專利名稱：一種降糖多肽融合蛋白及其衍生物的結(jié)構(gòu)及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降糖多肽融合蛋白及其衍生物的結(jié)構(gòu)及用途，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景糖尿病(Diabetes Mellitus， DM) —詞是描述一種多病因的代謝疾病，特點是慢性高血 糖，伴隨因胰島素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。該病又可分為以下 兩種類型 一型糖尿病，又稱為胰島素依賴型糖尿病；二型糖尿病，又稱為非胰島素依賴型 糖尿病。WHO統(tǒng)計得出目前糖尿病的發(fā)病率為2.8。/。，并預(yù)計到2030年該數(shù)值將會增加至 4.8%。美國CDCP報告目前糖尿病患者占全美人口的6.8義，其中90-95%為二型糖尿病患 者。隨著生活水平的提高和老齡化的加重，我國糖尿病患者的數(shù)量在不斷增加，而多種流行 病學(xué)數(shù)據(jù)也表明，我國糖耐量降低(impaired glucose tolerance, IGT )患者數(shù)量遠遠大于 糖尿病患者的數(shù)量，這個龐大的糖尿病后備軍，會進一步發(fā)展成為真正的糖尿病患者。二型 糖尿病是由于胰島素分泌相對不足引起的。發(fā)病初期，外周組織對胰島素敏感性降低，故而 人體分泌胰島素的量會代償性的升高，到后期，胰島素的分泌量無法滿足自身的需要，此時 病人即表現(xiàn)出糖尿病的癥狀。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，當癥狀出現(xiàn)時，胰島60-70%的功能已 經(jīng)喪失。在二型糖尿病的初期，通過鍛煉和控制飲食即可使血糖的水平維持在安全范圍之內(nèi)， 但到后期則必須依靠藥物的治療來控制血糖水平。病人需要終身服藥并不斷監(jiān)測血糖水平， 生活質(zhì)量受到較大影響。人體進餐后，在食物的刺激下腸道會分泌葡萄糖依賴性胰島素釋放肽 (glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP)及胰高血糖素樣月太(glucagon-like p印tide-1， GLP-1)等肽類物質(zhì)作用于胰島的B細胞刺激胰島素的分泌，這一系統(tǒng)被稱為腸 降血糖素(incretin)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是正常生理狀態(tài)下刺激胰島素分泌的一個必需條件，但在 糖尿病患者群中，腸降血糖素系統(tǒng)受到了嚴重的損傷，故而外源性的引入相關(guān)藥物可以明顯 改善糖尿病的癥狀。GLP-1主要有以下生物學(xué)活性(1)血糖依賴性的促胰島素分泌，當血糖濃度低于 4.3mmol/L (77mg/dl)時，GLP的降糖作用喪失，這是它有別于普通降糖藥物的最顯著特征 之一；(2)刺激胰島B細胞再生，誘導(dǎo)前體細胞向B細胞的分化，抑制B細胞凋亡；(3)增 加生長抑素的分泌，從而抑制胰高血糖素的分泌，該作用也是血糖依賴性的；(4)抑制胃酸 分泌，延遲胃排空；(5)作用于中樞神經(jīng)，抑制食欲等。近年來對GLP-1的神經(jīng)保護作用的研究越來越多。目前針對二型糖尿病的治療多是單途徑的，均存在一定程度的副作用，而GLP-1對二型糖尿病的治療效果是上述多種活性共同作用的結(jié)果，這也是GLP-1相對其它藥 物的優(yōu)勢之一。以上特點使得GLP-1分子成為治療糖尿病的理想藥物候選分子，但多年來天 然GLP-1卻一直未能應(yīng)用于臨床，這主要是因為GLP-1在體內(nèi)作角時間極短，血漿半衰期不 足2min，靜脈給藥后迅速被內(nèi)源性的二肽基肽酶(DPPIV)從N末端切掉2個氨基酸而失活， 且酶解后產(chǎn)生的片段GLP-l3-3o是天然GLP-1的拮抗劑，進一步抑制了 GLP-1的作用。Exendin-4是一個由39個氨基酸組成的多肽，與GLP-1有53%的同源性。最初由美洲巨 蜥的唾液中提取獲得，現(xiàn)已通過固相合成或是基因表達的手段制備。它也是通過與GLP-1受 體結(jié)合其作用，由于第二位氨基酸為Gly， Exendin-4可以有效的抵抗DPPIV的酶解，皮下注 射時其半衰期達到了 3.3-4h。 