專(zhuān)利名稱(chēng)：：豬痢疾短螺旋體的基因和蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及豬痢疾短螺旋體(Brachyspirahyodysenteriae)中的新基因和其中編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些新基因和蛋白質(zhì)用于診斷豬痢疾短螺旋體疾病、用于抗豬痢疾短螺旋體疫苗和用于篩選殺死豬痢疾短螺旋體或阻斷豬痢疾短螺旋體的致病效應(yīng)的化合物的用途。這些序列還可以用于診斷以及治療和/或預(yù)防動(dòng)物中由其他短螺旋體屬物種引起的疾病，所述其他短螺旋體屬物種包括B.suanatina,B.intermedia,B.alvinipulli>B.aalborgi>B.innocens>B.murdochii禾口毛腸fell!累方iE體(B.pilosicoli)。
背景技術(shù)：
：豬痢疾是澳大利亞和全世界顯著的豬地方病。豬痢疾是接觸傳染性粘膜出血性(mucohaemorrhagic)腹瀉疾病，特征為大腸上皮表面的廣泛炎癥和壞死。由豬痢疾引起的經(jīng)濟(jì)損失主要來(lái)自于生長(zhǎng)遲緩、藥療成本和死亡率。豬痢疾的致病因子在1971年首先被鑒定為厭氧螺旋體(豬痢疾密螺旋體(Tr印onemahyodysenteriae))，近來(lái)被重新分至短螺旋體屬為豬痢疾短螺旋體。當(dāng)豬痢疾在豬舍中建立后，疾病譜可以從輕微、暫時(shí)或不明顯到嚴(yán)重和甚至致命之間變化。對(duì)單個(gè)豬舍的藥物策略可以掩蔽臨床征象，并且在某些豬舍疾病可以變得不被注意或可能僅被懷疑。無(wú)論明顯疾病是否發(fā)生，豬痢疾短螺旋體都可以在受感染豬中、或在其他儲(chǔ)存宿主例如嚙齒類(lèi)動(dòng)物中或在環(huán)境中持續(xù)存在。所有這些來(lái)源均造成疾病向未感染豬群傳播的可能性。商業(yè)家禽也可以被豬痢疾短螺旋體定居，盡管不清楚這在自然條件下的發(fā)生頻率如何。豬痢疾短螺旋體的建群將引發(fā)針對(duì)該螺旋體的強(qiáng)免疫應(yīng)答，因此暴露于該螺旋體的間接證據(jù)可以通過(guò)測(cè)量受感染動(dòng)物血液中的循環(huán)抗體滴度來(lái)獲得。已報(bào)告這些抗體滴度維持在低水平，甚至在已從豬痢疾康復(fù)的動(dòng)物中。用于檢測(cè)抗體的血清學(xué)試驗(yàn)因此具有檢測(cè)亞臨床感染和康復(fù)的豬攜帶者的顯著潛力，所述豬在其大腸中具有不能檢測(cè)到的螺旋體數(shù)量。這些試驗(yàn)以容易使用試劑盒形式例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，而是特別有價(jià)值的。已開(kāi)發(fā)了各種技術(shù)來(lái)檢測(cè)針對(duì)豬痢疾短螺旋體的循環(huán)抗體的存在，包括間接熒光抗體試驗(yàn)、血凝集試驗(yàn)、微量滴定凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體固定試驗(yàn)和使用脂多糖或超聲處理的全螺旋體作為抗原的ELISA。所有這些試驗(yàn)都遇到特異性的問(wèn)題，因?yàn)橄嚓P(guān)的非致病性腸道螺旋體可以誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性抗體。這些試驗(yàn)對(duì)于檢測(cè)存在明顯疾病和高循環(huán)抗體滴度的豬群是有用的，但它們對(duì)于鑒定亞臨床感染的群體和單個(gè)受感染的豬是有問(wèn)題的。因此，迄今為止，尚無(wú)十分靈敏和特異的測(cè)定法可用于檢測(cè)針對(duì)豬痢疾短螺旋體的抗體。缺乏合適的診斷試驗(yàn)已阻礙了對(duì)豬痢疾的控制。許多方法被用于控制豬痢疾，從抗微生物劑的預(yù)防性使用，到受感染群體的完全轉(zhuǎn)移和防止受感染的豬攜帶者的再進(jìn)入。所有這些供選手段都是昂貴的，并且它們需要使用復(fù)雜的診斷試驗(yàn)監(jiān)控進(jìn)程，才能完全有效。目前，在具有亞臨床感染的獸群和單個(gè)健康動(dòng)物攜帶者中檢測(cè)豬痢疾仍是主要的問(wèn)題，其正在阻礙有效控制措施的執(zhí)行。傳統(tǒng)上，豬痢疾的確診需要從患病豬的糞便或粘膜分離和鑒定豬痢疾短螺旋體。涉及的主要問(wèn)題包括這些厭氧細(xì)菌的緩慢生長(zhǎng)和苛刻的營(yíng)養(yǎng)需求，以及由豬腸道正常菌群中存在的形態(tài)學(xué)相似螺旋體造成的混淆。隨著用于自糞便檢測(cè)螺旋體的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定法的開(kāi)發(fā)，在受累豬個(gè)體的診斷方面獲得了顯著改善。不幸的是，在實(shí)際應(yīng)用中，PCRs的檢測(cè)極限使得它無(wú)法檢測(cè)具有亞臨床感染的動(dòng)物攜帶者。由于這些診斷問(wèn)題，存在著開(kāi)發(fā)能夠在群體和豬個(gè)體水平上檢測(cè)豬痢疾短螺旋體感染的簡(jiǎn)單和有效診斷工具的明確需要。在豬痢疾短螺旋體建群后將誘導(dǎo)針對(duì)該螺旋體的強(qiáng)免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答可以防止自豬痢疾康復(fù)的豬再次感染。盡管如此，開(kāi)發(fā)疫苗控制豬痢疾的嘗試一直僅有非常有限的成功，這是因?yàn)樗鼈儾荒茉谌后w基礎(chǔ)上提供充足的保護(hù)，或它們太昂貴和難以生產(chǎn)從而使得它們無(wú)法商業(yè)化。菌苗疫苗可以提供一定水平的保護(hù)，但它們傾向于是脂多糖血清型特異的，這就要求使用多價(jià)菌苗。此外，因?yàn)樵撀菪w的苛刻厭氧生長(zhǎng)需求，它們的大規(guī)模生產(chǎn)是困難且昂貴的。已進(jìn)行開(kāi)發(fā)減毒活疫苗用于豬痢疾的幾種嘗試。這種方法具有減毒株顯示減少的建群和因此引起減少的免疫刺激的缺點(diǎn)。此外，因?yàn)榛貜?fù)毒力的可能性，部分生產(chǎn)者和獸醫(yī)不愿使用活疫苗用于豬痢疾，特別是在對(duì)豬痢疾短螺旋體的遺傳調(diào)節(jié)和組構(gòu)知之甚少的情況下。重組亞單位疫苗的使用是吸引人的備選方法，因?yàn)樵摦a(chǎn)品將是成分明確的(對(duì)于注冊(cè)目的而言是必需的)，并且相對(duì)容易大規(guī)模生產(chǎn)。迄今為止，首個(gè)報(bào)告的豬痢疾短螺旋體重組蛋白質(zhì)作為疫苗候選物(38千道爾頓鞭毛蛋白質(zhì))的使用未能阻止豬中的建群。這種失敗可能與使用的具體重組蛋白質(zhì)，以及遞送系統(tǒng)和途徑、劑量率、佐劑選擇等其他更下游的問(wèn)題特別相關(guān)(Gabe，JD,Chang,RJ,SIomiany,R,Andrews,WH禾口McCaman，MT(1995)IsolationofextracytoplasmicproteinsfromSerpulinahyodysenteriaeB204andmolecularcloningofthefIaBlgeneencodinga38-kilodaltonflagellarprotein.InfectionandImmunity63:142-148)。首個(gè)報(bào)告的用于疫苗接種的部分保護(hù)性重組豬痢疾短螺旋體蛋白質(zhì)是29.7kDa外膜脂蛋白(Bhlp29.7，也稱(chēng)為BmpB和BlpA)，其與各種致病菌的甲硫氨酸結(jié)合性脂蛋白具有同源性。用his標(biāo)記的重組Bhlp29.7蛋白質(zhì)接種豬，隨后用豬痢疾短螺旋體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性攻擊，與50-70%的未接種對(duì)照豬發(fā)病比較，導(dǎo)致17-40%的疫苗接種豬發(fā)病。因?yàn)锽hlp29.7接種的豬的疾病發(fā)生率明顯(P=0.047)低于對(duì)照豬，所以Bhlp29.7看起來(lái)具有作為豬痢疾疫苗組分的潛力(La，T，Phillips,ND,Reichel,MP禾口Hampson,DJ(2004)·ProtectionofpigsfromswinedysenterybyvaccinationwithrecombinantBmpB,a29.7kDaouter-membranelipoproteinofBrachyspirahyodysenteriae.VeterinaryMicrobiology102:97_109)。已進(jìn)行了許多其他嘗試以鑒定可以用作重組疫苗組分的豬痢疾短螺旋體外包被蛋白質(zhì)，但再次未能獲得成功的疫苗。需要一個(gè)更為全面得多的方法來(lái)自豬痢疾短螺旋體鑒定潛在有用的免疫原性重組蛋白質(zhì)。迄今為止，僅報(bào)告了一例使用DNA進(jìn)行疫苗接種的研究。在這項(xiàng)研究中，將編碼推定的鐵蛋白的豬痢疾短螺旋體ftnA基因克隆到大腸桿菌(E.coli)質(zhì)粒內(nèi)，該質(zhì)粒DNA用于包被金珠以進(jìn)行生物轟擊疫苗接種。使用豬痢疾的鼠類(lèi)模型測(cè)定用DNA和/或重組蛋白質(zhì)接種的保護(hù)性質(zhì)。用重組蛋白質(zhì)接種誘導(dǎo)了針對(duì)鐵蛋白的良好全身應(yīng)答，然而，用DNA疫苗接種僅誘導(dǎo)可檢測(cè)的全身應(yīng)答。用DNA疫苗接種后用重組蛋白質(zhì)加強(qiáng)，僅在用蛋白質(zhì)加強(qiáng)后誘導(dǎo)了針對(duì)鐵蛋白的全身免疫應(yīng)答。然而，試驗(yàn)的疫苗接種方案無(wú)一能夠給小鼠提供對(duì)抗豬痢疾短螺旋體建群和相關(guān)損傷的保護(hù)作用。有趣的是，小鼠用DNA單獨(dú)疫苗接種導(dǎo)致了疾病的顯著惡化(Davis,A.J.，Smith,S.C.和Moore，R.J.(2005).TheBrachyspirahyodysenteriaeftnAgene:DNAvaccinationandreal-timePCRquantificationofbacteriainamousemodelofdisease.CurrentMicrobiology50:285_291)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)目的是來(lái)自豬痢疾短螺旋體的新基因和由這些基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是新基因和由這些基因編碼的蛋白質(zhì)可以用于治療和診斷目的?？梢詫⑦@些基因和/或蛋白質(zhì)用于抗豬痢疾短螺旋體的疫苗中以及用于診斷豬痢疾短螺旋體感染。本發(fā)明的一個(gè)方面是具有SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中包含的核苷酸序列的新豬痢疾短螺旋體基因。本發(fā)明的再一方面是與SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65具有同一性的核苷酸序列，其中同一性百分比可以是至少95%、90%、85%、80%、75%和70%(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))。本發(fā)明還包括DNA疫苗或DNA免疫原性組合物，其包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的核苷酸序列，或與這些序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%等同性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的序列。本發(fā)明還包括包含DNA的診斷測(cè)定法，所述DNA具有SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的核苷酸序列，或與這些序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同一性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的序列。本發(fā)明的再一方面是包含DNA的質(zhì)粒，所述DNA具有SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的序列；包含DNA的原核和/或真核表達(dá)載體，所述DNA具有SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的序列；和包含質(zhì)粒的細(xì)胞，所述質(zhì)粒包含具有SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的序列的DNA。本發(fā)明的一個(gè)方面是具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的新豬痢疾短螺旋體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是與SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同源性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的再一方面是包含如下蛋白質(zhì)的疫苗或免疫原性組合物，所述蛋白質(zhì)具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列，或與SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同源性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的氨基酸序列。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面是包含一種或多種蛋白質(zhì)的診斷試劑盒，所述蛋白質(zhì)具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列，或與SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%,90%,85%、80%、75%和70%同源性。本發(fā)明的另一個(gè)方面是編碼具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及編碼與SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明還涵蓋包含具有如下序列的DNA的質(zhì)粒、真核和原核表達(dá)載體、和DNA疫苗，所述序列編碼具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和編碼與SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同源性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的氨基酸序列。包含這些質(zhì)粒和表達(dá)載體的細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明包括單克隆抗體，其與具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合，或與和SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同源性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的蛋白質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明還包括包含單克隆抗體的診斷試劑盒，所述單克隆抗體與具有SEQIDNOs2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合，或與和SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同源性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的蛋白質(zhì)結(jié)合。這些診斷試劑盒可以檢測(cè)動(dòng)物中豬痢疾短螺旋體的存在。動(dòng)物優(yōu)選是任何哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)；更優(yōu)選地，雞、鵝、鴨、火雞、鸚鵡、犬、貓、倉(cāng)鼠、沙鼠、兔、雪貂、馬、牛、綿羊、豬、猴和人。本發(fā)明還考慮通過(guò)給動(dòng)物施用DNA疫苗來(lái)預(yù)防或治療動(dòng)物中的豬痢疾短螺旋體感染的方法，所述DNA疫苗包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中列出的一種或多種核苷酸序列，或與這些序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同一性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的序列。本發(fā)明還涵蓋通過(guò)給動(dòng)物施用疫苗來(lái)預(yù)防或治療動(dòng)物中的豬痢疾短螺旋體感染的方法，所述疫苗包含一種或多種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列，或與這些序列至少95%,90%,85%,80%、75%和70%同源(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的序列。動(dòng)物優(yōu)選是任何哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)；更優(yōu)選地，雞、鵝、鴨、火雞、鸚鵡、犬、貓、倉(cāng)鼠、沙鼠、兔、雪貂、馬、牛、綿羊、豬、猴和人。本發(fā)明還考慮通過(guò)給動(dòng)物施用免疫原性組合物在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述免疫原性組合物包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中列出的一種或多種核苷酸序列，或與這些序列具有至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同一性(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的序列。