固體，熔點89~90°C，及y(石油醚/乙酸乙酯3/1):.0.35;核磁共振氫譜(iHNMR，400MHz,氖代甲醇)51.33(3H,單峰，CH3),1.45(3H,單峰，CH3)，2.32-3.12(4H，多重峰，H-2，6)，4.30(1H,雙雙峰，H-4),4.57(1H,多重峰，H畫5)，4.82(1H，雙雙雙峰，H國3),6.64(1H,雙峰，J=16.0Hz，H-2')，7.36(lH，多重峰，H-7')，7.53(2H,多重峰，H-6'，H-8')，7.98(lH,J=16.0Hz,H-3')。根據(jù)實施例2相同的方法制備得到表一所示之實施例3~5化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>表一<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>下面列出表一中各化合物的理化數(shù)據(jù)化合物II-b:淡黃色固體，熔點89％°C,&(石油醚/乙酸乙酯3/1):0.31;核磁共振氫譜('HNMR，400MHz,氖代甲醇)S1.35(3H,單峰，CH3):1.48(3H，單峰，CH3)，2.35-3.12(4H，多重峰，H畫2，6)，4.36(1H，雙雙峰:H畫4)，4.59(1H,多重峰，H-5),4,85(1H,雙雙雙峰，H-3)，6.57(1H,雙峰:J=16.0Hz，H-2'),7.35(1H,J=8.4Hz，H曙8'),7.52(1H，單峰，H-6')，7.78(1H:雙峰，J=8.4Hz，H-9')，7.98(1H,J=16.0Hz，H畫3')?；衔?1<:黃色油狀物，熔點9395。C(氯仿)；&(石油醚/乙酸乙酯3/1):0.40;核磁共振氫譜iHNMR(400MHz,氖代甲醇)51.33(3H,單峰，CH3),1.51(3H，單峰，CH3)，2.40~3.11(4H，多重峰，H-2,6),4.39(1H,雙雙峰，H-4)，4.68(1H,多重峰，H-5),4,87(1H，雙雙雙峰，H-3)，6.79(1H,雙峰，J-16.0Hz，H-2')，7.57(2H,多重峰，H-7',9'),7.72(1H，三重峰，H-8'),8.02(1H，雙峰，J=16.0Hz,H-3'),8.09(2H，多重峰，H-6',10');電噴霧質(zhì)i普ESI誦MSm/z:390.14([M+H20]+)?；衔颕I~d:黃色固體，熔點8990°C(氯仿)，A(石油醚/乙酸乙酯3/1):0.36;核磁共振氫譜。HNMR，400MHz,氘代甲醇)S1.33(3H,單峰，CH3),1.43(3H，單峰，CH3),2.333.10(4H，多重峰，H-2,6)，4.37(1H，雙雙峰,H-4)，4.65(1H,多重峰，H-5)，4.84(1H，雙雙雙峰，H誦3),6.26(1H，雙峰，J=16.0Hz，H-2'),6.56(1H,單峰，H-6'),6.75(1H，單峰，H-5')，7.36(1H,雙峰，^16.0Hz,H-3')，7.66(lH，單峰,H-7');電噴霧質(zhì)譜ESI-MSm/z:351.91([M+H20]+)。實施例6:化合物I-a[l-氧-(2,6-二氯苯-3-烯丙酰)-奎尼勒的制備在二頸瓶中加入化合物n-a(20毫克，0.048毫摩爾)，加入5毫升甲醇-四氫呋喃-水體系(3:1:1)，再滴加5滴1.5摩爾/升鹽酸，加熱回流7小時，由薄層色譜TLC檢測到產(chǎn)物和原料比不再變化，冷卻至室溫，用二氯甲烷萃取，合并氯仿層用大量水洗，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。用;SephadexLH-20凝膠柱以甲醇洗脫為條件多次分離后得到白色固體15毫克，產(chǎn)率為79°/。?；衔颕-a:白色固體，熔點141~143°C，A(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.17;核磁共振氫譜。HNMR，400MHz，氖代甲醇)52.253.12(4H,多重峰，H-2，6),3.86(1H,雙雙峰，H-4),4.09(1H，多重峰，H曙5)，4.64(1H，雙雙雙峰，H-3)，6.67(1H,雙峰，J=16.4Hz,H-2')，7.39(1H，多重峰，H-7'),7.52(2H,多重峰,H國6'，8'),7.87(1H,雙峰，J-16.4Hz，H-3')。下面列出表二中各化合物的理化數(shù)據(jù)化合物I-b:白色固體，熔點135~136°C，i/(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.15;核磁共振氫譜iHNMR(400MHz，氘代甲醇)S2.18-2.87(4H,多重峰，H-2，6)，3.04(1H，雙雙峰，H-4)，3.78(1H，多重峰，H-5),4.02(1H,雙雙雙峰，H-3)，6.60(1H,雙峰，J-16.0Hz，H-2')，7.37(1H，雙峰，J-8.4Hz，H國8'),7.55(1H，單峰，H國6')，7.79(1H,雙峰，J-8.4Hz，H-9'),8.00(1H，雙峰,J=16.0Hz，H-3')?；衔颕"C:黃色固體，熔點U3115。C，i^(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.22;核磁共振氫譜&NMR(400MHz，氖代甲醇)S2.13-3.03(4H,多重峰，H-2,6),3.60(1H,雙雙峰，H-4),3.93(1H，多重峰，H-5),4.57(1H，雙雙雙峰，H-3)，6.80(1H，雙峰，J=16.0Hz，H-2'),7.52(2H，多重峰，H畫7'，9')，7.66(1H，多重峰，H-8'),7.93(2H，多重峰，H-6',10'),7.98(1H,雙峰，J=16.0Hz，H-3')?；衔颕-d:黃色固體，熔點132~135°C，A(氯仿/甲醇/甲酸50/2/1):0.48;核磁共振氫譜iHNMR(400MHz，氘代甲醇)S2.152.92(4H，多重峰,H-2,6),3.38(1H,雙雙峰，H-4),3.83(1H,多重峰，H國5),4.15(1H，雙雙雙峰，H-3),6.29(1H,雙峰，J-16.0Hz，H-2'),6.60(1H，單峰，H-6'),6.73(1H，單峰，H-5')，7.46(1H,雙峰，J-16.0Hz，H-3')，7.68(1H,單峰，H-7')。