Exendin-4可以有效的控制血糖水平并適度減輕體重，其主要 不良反應(yīng)為惡心和嘔吐。有研究表明，對C57BL/6小鼠腹腔注射100pmol/kg，每天一次，持 續(xù)給藥兩周，結(jié)果胰島體積擴增1.7倍。以腹腔注射的方式對雄性SD大鼠給藥Exendin-4, 1 nmo1/ kg ，每天一次，持續(xù)10天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Exendin-4可以明顯增加胰島P細胞的數(shù)目。 它還可以有效的抑制胰島3細胞的凋亡。但即便可以抵抗DPP4的酶解，Exendin-4的半衰 期仍然較短，病人每天需要注射兩次Z依從性較差。公開號為CN 1483041A的名為GLP-1融合蛋白的專利提出了兩種GLP-1融合蛋白的結(jié) 構(gòu)，分別是在GLP-l的C末端融合白蛋白或是免疫球蛋白的Fc部分，其目的主要在于延長 GLP-1注射給藥時的體內(nèi)半衰期且不涉及口服給藥。公開號為CN 1587385A的名為高效表達 人胰高血糖素樣肽-1的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的專利提出一種通過串聯(lián)GLP-1基因 實現(xiàn)高效表達的方法，其主要目的在于提高GLP-1的表達量。公開號為CN1703424A的名為 GLP-1衍生物及其經(jīng)粘膜吸收的制劑的專利提出了一種可跨膜吸收的GLP-1衍生物，并通過 相應(yīng)的制劑進一步提高其跨膜效率，它主要通過在GLP-1的C末端添加堿性短肽序列實現(xiàn)跨 膜吸收的。公開號為CN1832944A的名為用于口服傳遞胰高血糖素樣肽(GLP) -1化合物或 黑色素皮質(zhì)激素4受體(MC4)激動劑肽的化合物、方法和制劑的專利提供了一種化合物的 結(jié)構(gòu)，該化合物具有利于GLP-1 口服傳遞的效果，它是以藥物組合物的形式出現(xiàn)在藥物復(fù)方 中的。公開號為CN 1297888A的名為GLP-1及其類似物與人溶菌酶融合的重組蛋白及其用途 的專利提供了一種GLP-1及其類似物的融合蛋白的結(jié)構(gòu)，該融合蛋白是在GLP-1及其類似物 的N端或是C端添加人溶菌酶序列構(gòu)成的。其主要目的有兩個， 一是延長GLP-1及其類似物 的體內(nèi)半衰期，二是使融合蛋白同時起到降血糖及抗感染的作用。目前，雖然這兩種多肽及其類似物的研究已經(jīng)取得了較大的進展，但在以下方面仍存在 問題(1)此類多肽的制備不論是采用普通的固相合成還是重組表達都存在成本較高、難度較大的問題；(2)此類多肽本身并不穩(wěn)定，但溶液狀態(tài)下極易形成聚集體而失活，尤其是在 酸性溶液中；(3)此類多肽原形的半衰期較短，但在臨床上給藥時多采用注射的手段，病人 依從性極差。本專利提供了一種可以提高降糖多肽穩(wěn)定性的融合蛋白及其衍生物，該融合蛋白在大腸 桿菌可以實現(xiàn)高表達，每升發(fā)酵液經(jīng)純化后可獲得目的蛋白560mg，且在一定劑量下口服或 注射具有明顯的降血糖活性。融合蛋白經(jīng)化學(xué)修飾后獲得的衍生物具有更高的穩(wěn)定性、更強 的疏水性以及更高的口服有效性。融合蛋白衍生物的酶切產(chǎn)物較原形多肽具有更高的穩(wěn)定性、 更好的生物學(xué)活性，在糖尿病等疾病的治療中是一個極具潛力的分子發(fā)明內(nèi)容腸降血糖素系統(tǒng)是人體代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要一員，葡萄糖依賴性促胰島素分泌肽 (glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP)及胰高血糖素樣肽(glucagon-like p印tide-l，GLP -1)是其兩個具有代表性的分子。人體內(nèi)源性GLP-1存在兩種形式GLP-1 (7-36)及GLP-1 (7-37)，這兩種分子在生物性活性上無顯著性差異。Exendin-4是源于美 洲巨蜥唾液的一種多肽，它與GLP-1在序列上有53%的同源性，是GLP-l受體的天然激動劑。 