本發(fā)明還涵蓋通過(guò)給動(dòng)物施用免疫原性組合物在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述免疫原性組合物包含一種或多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有SEQIDN0s:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列，或與這些序列至少95%、90%、85%、80%、75%和70%同源(以及從100到70的每一個(gè)整數(shù))的序列。動(dòng)物優(yōu)選是任何哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)；更優(yōu)選地，雞、鵝、鴨、火雞、鸚鵡、犬、貓、倉(cāng)鼠、沙鼠、兔、雪貂、馬、牛、綿羊、豬、猴和人。發(fā)明詳述冠詞“a”和“an”在本文中用于指該冠詞的一個(gè)或超過(guò)一個(gè)(即，至少一個(gè))的語(yǔ)法對(duì)象。例如，“an元件”意指一個(gè)元件或一個(gè)以上元件。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”意欲涵蓋包括氨基官能團(tuán)和酸官能團(tuán)并且能夠包括在天然氨基酸的聚合物中的所有分子，不論其是天然還是合成的。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其類(lèi)似物、衍生物和同類(lèi)物(congener)；具有變異側(cè)鏈的氨基酸類(lèi)似物；以及任何前述氨基酸的所有立體異構(gòu)體。動(dòng)物可以是任何哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)。哺乳動(dòng)物的例子包括犬、貓、倉(cāng)鼠、沙鼠、兔、雪貂、馬、牛、綿羊、豬、猴和人。鳥(niǎo)類(lèi)的例子包括雞、鵝、鴨、火雞、鸚鵡。術(shù)語(yǔ)“保守殘基”指這樣的氨基酸，其為具有某些共性的一組氨基酸中的成員。術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸置換”指將來(lái)自一個(gè)這種氨基酸組的氨基酸用來(lái)自相同組的不同氨基酸置換(概念上地或其他方式)。定義單個(gè)氨基酸之間的共性的一種函數(shù)方法是在同源生物體的相應(yīng)蛋白質(zhì)之間分析氨基酸變化的標(biāo)化后頻率(Schulz，G.E.和R.H.Schinner.,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。根據(jù)此禾中分析，可以定義氨基酸組，其中組內(nèi)的氨基酸優(yōu)先彼此交換，并因此在其對(duì)總體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響方面彼此最類(lèi)1以(Schulz,G.E.禾口R.H.Schirmer，PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。以這種方式定義的氨基酸組的例子包括(i)帶正電荷的組，包含Lys、Arg和His，(ii)帶負(fù)電荷的組，包含Glu和Asp，(iii)芳香族組，包含Phe、Tyr和Trp，(iv)氮環(huán)組，包含His和Trp，(ν)大脂肪族非極性組，包含Val、Leu和De、(vi)輕微極性組，包含Met和Cys,(vii)小殘基組，包含Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro,(viii)脂肪族組，包含Val、Leu、De、Met和CysJP(ix)小的羥基組，包含Ser和Thr?！叭诤系鞍住被颉叭诤隙嚯摹保绫绢I(lǐng)域已知的，指嵌合蛋白質(zhì)，其可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行構(gòu)建。在融合蛋白的許多例子中，存在2種不同多肽序列，而在某些情況下，可能存在更多不同的序列。編碼融合蛋白的多核苷酸序列可以在框內(nèi)可操作地連接，從而使得融合蛋白可以正確翻譯。融合蛋白可以包括來(lái)自相同物種或來(lái)自不同物種的多肽序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽可以包含與第一多肽連接的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。在超過(guò)一個(gè)氨基酸序列與第一多肽連接的情況下，融合序列可以是同一序列的多個(gè)拷貝，或備選地，可以是多個(gè)不同氨基酸序列。融合多肽可以與第一多肽的N末端、C末端或N和C末端融合。示例性融合蛋白包括包含谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST-標(biāo)簽)、組氨酸標(biāo)簽(His-標(biāo)簽)、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”指這樣的多肽，所述多肽在某些實(shí)施方案中由重組DNA或RNA制備、或具有合成起源或天然起源、或其某種組合，該多肽(1)不與在自然界中通常和其一起存在的蛋白質(zhì)相聯(lián)系，(2)與正常存在該多肽的細(xì)胞分離，(3)不含來(lái)自相同細(xì)胞來(lái)源的其他蛋白質(zhì)，(4)由來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(5)在自然界中不存在。分離的多肽可以以純化多肽的形式存在，但不限定為純化的多肽。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”和“分離的多核苷酸”指這樣的多核苷酸，其可以是基因組DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、iRNA，或得自細(xì)胞器(例如，線粒體和葉綠體)的多核苷酸，或合成起源的多核苷酸，該多核苷酸(1)不與天然存在該“分離核酸”的細(xì)胞相聯(lián)系，或(2)與在自然界中和之不連接的多核苷酸可操作地連接。分離的多核苷酸可以以純化的多核苷酸的形式存在，但不限定為純化的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”指核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類(lèi)型的核苷酸的修飾形式)的聚合形式。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)理解為包括由核苷酸類(lèi)似物制備的RNA或DNA類(lèi)似物作為等價(jià)物，以及，根據(jù)對(duì)所描述的實(shí)施方案的適用性，單鏈(例如有義或反義)和雙鏈多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的核酸”和“本發(fā)明的多核苷酸”指編碼本發(fā)明的多肽的核酸。本發(fā)明的多核苷酸可以包括主題核酸序列的全部或部分；與主題核酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%(以及60至100之間的每一個(gè)整數(shù))同一性的核苷酸序列；在嚴(yán)格條件下與主題核酸序列雜交的核苷酸序列；編碼與本發(fā)明的多肽功能上等價(jià)的多肽的核苷酸序列；編碼與主題氨基酸序列具有至少約60%、70%、80%、85%、90%,95%,98%,99%(以及60至100之間的每一個(gè)整數(shù))同源性或同一性的多肽的核苷酸序列；編碼具有本發(fā)明多肽的活性且與主題氨基酸序列具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高(以及60至100之間的每一個(gè)整數(shù))同源性或同一性的多肽的核苷酸序列；與主題核酸序列相差1至約2、3、5、7、10、15、20、30、50、75個(gè)或更多個(gè)核苷酸置換、添加或缺失的核苷酸序列，例如等位基因變體；衍生自主題核酸序列且與主題核酸序列進(jìn)化上相關(guān)的核酸；及所有前述的和其他的本發(fā)明核酸的互補(bǔ)序列和由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性導(dǎo)致的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸也包括主題核酸序列的同源物，例如直系同源物和旁系同源物、以及已針對(duì)在特定生物體(例如宿主細(xì)胞)中的表達(dá)進(jìn)行過(guò)密碼子優(yōu)化的主題核酸序列的變體。當(dāng)描述2個(gè)核酸區(qū)域之間的關(guān)系時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指并置，在該并置中這些區(qū)域處于允許它們以其預(yù)期方式起作用的關(guān)系中。例如，與編碼序列“可操作地連接的”控制序列以這樣的方式連接，該方式使得編碼序列的表達(dá)可以在與該控制序列相容的條件下達(dá)到，例如當(dāng)合適分子(例如，誘導(dǎo)物和聚合酶)與該控制或調(diào)節(jié)序列(一個(gè)或多個(gè))結(jié)合時(shí)。在本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”以及術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“肽”指氨基酸的聚合物。示例性多肽包括基因產(chǎn)物、天然存在的蛋白質(zhì)、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段、以及前述多肽的其他等價(jià)物、變體和類(lèi)似物。當(dāng)引述參考多肽進(jìn)行使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多肽片段”或“片段”指與參考多肽本身比較，存在氨基酸殘基缺失、但其余氨基酸序列通常與參考多肽中的相應(yīng)位置相同的多肽。此種缺失可以在參考多肽的氨基末端或羧基末端處發(fā)生或備選地在兩處發(fā)生。片段一般是至少5、6、8或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少14個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少20、30、40或50個(gè)氨基酸長(zhǎng)，至少75個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或至少100、150、200、300、500個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)。片段可以保留參考多肽的一種或多種生物活性。在某些實(shí)施方案中，片段可以包括具有所需生物活性的結(jié)構(gòu)域，和任選地位于結(jié)構(gòu)域一側(cè)或兩側(cè)的另外氨基酸，所述另外氨基酸的數(shù)目可以從5、10、15、20、30、40、50或直至100個(gè)或更多個(gè)殘基。此外，片段可以包括特定區(qū)域的亞片段，所述亞片段保留其來(lái)源區(qū)域的功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段可以具有免疫原性性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的多肽”指包含主題氨基酸序列或其等價(jià)物或片段的多肽。本發(fā)明的多肽包括包含主題氨基酸序列的全部或部分的多肽；具有1至約2、3、5、7、10、15、20、30、50、75個(gè)或更多個(gè)保守氨基酸置換的主題氨基酸序列；與主題氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%(以及60至100之間的每一個(gè)整數(shù))同源的氨基酸序列；及它們的功能片段。本發(fā)明的多肽還包括主題氨基酸序列的同源物，例如直系同源物和旁系同源物?？梢孕揎棻景l(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)，以例如增強(qiáng)治療或預(yù)防功效、或穩(wěn)定性(例如，離體保存期限、體內(nèi)對(duì)蛋白水解降解的抗性等)。當(dāng)設(shè)計(jì)為保留天然形式蛋白質(zhì)的至少一種活性時(shí)，此種修飾多肽被視為在本文中更詳細(xì)地描述的多肽的“功能等價(jià)物”。此種修飾多肽可以例如通過(guò)氨基酸置換、缺失或添加產(chǎn)生，所述置換可以整體或部分地由保守氨基酸置換組成。例如，可以合理地預(yù)期到，分離的保守氨基酸置換，例如用異亮氨酸或纈氨酸替換亮氨酸、用谷氨酸替換天冬氨酸、用絲氨酸替換蘇氨酸，將對(duì)所得到的分子的生物活性不具有主要影響。通過(guò)評(píng)估變體多肽產(chǎn)生類(lèi)似于野生型蛋白質(zhì)的應(yīng)答的能力，可以容易地確定多肽氨基酸序列中的改變是否導(dǎo)致了功能同源物。以相同方式可以容易地測(cè)試其中已發(fā)生超過(guò)一個(gè)替換的多肽。術(shù)語(yǔ)“純化的”指目標(biāo)物為存在的主要物(即，以摩爾為基礎(chǔ)，它比組合物中的任何其他單個(gè)物都更豐富)?！凹兓募?jí)分”是其中目標(biāo)物占存在的所有物的至少約50%(在摩爾基礎(chǔ)上)的組合物。在確定溶液或分散體中一個(gè)物的純度時(shí)，溶解或分散該物的溶劑或基質(zhì)通常不包括在此確定中；相反，僅考慮被溶解或分散的各種物(包括目的物)。一般地，純化的組合物將具有一種物占組合物中存在的所有物的約80%以上，或組合物中存在的所有物的約85%、90%、95%、99%以上或更多。目標(biāo)物可以被純化至基本同質(zhì)(通過(guò)常規(guī)檢測(cè)方法不能在組合物中檢測(cè)出污染物)，其中該組合物基本上是單一物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本文教導(dǎo)使用蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化本發(fā)明的多肽。多肽純度可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法進(jìn)行測(cè)定，包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝膠電泳、質(zhì)譜分析和本文描述的方法。術(shù)語(yǔ)“重組蛋白質(zhì)”或“重組多肽”指通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽。此種技術(shù)的一個(gè)例子包括將編碼表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA插入合適表達(dá)載體，然后用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生由該DNA編碼的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”是一個(gè)上位概念，在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中用于指諸如起始信號(hào)、增強(qiáng)子、調(diào)節(jié)子和啟動(dòng)子等多核苷酸序列，其是影響與之可操作地連接的編碼和非編碼序列表達(dá)所需的或所期望的。示例性調(diào)節(jié)序列在Goeddel；GeneExpressionTechnology=MethodsinEnzymology,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述，并且包括例如SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、其表達(dá)由T7RNA聚合酶指導(dǎo)的T7啟動(dòng)子、噬菌體λ的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白質(zhì)的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶(例如，Pho5)的啟動(dòng)子、酵母α-交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體啟動(dòng)子和已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其他序列、及其各種組合。此類(lèi)控制序列的性質(zhì)和使用可以依據(jù)宿主生物體而不同。在原核生物中，調(diào)節(jié)序列一般包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”意欲最低限度包括其存在可影響表達(dá)的組分，并且還可以包括其存在具有有利之處的另外組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄處于啟動(dòng)子序列(或其他調(diào)節(jié)序列)的控制下，該啟動(dòng)子序列(或其他調(diào)節(jié)序列)控制該多核苷酸在意欲實(shí)現(xiàn)表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。還應(yīng)當(dāng)理解，多核苷酸可以處于調(diào)節(jié)序列的控制下，所述調(diào)節(jié)序列與控制天然存在形式的該多核苷酸表達(dá)的那些序列可以相同或不同。術(shù)語(yǔ)“序列同源性”指在2個(gè)核酸序列之間的堿基匹配比例或在2個(gè)氨基酸序列之間的氨基酸匹配比例。當(dāng)序列同源性表示為百分比例如50%時(shí)，該百分比指期望序列與某些其他序列比較，在序列長(zhǎng)度上的匹配比例。允許空位(在2個(gè)序列的任一個(gè)中)以使匹配達(dá)到最大；通常使用15個(gè)堿基或更少的空位長(zhǎng)度，更常使用6個(gè)堿基或更少的空位長(zhǎng)度，甚至更常使用的是2個(gè)堿基或更少的空位長(zhǎng)度。術(shù)語(yǔ)“序列同一”意指在比較窗口上序列相同(即，對(duì)于核酸，在一個(gè)核苷酸接一個(gè)核苷酸的基礎(chǔ)上，或?qū)τ诙嚯?，在一個(gè)氨基酸接一個(gè)氨基酸的基礎(chǔ)上)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”通過(guò)下述進(jìn)行計(jì)算在比較窗上比較2個(gè)最佳比對(duì)的序列，確定兩個(gè)序列出現(xiàn)相同氨基酸或核苷酸的位置的數(shù)目，以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100，產(chǎn)生序列同一性百分比。