專利名稱：：來自高麗參的黑色素生物合成抑制劑及含有該抑制劑的化妝品組合物用于皮膚增白的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用酸、堿、酶或產(chǎn)生所述酶的微生物從人參提取物中獲得的人參皂苷Fl的用途，以及含有該人參皂苷Fl的用于皮膚增白的化妝品組合物。
背景技術(shù)：
：決定人的膚色的因素有多種，在這些因素中，諸如人體內(nèi)的產(chǎn)生黑色素的黑素細胞的活性、血管的分布、皮膚的厚度以及存在或不存在色素(例如，類胡蘿卜素、膽紅素等)等因素具有重要作用。它們中最重要的因素是通過人體黑素細胞中的各種酶(例如，酪氨酸酶)的活動而產(chǎn)生的黑色素。黑色素的形成受到遺傳因素、激素分泌、與應激有關(guān)的生理因素以及環(huán)境因素(例如，紫外(UV)光照射)的影響。人皮膚上的黑色素細胞中產(chǎn)生的黑色素是一種具有黑色素與蛋白質(zhì)的絡合物的酚系聚合物。黑色素阻斷太陽紫外射線，從而保護真皮下面的皮膚器官，同時，黑色素清除皮膚組織中產(chǎn)生的游離自由基從而保護皮膚中的蛋白質(zhì)和基因。但是，由皮膚中的內(nèi)部或外部應激刺激產(chǎn)生的黑色素是一種穩(wěn)定的物質(zhì)，即使在應激消失后也不會被除去，直到通過皮膚角化作用才能被釋放到外界。因此，如果產(chǎn)生了不必要的大量的黑色素就會出現(xiàn)有損美麗的色素過度沉著(hyperpigmentation)，例如變色、雀斑和斑點。隨著休閑人群的增加，喜歡戶外活動的人越來越多，因此防止由UV光引起的黑色素沉著的需求也在增多。為了滿足這一需求，已經(jīng)在化妝品或醫(yī)療藥物中使用了抗壞血酸、曲酸、熊果苷(albutin)、對苯二酚、谷胱甘肽、或它們的衍生物，或者具有酪氨酸酶抑制活性的物質(zhì)。但是，由于增白效果不充分以及其他的問題(例如，將上述物質(zhì)添加到化妝品中所帶來的皮膚安全問題、配方和穩(wěn)定性問題)使這些物質(zhì)的使用受到了限制。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的發(fā)明人進行了大量研究來制備增白化妝品組合物，該增白化妝品組合物源自天然產(chǎn)生的物質(zhì)，對皮膚安全，同時還具有優(yōu)異的增白效果和優(yōu)異的產(chǎn)品穩(wěn)定性。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使植物提取物(特別是人參提取物)與酸、堿或酶進行反應而獲得的人參皂苷Fl具有優(yōu)異的減少黑色素生物合成的效果，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一個目的在于檢驗人參皂苷Fl的黑色素生物合成抑制效果，該人參皂苷Fl是通過使植物提取物與酸、堿或酶進行反應而得到的，本發(fā)明還提供了具有優(yōu)異的增白效果的化妝品和治療組合物。本發(fā)明提供了由下式1表示的人參皂苷Fl以及含有該人參皂苷Fl的用于皮膚增白的化妝品組合物的用途。[式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>下面將對本發(fā)明進行詳細的描述。人參皂苷Fl是由植物提取物獲得的。具體來說，本發(fā)明的化妝品組合物中含有的人參皂苷Fl獲得自人參、紅參、白參、鮮人參、參須(ginsengtail)、人參葉或人參果。可以以下方式來制備用于本發(fā)明的提取物。向植物中添加有機溶劑，該有機溶劑的量約為所述植物的重量的1-6倍，優(yōu)選約3倍，通過在室溫下對所述植物進行1-5次萃取而將該植物脫脂。向脫脂后的植物中添加有機溶劑，該有機溶劑的量約為所述脫脂后的植物的重量的1-8倍，優(yōu)選約4倍，并在回流下對所述脫脂后的植物進行1-5次提取。將提取物在10-20°C下培養(yǎng)1-3天，然后通過過濾和離心將該提取物分離成殘渣和濾液。分離出的濾液在減壓下進行濃縮，并將濃縮物懸浮在水中，隨后用例如乙醇進行處理以除去其中的色素。接下來，用有機溶劑對水層進行1-5次萃取，然后，獲得的有機溶劑層在減壓下進行濃縮，從而獲得有機溶劑提取物。