本發(fā)明立足于此類多肽及其類似物，釆用融合蛋白的形式進行重組制備，可以實現(xiàn)可溶性高 表達，每升發(fā)酵液獲得的目的蛋白高達560mg。通過在融合序列與目的多肽之間添加特定的 Linker結(jié)構(gòu)，并加以相應(yīng)的衍生化，可實現(xiàn)融合蛋白直接口服給藥。該融合蛋白及其衍生物 在口服給藥時具有較高的生物利用度，其降血糖活力顯著。融合蛋白衍生物的酶切產(chǎn)物亦具 有具有顯著的降血糖活性，而且該酶切產(chǎn)物在口服給藥時有相對較高的生物利用度，該分子 穩(wěn)定性較高、半衰期較長、制備方法較為簡單，在糖尿病等疾病的治療中有一定的價值。本發(fā)明的第一個目的是提出一種降糖多肽融合蛋白及其衍生物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有以下 特征R2多肽2 — linker —多肽1 — Rj其中多肽2為可促進多肽1可溶性表達、高表達或利于純化的多肽序列，本專利優(yōu)選為TrxA、 GST或者His-Tag但不局限于此。Linker為可以被蛋白酶特異性識別并切斷的1 5個氨基酸序列，本專利優(yōu)選為Lys、 Arg或者Asp-Asp-Asp-Asp-Lys但不局限于此。多肽1為具有降糖作用的30 50氨基酸的多肽序列，包括但不限于GLP-1、 Exendin-4及其類似物。所述衍生物的其進一步特征在于，Rl可以不存在或為可提高融合蛋白穩(wěn)定性、疏水性的聚合物，包括但不僅限于聚乙二醇及其衍生物、多聚唾液酸、棕櫚酸或月桂酸及它們的衍生 物。所述衍生物的進一步特征在于，R2可以缺失或為促進融合蛋白或多肽跨膜轉(zhuǎn)運的小分子 化學(xué)物質(zhì)，包括但不限于維生素B12、泛酸、硫辛酸或生物素。本發(fā)明的第二個目的在于提出融合蛋白衍生物的酶切產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。融合蛋白衍生物的酶 切產(chǎn)物是通過在融合蛋白序列中的Linker處進行特異性酶切所獲得的，該產(chǎn)物可口服給藥且 具有制備方法簡單易行、穩(wěn)定性高、半衰期長等優(yōu)點。所述酶切產(chǎn)物的進一步特征在于，當 采用聚乙二醇、生物素化聚乙二醇或是多聚唾液酸進行衍生化時，酶切后獲得的產(chǎn)物穩(wěn)定性 得到了顯著的提升，在口服或是注射給藥后其體內(nèi)半衰期延長顯著；當采用月桂酸、棕櫚酸 進行融合蛋白的衍生化時，酶切后獲得的產(chǎn)物疏水性提升顯著，在口服或是注射給藥時生物 利用度得到顯著提高，體內(nèi)半衰期延長顯著；當采用維生素B12、泛酸、硫辛酸或生物素進 行融合蛋白衍生化時，酶切產(chǎn)物可直接用于口服給藥，具有顯著的生物學(xué)活性。酶切產(chǎn)物的制備方法如下第一步根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性合成降糖多肽的基因。 第二步將該基因與融合序列的基因進行串聯(lián)。第三步將串聯(lián)后的基因重組入表達載體，克隆入宿主菌后進行誘導(dǎo)表達。第四步采用融合蛋白上的HisTag標簽進行親和純化獲得融合蛋白。第五步對融合蛋白進行相應(yīng)的衍生化反應(yīng)。第六步融合蛋白衍生化產(chǎn)物在Linker處進行酶切，獲得酶切產(chǎn)物。本發(fā)明的第三個目的是提出此類降糖多肽融合蛋白、融合蛋白衍生物及衍生物的酶切產(chǎn) 物的用途，它們可在糖尿病、肥胖癥、老年癡呆癥及心肌梗塞中得到應(yīng)用。本專利所提出的降糖多肽融合蛋白及其衍生物結(jié)構(gòu)中的降糖多肽是在GLP-1及 Exendin-4分子基礎(chǔ)上進行較大改構(gòu)獲得的，它與GLP-1受體具有更高的親和力其在胃腸道及 血液中的穩(wěn)定性明顯高于GLP-1或Exendin-4原形。本專利所提出的融合蛋白是在降糖多肽 的N端融合相應(yīng)的多肽序列，其主要目的一是利于融合蛋白的表達與純化，二是在口服給藥 時起到保護降糖多肽免受酶解的作用。通過對融合蛋白進行進一步的衍生化可提高其穩(wěn)定性， 增加其口服生物利用度。融合蛋白衍生物在Linker處進行酶切后的產(chǎn)物口服給藥或是注射給 藥均具有顯著的降血糖活性。在口服給藥時其生物利用度較高，胃腸道穩(wěn)定性顯著高于原形 多肽。靜脈注射給藥時，該酶切產(chǎn)物較原形多肽有更長的半衰期。