計(jì)算序列同一性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在下文更詳細(xì)地描述。在本文中，就本發(fā)明的多肽或其他蛋白質(zhì)所使用的術(shù)語(yǔ)“可溶的”，意指在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)后，表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的至少某些部分保留在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)級(jí)分中，并且在裂解和裂解物離心后不與細(xì)胞碎片一起分級(jí)分離。多肽的溶解性可以通過(guò)本領(lǐng)域多種公知方法增加，所述方法包括與異源氨基酸序列融合、氨基酸殘基缺失、氨基酸置換(例如，使序列富含具有親水側(cè)鏈的氨基酸殘基)、和化學(xué)修飾(例如，添加親水基團(tuán))。多肽溶解性可以使用本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)進(jìn)行測(cè)量，包括動(dòng)態(tài)光散射以測(cè)定聚集狀態(tài)、UV吸收、離心以使聚集物與非聚集物分離、和SDS凝膠電泳(例如，將蛋白質(zhì)在可溶級(jí)分中的量與蛋白質(zhì)在可溶和不可溶級(jí)分中的量的組合相比較)。當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的多肽可以是至少約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高可溶的，例如，細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的總量的至少約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多存在于細(xì)胞質(zhì)級(jí)分中。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞的一升培養(yǎng)物將產(chǎn)生至少約0.1,0.2,0.5、1、2、5、10、20、30、40、50毫克或更多的可溶蛋白質(zhì)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是至少約10%可溶的，并且從一升細(xì)胞培養(yǎng)物中將產(chǎn)生至少約1毫克蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”指可檢測(cè)的特異性核酸結(jié)合。本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸和核酸在如下雜交和洗滌條件下與核酸鏈選擇性雜交，所述雜交和洗滌條件使與非特異性核酸的可檢測(cè)結(jié)合的可感知量降到最低。嚴(yán)格條件可以用于達(dá)到如本領(lǐng)域已知和本文討論的選擇性雜交條件。一般地，本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸和核酸與目的核酸序列之間的核酸序列同一性將是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多(以及30和100之間的每一個(gè)整數(shù))。在某些情況下，雜交和洗滌條件根據(jù)常規(guī)雜交操作和如本文進(jìn)一步描述的在嚴(yán)格條件下執(zhí)行。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”指促進(jìn)2條互補(bǔ)多核苷酸鏈之間的特異性雜交以便形成雙鏈體的條件。嚴(yán)格條件可以選擇為比規(guī)定的離子強(qiáng)度和PH下給定多核苷酸雙鏈體的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5°C?；パa(bǔ)多核苷酸鏈的長(zhǎng)度及其GC含量將決定雙鏈體的Tm，并由此決定獲得期望雜交特異性所需的雜交條件。Tm是50%的多核苷酸序列與完全匹配的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交時(shí)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和PH下)。在某些情況下，可能希望增加雜交條件的嚴(yán)格性，以約等于特定雙鏈體的Tm。用于估計(jì)Tm的多種技術(shù)是可得的。一般地，雙鏈體中的G-C堿基對(duì)據(jù)估計(jì)對(duì)Tm貢獻(xiàn)約3°C，而A-T堿基對(duì)據(jù)估計(jì)貢獻(xiàn)約2V，直至約80-100°C的理論最大限度。然而，可獲得更復(fù)雜的Tm模型，其中考慮G-C堆疊相互作用、溶劑效應(yīng)、所需的試驗(yàn)溫度等。例如，使用如下公式，探針可以設(shè)計(jì)為具有約60°C的離解溫度(Td)=Td=(((3x#GC)+(2x#AT))x37)-562)/#bp)-5；其中#GC、#AT和#bp分別是雙鏈體形成中涉及到的鳥(niǎo)嘌呤_胞嘧啶堿基對(duì)數(shù)目、腺嘌呤_胸腺嘧啶堿基對(duì)數(shù)目、和總堿基對(duì)數(shù)目。雜交可以在5xSSC、4xSSC、3xSSC、2xSSCUxSSC或0.2xSSC中執(zhí)行至少約1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)或24小時(shí)。可以增加雜交溫度以調(diào)整反應(yīng)嚴(yán)格性，例如從約250C(室溫)到約451、501、551、601或651。雜交反應(yīng)還可以包括影響嚴(yán)格性的其它試劑，例如在50%甲酰胺的存在下進(jìn)行的雜交增加在規(guī)定溫度的雜交的嚴(yán)格性。雜交反應(yīng)后可以為單個(gè)洗滌步驟，或2個(gè)或更多個(gè)洗滌步驟，其可以在相同或不同鹽度和溫度進(jìn)行。例如，可以增加洗滌溫度，以調(diào)整嚴(yán)格性從約25°C(室溫)至約45°C、50°C、55°C、60°C、65°C或更高。洗滌步驟可以在洗滌劑例如0.1或0.2%SDS的存在下進(jìn)行。例如，雜交后可以為在2xSSC、0.SDS中65°C的2個(gè)洗滌步驟，每個(gè)步驟約20分鐘，以及任選地在0.2xSSC、0.SDS中65°C的2個(gè)額外的洗滌步驟，各步驟約20分鐘。示例性嚴(yán)格雜交條件包括在包含50%甲酰胺、IOxDenhardt(0.2%Ficoll,0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0.2%牛血清白蛋白)和200μg/ml變性載體DNA例如剪切鮭精DNA的溶液中65°C過(guò)夜雜交，隨后為各在2xSSC、0.SDS中65°C約20分鐘的2個(gè)洗滌步驟，和各在0.2xSSC、0.SDS中65°C約20分鐘的2個(gè)洗滌步驟。雜交可以為2種核酸在溶液中的雜交，或在溶液中的核酸與附著在固體載體例如濾膜上的核酸的雜交。當(dāng)一種核酸在固體載體上時(shí)，可以在雜交前進(jìn)行預(yù)雜交步驟。預(yù)雜交可以在與雜交溶液相同的溶液和相同的溫度(無(wú)互補(bǔ)多核苷酸鏈)進(jìn)行至少約1小時(shí)、3小時(shí)或10小時(shí)。合適的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以由技術(shù)人員實(shí)驗(yàn)確定。參見(jiàn)例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-12.3.6；Sambrook等人，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.；S.Agrawal(編輯)MethodsinMolecularBiology,第20^；Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationWithNucleicAcidProbes,例如部分I第2章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays“，Elsevier，NewYork；和Tibanyenda，N.等人，Eur.J.Biochem.139:19(1984)和Ebel，S.等人，Biochem.3112083(1992)。術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)已與之連接的另一核酸的核酸?？梢砸勒毡景l(fā)明使用的一種載體類(lèi)型是附加體，即能夠在染色體外復(fù)制的核酸。其他載體包括能夠自主復(fù)制和表達(dá)與之連接的核酸的載體。能夠指導(dǎo)與之可操作地連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱(chēng)為“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中具有功用的表達(dá)載體通常為“質(zhì)?！毙问?，所述質(zhì)粒形式指環(huán)狀雙鏈DNA分子，該分子以其載體形式不與染色體結(jié)合。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意欲包括可以發(fā)揮等價(jià)功能的和將來(lái)為本領(lǐng)域已知的其他形式的表達(dá)載體。本發(fā)明的核酸可以用作診斷試劑，以檢測(cè)能夠與之特異性結(jié)合的靶DNA或RNA序列的存在或不存在，例如用于測(cè)定本發(fā)明核酸的表達(dá)水平。在一個(gè)方面，本發(fā)明考慮用于檢測(cè)樣品中本發(fā)明核酸或其部分的存在的方法，該方法具有下述步驟(a)提供長(zhǎng)度至少8個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該寡核苷酸與本發(fā)明核酸的一部分互補(bǔ)；(b)在允許寡核苷酸與本發(fā)明的核酸或其部分雜交的條件下，使寡核苷酸與包含至少一種核酸的樣品接觸；和(c)檢測(cè)寡核苷酸與樣品中核酸的雜交，從而檢測(cè)本發(fā)明的核酸或其部分在樣品中的存在。在另一個(gè)方面，本發(fā)明考慮用于檢測(cè)樣品中本發(fā)明核酸或其部分的存在的方法，通過(guò)(a)提供一對(duì)單鏈寡核苷酸，其各自長(zhǎng)至少8個(gè)核苷酸，與本發(fā)明核酸的序列互補(bǔ)，并且其中這些寡核苷酸的互補(bǔ)序列間隔至少10個(gè)核苷酸；和(b)使寡核苷酸與包含至少一種核酸的樣品在雜交條件下接觸；(c)擴(kuò)增這2個(gè)寡核苷酸引物之間的核苷酸序列；和(d)檢測(cè)擴(kuò)增序列的存在，從而檢測(cè)本發(fā)明的核酸或其部分在樣品中的存在。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的多核苷酸在表達(dá)載體中提供，所述表達(dá)載體包括編碼本發(fā)明多肽且與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接的核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于多種因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇和/或希望表達(dá)的蛋白質(zhì)的類(lèi)型。應(yīng)當(dāng)考慮載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力、以及由該載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)例如抗生素標(biāo)記的表達(dá)。包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體隨后可以用作藥劑以治療由豬痢疾短螺旋體感染的動(dòng)物，或用作疫苗(也是藥劑)以預(yù)防動(dòng)物感染豬痢疾短螺旋體，或在動(dòng)物確實(shí)受感染時(shí)減少該疾病的癥狀和病程。使用表達(dá)載體作為藥劑的一種方式是給處于感染危險(xiǎn)中的動(dòng)物或被感染后的動(dòng)物施用核酸疫苗。核酸疫苗技術(shù)是本領(lǐng)域充分描述的。某些描述可以在美國(guó)專(zhuān)利6，562，376(Hooper等人)；美國(guó)專(zhuān)利5，589，466(Feigner，等人)；美國(guó)專(zhuān)利6，673，776(Feigner，等人)；和美國(guó)專(zhuān)利6，710，035(Feigner，等人)中發(fā)現(xiàn)。核酸疫苗可以注射到肌肉內(nèi)或皮內(nèi)，可以通過(guò)電穿孔進(jìn)入動(dòng)物(參見(jiàn)W001/23537，King等人；和WO01/68889，Malone等人)，經(jīng)由脂質(zhì)組合物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，703，055，F(xiàn)eigner,等人)，或本領(lǐng)域已知的其他機(jī)制。表達(dá)載體還可以轉(zhuǎn)染到細(xì)菌內(nèi)，所述細(xì)菌可以施用于靶動(dòng)物，以誘導(dǎo)針對(duì)該表達(dá)載體所包含的本發(fā)明核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。表達(dá)載體可以包含真核表達(dá)序列，從而使得本發(fā)明的核苷酸在宿主動(dòng)物中轉(zhuǎn)錄和翻譯。備選地，表達(dá)載體可以在細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄，隨后在宿主動(dòng)物中翻譯。用作表達(dá)載體的運(yùn)載體的細(xì)菌應(yīng)是減毒但仍具有侵襲性的。例如，可以使用已減毒但仍具有侵襲性的志賀氏菌屬物種(Shigellaspp.)、沙門(mén)氏菌屬物種(Salmonellaspp.)、埃希氏菌屬物種(Escherichiaspp.)和氣單胞菌屬物種(Aeromonasspp·)。這些方法的例子可以在美國(guó)專(zhuān)利5，824，538(Branstrom等人)；美國(guó)專(zhuān)利5，877，I59(Powell，等人)；美國(guó)專(zhuān)利6，ΙδΟ，I7O(Powell，等人)；美國(guó)專(zhuān)利6，500，419(Hone，等人)；和美國(guó)專(zhuān)利6，682，729(Powell，等人)中發(fā)現(xiàn)。備選地，本發(fā)明的多核苷酸可以放置在充當(dāng)載體的某些病毒中。病毒載體可以在病毒表面上表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或?qū)⒈景l(fā)明的多核苷酸攜帶到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，在此處多核苷酸被轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。由病毒載體感染的動(dòng)物可以發(fā)展針對(duì)本發(fā)明多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。由此可以在接受病毒載體的動(dòng)物中減輕或預(yù)防豬痢疾短螺旋體的感染。病毒載體的例子可以在美國(guó)專(zhuān)利5，283，191(Morgan等人)；美國(guó)專(zhuān)利5，554，525(Sondermeijer等人)和美國(guó)專(zhuān)利5，712，118(Murphy)中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的多核苷酸可以用于引起本發(fā)明多肽在培養(yǎng)繁殖的細(xì)胞中表達(dá)和超表達(dá)，例如以產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽，包括融合蛋白或多肽。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)染了重組基因的宿主細(xì)胞，以便表達(dá)本發(fā)明的多肽。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，本發(fā)明的多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞(桿狀病毒)、酵母、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在宿主細(xì)胞是人細(xì)胞的情況下，它可以在或不在活體中。其他合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此外，宿主細(xì)胞可以補(bǔ)充一般在宿主中不存在的tRNA分子，以便優(yōu)化多肽表達(dá)。備選地，可以改變核苷酸序列以?xún)?yōu)化在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，然而，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將與原始編碼的蛋白質(zhì)具有高同源性。適合于使多肽表達(dá)最大化的其他方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。例如，可以在合適條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以允許多肽表達(dá)?？梢詮陌嚯牡募?xì)胞和培養(yǎng)基的混合物中分泌和分離多肽。備選地，多肽可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，收獲、裂解細(xì)胞并分離蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他副產(chǎn)品。用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的。多肽可以使用本領(lǐng)域已知用于純化蛋白質(zhì)的技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或兩者中分離，所述技術(shù)包括離子交換色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法、超濾、電泳、以及用對(duì)于本發(fā)明多肽的特定表位特異的抗體進(jìn)行的免疫親和純化。因此，編碼本發(fā)明多肽的全部或選擇的部分的核苷酸序列可以用于經(jīng)由微生物或真核細(xì)胞工藝生產(chǎn)重組形式的蛋白質(zhì)。