將所述有機溶劑提取物溶解在少量的甲醇等中，然后向其中加入大量的乙酸乙酯。將生成的沉淀物干燥，從而得到本發(fā)明的提取物。本發(fā)明所使用的有機溶劑優(yōu)選為選自由無水甲醇、水合甲醇(hydratedmethanol)、無水乙醇和水合乙醇所組成的組中的一種溶劑，或者上述甲醇中的一種與上述乙醇中的一種的混合溶劑。利用酸、堿、酶或產(chǎn)生所述酶的微生物對所述提取物進行水解，從而制得人參皂苷Fl0使用酸時，所述酸可以是選自由鹽酸、硫酸和硝酸所組成的組中的至少一種酸，或者是上述酸與選自由乙醇、甲醇和丁醇所組成的組中的至少一種醇的混合物。酸_醇混合物中使用的醇優(yōu)選為50%的乙醇。向所述提取物中加入0.1-2N的酸溶液(優(yōu)選IN的酸溶液)或酸-醇混合物，然后通過在50-100°C(優(yōu)選80°C)的溫度下，在水浴中加熱回流而使該提取物進行0.5-2小時的水解。使用堿時，所述堿可以是選自由氫氧化鈉和氫氧化鉀所組成的組中的至少一種堿，或者是所述堿與選自由乙醇、甲醇和丁醇所組成的組中的至少一種醇的混合物。堿_醇混合物中使用的醇優(yōu)選為50%的丁醇。向所述提取物中加入0.1-2N的堿溶液(優(yōu)選IN的堿溶液)或酸-醇混合物，然后通過在50-100°C(優(yōu)選100°C)的溫度下，在水浴中加熱回流而使該提取物進行1-12小時的水解。使用酶時，所述酶可以是選自由β-葡萄糖苷酶、α，β-阿拉伯糖苷酶(α，β-arabinosidase)、α，β-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶所組成的組中的至少一種。將所述提取物溶解于5-20倍體積(優(yōu)選約10倍體積)的酸性緩沖溶液中，接著加入酶。然后，在約37°C下，在水浴中將該提取物攪拌約1-60小時，同時通過薄層色譜法來檢測底物的消除速率。底物被完全耗盡后，在80-100°C下，在熱水中將所述提取物加熱5-15分鐘。接著，使水解反應終止并收集反應溶液。當使用微生物時，所述微生物可以是產(chǎn)生所述酶的微生物。更具體的說，所述微生物可以選自由曲霉屬(aspergillussp.)、芽孢桿菌屬(bacillussp.)、青霉屬(peniciIliumsp·)、根霉屬(rhizopussp·)、根毛霉屬(rhizomucorsp·)、籃狀菌屬(talaromycessp.)、雙歧桿菌屬(bifidobacteriumsp.)、被抱霉屬(mortierellasp.)、隱球菌屬(Cryptococcussp.)、微桿菌屬(microbacteriumsp.)等所組成的組。將所述提取物溶解于5-10倍體積(優(yōu)選約10倍體積)的離子水(ionizedwater)中，接著在121°C下進行30分鐘的滅菌，繼而冷卻至30°C。將預先培養(yǎng)的微生物接種到提取物溶液中，并在30°C下培養(yǎng)2-5天，以所述提取物溶液的重量為基準，所述預先培養(yǎng)的微生物的接種量為5-10重量％。然后，利用薄層色譜法檢測底物的清除率(scavengingrate)，當?shù)孜锉煌耆谋M時，反應完成，以5，000-10,000轉(zhuǎn)/分(rpm)對反應溶液進行離心。用蒸餾水將收集的沉淀物洗滌3次，從而獲得沉淀物。如上所述，使用酸、堿、酶或產(chǎn)生所述酶的微生物進行水解反應之后，在減壓下將反應溶液濃縮以除去溶劑。向殘渣中加入選自由甲醇、乙醇和丁醇所組成的組中的醇，并將該溶解攪拌1-5次。然后，通過過濾除去沉淀出來的鹽，將濾液在減壓下進行濃縮，從而獲得人參皂苷Fl。本發(fā)明的增白化妝品組合物中含有的所述人參皂苷Fl的量為該組合物總重量的0.0001-10重量％。若人參皂苷Fl的含量低于0.0001重量％，則無法提供增白等效果，而若人參皂苷Fl的含量超過10重量％，則含量的增加不會帶來效果的提高。本發(fā)明的增白化妝品組合物抑制了由UV光或炎癥所誘導的皮膚黑色素的產(chǎn)生并改善了色素沉著。