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提出的降糖多肽的融合蛋白、融合 蛋白的衍生物及衍生物的酶切產(chǎn)物均可直接口服給藥，其生物利用度較高，可顯著減輕病的痛苦，提高病人的依從性；(2)本發(fā)明所提出的融合蛋白衍生物的酶切產(chǎn)物在注射給藥時 具有更高的穩(wěn)定性、更低的免疫原性及更長的體內(nèi)半衰期；(3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提 供融合方式能使降糖多肽獲得高可溶性表達，經(jīng)優(yōu)化后每升發(fā)酵液在純化后可獲得560mg高 純可溶融合蛋白，其成本低廉，操作簡單。


圖1: TrxA-mGLP-l融合蛋白的SDS-PAGE圖及Western-Blot鑒定圖2: TrxA-mGLP-l融合蛋白聚乙二醇衍生物及其酶切產(chǎn)物的SDS-PAGE3:融合蛋白口服給藥的降血糖活性圖4:融合蛋白聚乙二醇衍生物酶切產(chǎn)物的降血糖活性具體實施方式
下面結(jié)合實施例，進一步詳述本發(fā)明。說明書及實施例中采用的菌株、質(zhì)粒、化學(xué)試劑 等，如未特殊說明均按常規(guī)實驗條件進行操作，或按供應(yīng)商提供的說明進行操作。實施例1降糖多肽l融合蛋白的制備第一步按照降糖多肽1的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，在基因的上游設(shè)計入DDDDK序列，兩端分別添加Kpnl和Hind3的識別序列。該基因與TrxA融合 后的氨基酸序列如下TrxA-HisTag-DDDDK-HGEGT FTSDV SSYLE GQMK EFIAW LVKGR PSSGA PPPS 第二步將合成后的基因與pET32a載體分別用Kpnl和Hind3進行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物16 度連接8小時，按照《分子克隆》給出的標準方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并挑 選陽性克隆。測序驗證插入基因的準確性。第三步將陽性克隆37度以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜做種子液，培養(yǎng)基中添加50ug/ml氨芐青霉 素做選擇性壓力。按1%接種量將種子液轉(zhuǎn)接至100ml LB培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)至OD600達到 0.6-1.0，添加0.2-lmmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4-10小時后結(jié)束培養(yǎng)。 第四步4000轉(zhuǎn)20分鐘離心收獲菌體沉淀，超聲波破壁后以Ni-IMAC進行層析純化，獲得 純化后的融合蛋白，以SDS-PAGE檢測純度高于95%。表達及純化過程的SDS-PAGE結(jié)果詳見 附圖l,其中左側(cè)為SDS-PAGE結(jié)果，右側(cè)為Western Blot鑒定結(jié)果。第五步選取雄性KM小鼠24只，測定空腹血糖，將空腹血糖值接近的小鼠分為一組，共分三組，分別為高糖組、對照組及高糖加融合蛋白組。高糖加融合蛋白組按0.5umol/kg劑量灌胃給融合蛋白，其余兩組只給生理鹽水。20分鐘后高糖組和高糖加融合蛋白組均按18ramol/kg腹腔注射葡萄糖，對照組則注射生理鹽水。分別于注射后的0分鐘、10分鐘、20 分鐘、30分鐘及60分鐘采集血樣測定血糖含量。測定結(jié)果見附圖3。實施例2降糖多肽2融合蛋白、單鏈聚乙二醇化融合蛋白衍生物、衍生物的酶切產(chǎn)物的制備及降糖活 性測定。按照降糖多肽2的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，在基因的 上游設(shè)計入DDDDK序列，兩端分別添加Kpnl和Hind3的識別序列。