本發(fā)明的式(I)和式(II)化合物具有抑制乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制，降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表達的功能；可以用于制備治療相關(guān)的乙肝病毒感染性疾病的藥物用途。該類化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)制備得到具有抗乙肝病毒活性從而可以用于防治乙肝病毒引起的疾病的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型藥物，還可以利用現(xiàn)有公知技術(shù)制備成其控釋、緩釋劑型及納米制劑，又可以應(yīng)用靶向藥物制劑技術(shù)制備成相應(yīng)藥物劑型和給藥方式。本發(fā)明的式(I)和式(II)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療乙型病毒性肝炎藥物如拉米呋啶(lamivuding)、阿德福韋及其二匹伏酯(adevovir/adevovirdipivoxil)、恩替卡韋(entecavir)、恩曲他濱(emtricitabine)、克來福定(clevudine)、泛昔絡(luò)韋(famciclovir)、洛布卡韋(lobucavir)、干擾素(IFN)等聯(lián)合使用，制備得到具有治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物。上述各類藥物組合物均可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型藥物，還可以利用現(xiàn)有公知技術(shù)制備成其控釋、緩釋劑型及納米制劑，還可以應(yīng)用靶向藥物制劑技術(shù)制備成相應(yīng)藥物劑型和給藥方式。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用藥理實施例的形式簡述式(I)和式(II)化合物對乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制試驗之藥理實驗結(jié)果，以說明其在抗病毒藥物開發(fā)領(lǐng)域中的用途。藥理實施例給出了式(I)和式(II)化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說明，本發(fā)明的藥理實施例仍是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。藥理實施例l:化合物I~c對HepG2.2.15細胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抑制作用1.1細胞培養(yǎng)將HepG2.2.15細胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/毫升青霉素和,100微克/毫升鏈霉素，100微克/毫升G418的DMEM培養(yǎng)基中，置37"C，5%二氧化碳(302，100。/^相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法測定化合物I~c對HepG2.2.15細胞生長的抑制作用取對數(shù)生長期的HepG2.2.15細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成1X105個/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37'C,5%C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物I-c，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升，和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37。C，5%C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，每孔加入5毫克/毫升MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜DMSO200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對照孔。實驗重復(fù)三次。抑制率(%)=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值X100%。1.3測定化合物I"C對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用取對數(shù)生長期的HepG2.2.15細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成1X105個/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37t:，5%C02,100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物I~c化合物，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37。C，5%C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測樣品。用酶聯(lián)反應(yīng)ELISA試劑盒測定培養(yǎng)基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)濃度，以P/N表示；以拉米昧啶(3-TC)為陽性對照。