對本發(fā)明的增白化妝品組合物的劑型沒有特別的限制，可以將本發(fā)明的組合物配制成化妝產(chǎn)品，例如潤膚液(skinlotion)、收斂洗液(astringentlotion)、乳液(milklotion)、營養(yǎng)霜(nourishingcream)、按摩霜(massagecream)、精華素(essence)、目艮霜(eyecream)、目艮部精華素(eyeessence)、i青潔霜(cleansingcream)、i青潔泡沫(cleansingfoam)、清潔水(cleansingwater)、美容涂敷劑(pack)、粉劑(powder)、潤體液(bodylotion)、體霜(bodycream)、身體調(diào)和油(bodyoil)和護體精華素(bodyessence)。本發(fā)明提供的來源于人參的人參皂苷Fl(20-0-β-D-吡喃葡糖基_20(S)-原人參三醇(20-0-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol))具有抑制黑色素產(chǎn)生并改善色素沉著的效果。由于具有上述效果，在用來抑制黑色素產(chǎn)生并改善由UV光引起的色素沉著的化妝品組合物中使用人參皂苷Fl(20-0-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參三醇)是有利的。具體實施例方式下面結(jié)合實施例和測試例對本發(fā)明進行更為詳細的描述，但本發(fā)明的范圍不僅限于這些實施例。參考例1人參提取物的制備將2kg的人參添加到4L的甲醇水溶液中，并在回流下提取3次，然后在15°C下培養(yǎng)一天。接著，用濾布過濾并離心，將提取后的植物分離成為殘渣和濾液，并將濾液在減壓下濃縮。將濃縮物懸浮在水中，然后用IL的乙醇萃取5次以除去其中的色素，水層用500mL的1-丁醇萃取3次。將獲得的全部的1-丁醇層在減壓下進行濃縮，從而得到1-丁醇提取物，隨后將該1-丁醇提取物溶解在少量的甲醇中，并添加到大量的乙酸乙酯中。將產(chǎn)生的沉淀干燥，獲得IOOg的人參提取物。實施例1通過酸水解制備人參皂苷Fl將IOg參考例1得到的人參提取物添加到20倍體積(體積/重量)的IN的HCl-50%的甲醇溶液(體積/體積)中，并通過在80°C下，在水浴中加熱回流8小時而進行水解。然后，將反應溶液在減壓下進行濃縮以除去溶劑，將殘渣添加到200mL的乙醇中并攪拌3次。接著通過過濾除去沉淀出來的鹽，并將濾液在減壓下進行濃縮，由此得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=81-41)進行純化，由此獲得1.25g的人參皂苷F1。實施例2通過堿水解制備人參皂苷Fl將IOg參考例1得到的人參提取物溶解于500mL干燥的吡啶中，并向其中加入IOg甲醇鈉粉末。然后，通過在水浴中加熱回流8小時而進行水解，將反應溶液在減壓下進行濃縮以除去溶劑。將殘渣添加到200mL的乙醇中并攪拌3次。通過過濾除去沉淀出來的鹽。將濾液在減壓下進行濃縮，由此得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=8:1-4:1)進行純化，由此獲得0.85g的人參皂苷F1。實施例3通過酶水解制備人參皂苷Fl將IOg參考例1得到的人參提取物溶解于IOOmL0.IM的乙酸溶液(pH4.5)中，并加入2.5g的酶(0.5g的橘皮苷酶、0.5g的柚皮苷酶、0.5g的纖維素酶(cellulose)、0.2g的β-葡萄糖苷酸酶和0.3g的淀粉葡萄糖苷酶，Sigma制造)。然后，將溶液在37°C下在水浴中攪拌48小時，并在80-100°C下在熱水中加熱10分鐘。反應完成之后，將反應溶液在減壓下進行濃縮以除去溶劑。將殘渣添加到200mL的乙醇中并攪拌3次。通過過濾除去沉淀物，并將濾液在減壓下進行濃縮，由此得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=81-41)進行純化，由此獲得0.91g的人參皂苷F1。實施例4利用微生物制備人參皂苷Fl將IOg參考例1得到的人參提取物溶解于IOOmL的離子水中，并在121°C下進行30分鐘的滅菌，繼而冷卻至30°C。然后，將預先培養(yǎng)的黑曲霉(Aspergillusniger)KCCM11885接種到提取物溶液中，并在30°C下培養(yǎng)5天，以所述提取物溶液的重量為基準，所述預先培養(yǎng)的黑曲霉KCCM11885的接種量為5-10重量％。