該基因與TrxA融合后的 氨基酸序列如下TrxA-HisTag-DDDDK HGEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGRCTrxA-GLP-1 (Gly8， Cys37)融合蛋白的基因的重組構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及表達和純化同實施例1， SDS-PAGE檢測表明純化獲得的融合蛋白純度高于95%。將純化后的蛋白稀釋至lmg/ml，按摩 爾比10: 1的條件加入馬來酰亞胺化單鏈聚乙二醇5000, 4-37度攪拌反應(yīng)2-24小時，反應(yīng) 液以20mmol/L PBS pH7. 2透析過夜。透析后的反應(yīng)液以Q-S印harose Fast Flow層析柱進行 純化獲得融合蛋白的衍生物，SDS-PAGE檢測該衍生物的純度高于90M。采用截留分子量為10KD的超濾膜對純化后的融合蛋白聚乙二醇衍生物進行濃縮，將濃縮 后的蛋白濃度調(diào)節(jié)至2mg/ml。按lmg/ml比例加入腸激酶，4-37度酶切4-24小時。酶切產(chǎn)物 采用制備型C18RP-HPLC進行純化并冷凍干燥。融合蛋白聚乙二醇衍生物及衍生物的酶切產(chǎn)物 的SDS-PAGE結(jié)果見附圖2.酶切產(chǎn)物按下面的方法進行降血糖活性測定。選取雄性KM小鼠24只，測定空腹血糖，將空腹血糖值接近的小鼠分為一組，共分三組， 分別為高糖組、對照組及給藥組。高糖組按18mmol/kg劑量腹腔注射葡萄糖，給藥組則在同 劑量的葡萄糖溶液中按50nmol/kg溶解酶切產(chǎn)物后給藥，對照組只給予生理鹽水。給藥體積 均控制在8ml/kg。給藥后分別于O分鐘、IO分鐘、20分鐘、30分鐘及60分鐘采集血樣測定 血糖含量。測定結(jié)果見附圖4。實施例3降糖多肽3融合蛋白、生物素化融合蛋白衍生物的制備及降血糖活性測定。第一步按照降糖多肽3的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，在基因的上游設(shè)計入一個Arg的密碼子，兩端分別添加BamHl和Hind3的識別序列。該基因與HisTag構(gòu)成的融合蛋白的氨基酸序列如下GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAQEFIAWLVKGR第二步將合成后的基因與pET28a載體分別用BamHl和Hind3進行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物916度連接8小時，按照《分子克隆》給出的標準方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并 挑選陽性克隆。測序驗證插入基因的準確性。第三步將陽性克隆37度以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜做種子液，培養(yǎng)基中添加50iig/ml卡那霉素 做選擇性壓力。按W接種量將種子液轉(zhuǎn)接至100ml LB培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)至OD600達到0. 6-1.0， 添加0.2-lmmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4-10小時后結(jié)束培養(yǎng)。第四步4000轉(zhuǎn)20分鐘離心收獲菌體沉淀，超聲波破壁后以Ni-IMAC進行層析純化，獲得 純化后的融合蛋白，以Tricine-SDS-PAGE檢測純度高于95M。第五步按摩爾比10: 1添加琥珀酸亞胺活化后的生物素，反應(yīng)pH5-10，溫度4-37攝氏度， 反應(yīng)2-24小時以使反應(yīng)充分進行。第六步反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)20mmol/L Tris-HC1緩沖液透析后上Q-S印harose Fast Flow層析柱純 化。初步純化后的產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC進行進一步純化制的精品并冷凍千燥?；钚詼y定方法同實 施例l。實施例4降糖多肽4融合蛋白、棕櫚酸化融合蛋白衍生物的制備按照降糖多肽4的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，在基因的 上游設(shè)計入一個Arg的密碼子，兩端分別添加BamHl和Hind3的識別序列。