將序列連接到多核苷酸構(gòu)建體例如表達(dá)載體內(nèi)，和轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到真核(酵母、禽類(lèi)、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物)或原核(細(xì)菌細(xì)胞)宿主內(nèi)，是標(biāo)準(zhǔn)操作?？梢圆捎孟嗨撇僮骰蚱湫揎椥问?，通過(guò)微生物方法或組織培養(yǎng)技術(shù)制備本發(fā)明的重組多肽。用于表達(dá)本發(fā)明多肽的合適載體包括下述類(lèi)型的質(zhì)粒用于在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中表達(dá)的PTrcHis-衍生質(zhì)粒、pET-衍生質(zhì)粒、pBR322-衍生質(zhì)粒、pEMBL-衍生質(zhì)粒、pEX-衍生質(zhì)粒、pBTac-衍生質(zhì)粒和pUC-衍生質(zhì)粒。在質(zhì)粒制備和宿主生物體轉(zhuǎn)化中采用的各種方法是本領(lǐng)域眾所周知的。對(duì)于原核和真核細(xì)胞的其他合適表達(dá)系統(tǒng)，以及一般重組操作方案，可以參見(jiàn)MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，由Sambrook、Fritsch禾口Maniatis編輯(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)第16禾口17章?？梢詫⒛康亩嚯牡木幋a序列摻入作為融合基因的部分，所述融合基因包括編碼不同多肽的核苷酸序列。本發(fā)明考慮包含本發(fā)明的核酸和至少一種異源序列的分離多核苷酸，所述異源序列編碼與本發(fā)明核酸的核苷酸序列框內(nèi)連接的異源肽，由此編碼包含異源多肽的融合蛋白。異源多肽可以與(a)本發(fā)明多肽的C末端、(b)本發(fā)明多肽的N末端、或(c)本發(fā)明多肽的C末端和N末端融合。在某些情況下，異源多肽編碼允許檢測(cè)、分離、溶解和/或穩(wěn)定與之融合的多肽的多肽。在另外其他的實(shí)施方案中，異源序列編碼多肽例如多聚His標(biāo)簽、myc、HA、GST、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、硫氧還蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、多聚精氨酸、多聚His-Asp、FLAG、免疫球蛋白的部分和胞轉(zhuǎn)肽。當(dāng)希望產(chǎn)生本發(fā)明多肽的免疫原性片段時(shí)，融合表達(dá)系統(tǒng)可以是有用的。例如，輪狀病毒的VP6衣殼蛋白質(zhì)可以，以單體形式或以病毒顆粒的形式，用作免疫原性載體蛋白質(zhì)用于多肽的部分?？梢詫⒋l(fā)抗體的本發(fā)明多肽部分的對(duì)應(yīng)核酸序列摻入融合基因構(gòu)建體內(nèi)，所述構(gòu)建體包括痘苗病毒晚期結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的編碼序列，以產(chǎn)生表達(dá)融合蛋白的一組重組病毒，其中所述融合蛋白包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的部分作為病毒粒子的一部分。乙型肝炎表面抗原也可以以這種作用使用。類(lèi)似地，可以制備編碼如下融合蛋白的嵌合構(gòu)建體以增強(qiáng)免疫原性，所述融合蛋白包含本發(fā)明多肽的部分和脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白質(zhì)(參見(jiàn)例如，EPPublicationNO0259149；禾口Evans等人，(1989)Nature339385；Huang等人，(1988)J.Virol.623855；和Schlienger等人，(1992)J.Virol.662)。融合蛋白可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或純化。例如，本發(fā)明的多肽可以作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白產(chǎn)生。此種GST融合蛋白可以用于簡(jiǎn)化本發(fā)明多肽的純化，例如通過(guò)使用谷胱甘肽衍生基質(zhì)(參見(jiàn)例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,編輯Ausubel等人，(N.Y.Johnffiley&Sons，1991))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在重組蛋白質(zhì)的期望部分的N端編碼純化前導(dǎo)序列例如多聚-(His)/腸激酶切割位點(diǎn)序列的融合基因，可以允許通過(guò)使用Ni2+金屬樹(shù)脂的親和色譜法純化表達(dá)的融合蛋白。該純化前導(dǎo)序列隨后可以通過(guò)用腸激酶處理而去除，以提供純化的蛋白質(zhì)(例如，參見(jiàn)Hochuli等人，(1987)J.Chromatography411177；和Janknecht等人，PNASUSA888972)。用于制備融合基因的技術(shù)是眾所周知的?；旧?，可以依照常規(guī)技術(shù)連接編碼不同多肽序列的各種DNA片段，采用平末端連接或粘性末端用于連接、限制性酶消化以提供合適末端，適當(dāng)時(shí)補(bǔ)平粘性末端，堿性磷酸酶處理以避免不希望有的連接，和酶促連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合基因可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)化DNA合成儀合成。備選地，可以使用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物產(chǎn)生在2個(gè)連續(xù)基因片段之間的互補(bǔ)突出端，隨后可以退火所述片段以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見(jiàn)例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，編輯Ausubel等人，JohnWiley&Sons:1992)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了固定在固體表面上的本發(fā)明核酸，所述固體表面包括平板、微量滴定板、載玻片、珠、顆粒、球、膜、線、沉淀物、凝膠、片、管、容器、毛細(xì)管、墊、切片等。本發(fā)明的核酸可以固定在芯片上作為陣列的一部分。陣列可以包含如本文描述的本發(fā)明的一種或多種多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，芯片包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸作為與該多核苷酸來(lái)自相同致病物種的多核苷酸序列的陣列的一部分。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供如本文描述的分離的豬痢疾短螺旋體多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸序列。更優(yōu)選地，以基本上純化的形式提供豬痢疾短螺旋體多肽。優(yōu)選的本發(fā)明多肽將具有天然全長(zhǎng)多肽的一種或多種生物學(xué)性質(zhì)(例如，體內(nèi)、體外或免疫學(xué)性質(zhì))。非功能多肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)樗鼈兝缈梢杂米鞴δ芏嚯牡霓卓箘?。相?duì)于野生型的類(lèi)似物、片段或衍生物的生物學(xué)性質(zhì)可以例如借助于生物學(xué)測(cè)定法測(cè)定。可以合成制備多肽，包括類(lèi)似物、片段和衍生物(例如，使用眾所周知的固相或溶液相肽合成技術(shù))。優(yōu)選地，采用固相合成技術(shù)。備選地，本發(fā)明的多肽可以使用眾所周知的基因工程技術(shù)進(jìn)行制備，如下文描述的。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可以從生物學(xué)液體中純化(例如，通過(guò)免疫親和純化)，所述生物學(xué)液體例如但不限于來(lái)自動(dòng)物的血漿、糞便、血清或尿液，所述動(dòng)物包括但不限于豬、雞、鵝、鴨、火雞、鸚鵡、人、猴、犬、貓、馬、倉(cāng)鼠、沙鼠、兔、雪貂、馬、牛和綿羊。動(dòng)物可以是任何哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)。豬痢疾短螺旋體多肽類(lèi)似物包括具有本發(fā)明氨基酸序列的那些多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸由另外的氨基酸置換，所述置換基本上不改變分子的生物活性。根據(jù)本發(fā)明，重組或通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生的本發(fā)明多肽，以及其片段或其他衍生物或類(lèi)似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以產(chǎn)生識(shí)別多肽的抗體。分子具有“抗原性”，當(dāng)它能夠與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子例如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體特異性地相互作用時(shí)?？乖园被嵝蛄邪辽偌s5個(gè)、且優(yōu)選至少約10個(gè)氨基酸。分子的抗原性部分可以是就抗體或T細(xì)胞受體的識(shí)別而言為免疫顯性的部分，或它可以是用于產(chǎn)生針對(duì)該分子的抗體的部分(通過(guò)將該抗原性部分與載體分子綴合用于免疫)。具有抗原性的分子無(wú)需自身是免疫原性的，即無(wú)需載體能夠引發(fā)免疫應(yīng)答?！翱贵w”是結(jié)合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗體及其片段。該術(shù)語(yǔ)包含多克隆、單克隆和嵌合抗體(所提及的后者在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，397和4，816，567中更詳細(xì)地描述)，以及抗體的抗原結(jié)合部分，包括Fab、F(ab')2和F(v)(包括單鏈抗體)。因此，如本文所使用的，短語(yǔ)“抗體分子”以其各語(yǔ)法形式考慮完整免疫球蛋白分子和包含抗體結(jié)合部位的免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分?！翱贵w結(jié)合部位”是由特異性結(jié)合抗原的重和輕鏈可變和高變區(qū)組成的抗體分子的結(jié)構(gòu)部分。示例性抗體分子是完整免疫球蛋白分子，基本上完整的免疫球蛋白分子和包含抗原互補(bǔ)位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本領(lǐng)域已知的那些部分，如Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)，所述部分對(duì)于在本文描述的治療方法中的使用是優(yōu)選的?？贵w分子的Fab和F(ab‘)2部分可以通過(guò)眾所周知的方法，分別通過(guò)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)基本上完整的抗體分子進(jìn)行蛋白酶解反應(yīng)而制備。參見(jiàn)例如，11^0打1叩010118等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，342，566。Fab'抗體分子部分也是眾所周知的，可以由F(ab')2部分產(chǎn)生，在用巰基乙醇還原連接該2個(gè)重鏈部分的二硫鍵后，用試劑例如碘乙酰胺烷基化所得到的蛋白質(zhì)硫醇。包含完整抗體分子的抗體是本文優(yōu)選的。短語(yǔ)“單克隆抗體”的各種語(yǔ)法形式指僅具有一種能夠與特定抗原免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合部位的抗體。單克隆抗體因此一般顯示出對(duì)與之免疫反應(yīng)的任何抗原的單一結(jié)合親和性。因此，單克隆抗體可以包含具有多個(gè)抗體結(jié)合部位的抗體分子，每個(gè)抗體結(jié)合部位對(duì)不同抗原具免疫特異性；例如雙特異性(嵌合)單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)“佐劑”指增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的化合物或混合物。佐劑可以充當(dāng)組織儲(chǔ)庫(kù)以緩慢釋放抗原，也可以充當(dāng)淋巴系統(tǒng)激活物以非特異性地增強(qiáng)免疫應(yīng)答[Hood等人，在Immunology中，第384頁(yè)，第二片反，Benjamin/Cummings,MenloPark,California(1984)]。通常，在不存在佐劑的情況下，用抗原單獨(dú)進(jìn)行初次攻擊將無(wú)法引發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于，完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、多聚醇類(lèi)(pluronicpolyols)、多聚陰離子、肽、油或烴類(lèi)乳劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。優(yōu)選地，佐劑是藥學(xué)上可接受的。本領(lǐng)域已知的多種操作可以用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的多克隆抗體。對(duì)于抗體產(chǎn)生，可以通過(guò)用本發(fā)明多肽注射，免疫多種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以與免疫原性載體例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)綴合。依賴(lài)于宿主物種，可以使用多種佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、礦物凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、多聚醇類(lèi)、多聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。對(duì)于制備針對(duì)本發(fā)明多肽的單克隆抗體，可以使用通過(guò)培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)。這些包括但不限于最初由Kohler等人，(1975)Nature，256:495_497開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)、三源雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)[Kozbor等人，(1983)ImmunologyToday，4:72]、和EBV-雜交瘤技術(shù)以產(chǎn)生人單克隆抗體[Cole等人，(1985)inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,第77-96頁(yè)，AlanR.Liss,Inc.]。永生的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系可以通過(guò)除融合外的技術(shù)產(chǎn)生，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞、或用EB病毒轉(zhuǎn)染。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，341，761；4,399，121；4,427，783；4,444，887；4，451，570；4，466，917；4，472，500；4，491，632；和4，493，890。在本發(fā)明的一個(gè)另外實(shí)施方案中，單克隆抗體可以使用最近技術(shù)在無(wú)菌動(dòng)物中產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，可以使用雞或豬抗體，其可以通過(guò)使用雞或豬雜交瘤或通過(guò)用EBV病毒在體外轉(zhuǎn)化B細(xì)胞來(lái)獲得。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明，可以使用開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)[Morrison等人，(1984)J.Bacteriol.，159-870;Neuberger等人，(1984)Nature,312604-608；Takeda等人，(1985)Nature，314:452_454]，其中將來(lái)自對(duì)本發(fā)明多肽具有特異性的小鼠抗體分子的基因與來(lái)自具有合適生物活性的抗體分子的基因剪接在一起；此種抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此種嵌合抗體優(yōu)選用于治療腸道疾病或病癥(下文描述)，因?yàn)樵摽贵w自身比異種抗體有少得多的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的可能性，特別是變應(yīng)性反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，可以適應(yīng)性調(diào)整描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4，946，778)，來(lái)產(chǎn)生對(duì)于本發(fā)明多肽特異的單鏈抗體。本發(fā)明的一個(gè)另外實(shí)施方案利用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)[Huse等人，(1989)Science,2461275-1281]，以允許快速且容易地鑒定對(duì)于本發(fā)明多肽具有所需特異性的單克隆Fab片段。