1.4實驗結(jié)果實驗結(jié)果如表三所示，化合物有顯著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其對HepG2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，但對HepG2.2.15細胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低劑量下抑制活性都高于拉米呋啶。表三.化合物I^c對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表示無抑制活性。1.5結(jié)果說明乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率是判斷乙型肝炎病毒感染重要標(biāo)志，有效抑制HBsAg分泌并使HBsAg反應(yīng)轉(zhuǎn)陰是治療乙型肝炎的目標(biāo)之一。化合物1~0在第八天對11叩02.2.15細胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有顯著的抑制作用，說明此類l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸化合物可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的藥物。藥理實施例2:化合物II-d對HepG2.2.15細胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抑制作用2.1細胞培養(yǎng)同藥理實施例1。2.2采用MTT法測定化合物11~<1對HepG2.2.15細胞生長的抑制作用取對數(shù)生長期的HepG2,2.15細胞，方法同藥理實施例1。2.3測定化合物I~c對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照。具體方法同藥理實施例l。2.4實驗結(jié)果實驗結(jié)果如表四所示，化合物II-d有顯著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其對HepG2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，但對HepG2.2.15細胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低劑量下抑制活性都高于拉米呋啶。表四.化合物II-d對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制率(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表示無抑制活性。2.5結(jié)果說明乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率是判斷乙型肝炎病毒感染重要標(biāo)志，有效抑制HBsAg分泌并使HBsAg反應(yīng)轉(zhuǎn)陰是治療乙型肝炎的目標(biāo)之一。化合物II-d在第八天對HepG2.2.15細胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有顯著的抑制作用，說明該類l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]-3,4-,氧-異丙叉奎尼酸-l,5-內(nèi)酯中間體化合物可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的藥物。藥理實施例3:化合物I"d對HepG2.2.15細胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制作用3.1儀器與試劑PE7700自動熒光PCR儀，美國PerkinElmer公司生產(chǎn)；HBVDNA熒光定量檢測試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)達安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購自Gibco公司。3.2細胞培養(yǎng)將HepG2.2.15細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，380微克/毫升G418)，置5X二氧化碳C02培養(yǎng)箱中37t:培養(yǎng)，具體方法同藥理實施例1。3.3采用MTT法測定化合物I"d對HepG2.2.15細胞生長的抑制作用旅同離^"。3.4測定化合物I-d對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)復(fù)制的抑制作用取對數(shù)生長期的H印G2.2.15細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成"105個/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37。C，5%C02,100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物14，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37。C，5%C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測樣品。第8天時用HBVDNA定量PCR儀測定培養(yǎng)基中HBVDNA濃度。按試劑盒說明書操作，50微升反應(yīng)體積中含30微升反應(yīng)緩沖液，5微升氯化鎂，5微升引物和探針，7微升樣品處理上清液和3微升'Taq酶。各反應(yīng)管放入PCR儀中，按下列條件擴增92°C2分鐘預(yù)變性，然后按93'C45秒-55。C120秒，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由自動分析軟件計算出結(jié)果。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照，實驗結(jié)果如表五所示。