該基因與HisTag 構(gòu)成的融合蛋白的氨基酸序列如下GSSHHHHHHSSGLVPRGS腿SMTGGQQMGRGSRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及表達與純化等步驟同實施例3，純化獲得的融合蛋白經(jīng) Tricine-SDS-PAGE檢測純度高于95%，按摩爾比10: 1添加琥珀酸亞胺活化后的棕櫚酸，控 制pH5-10，溫度4-37攝氏度，充分反應(yīng)2-24小時。棕櫚酸化降糖多肽4融合蛋白衍生物的 純化及活力測定方法同實施例3。實施例5降糖多肽5融合蛋白、泛酸化融合蛋白衍生物的制備按照降糖多肽5的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，在基因的 上游設(shè)計入一個Arg密碼子。兩端分別添加BamHl和Hind3的識別序列。該基因與HisTag融 合后的氨基酸序列如下GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSRHGEGTFTSDLSKQMEEEAVALFIEWLKNGGPSSGAPPPS表達載體采用pET28a，表達及純化的具體步驟同實施例3。純化后的融合蛋白稀釋至lmg/ml。按摩爾比10: 1添加琥珀酸亞胺活化的泛酸，控制pH5-10，溫度在4-37攝氏度條 件下充分反應(yīng)2-24小時。泛酸化降糖多肽5融合蛋白的純化步驟及活性測定同實施例3。實施例6降糖多肽6融合蛋白衍生物及衍生物酶切產(chǎn)物的制備按照降糖多肽6的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，上游添加 DDDDK序列，兩端分別添加Kpnl和Hind3的識別序列。該基因與TrxA融合后的氨基酸序列 如下TrxA-HisTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRPSSGAPPPC表達載體采用pET32a，表達及純化的具體步驟同實施例3。 SDS-PAGE檢測表明融合蛋白 電泳純度高于95%。調(diào)節(jié)融合蛋白的濃度至lmg/ml，按摩爾比10: 1添加馬來酰亞胺活化的 聚乙二醇5000，控制p服-8，充分反應(yīng)2-24小時后透析除去小分子物質(zhì)。以RP-HPLC對融合 蛋白聚乙二醇衍生物進行純化。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)聚乙二醇衍生化后的融合蛋白濃度至2mg/ml，按 lmg/IU添加EK酶，控制pH5-8，在4-37攝氏度條件下酶解4-24小時。酶切產(chǎn)物的純化采用 C18RP-HPLC。調(diào)節(jié)酶切產(chǎn)物濃度至lmg/ml，按摩爾比20: 1添加N羥基琥珀酰亞胺活化后的 生物素，控制pH5-10，充分反應(yīng)2-24小時后透析除去小分子雜質(zhì)，產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC純化后 冷凍干燥?；钚詼y定方法參見實施例l。實施例7降糖多肽7融合蛋白及融合蛋白酶切產(chǎn)物的制備按照降糖多肽7的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，上游添加 DDDDK序列，在兩端分別添加BamHl和Hind3的識別序列。該基因與GST融合后 的氨基酸序 列如下GST-Hi sTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS表達載體采用pGEX-KG,表達及純化的具體步驟同實施例1。 SDS-PAGE檢測顯示純化后 融合蛋白的純度高于95%。調(diào)節(jié)蛋白濃度至2rag/ml，按lmg/IU添加EK進行酶切反應(yīng)，控制 pH5-8，在4-37攝氏度條件下酶解4-24小時。酶切產(chǎn)物的純化采用C18RP-HPLC，冷凍干燥。 活性測定方法參加實施例2。實施例8降糖多肽8融合蛋白、融合蛋白酶切產(chǎn)物及雙鏈聚乙二醇化酶切產(chǎn)物衍生物的制備及降血糖活性測定按照降糖多肽8的氨基酸序列，參考大腸桿菌密碼子偏愛性合成其基因序列，上游添加 DDDDK序列，兩端分別添加Kpnl和Hind3的識別序列。