包含抗體分子的獨(dú)特型的抗體片段可以通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，此種片段包括但不限于可以通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab')2片段；可以通過(guò)還原F(ab')2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab'片段，和可以通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。在抗體生產(chǎn)中，就所需抗體的篩選可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成，例如放射性免疫測(cè)定法、ELISA、“夾心”免疫測(cè)定法、免疫放射計(jì)量測(cè)定法、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定法、原位免疫測(cè)定法(使用例如膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測(cè)定法(例如，凝膠凝集測(cè)定法、血凝集測(cè)定法)、補(bǔ)體固定測(cè)定法、免疫熒光測(cè)定法、蛋白質(zhì)A測(cè)定法、免疫電泳測(cè)定法等。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合通過(guò)檢測(cè)在一抗上的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一抗通過(guò)檢測(cè)二抗或試劑與一抗的結(jié)合來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，二抗是標(biāo)記的。用于免疫測(cè)定法中檢測(cè)結(jié)合的許多方法是本領(lǐng)域已知的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，為了選擇識(shí)別本發(fā)明多肽的特定表位的抗體，可以分析產(chǎn)生的雜交瘤，檢測(cè)與包含此種表位的本發(fā)明多肽的片段結(jié)合的產(chǎn)物。本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的多肽和/或與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體檢測(cè)豬痢疾短螺旋體的存在的診斷和預(yù)后方法，和用于豬痢疾短螺旋體感染的診斷和預(yù)后的試劑盒。診斷和預(yù)后方法一般使用得自動(dòng)物例如雞或豬的生物學(xué)樣品進(jìn)行?！皹悠贰敝笐岩砂搪菪w屬物種例如豬痢疾短螺旋體或其多核苷酸或其多肽的動(dòng)物組織或液體。此種組織或液體的例子包括但不限于血漿、血清、糞便材料、尿液、肺、心臟、骨骼肌、胃、腸和體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中本發(fā)明多肽的存在的方法，具有下述步驟(a)使懷疑包含本發(fā)明多肽的樣品與能夠特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體(優(yōu)選與固體載體結(jié)合)，在允許包含抗體和本發(fā)明多肽的反應(yīng)復(fù)合物形成的條件下接觸；和(b)檢測(cè)包含抗體和樣品中的本發(fā)明多肽的反應(yīng)復(fù)合物的形成，其中檢測(cè)到反應(yīng)復(fù)合物的形成將指示本發(fā)明多肽在樣品中的存在。優(yōu)選地，在這種方法中使用的抗體可以來(lái)自親和純化的多克隆抗體，且更優(yōu)選單克隆抗體。此外，優(yōu)選本文使用的抗體分子為Fab、Fab'、F(ab')2或F(ν)部分或完整抗體分子的形式?；谏鲜龇椒ㄓ糜跈z測(cè)豬痢疾短螺旋體的特別優(yōu)選方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、免疫放射計(jì)量測(cè)定法和免疫酶學(xué)測(cè)定法，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾心測(cè)定法。特別有用的3種此類(lèi)操作程序利用由可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的本發(fā)明多肽(或其片段)、由可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的Ab1抗體、或由可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的Ab2抗體。程序可以由下述公式概括，其中星號(hào)指示顆粒是標(biāo)記的，并且“ΑΑ”表示本發(fā)明的多肽A.AA*+Ab1=AA*Ab1B.AA+Ab*丄=AAAb1*C.AA+Ab1+Ab2*=Ab1AAAb2*這些程序及其應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的并且因此可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)利用?！案?jìng)爭(zhēng)性”程序，程序A，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，654，090和3，850，752中描述。程序B代表眾所周知的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法技術(shù)。程序C，“夾心”操作，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)RE31，006和4，016，043中描述。另外其他的程序也是已知的，例如“雙抗體”或“DASP”程序，并且可以使用。在每種情況下，本發(fā)明的多肽與一種或多種抗體或結(jié)合配偶體形成復(fù)合物，并且復(fù)合物的一個(gè)成員由可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。復(fù)合物已形成的事實(shí)以及，如果期望的話，其量可以通過(guò)可應(yīng)用于標(biāo)記檢測(cè)的已知方法進(jìn)行確定。由上文可見(jiàn)的，Ab2的特性是它將與Ab1反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)是因?yàn)樵谝环N哺乳動(dòng)物物種中產(chǎn)生的Ab1被用作抗原在另一個(gè)物種中產(chǎn)生抗體Ab2。例如，Ab2可以在山羊中使用兔抗體作為抗原產(chǎn)生。Ab2因此將是在山羊中產(chǎn)生的抗兔抗體。為了本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求的目的，Ab1將稱(chēng)為一抗，Ab2將稱(chēng)為二抗或抗Ab1抗體。最通常用于這些研究的標(biāo)記是放射性元素、酶、當(dāng)暴露于紫外線時(shí)發(fā)熒光的化學(xué)品及其他。能夠用作標(biāo)記的熒光材料的例子包括熒光素、羅丹明和金胺。一個(gè)特定的檢測(cè)材料是在山羊中制備的且通過(guò)異硫氰酸鹽與熒光素綴合的抗兔抗體。優(yōu)選同位素的例子包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59Fe、9°Y、125I、131I和186Re0放射性標(biāo)記可以通過(guò)目前可用的任何計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)。雖然可以使用許多酶，但優(yōu)選酶的例子是過(guò)氧化物酶、β_葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加上過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。酶可以通過(guò)與交接分子反應(yīng)而與選擇的顆粒綴合，所述交接分子例如碳化二亞胺、二異氰酸鹽、戊二醛等。酶標(biāo)記可以通過(guò)目前利用的比色法、分光光度法、熒光分光光度法、安培定量法或氣體定量技術(shù)中的任何技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于可選標(biāo)記材料和方法，作為例子，可以例如提及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，654，090；3，850，752；和4，016，043的公開(kāi)內(nèi)容。本發(fā)明還提供檢測(cè)生物樣品中本發(fā)明多肽的抗體的方法，使用下述步驟(a)提供本發(fā)明多肽或其片段；(b)在允許抗體-抗原復(fù)合物形成的條件下使生物樣品與所述本發(fā)明的多肽溫育；和(c)測(cè)定是否形成具有本發(fā)明多肽的抗體-抗原復(fù)合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于評(píng)估生物樣品中本發(fā)明多肽的抗體的水平的體外方法，使用下述步驟(a)根據(jù)上文所述方法檢測(cè)生物樣品中反應(yīng)復(fù)合物的形成；和(b)評(píng)估形成的反應(yīng)復(fù)合物的量，所述反應(yīng)復(fù)合物的量對(duì)應(yīng)于生物樣品中本發(fā)明多肽的水平。此外，提供了用于監(jiān)控動(dòng)物宿主中豬痢疾短螺旋體相關(guān)疾病的治療的體外方法，包括在不同時(shí)間點(diǎn)自歷經(jīng)此治療的動(dòng)物宿主獲得一系列生物樣品，在這些樣品中如上所述評(píng)估針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體的水平。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測(cè)生物樣品中豬痢疾短螺旋體的存在或不存在的方法，包括(a)在合適雜交條件下使生物樣品與本發(fā)明的多核苷酸探針或多核苷酸引物接觸；和(b)檢測(cè)在探針或引物和樣品中核酸之間形成的任何雙鏈體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)可以通過(guò)下述完成使用已知技術(shù)自生物樣品直接擴(kuò)增多核苷酸序列，并且隨后檢測(cè)具有本發(fā)明序列的多核苷酸的存在。在本發(fā)明的一個(gè)形式中，通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸序列，并且隨后使用上文提及的任何特異性方法進(jìn)行檢測(cè)?？梢杂糜跈z測(cè)多核苷酸序列存在的其他有用的診斷技術(shù)包括但不限于1)等位基因特異性PCR；2)單鏈構(gòu)象分析；3)變性梯度凝膠電泳；4)RNA酶保護(hù)測(cè)定法；5)識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的蛋白質(zhì)例如大腸桿菌mutS蛋白質(zhì)的使用；6)等位基因特異性寡核苷酸；和7)熒光原位雜交。除上述方法外，多核苷酸序列可以使用常規(guī)探針技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)探針用于檢測(cè)期望的多核苷酸序列的存在時(shí)，需要時(shí)，可以處理待分析的生物學(xué)樣品例如血液或血清以提取核酸。樣品多核苷酸序列可以以各種方法進(jìn)行制備，以利于靶序列的檢測(cè)；例如變性、限制性消化、電泳或斑點(diǎn)印跡。樣品多核苷酸序列的被靶向區(qū)域通常必須是至少部分單鏈的，以便與探針的靶向序列形成雜交體。如果序列是天然單鏈的，那么不需要變性。然而，如果序列是雙鏈的，那么序列可能將需要變性。變性可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進(jìn)行。樣品多核苷酸序列和探針在如下條件下溫育，所述條件將促進(jìn)探針中的靶序列與樣品中的推定期望多核苷酸序列形成穩(wěn)定的雜交體。優(yōu)選地，使用高嚴(yán)格條件以便阻止假陽(yáng)性。對(duì)所得到的雜交體的檢測(cè)，如果存在的話，通常通過(guò)使用標(biāo)記的探針來(lái)完成。備選地，探針可以是未標(biāo)記的，但可以通過(guò)與直接或間接標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)。合適的標(biāo)記物以及用于標(biāo)記探針和配體的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如可以通過(guò)已知方法(例如，切口平移、隨機(jī)引發(fā)或激酶化(kinasing))摻入的放射性標(biāo)記、生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(例如，二氧雜環(huán)丁烷類(lèi)化合物(dioxetanes)，特別是觸發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷類(lèi)化合物)、酶、抗體等。這個(gè)基本方案的變化形式是本領(lǐng)域已知的，包括促進(jìn)待檢測(cè)雜交體與外來(lái)物分離和/或自標(biāo)記的部分?jǐn)U增信號(hào)的那些變化形式。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還考慮，本發(fā)明的核酸探針測(cè)定法可以采用能夠檢測(cè)期望的本發(fā)明多核苷酸序列的核酸探針混合物(cocktail)。因此，在檢測(cè)細(xì)胞樣品中本發(fā)明多核苷酸序列的存在的一個(gè)例子中，采用與多核苷酸序列互補(bǔ)的一種以上探針，特別地不同探針的數(shù)目可選地是2、3或5種不同核酸探針序列。本文描述的多核苷酸序列(優(yōu)選探針形式)還可以固定于固相載體用于檢測(cè)短螺旋體屬物種，包括但不限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens,B.murdochii和毛腸短螺旋體。備選地，本文描述的多核苷酸序列可以構(gòu)成DNA分子文庫(kù)的一部分，所述DNA分子文庫(kù)可以用于同時(shí)檢測(cè)來(lái)自短螺旋體屬物種例如豬痢疾短螺旋體的許多不同基因。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步備選形式中，本文描述的多核苷酸序列連同其他多核苷酸序列(例如來(lái)自其他細(xì)菌或病毒)可以以此種方式固定在固體載體上，該方式允許鑒定短螺旋體屬物種例如豬痢疾短螺旋體的存在和/或結(jié)合在固體載體上的任何其他多核苷酸序列。用于產(chǎn)生固定的DNA分子文庫(kù)的技術(shù)已在本領(lǐng)域中得到描述。一般地，大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)方法描述了單鏈核酸分子文庫(kù)的合成，其中使用例如掩蔽技術(shù)以在固體基質(zhì)上的各個(gè)離散位點(diǎn)構(gòu)建序列的各種排列。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，837，832描述了基于非常大規(guī)模的整合技術(shù)產(chǎn)生固定在硅基質(zhì)上的DNA陣列的改良方法。特別地，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，837，832描述了稱(chēng)為“tiling”的策略，以在基質(zhì)上的空間限定位置處合成特定的探針組，所述策略可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的固定DNA文庫(kù)。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，837，832還提供了關(guān)于可以使用的較早技術(shù)的參考文獻(xiàn)。因此多核苷酸序列探針可以在基質(zhì)表面上原位合成。備選地，單鏈分子可以在固體基質(zhì)外合成，然后將每個(gè)預(yù)先形成的序列施加到固體基質(zhì)上的離散位置。例如，多核苷酸序列可以使用配備有針或Pizo電子裝置的機(jī)器人裝置直接印刷在基質(zhì)上。文庫(kù)序列一般被固定在固體基質(zhì)的離散區(qū)域上或中?；|(zhì)可以是多孔的以允許固定在基質(zhì)內(nèi)，或基本上無(wú)孔的，在這種情況下文庫(kù)序列一般固定在基質(zhì)表面上。固體基質(zhì)可以由多肽能與之直接或間接結(jié)合的任何材料制成。合適固體基質(zhì)的例子包括平玻璃、硅片、云母、陶瓷和有機(jī)聚合物例如塑料，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯。還可以使用半透性膜例如廣泛可得的硝酸纖維素或尼龍膜。可以將半透性膜裝在更堅(jiān)實(shí)的固體表面例如玻璃上。表面可以任選用金屬層包被，所述金屬例如金、鉬或其他過(guò)渡金屬。優(yōu)選地，固體基質(zhì)一般是具有剛性或半剛性表面的材料。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基質(zhì)的至少一個(gè)表面將是基本上平坦的，但在某些實(shí)施方案中，可能希望物理地將用于不同聚合物的合成區(qū)與例如凸起區(qū)域或蝕刻溝槽分開(kāi)。還優(yōu)選固體基質(zhì)適于在一般50至100μm的離散區(qū)域中施加高密度DNA序列，給出10000至40000個(gè)點(diǎn)/cnT2的密度。固體基質(zhì)可以方便地分區(qū)。這可以通過(guò)技術(shù)例如光蝕刻，或通過(guò)應(yīng)用疏水墨例如基于特氟龍的墨(Cel-line，USA)來(lái)達(dá)到。文庫(kù)的各不同成員所定位的不連續(xù)位置可以具有任何方便的形狀，例如環(huán)狀、矩形、橢圓形、楔形等。多核苷酸序列與基質(zhì)的附著可以是共價(jià)或非共價(jià)方式。多核苷酸序列可以經(jīng)由分子層與基質(zhì)附著，文庫(kù)序列與所述分子層結(jié)合。例如，多核苷酸序列可以用生物素進(jìn)行標(biāo)記，并且基質(zhì)用抗生物素蛋白和/或鏈霉親和素進(jìn)行包被。使用生物素化的多核苷酸序列的一個(gè)方便特征是可以容易地測(cè)定與固體基質(zhì)的偶聯(lián)效率。