表五.化合物I-d對HepG2.2.15脫i<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>第八天和第十二天化合物14對HBVDNA均顯示出一定的抑制活性，雖然比陽性對照藥品拉米呋啶對HBVDNA的抑制活性要弱，但仍屬于有確切活性的HBVDNA抑制劑。3.6結(jié)論化合物I-d能顯著抑制HBVDNA的復(fù)制，說明此類1-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸化合物可以預(yù)期發(fā)展成為治療病毒性乙型肝炎疾病的藥物。在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實施例和藥理實施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實際操作過程和本發(fā)明的意義。在進入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進。權(quán)利要求1.一種具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的1-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸類化合物及其可藥用鹽式(I)其中R是苯甲酰基，取代或未取代的苯環(huán)或五元芳雜環(huán)；所述苯環(huán)或五元芳雜環(huán)上的取代基可以相同或不同，分別選自氫，羥基，鹵素，含1～8個碳的烷氧基，其條件是當(dāng)R為苯環(huán)時，苯環(huán)上的取代基不能全為氫，也不能是4-羥基取代或3，4-二羥基取代或3，5-二羥基取代或3，4-二甲氧基取代，還不能是3-甲氧基-4-羥基取代。2.根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)化合物，其特征為式(I)化合物是選自下列化合物I-a.l-氧-[3-(2,6-二氯苯)-烯丙酰]-奎尼酸；I-b.l-氧-[3-(2,4-二氯苯)-烯丙酰]-奎尼酸；I-C.l-氧-(3-苯甲?；?烯丙酰)-奎尼酸；I~d.l-氧-[3-(2-呋喃基)-烯丙酰]-奎尼酸。3.—種具有式(II)所示的制備式(I)化合物的關(guān)鍵中間體l-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]-3,4-氧-異丙叉奎尼酸-l,5-內(nèi)酯及其可藥用鹽其中R是苯甲?；?，取代或未取代的苯環(huán)或五元芳雜環(huán)；所述苯環(huán)或五元式(I)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式(II)芳雜環(huán)上的取代基可以相同或不同，分別選自氫，羥基，鹵素，含18個碳的垸氧基，其條件是-當(dāng)R為苯環(huán)時，苯環(huán)上的取代基不能全為氫，也不能是4-羥基取代或3,4-二羥基取代或3,5-二羥基取代或3，4-二甲氧基取代，還不能是3-甲氧基-4-羥基取代。4.根據(jù)權(quán)利要求3的式(II)化合物，其特征為式(II)化合物是選自下列化合物II-a.l-氧-[3-(2，6-二氯苯)-烯丙酰]-3,4-氧-異丙叉奎尼酸-l,5-內(nèi)酯；II-b.1-氧-[3-(2,4-二氯苯)-烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-1，5-內(nèi)酯；II~c.l-氧-(3-苯甲?；?烯丙酰)-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l,5-內(nèi)酯；114.l-氧-[3-(2-呋喃基)烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-l，5-內(nèi)酯。5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一所述化合物及其可藥用鹽用于制備治療乙型病毒性肝炎的藥物用途，其特征為該類藥物具有降低乙型肝炎病毒表面抗原表達、抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制的功效。6.—種用于制備治療乙型病毒性肝炎藥物的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求14之一的化合物或者它們的混合物，以及它們的可藥用鹽和可藥用輔料。7.根據(jù)權(quán)利要求5~6的藥物和藥物組合物，其劑型是注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋或納米制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種式(I)所示的1-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]奎尼酸類化合物及用途，本發(fā)明還涉及這些化合物的制備方法及其中間體式(II)化合物即1-氧-[3-芳基取代-烯丙酰]-3，4-氧-異丙叉奎尼酸-1，5-內(nèi)酯，本發(fā)明同時還涉及這些化合物的藥物用途和含有該類化合物的藥物組合物。本發(fā)明的式(I)和式(II)化合物及其可藥用鹽具有抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制和降低乙肝病毒表面抗原表達的功能，因此，式(I)和式(II)化合物可以預(yù)期用于制備防治乙肝病毒感染性疾病的藥物應(yīng)用。文檔編號A61P1/00GK101293830SQ20081006254公開日2008年10月29日申請日期2008年6月24日優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日發(fā)明者巫秀美,張麗娟,李校堃,李海波,佳瞿,董建勇,昱趙,黃可新申請人:溫州醫(yī)學(xué)院