該基因與TrxA融合后的氨基酸序列 如下TrxA-Hi sTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQMREFIAWLVKGRPSSGAPPPS表達載體采用pET32a，表達及純化的具體步驟同實施例1。 SDS-PAGE檢測純化后融合蛋 白的純度高于95%。調(diào)節(jié)融合蛋白的濃度至2mg/ml，按lmg/IU添加EK酶，控制pH5-10，在 4-37攝氏度的條件下充分酶切4-24小時。酶切產(chǎn)物的純化采用C18RP-HPLC。純化后的酶切 產(chǎn)物按摩爾比10: 1添加琥珀酸亞胺活化的雙鏈聚乙二醇IOK，控制反應(yīng)溫度4-37攝氏度條 件下充分反應(yīng)4-24小時，反應(yīng)物經(jīng)透析后以Q-S印harose Fast Flow樹脂純化獲得雙鏈聚乙 二醇化酶切產(chǎn)物的衍生物，冷凍干燥后-20度保存。降血糖活性的具體測定步驟同實施例2。序列表<110>中國藥科大學(xué)〈120〉 一種降糖多肽融合蛋白及其衍生物的結(jié)構(gòu)及用途<160〉 2〈170> Patentln version 3.3<210〉 1〈211〉 39<212> PRT 〈213〉人工序列〈220><221> MISC一FEATURE<222〉 (2).. (2)<223〉 Xaa=Ala, Gly, Ser或Val〈220〉〈221〉 MISC一FEATURE<222〉 (20) . (20)<223> Xaa=Lys， Arg, Cys, Ala或Gin〈220〉〈221〉 MISC—FEATURE〈222〉 (28).. (28)<223〉 Xaa=Lys,Arg, Cys,Ala或Gln<220〉<221〉 MISC—FEATURE〈222〉 (31).. (31)<223〉 Xaa=Gly， Pro, Cys或缺失〈220〉〈221〉 MISC—FEATURE〈222〉 (32).. (32)〈223> Xaa=Ser, Cys或缺失13〈220〉〈221> MISC—FEATURE〈222〉 (33).. (33)<223> Xaa=Ser， Cys或缺失〈220〉〈221〉 MISC一FEATURE〈222> (34) .(34)〈223> Xaa=Gly, Cys或缺失〈220〉〈221〉 MISC一FEATURE〈222> (35).. (35)〈223〉 Xaa=Ala， Cys或缺失〈220>〈221> MISC—FEATURE〈222> (36)..(36)〈223〉 Xaa=Pro, Cys或缺失<220>〈221> MISC_FEATURE〈222> (37)..(37)〈223〉 Xaa=Pro, Cys或缺失〈220><221> MISC_FEATURE<222> (38).. (38)<223> Xaa=Pro， Cys或缺失〈220〉〈221〉 MISC—FEATURE〈222> (39).,(39)〈223〉 Xaa=Ser, Cys或缺失〈400> 1His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15Gin Ala Ala Xaa Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Xaa Gly Arg Xaa Xaa 20 25 30Xaa X33 Xaa X肪 35<210> 2〈211〉 40〈212> PRT 〈213〉人工序列〈220〉〈221〉 MISC—FEATURE〈222> (12). .(12)<223> Xaa=Lys, Arg， Ala或Gin〈220〉〈221> MISC_FEATURE〈222〉 (20).. (20)<223〉 Xaa=Lys， Arg， Ala, Gin或Cys〈220〉〈221〉 MISC—FEATURE〈222〉 (27).. (27)<223> Xaa=Lys， Arg, Ala或Cys〈220〉〈221〉 MISC—FEATURE〈222> (40).. (40)〈223〉 Xaa=Lys, Ala或Cys<400〉 2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Xaa Gin Met Glu Glu 15 10 15Glu Ala Val Xaa Leu Phe lie Glu Trp Leu Xaa Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40