因?yàn)槎嗪塑账嵝蛄锌梢詢(xún)H與某些固體載體有弱結(jié)合，所以通常必須在固體基質(zhì)(例如，在玻璃的情況下)和核酸序列之間提供化學(xué)界面。合適化學(xué)界面的例子包括六甘醇。另一個(gè)例子是使用聚賴(lài)氨酸包被的玻璃，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)操作化學(xué)修飾該聚賴(lài)氨酸以引入親和配體。通過(guò)使用偶聯(lián)劑使分子與固體基質(zhì)表面附著的其他方法是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)例如，W098/49557?；パa(bǔ)多核苷酸序列與固定的核酸文庫(kù)的結(jié)合可以通過(guò)各種方法進(jìn)行測(cè)定，例如結(jié)合的多核苷酸序列的光學(xué)特性的改變(即，通過(guò)使用溴化乙啶)，或通過(guò)使用標(biāo)記的核酸例如用熒光團(tuán)標(biāo)記的多肽。不需要使用標(biāo)記的其他檢測(cè)技術(shù)包括光學(xué)技術(shù)例如光聲學(xué)、反射計(jì)、橢圓光度法和表面等離子體共振(參見(jiàn)W097/49989)。因此，本發(fā)明提供了在其上固定有至少一種本發(fā)明多核苷酸，優(yōu)選2種或更多種不同的本發(fā)明多核苷酸序列，的固體基質(zhì)。本發(fā)明還可以用作預(yù)防或治療劑，這可以用于刺激動(dòng)物例如雞和豬中的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，從而提供對(duì)抗短螺旋體屬物種建群的保護(hù)作用，所述短螺旋體屬物種包括但不限于豬痢疾短螺旋體、B.suanatina、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens,B.murdochii和毛腸短螺旋體。短螺旋體屬物種例如豬痢疾短螺旋體的天然感染將誘導(dǎo)針對(duì)本文描述的蛋白質(zhì)的循環(huán)抗體滴度。因此，本文描述的氨基酸序列或其部分具有構(gòu)成全身性或口服施用的預(yù)防或治療劑的基礎(chǔ)的潛力，以提供對(duì)抗腸道螺旋體病的保護(hù)作用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以治療有效量與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合的本文描述的氨基酸序列或其片段、或結(jié)合該氨基酸序列的抗體、或本發(fā)明描述的多核苷酸序列。短語(yǔ)“治療有效量”在本文中用于指這樣的量，其足以使動(dòng)物宿主在活動(dòng)、功能和應(yīng)答上的臨床顯著缺陷減少至少約15%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少90%、并且最優(yōu)選阻止所述缺陷。備選地，治療有效量足以在動(dòng)物宿主中引起臨床顯著病狀的改善。短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”指，分子實(shí)體和組合物是生理可耐受的，并且當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)，一般不引起變應(yīng)性反應(yīng)或類(lèi)似的不利反應(yīng)，例如胃部不適等。術(shù)語(yǔ)“載體”(carrier)指化合物與之一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此種藥學(xué)載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、蔬菜或合成來(lái)源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水或鹽水溶液和葡萄糖及甘油水溶液優(yōu)選用作載體，特別用于可注射溶液。合適的藥物載體在Martin,Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，MackPublishingCo.，Easton,PA,(1990)中描述。在本發(fā)明的一個(gè)更具體形式中，提供了藥物組合物，其包括治療有效量的本文描述的氨基酸序列或其類(lèi)似物、片段或衍生物或針對(duì)其的抗體，連同藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、溶解劑、乳化劑、佐劑和/或載體。該組合物可以包括具有各種緩沖劑含量(例如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑以及添加劑例如洗滌劑和增溶劑(例如，Tween80、Polysorbate80)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，硫柳汞、苯甲醇)和填充物質(zhì)(例如，乳糖、甘露糖醇)。材料可以摻入聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的顆粒制品或脂質(zhì)體內(nèi)。還可以使用透明質(zhì)酸(Hylauronicacid)。該組合物可以影響本發(fā)明蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。參見(jiàn)例如，通過(guò)弓I用合并入本文的Martin，Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版(1990，MackPublishingCo.,Easton,PA18042)第1435-1712頁(yè)。組合物可以以液體形式制備，或可以為干燥粉末例如凍干形式。備選地，本發(fā)明的多核苷酸可以就在植物(例如，玉米)中的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。植物可以用包含該優(yōu)化的多核苷酸的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。隨后，使植物生長(zhǎng)，并且在植物中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或表達(dá)該植物優(yōu)化版本。隨后收獲植物，可以將包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物部分加工成動(dòng)物的飼料。當(dāng)動(dòng)物食用時(shí)，這種動(dòng)物飼料將賦予針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫性。詳述這些方法的現(xiàn)有技術(shù)的例子可以在美國(guó)專(zhuān)利5，914，123(Arntzen，等人)；美國(guó)專(zhuān)利6，034，298(Lam,等人)；和美國(guó)專(zhuān)利6，136，320(Arntzen,等人)中發(fā)現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明提供的藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行施用。優(yōu)選地，用于施用的藥物組合物通過(guò)注射、口服、或通過(guò)肺或鼻途徑進(jìn)行施用。本文描述的氨基酸序列或由其衍生的抗體更優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下施用途徑進(jìn)行遞送。備選地，適當(dāng)配制的本文描述的氨基酸序列或由其衍生的抗體可以通過(guò)鼻或口服施用進(jìn)行施用。本發(fā)明還包括本發(fā)明多核苷酸序列、以及可與編碼本發(fā)明氨基酸序列的多核苷酸序列雜交的反義和核酶多核苷酸序列的用途，用于制造調(diào)節(jié)豬痢疾短螺旋體相關(guān)疾病的藥物。在治療方法中使用的編碼反義構(gòu)建體或核酶的多核苷酸序列可能期望以裸露核酸構(gòu)建體的形式直接施用?？梢酝ㄟ^(guò)幾種已知轉(zhuǎn)染技術(shù)，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞對(duì)裸露核酸構(gòu)建體的攝取，所述轉(zhuǎn)染技術(shù)例如包括使用轉(zhuǎn)染試劑。這些試劑的例子包括陽(yáng)離子試劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和lipofectants。一般地，核酸構(gòu)建體與轉(zhuǎn)染試劑混合以產(chǎn)生組合物。備選地，反義構(gòu)建體或核酶可以與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合，以產(chǎn)生藥物組合物。合適載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。組合物可以配制用于腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、口或經(jīng)皮施用。所述施用途徑僅旨在作為引導(dǎo)，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定用于任何具體動(dòng)物和病狀的最佳施用途徑和任何劑量。本發(fā)明還包括試劑盒，該試劑盒可以用于篩選懷疑受到短螺旋體屬物種例如豬痢疾短螺旋體感染的動(dòng)物、或證實(shí)動(dòng)物是否被短螺旋體屬物種例如豬痢疾短螺旋體感染。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，可以制備適于專(zhuān)家使用的試劑盒，以在疑似感染動(dòng)物中確定短螺旋體屬物種，包括但不限于豬痢疾短螺旋體、B.suanatina,B.intermedia,B.alvinipulli>B.aalborgi>B.innocens>B.murdochii禾口毛腸短il旋體，的存在或不存在，或定量測(cè)量短螺旋體屬物種，包括但不限于豬痢疾短螺旋體、B.suanatina,B.intermedia,B.alvinipulli.B.aalborgi和毛腸短螺旋體感染。依照上文討論的測(cè)試技術(shù)，此種試劑盒可以包含至少標(biāo)記形式的本文描述的氨基酸序列之一或其結(jié)合配偶體，例如特異性針對(duì)其的抗體，以及依據(jù)所選擇方法，例如“競(jìng)爭(zhēng)”、“夾心”、“DASP”等的說(shuō)明書(shū)。備選地，此種試劑盒可以包含至少與本文描述的多核苷酸序列之一的部分互補(bǔ)的多核苷酸序列以及其使用說(shuō)明書(shū)。試劑盒還可以包含外圍試劑例如緩沖劑、穩(wěn)定劑等。因此，用于證實(shí)短螺旋體屬物種，包括但不限于豬痢疾短螺旋體、B.suanatina,B.intermedia、B.alvinipulli>B.aalborgi>B.innocens、B.murdochii禾口毛腸短螺方寵體，的存在的試驗(yàn)試劑盒可以包含下述(a)預(yù)定量的至少一種標(biāo)記的免疫化學(xué)反應(yīng)性組分，其通過(guò)將本文描述的氨基酸序列之一或針對(duì)其的特異性結(jié)合配偶體與可檢測(cè)標(biāo)記直接或間接附著而獲得；(b)其他試劑；和(c)所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。更具體地，診斷試驗(yàn)試劑盒可以包含(a)已知量的如上所述本文氨基酸序列之一(或結(jié)合配偶體)，其一般與固相結(jié)合以形成免疫吸附劑，或備選地，與合適標(biāo)簽結(jié)合，或存在多種此類(lèi)終產(chǎn)物，等；(b)必要時(shí)，其他試劑；和(C)所述試驗(yàn)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)進(jìn)一步的變化形式中，試驗(yàn)試劑盒可以包含(a)通過(guò)使本文描述的氨基酸序列之一與可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)而獲得的標(biāo)記的組分；(b)一種或多種另外的免疫化學(xué)試劑，其中至少一種試劑是配體或固定化的配體，所述配體選自(i)能夠與標(biāo)記的組分(a)結(jié)合的配體；(ii)能夠與標(biāo)記的組分(a)的結(jié)合配偶體結(jié)合的配體；(iii)能夠與待測(cè)定的至少一種組分結(jié)合的配體；或(iv)能夠與待測(cè)定的至少一種組分的至少一種結(jié)合配偶體結(jié)合的配體；和(c)說(shuō)明書(shū)，用于說(shuō)明如何檢測(cè)和/或測(cè)定本文描述的氨基酸序列之一與其特異性結(jié)合配偶體之間的免疫化學(xué)反應(yīng)中的一種或多種組分?；蚪M文庫(kù)的制備使用豬痢疾短螺旋體的澳大利亞豬野外分離株(菌株WAl)制備基因組文庫(kù)。這種菌株已得到充分表征，并且在實(shí)驗(yàn)性攻擊豬后顯示是有毒力的。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法用于制備適于基因組DNA文庫(kù)制備的高質(zhì)量染色體DNA。豬痢疾短螺旋體在IOOml厭氧胰胨豆胨肉湯培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至IO9細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。在4，OOOxg進(jìn)行10分鐘收獲細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀重懸浮于9.5mlTE緩沖液中。加入SDS至0.5%(w/v)的終濃度，并且細(xì)胞在37°C用100μg蛋白酶K裂解1小時(shí)。加入NaCl至0.7M的終濃度，加入1.5mlCTAB/NaCl溶液(10%w/vCTAB，0.7麗aCl)后，溶液在65°C溫育20分鐘。用等體積氯仿/異戊醇提取裂解物，管在6，OOOxg離心10分鐘以相分離。將水相轉(zhuǎn)移至新鮮管，并且加入0.6體積的異丙醇以沉淀高分子量DNA。使用有鉤的玻璃棒收集沉淀的DNA，并且轉(zhuǎn)移至包含Iml70%(ν/ν)乙醇的管。管在10，OOOxg離心，將沉淀的DNA重溶解于4mlTE緩沖液中過(guò)夜。使用重溶解的DNA溶液制備包含1.05g/mlCsCl和0.5mg/ml溴化乙啶的氯化銫梯度。將梯度轉(zhuǎn)移至4ml可密封離心管，并且在70，OOOxg在15°C離心過(guò)夜。在紫外線下觀察分離的DNA，使用15-g針從梯度中取出高分子量DNA。通過(guò)用CsCl飽和的異丙醇順次提取，從DNA中去除溴化乙啶。純化的染色體DNA相對(duì)于2升TE緩沖液進(jìn)行透析，并且用異丙醇進(jìn)行沉淀。重懸浮的基因組DNA使用GeneMachinesHydroshear(GenomicSolutions,AnnArbor，MI)剪切，剪切的DNA使用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平以產(chǎn)生平末端片段。使用CloneSmartDNA連接酶，將IOOng平末端DNA片段與25ngpSMARTVC載體(Lucigen，Meddleton,WI)連接。隨后將連接DNA電穿孔到大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將小插入片段(2-3kb)文庫(kù)和中等插入片段(3-10kb)文庫(kù)構(gòu)建到低拷貝形式的pSMARTVC載體內(nèi)。基因組測(cè)序在獲得基因組文庫(kù)后，挑取包含pSMARTVC載體的大腸桿菌單克隆。純化且測(cè)序質(zhì)粒DNA。對(duì)純化的質(zhì)粒實(shí)施pSMARTVC載體的自動(dòng)化直接測(cè)序，使用對(duì)于pSMARTVC載體特異的正向和反向引物。每個(gè)測(cè)序反應(yīng)在10μ1體積中執(zhí)行，所述10μ1體積由200ng質(zhì)粒DNA、2pmol弓丨物禾Π4μ1ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReady反應(yīng)混合物(ΡΕAppliedBiosystems,FosterCity,CA)組成。循環(huán)條件涉及在96°C的2分鐘變性步驟，隨后為包括在96°C變性10秒和在60°C4分鐘合并引物復(fù)性和延伸的步驟的25個(gè)循環(huán)。通過(guò)用包含85mM乙酸鈉(pH5.2)、3mMEDTA(pH8)的95%(ν/ν)乙醇沉淀，從測(cè)序產(chǎn)物中去除殘留染料終止劑，真空干燥。質(zhì)粒使用每種引物一式兩份地進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序產(chǎn)物使用ABI373ΑDNASequencer(ΡΕAppliedBiosystems)進(jìn)行分析。腿使用一系列公眾域生物信息學(xué)工具，裝配和注釋豬痢疾短螺旋體的部分基因組序列，以分析和重分析這些序列，作為有關(guān)數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量保證程序的一部分。使用各種程序，包括GeneMark、GLIMMER、ORPHEUS、SELFID和GetORF，預(yù)測(cè)開(kāi)放讀碼框(ORFs)。使用搜索工具，包括BLAST和FASTA，檢查推定的ORFs與現(xiàn)有國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性(DNA和蛋白質(zhì))。使用程序，包括PSI-BLAST、FASTA,MOTIFS、FINDPATTERNS、PHD、SIGNALP和PS0RT，分析所有預(yù)測(cè)的ORFs，以確定其細(xì)胞定位。數(shù)據(jù)庫(kù)，包括Interpro、Prosite、ProDom、Pfam和Blocks，被用于預(yù)測(cè)表面相關(guān)蛋白質(zhì)，例如跨膜結(jié)構(gòu)域、前導(dǎo)肽、與已知表面蛋白質(zhì)的同源性、脂蛋白標(biāo)簽(signature)、外膜錨定基序和宿主細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域。用鑒定的基因和其他物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析和其他分子進(jìn)化分析，以幫助功能劃分(assignment)。對(duì)部分測(cè)序的基因組的insilico分析產(chǎn)生在目前獲得的序列數(shù)據(jù)中存在的所有預(yù)測(cè)ORFs的一個(gè)全面列表。