然后，通過薄層色譜法檢測底物的消除率，當?shù)孜锉煌耆谋M時，反應完成。將培養(yǎng)物以5，000-10，OOOrpm進行離心，將收集的沉淀物用蒸餾水洗滌3次，然后進行離心收集作為沉淀物的反應溶液。接著，將沉淀物加入到200mL的乙醇中并攪拌3次。然后，通過過濾除去沉淀物，并將濾液在減壓下進行濃縮，由此得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=81-41)進行純化，由此獲得0.62g的人參皂苷。測試例1用鼠類黑素細胞來檢測黑餼素產(chǎn)生抑制效果在37°C和5%CO2的條件下，將來自C57BL/6小鼠的鼠類黑素細胞(Mel-Ab細胞)在DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEagle，smedia))中進行培養(yǎng)，所述DMEM含有10%的胎牛血清、IOOnM的2_0_十四烷酰佛波醋酸酯-13(2-0-tetradecanoyphorbol-13-acetate)和InM的霍亂毒素。用0.25%的胰蛋白酶-EDTA來消化(detach)經(jīng)過培養(yǎng)的Mel-Ab細胞，并在24孔板中以IO5個細胞/孔的濃度進行培養(yǎng)。從開始培養(yǎng)之后的第2天起，將IOppm的各種測試物質(zhì)(曲酸，參考例1和實施例1-4)添加到培養(yǎng)中的細胞中再培養(yǎng)3天。在此，曲酸作為對照組以檢測本發(fā)明的人參皂苷Fl的黑色素產(chǎn)生抑制效果。移除培養(yǎng)基，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌細胞，并用IN的氫氧化鈉溶解(Iyse)。檢測細胞在400nm處的吸光度，然后根據(jù)下列的公式1來計算各個測試樣品的黑色素產(chǎn)生抑制率(％)。計算結(jié)果列于下表1中(多利法(Dooleymethod))。[公式1]黑色素產(chǎn)生抑制率(％)=100_(各個測試樣品的吸光度/對照組的吸光度χ100)表1黑色素產(chǎn)生抑制效果^測試樣品黑色素產(chǎn)生抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如上表1所示，與現(xiàn)有的增白劑曲酸相比，根據(jù)本發(fā)明的人參皂苷Fl表現(xiàn)出優(yōu)異的黑色素產(chǎn)生抑制率(％)。此外，可以看到，從人參提取物中通過水解方法制備的人參皂苷Fl之間的黑色素產(chǎn)生抑制率(％)幾乎相同。測試例2對人體皮膚的增白效果的測試將具有直徑為1.5cm的穿孔的不透明膠帶粘附到12位健康男性的上臂上。然后，用UV射線(UVB)對每位受試者進行照射，照射的劑量比最小紅斑劑量高1.5-2倍，從而使皮膚變黑。用UV進行照射之后，將1重量％的各個測試樣品溶液(使用1，3_丁二醇乙醇=73作為賦形劑)施敷到每位受試者的皮膚上。將3重量％的曲酸和賦形劑溶液分別施敷到每位受試者的皮膚上，作為陰性對照組和陽性對照組。對照組不施敷任何東西，并對受試者的皮膚狀態(tài)改變進行持續(xù)10周的觀察。每隔一周用比色計(Minolta，日本)檢測皮膚的顏色。然后，根據(jù)下列公式2計算各個樣品的施敷時間點與施敷結(jié)束的時間點之間的膚色差值(ΔL*)，并且計算結(jié)果列于下表2中。同時，通過將施敷了各個樣品的部位與對照部位之間的進行比較來評估增白效果。在該評估中，△L*的值約為2表示色素沉著得到了明顯的改善，ΔL*值高于1.5說明該樣品具有增白效果。[公式2]ΔL*=施敷結(jié)束時的L*值一開始施敷時的L*值表2對人體皮膚的增白效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上表2中可以看出，根據(jù)本發(fā)明的人參皂苷Fl的ΔL*值高于1.6，說明該人參皂苷Fl具有優(yōu)異的增白效果。此外還可以看出，與已知具有優(yōu)異的增白效果的曲酸相比，根據(jù)本發(fā)明的人參皂苷Fl具有優(yōu)異的增白效果。