權(quán)利要求
1.一種降糖多肽融合蛋白衍生物的結(jié)構(gòu)，其特征為符合以下結(jié)構(gòu)通式其中多肽1為具有降糖作用的30～40氨基酸的多肽序列，包含序列1(SQD ID NO1)或序列2(SQD ID NO2)所示氨基酸序列；序列1His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa3-Gly-Arg-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12其中Xaa1為Ala、Gly、Ser或ValXaa2為Lys、Arg、Cys、Ala或GlnXaa3為Lys、Arg、Cys、Ala或GlnXaa4為Gly、Pro、Cys或缺失Xaa5為Ser、Cys或缺失Xaa6為Ser、Cys或缺失Xaa7為Gly、Cys或缺失Xaa8為Ala、Cys或缺失Xaa9為Pro、Cys或缺失Xaa10為Pro、Cys或缺失Xaa11為Pro、Cys或缺失Xaa12為Ser、Cys或缺失序列2His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa1-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa4其中Xaa1為Lys、Arg、Ala或GlnXaa2為Lys、Arg、Ala、Gln或CysXaa3為Lys、Arg、Ala或CysXaa4為Lys、Ala或Cys；Linker部分是Lys、Arg或者Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；多肽2為TrxA、GST或者His-Tag；R1不存在或為可提高融合蛋白穩(wěn)定性、疏水性的聚合物，R2不存在或為可以促進融合蛋白跨膜轉(zhuǎn)運的小分子化合物。
2. 權(quán)利要求l中所述融合蛋白衍生物，其特征為R是聚乙二醇、連接有生物素、泛酸或 硫辛酸的聚乙二醇，多聚唾液酸、棕櫚酸或月桂酸。
3. 權(quán)利要求l中所述融合蛋白衍生物，其特征為R2是維生素B12、泛酸、硫辛酸或生物 素。
4. 權(quán)利要求l中所述的融合蛋白衍生物的酶切產(chǎn)物，其特征為符合以下結(jié)構(gòu)通式-多肽l — Ri其中多肽l、 R1及R2的定義同權(quán)利要求1。
5. 權(quán)利要求4中所述融合蛋白質(zhì)衍生物的酶切產(chǎn)物，其特征為Ri是聚乙二醇、連接有生 物素、泛酸或硫辛酸的聚乙二醇，多聚唾液酸、棕櫚酸或月桂酸。
6. 權(quán)利要求4中所述融合蛋白質(zhì)衍生物的酶切產(chǎn)物，其特征為R2是維生素B12、泛酸、 硫辛酸或生物素。
7. 權(quán)利要求4中所述融合蛋白質(zhì)衍生物的酶切產(chǎn)物，其特征為&為分子量2000 40000的聚乙二醇，R2不存在或為生物素。
8. 權(quán)利要求1中所述的融合蛋白衍生物用于制備治療糖尿病、肥胖癥、老年癡呆癥或心肌 梗塞的疾病的藥物的用途。
9. 權(quán)利要求4中所述融合蛋白的酶切產(chǎn)物用于制備治療糖尿病、肥胖癥、老年癡呆癥及心 肌梗塞的疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降糖多肽融合蛋白及其衍生物的結(jié)構(gòu)及用途，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的技術(shù)方案通過添加特殊多肽序列，使所獲得的融合多肽在大腸桿菌系統(tǒng)獲得高可溶性表達。該融合多肽及其衍生物比天然降糖多肽具有更高的穩(wěn)定性和活性，在一定劑量下口服或注射均能產(chǎn)生明顯的降血糖活性。
文檔編號A61P3/00GK101328221SQ20081002344
公開日2008年12月24日 申請日期2008年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日
發(fā)明者姚文兵, 浤 田, 高向東, 高明明 申請人:中國藥科大學(xué)