就描述性信息，例如預(yù)測(cè)的分子量、等電點(diǎn)、疏水性和亞細(xì)胞定位，調(diào)查每個(gè)0RF，以便能夠與天然基因產(chǎn)物的體外性質(zhì)相關(guān)聯(lián)。選擇如下預(yù)測(cè)基因作為潛在的疫苗靶，所述預(yù)測(cè)基因編碼與其他致病細(xì)菌中的表面定位組分和/或毒力因子相似的蛋白質(zhì)。牛物信息學(xué)結(jié)果豬痢疾短螺旋體基因組的鳥(niǎo)槍法測(cè)序?qū)е?4.6%(預(yù)測(cè)的3200kb中的3028.6kb)基因組被測(cè)序。該豬痢疾短螺旋體序列包括具有10.3kb的平均重疊群大小的294個(gè)重疊群。對(duì)于豬痢疾短螺旋體，從該294個(gè)重疊群中預(yù)測(cè)了2，593個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORFs)。比較預(yù)測(cè)的ORFs與核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的基因，表明約70%的ORFs與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的基因具有同源性。其余30%的預(yù)測(cè)ORFs不具有已知同一性。疫苗候詵物為了幫助減少將作為疫苗候選物測(cè)試的ORFs的數(shù)目，選擇與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的外表面蛋白質(zhì)、分泌型蛋白質(zhì)和可能的毒力因子具有合理同源性(E值小于e_15)的ORF作為潛在的疫苗候選物。在基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序中獲得的2，593個(gè)ORFs中，許多通過(guò)了這個(gè)試驗(yàn)，但33種基因的結(jié)果在本文中呈現(xiàn)。表1顯示選擇作為潛在疫苗靶的33種基因及其與得自SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫(kù)的其他已知氨基酸序列的相似性?？梢宰⒁獾?，氨基酸同一性百分比不高過(guò)58%，而氨基酸相似性或同源性百分比仍小于71%，由此說(shuō)明這些ORFs是獨(dú)特的。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>NAV-H54的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs1禾口2中。NAV-H55的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs:3和4中。NAV-H56的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs5禾口6中。NAV-H57的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs:7禾口8中。NAV-H58的DNA禾口氨基酸序列分別在SEQIDNOs9和10中。NAV-H59的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs11禾口12中。NAV-H60的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs13禾口14中。NAV-H61的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs15和16中。NAV-H62的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs17禾口18中。NAV-H63的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs19禾口20中。NAV-H64的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs:21和22中。NAV-H65的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs23禾Π24中。NAV-H66的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs25禾口26中。NAV-H67的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs27禾口28中。NAV-H68的DNA禾口氨基酸序列分別在SEQIDNOs29和30中。NAV-H69的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs31禾口32中。NAV-H70的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs33禾口34中。NAV-H71的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs35和36中。NAV-H72的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs37禾口38中。NAV-H73的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs39禾口40中。NAV-H74的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs41禾口42中。NAV-H22的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs43禾口44中。NAV-H23的DNA禾口氨基酸序列分別在SEQIDNOs45和46中。NAV-H24的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs47禾口48中。NAV-H30的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs49禾口50中。NAV-H32的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs:51和52中。NAV-H33的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs53禾口54中。NAV-H37的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs55禾口56中。NAV-H40的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs57和58中。NAV-H41的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs59和60中。NAV-H43的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs61禾口62中。NAV-H44的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs:63禾口64中。NAV-H45的DNA和氨基酸序列分別在SEQIDNOs65和66中。為了進(jìn)一步減少將作為疫苗候選物測(cè)試的ORFs的數(shù)目，棄去在insilico分析中被預(yù)測(cè)定位在螺旋體的細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)膜中的基因產(chǎn)物。因此，進(jìn)一步分析表1中呈現(xiàn)的33種基因中的21種。這些包括NAV-H58、NAV-H60、NAV-H62、NAV-H64、NAV-H66、NAV-H67、NAV-H69、NAV-H71、NAV-H73、NAV-H22、NAV-H23、NAV-H24、NAV-H30、NAV-H32、NAV-H33、NAV-H37、NAV-H40、NAV-H41、NAV-H43、NAV-H44和NAV-H45。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析基因分布設(shè)計(jì)退火到靶基因編碼區(qū)的不同區(qū)域的一個(gè)或兩個(gè)引物對(duì)并且就PCR檢測(cè)進(jìn)行優(yōu)化。使用OligoExplorer1.2設(shè)計(jì)單個(gè)引物，選擇具有約55_60°C的計(jì)算解鏈溫度的引物組。這些引物組也被選擇用于產(chǎn)生超過(guò)200bp的PCR產(chǎn)物。選擇50°C的中等嚴(yán)格性引物退火溫度用于該分布分析PCR。中等嚴(yán)格性條件將允許在引物結(jié)合位點(diǎn)處有潛在的微小錯(cuò)配序列(因?yàn)橹晗挡町悓?dǎo)致)，而不影響引物結(jié)合。對(duì)23種豬痢疾短螺旋體菌株進(jìn)行該21種豬痢疾短螺旋體靶基因的分布分析，其中所述菌株包括已證實(shí)無(wú)毒的2種菌株。PCR分析使用TaqDNA聚合酶(BiotechInternational,Thurmont,MD)在25μ1總體積中進(jìn)行。擴(kuò)增混合物由IxPCR緩沖液(包含1.5mMMgC12)、lUTaqDNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)、0·5μM弓|物對(duì)、禾口1μ1純化的染色體模板DNA組成。循環(huán)條件涉及在94°C5分鐘的起始模板變性步驟，隨后為包括在94°C30秒變性、在50°C15秒退火和在68°C4分鐘引物延伸的35個(gè)循環(huán)。在(w/v)瓊脂糖凝膠中在IxTAE緩沖液(40mMTris-乙酸鹽、ImMEDTA)中對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)施電泳，用1μg/ml溴化乙啶溶液染色并且在UV光線下觀察。用于(21種基因中的)18種基因的引物在表2中給出。在這18種基因中，其中3種(NAV-H23、NAV-H41和NAV-H71)在試驗(yàn)的83%豬痢疾短螺旋體菌株中存在；其中3種(NAV-H24、NAV-H30和NAV-H73)在試驗(yàn)的87%菌株中存在，其中7種(NAV-H22、NAV-H32、NAV-H33、NAV-H37、NAV-H43、NAV-H64和NAV-H69)在試驗(yàn)的91%菌株中存在，并且其中3種(NAV-H40、NAV-H44和NAV-H45)在試驗(yàn)的100%菌株中存在。剩余3種基因在試驗(yàn)的少于80%豬痢疾短螺旋體菌株中存在。這些基因的弱分布使得它們作為疫苗亞單位較不有用。為此，已放棄對(duì)這些基因的進(jìn)一步分析。表2引物名稱(chēng)引物序列(5’-3’)NAV-H22H22-F4AAACGTTTATATTTTATTTTATC(SEQIDNO67)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>PTrcHis質(zhì)粒提取具有pTrcHis質(zhì)粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的大腸桿菌JM109克隆從甘油原種貯存物劃線培養(yǎng)到補(bǔ)充有100mg/l氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上，并且在37°C溫育16小時(shí)。單菌落用于接種補(bǔ)充有100mg/l氨芐青霉素的IOmlLB肉湯，并且使肉湯培養(yǎng)物在37°C伴隨振蕩溫育12小時(shí)。使整個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物在5，OOOxg離心10分鐘，并且使用QIApr印SpinMiniprepKit(Qiagen,DoncasterVIC)提取細(xì)胞中包含的質(zhì)粒。用250μ1細(xì)胞重懸浮緩沖液Pl將沉淀的細(xì)胞重懸，并且隨后通過(guò)添加250μ1細(xì)胞裂解緩沖液Ρ2裂解。裂解的細(xì)胞用350μ1中和緩沖液Ν3進(jìn)行中和，并且通過(guò)在20，OOOxg離心10分鐘使沉淀的細(xì)胞碎片形成團(tuán)塊。將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)柱，并且在10，OOOxg離心1分鐘。在棄去流出物后，將500μ1洗滌緩沖液PE施加于柱，并且如前離心。棄去流出物，并且通過(guò)在20，OOOxg離心3分鐘使柱干燥。用100μ1洗脫緩沖液EB從柱中洗脫質(zhì)粒DNA。使用DynaquantDNA熒光計(jì)(Hoefer，SanFrancisco,CA)定量純化的質(zhì)粒，并且通過(guò)用TE緩沖液稀釋將DNA濃度調(diào)整至100μg/ml。純化的pTrcHis質(zhì)粒貯存于_20°C。載體制備2μg純化的pTrcHis質(zhì)粒在37°C在50μ1總體積中消化1-4小時(shí)，所述50μ1總體積包含在IOOmMTris-HCKpH7.5)、50mMNaClUOmMMgC12UmMDTT禾口100μg/mlBSA中的5U2種限制性酶。使用的具體限制性酶對(duì)依賴(lài)于引物序列和ORF序列；目的是使用不切割ORFs的引物。通過(guò)Iyl消化反應(yīng)物在(w/v)瓊脂糖凝膠中在IXTAE緩沖液中在90V電泳1小時(shí)，驗(yàn)證限制性消化的載體。用1μg/ml溴化乙啶染色電泳的DNA，并且在紫外(UV)線下觀察。使用UltraCleanPCRClean-upKit(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)純化線性化pTrcHis載體。簡(jiǎn)言之，使限制性反應(yīng)物(50μ1)%250μ1SpinBind緩沖液Bl混合，并且將整個(gè)體積加入旋轉(zhuǎn)柱中。在8，OOOxg離心1分鐘，棄去流出物，并且將300μ1SpinClean緩沖液Β2加入柱中。柱如前離心，棄去流出物，柱以20，OOOxg干燥3分鐘。用50μ1TE緩沖液從柱中洗脫純化的載體。使用熒光計(jì)定量純化的線性載體，并且通過(guò)用TE緩沖液稀釋將DNA濃度調(diào)整至50μg/ml。純化的限制性消化質(zhì)粒貯存于_20°C。用于插入片段制備的引物設(shè)計(jì)使用基因組DNA作為起始點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物對(duì)以擴(kuò)增盡可能多的靶基因編碼區(qū)。所有引物序列包括末端限制性酶位點(diǎn)，以使得所得到的擴(kuò)增子能夠以粘性末端連接到線性化的pTrcHis載體內(nèi)。使用Amplify1.2(UniversityofWisconsin,Madison,WI)檢查引物，將理論擴(kuò)增子序列插入在PTrcHis載體序列中的合適位置內(nèi)。使用VectorNTIversion6(InforMax)執(zhí)行嵌合pTrcHis表達(dá)盒的推導(dǎo)翻譯，以證實(shí)基因插入片段在正確讀碼框中。表3還提供了基因大小、蛋白質(zhì)大小、天然蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)道爾頓分子量和蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)pi。注意，重組蛋白質(zhì)的組氨酸-融合物在天然蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)分子量上增加約4kDa。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>基因插入片段的擴(kuò)增使用基因組DNA，使用TaqDNA聚合酶(BiotechInternational)和PfuDNA聚合酶(Promega，Madison,WI)在100μ1總體積中通過(guò)PCR擴(kuò)增所有靶基因插入片段。擴(kuò)增混合物由IxPCR緩沖液(包含1.5mMMgC12)、1UTaqDNA聚合酶、0.OlUPfuDNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(AmershamPharmaciaBiotech)、0·5μM合適引物對(duì)、和1μ1純化染色體DNA組成。染色體DNA從用于基因組測(cè)序的相同豬痢疾短螺旋體菌株制備。循環(huán)條件涉及在94°C5分鐘的起始模板變性步驟，隨后為在94°C30秒變性、在50°C15秒退火和在68°C4分鐘引物延伸的35個(gè)循環(huán)。在(w/v)瓊脂糖凝膠中在IxTAE緩沖液中對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)施電泳，用1μg/ml溴化乙啶溶液染色并且在UV線下觀察。在驗(yàn)證正確大小PCR產(chǎn)物的存在后，使用UltraCleanPCRClean-upKit(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA)純化PCR反應(yīng)物。使PCR反應(yīng)物(100μ1)與500μ1SpinBind緩沖液Bl混合，并且將整個(gè)體積加入旋轉(zhuǎn)柱中。在8，OOOxg離心1分鐘，棄去流出物，并且將300μ1SpinClean緩沖液Β2加入柱中。柱如前離心，棄去流出物，之后在20，OOOxg下3分鐘干燥柱。用100μ1TE緩沖液從柱中洗脫純化的載體?；虿迦肫蔚南拗萍赶?0μ1純化的PCR產(chǎn)物在50μ1總體積中用每種限制性酶各IU進(jìn)行消化，所述限制性酶與由克隆寡核苷酸引物確定的末端限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相容。限制性反應(yīng)由IOOmMTris-HCKpH7.5)、50mMNaClUOmMMgC12、lmMDTT和100μg/mlBSA與IU每種限制性酶在37°C1-4小時(shí)組成。使用UltraCleanPCRClean-upKi(參見(jiàn)上文)純化消化的插入片段DNA。使用熒光計(jì)定量純化的消化插入片段DNA，并且通過(guò)用TE緩沖液稀釋將DNA濃度調(diào)整至20μg/ml。純化的限制性插入片段DNA立即用于載體連接。基因插入片段連接到DTrcHis載體內(nèi)連接反應(yīng)都在20μ1總體積中執(zhí)行。在包含IUΤ4DNA連接酶(Promega)的30mMTris-HCKpH7.8)UOmMMgC12、10mMDTT禾口ImMATP中，使IOOng線性化pTrcHis與20ng限制性插入片段在16°C溫育16小時(shí)。也包括不包含插入片段DNA的相同連接反應(yīng)作為載體重新環(huán)化的陰性對(duì)照。合適限制性酶用于各反應(yīng)。pTrcHis連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)感受態(tài)大腸桿菌JM109(Promega)細(xì)胞從_80°C解凍，貯存于冰上，并且隨后將50μ1細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包含5μ1過(guò)夜連接反應(yīng)物(等價(jià)于25ngpTrcHiS載體)的冰冷1.5ml離心管內(nèi)。