工業(yè)實用性如上所述，提取自人參的人參皂苷Fl具有優(yōu)異的抑制黑色素產(chǎn)生以及改善由UV光引起的色素沉著的效果。因此，本發(fā)明提供了一種化妝品組合物，該化妝品組合物含有人參皂苷Fl作為活性成分，從而具有優(yōu)異的增白效果。權(quán)利要求人參皂苷F1(20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參三醇)在皮膚增白中的用途。2.一種化妝品組合物在皮膚增白中的用途，該組合物含有人參皂苷Fl(20-0-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參三醇)作為活性成分。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中，以所述組合物的總重量為基準，所述人參皂苷Fl的含量為0.0001-10重量％。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，含有人參皂苷Fl(20-0-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參三醇)的所述組合物獲得自人參、紅參、白參、鮮人參、參須、人參葉或人參果的提取物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述人參皂苷Fl是通過使所述提取物與酸、堿、酶或產(chǎn)生所述酶的微生物進行反應而得到的。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述酸為選自由鹽酸、硫酸和硝酸所組成的組中的至少一種，或者為所述酸與選自由乙醇、甲醇和丁醇所組成的組中的至少一種醇的混合物。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述堿為選自由氫氧化鈉和氫氧化鉀所組成的組中的至少一種堿，或者為所述堿與選自由乙醇、甲醇和丁醇所組成的組中的至少一種醇的混合物。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述酶為選自由葡萄糖苷酶、α，阿拉伯糖苷酶、α，β-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶所組成的組中的至少一種。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述微生物為選自由曲霉屬(aspergillussp.)、芽孢桿菌屬(bacillussp.)、青霉屬(penicilliumsp.)、根霉屬(rhizopussp.)、根毛霉屬(rhizomucorsp·)、籃狀菌屬(talaromycessp·)、雙歧桿菌屬(bifidobacteriumsp.)、被孢霉屬(mortierellasp.)、隱球菌屬(Cryptococcussp.)、禾口微桿菌屬(microbacteriumsp.)所組成的組中的至少一種。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述組合物抑制黑色素的產(chǎn)生。11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述組合物改善由UV光造成的色素沉著。全文摘要本文公開了一種含有源自植物的人參皂苷F1(20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人參三醇)作為活性成分的增白化妝品組合物。更具體地說，所述人參皂苷F1是通過使用酸、堿、酶或微生物由人參提取物獲得的，而且含有該人參皂苷F1的增白化妝品組合物具有優(yōu)異的抑制黑色素生物合成的效果，從而提供優(yōu)異的皮膚增白效果。文檔編號A61P17/18GK101820854SQ200780101086公開日2010年9月1日申請日期2007年10月31日優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日發(fā)明者姜炳永,安秀美,張利燮,樸惠胤,樸葰星,李真锳,金德熙,金銀珠申請人:株式會社太平洋