通過(guò)在工作臺(tái)上輕輕敲擊每個(gè)管的底部使管混合，在冰上留置30分鐘。隨后通過(guò)將管放置到42°C水浴內(nèi)45秒，使細(xì)胞熱休克，之后將管送回冰上2分鐘。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在ImlLB肉湯中在37°C伴隨輕輕混合下復(fù)蘇1小時(shí)。復(fù)蘇的細(xì)胞在2，500xg5分鐘進(jìn)行收獲，將細(xì)胞重懸浮于50μ1新鮮LB肉湯中。使用無(wú)菌玻璃棒，將完整50μ1重懸浮細(xì)胞均勻鋪展到包含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。使平板在37°C溫育16小時(shí)。通過(guò)PCR在大腸桿菌中檢測(cè)重組pTrcHis構(gòu)建體在包含100mg/l氨芐青霉素的新鮮LB瓊脂平板上劃線每個(gè)構(gòu)建體的12個(gè)轉(zhuǎn)化單菌落，并且在37°C溫育16小時(shí)。將來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化事件的單菌落重懸浮于50μ1TE緩沖液中，并且煮沸1分鐘。2μ1煮沸細(xì)胞用作模板用于PCR。擴(kuò)增混合物由IxPCR緩沖液(包含1.5mMMgC12)、lUTaqDNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(AmershamPharmaciaBiotech)、0·5μMpTrcHis-F引物(5'-CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3‘SEQIDNO107)和0.5μMpTrcHis-R引物(5'-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3‘SEQIDNO:108)組成。循環(huán)條件涉及在94°C5分鐘的起始模板變性步驟，隨后為在94°C30秒變性、在60°C15秒退火和在720C1分鐘引物延伸的35個(gè)循環(huán)。在(w/v)瓊脂糖凝膠中在IxTAE緩沖液中對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)施電泳，用1μg/ml溴化乙啶溶液染色并且在UV線下觀察。不同插入片段克隆到pTrcHis表達(dá)載體內(nèi)產(chǎn)生不同大小的重組構(gòu)建體。重組His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的試驗(yàn)表達(dá)將大腸桿菌JM109中重組pTrcHis構(gòu)建體的5至10個(gè)分離的菌落接種到5ml管中的包含100mg/l氨芐青霉素和ImMIPTG的3mlLB肉湯內(nèi)，并且在37°C伴隨振蕩溫育16小時(shí)。通過(guò)在5，OOOxg在4°C離心10分鐘收獲細(xì)胞。棄去上清液，用IOylNi-NTA變性裂解緩沖液(IOOmMNaH2PO4UOmMTris-HCl，8Μ尿素，ρΗ8.0)重懸浮每個(gè)沉淀。在管渦旋1分鐘后，通過(guò)在10，OOOxg在4°C離心10分鐘，沉淀細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新管并且貯存于-20°C直至分析。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)使用不連續(xù)Tris-甘氨酸緩沖液體系，執(zhí)行蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。30μ1蛋白質(zhì)樣品與10μ14χ樣品處理緩沖液(250mMTris-HCl(pH6.0),8%(w/v)SDS、200mMDTT,40%(ν/ν)甘油和0.04%(w/v)溴酚藍(lán))混合。樣品煮沸5分鐘后立即將10μ1樣品裝載到凝膠孔。凝膠包括濃縮膠(125mMTris-HClpH6.8、4%w/v丙烯酰胺、0.15%w/v雙丙烯酰胺和0.1%w/vSDS)和分離膠(375mMTris-HClph8.8、12%w/v丙烯酰胺、0.31%w/v雙丙烯酰胺和0.1%w/vSDS)。這些凝膠通過(guò)添加0.1%(v/v)TEMED和0.05%(w/ν)新鮮制備的硫酸銨溶液進(jìn)行聚合，并且倒入mini-Proteandualslabcell(Bio-Rad,Hercules,California)。樣品在150V室溫(RT)跑膠，直至溴酚藍(lán)染料達(dá)到凝膠底部。預(yù)染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)與樣品平行進(jìn)行電泳，以便允許分子量估計(jì)。在電泳后，凝膠立即使用考馬斯亮藍(lán)G250(Bio-Rad)進(jìn)行染色，或?qū)嵤╇娹D(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上用于蛋白質(zhì)印跡。蛋白質(zhì)印跡分析分離的蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠到硝酸纖維素膜的電轉(zhuǎn)移使用Towbin轉(zhuǎn)移緩沖液體系來(lái)進(jìn)行。電泳后，凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mMTris、192mM甘氨酸、20%ν/ν甲醇，pH8.3)中平衡15分鐘。使用mini-Proteantransblot儀器(Bio-Rad)在30V在4°C，將凝膠中的蛋白質(zhì)過(guò)夜電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Protran,SchleicherandSchuellBioscience,Inc.，Keene，NH)。包含分離蛋白質(zhì)的新鮮轉(zhuǎn)移的硝酸纖維素膜用包含5%(w/v)脫脂奶粉的IOmltris-緩沖鹽水(TBS)在室溫封閉1小時(shí)。膜用包含0.1%(v/v)Tween20的TBS(TBST)洗滌，并且隨后與IOmL小鼠抗his抗體(用TBST稀釋5，000倍)在室溫溫育1小時(shí)。在用TBST洗滌5分鐘3次后，使膜與在TBST中稀釋5，000倍的IOmL山羊抗小鼠IgG(完整分子)-AP在RT溫育1小時(shí)。膜使用AlkalinePhosphataseSubstrateKit(Bio-Rad)進(jìn)行顯色。顯色反應(yīng)通過(guò)用蒸餾水洗滌膜而終止。隨后干燥和掃描膜用于呈現(xiàn)。通過(guò)肓接序列分析驗(yàn)證重組PTrcHis構(gòu)建體的讀碼框?qū)a(chǎn)生正確大小PCR產(chǎn)物的每個(gè)構(gòu)建體的2個(gè)轉(zhuǎn)化體克隆接種到包含100mg/l氨芐青霉素的10mlLB肉湯內(nèi)，并且在37°C伴隨振蕩溫育12小時(shí)。整個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物在5，OOOxg離心10分鐘，并且如前所述使用QIApr印SpinMiniprepKit提取細(xì)胞中包含的質(zhì)粒。純化的質(zhì)粒使用熒光計(jì)進(jìn)行定量。使用PTrcHis-F和pTrcHis-R引物對(duì)兩個(gè)純化的質(zhì)粒均實(shí)施PTrcHis表達(dá)盒的自動(dòng)化直接測(cè)序。每個(gè)測(cè)序反應(yīng)在10μ1體積中執(zhí)行，所述10μ1體積由200ng質(zhì)粒DNA、2pmol引物和4μ1ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionMix(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)砠@。牛96°C2分鐘的變性步驟，隨后為包括在96°C變性10秒、和在60°C4分鐘組合地進(jìn)行引物退火和延伸步驟的25個(gè)循環(huán)。通過(guò)用包含85mM乙酸鈉(pH5.2)、3mMEDTA(pH8)的95%(ν/ν)乙醇沉淀，從測(cè)序產(chǎn)物中去除殘留染料終止劑，并且進(jìn)行真空干燥。質(zhì)粒使用每種引物一式兩份地進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序產(chǎn)物使用ABI373ΑDNASequencer(ΡΕAppliedBiosystems)進(jìn)行分析。執(zhí)行PTrcHis的核苷酸測(cè)序，以驗(yàn)證每個(gè)構(gòu)建體中的表達(dá)盒是否處于正確讀碼框中。重組His標(biāo)簽蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化用大腸桿菌JM109中重組pTrcHis構(gòu)建體的單菌落接種250ml錐形瓶中的包含100mg/l氨芐青霉素的50mlLB肉湯，37°C伴隨振蕩溫育16小時(shí)。用IOml過(guò)夜培養(yǎng)物接種包含補(bǔ)充有100mg/l氨芐青霉素的IlLB肉湯的21錐形瓶，37°C溫育直至細(xì)胞在600nm的光密度是ο.5(約3-4小時(shí))。培養(yǎng)物隨后通過(guò)加入IPTG至ImM的終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，將細(xì)胞返回37°C同時(shí)振蕩。誘導(dǎo)5小時(shí)后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至250ml離心瓶，瓶在5，OOOxg在4°C離心20分鐘。棄去上清液，并且用8mlNi-NTA變性裂解緩沖液(IOOmMNaH2P04、10mMTris-HCl、8M尿素，pH8.0)重懸浮每個(gè)沉淀。重懸浮細(xì)胞貯存于-20°C過(guò)夜。從-20°C貯存物取出細(xì)胞懸浮液并且在冰上融解。細(xì)胞裂解物隨后在冰上超聲處理3次共30秒，其中在兩次超聲處理之間在冰上溫育1分鐘。通過(guò)在20，OOOxg在4°C離心10分鐘，清除裂解的細(xì)胞，上清液轉(zhuǎn)移至包含0.5ml柱床體積Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂(Qiagen)的15ml柱中。反復(fù)顛倒混合，使重組帶His6標(biāo)簽的蛋白質(zhì)與樹(shù)脂在4°C結(jié)合1小時(shí)。隨后用30mlNi-NTA變性洗滌緩沖液(IOOmMNaH2P04、10mMTris-HCl、8M尿素，pH6.3)洗滌樹(shù)月旨，之后用12mlNi-NTA變性洗脫緩沖液(100mMNaH2P04、IOmMTris-HCl、8M尿素，pH4.5)洗脫。收集4個(gè)3ml洗脫物級(jí)分，貯存于4°C。每個(gè)洗脫物各30μ1用10μ14χ樣品處理緩沖液處理，并且煮沸5分鐘。對(duì)樣品實(shí)施SDS-PAGE，并且用考馬斯亮藍(lán)G250(Bio-Rad)染色。染色的凝膠在蒸餾水中平衡1小時(shí)，并且在2片纖維素之間在RT過(guò)夜干燥。以中等規(guī)模進(jìn)行所選擇的重組大腸桿菌克隆的表達(dá)，以產(chǎn)生足夠的重組蛋白質(zhì)用于小鼠的疫苗接種(參見(jiàn)下文)。純化的重組His標(biāo)簽蛋白質(zhì)的誘析和凍干將洗脫的蛋白質(zhì)合并，并且轉(zhuǎn)移到具有3，500Da分子量截?cái)嘀?MWCO)的水合透析管(SpectrumLaboratories,Inc.，LosAngeles,CA)內(nèi)。取200μ1等分試樣的合并洗脫物，并且使用商業(yè)ProteinAssay(Bio-Rad)進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)針對(duì)21蒸餾水在4°C伴隨攪拌進(jìn)行透析。透析緩沖液以12小時(shí)間隔更換8次。透析后的蛋白質(zhì)從透析管轉(zhuǎn)移到50ml離心管(40ml最大體積)內(nèi)，并且將管置于_80°C過(guò)夜。將管放置到MAXI冷凍干燥器(Heto-Holten,Allerod,Denmark)內(nèi)且凍干至干燥。凍干的蛋白質(zhì)隨后用PBS再水合至2mg/ml的計(jì)算濃度，并且貯存于_20°C。透析和凍干后，成功產(chǎn)生穩(wěn)定的重組抗原。18種基因中的8種成功地克隆到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)，并且從這些克隆能夠穩(wěn)定地表達(dá)重組蛋白質(zhì)。使用純化的重組蛋白質(zhì)講行血清學(xué)分析將20μg純化的重組蛋白質(zhì)加到7cmIEF孔內(nèi)，通過(guò)10%(w/v)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，并且電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。膜用TBS脫脂乳(5%w/v)封閉，并且組裝到Multi-screen儀器(Bio-Rad)內(nèi)。孔用100μ1稀釋的豬血清(100倍)在室溫溫育1小時(shí)。豬血清得自高健康狀態(tài)的豬(η=3)、顯示臨床SD的實(shí)驗(yàn)性攻擊的豬(η=5)、自然感染的血清轉(zhuǎn)化的豬(η=5)、和從自然感染恢復(fù)的豬(η=4)。隨后從儀器中取出膜，用TBST(0.1%ν/ν)洗滌3次，與IOml山羊抗豬IgG(完整分子)-AP(5，000倍)在RT溫育1小時(shí)。用TBST洗膜3次，之后使用AlkalinePhosphataseSubstrateKit(Bio-Rad)顯色。當(dāng)顯色已足夠后，用自來(lái)水洗滌膜，干燥且掃描用于呈現(xiàn)。得自不同健康狀態(tài)動(dòng)物的豬血清的反應(yīng)性顯示于下表中。所有蛋白質(zhì)被100%的該組血清所識(shí)別，由此說(shuō)明這些基因在體內(nèi)表達(dá)，并且在暴露于螺旋體后，它們能夠誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答。表4.8個(gè)成功表達(dá)的豬痢疾短螺旋體疫苗候選物的基因分布和血清學(xué)反應(yīng)性。使用一組23種不同菌株通過(guò)PCR分析基因分布。使用來(lái)自5個(gè)不同疾病分類(lèi)的19個(gè)血清樣品執(zhí)行血清學(xué)分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>使用純化的重組his標(biāo)簽蛋白質(zhì)接種小鼠對(duì)于每一種純化的重組his標(biāo)簽蛋白質(zhì)，使用10只小鼠進(jìn)行全身性和口服免疫，以測(cè)定重組蛋白質(zhì)是否具有免疫原性。重組蛋白質(zhì)用30%(ν/ν)油包水佐劑乳化，肌內(nèi)注射到10只小鼠(Balb/cJ:5周齡，雄性)的股四頭肌內(nèi)。所有小鼠接受在100μ1總體積中的IOOyg蛋白質(zhì)。第一次疫苗接種后3周，所有小鼠接受與第一次疫苗接種相同的第二次肌內(nèi)疫苗接種。在第二次疫苗接種后2周處死所有小鼠。自死后的心臟獲得血清，并且在蛋白質(zhì)印跡分析中檢測(cè)針對(duì)豬痢疾短螺旋體的細(xì)胞提取物的抗體。蛋白質(zhì)印跡分析將20μg純化的重組蛋白質(zhì)加到7cmIEF孔內(nèi)，通過(guò)10%(w/v)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，并且電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用TBS脫脂乳(5%w/v)封閉膜，組裝到Multi-Screen儀器(Bio-Rad)內(nèi)?？子?00μ1稀釋的小鼠血清(100倍)在室溫溫育1小時(shí)。隨后從儀器中取出膜，用TBST(0.ν/ν)洗滌3次，之后與IOml山羊抗小鼠IgG(完整分子)-AP(5，000倍)在RT溫育1小時(shí)。用TBST洗滌膜3次，使用AlkalinePhosphataseSubstrateKit(Bio-Rad)顯色。當(dāng)顯色已足夠時(shí)，用自來(lái)水洗滌膜，干燥且掃描用于呈現(xiàn)。蛋白質(zhì)印跡分析顯示在疫苗接種后小鼠中針對(duì)重組疫苗抗原具有顯著增加的抗體反應(yīng)性。所有小鼠都識(shí)別與考馬斯藍(lán)染色的純化重組蛋白質(zhì)具有相似分子量的重組蛋白質(zhì)。這些實(shí)驗(yàn)提供了證據(jù)證實(shí)，當(dāng)用于給小鼠疫苗接種時(shí)這些重組蛋白質(zhì)是免疫原性的，并且采用的疫苗接種方案可以誘導(dǎo)針對(duì)該抗原的特異性循環(huán)抗體滴度。結(jié)果表明，這些重組蛋白質(zhì)可以用于有效疫苗中用于動(dòng)物物種抵抗豬痢疾短螺旋體的建群。使用純化的重組his標(biāo)簽蛋白質(zhì)接種豬對(duì)于每一種純化的重組his標(biāo)簽蛋白質(zhì)，用在Iml疫苗體積中的Img具體抗原肌內(nèi)注射10只血清陰性的豬?？乖玫润w積油包水佐劑乳化。豬在3周齡時(shí)和再在6周齡時(shí)進(jìn)行疫苗接種。具有10只血清陰性豬的第二個(gè)組用作陰性對(duì)照，并且不接種疫苗。所有豬在8周齡時(shí)用IOOml活躍豬痢疾短螺旋體培養(yǎng)物(IO9細(xì)胞/ml)進(jìn)行攻擊，并且在實(shí)驗(yàn)(直至攻擊后6周)過(guò)程中和在死亡后檢查時(shí)就豬痢疾的臨床體征觀察豬。診斷試劑念血清得自已知感染豬痢疾短螺旋體的豬舍中的豬、已知尚未被豬痢疾短螺旋體感染的豬、和未知豬痢疾短螺旋體感染的豬舍中的豬。將20μg純化的重組蛋白質(zhì)加到7cmIEF孔內(nèi)，通過(guò)10%(w/v)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，并且電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。膜用TBS脫脂乳(5%w/v)封閉，并且裝配到Multi-Screen儀器(Bio-Rad)內(nèi)?？子?00μ1稀釋的豬血清(100倍)在室溫溫育1小時(shí)。隨后從儀器中取出膜，用TBST(0.1%ν/ν)洗滌3次，之后與IOml山羊抗豬IgG(完整分子)-AP(5，000倍)在RT溫育1小時(shí)。用TBST洗膜3次，之后使用AlkalinePhosphataseSubstrateKit(Bio-Rad)顯色。當(dāng)顯色已足夠時(shí)，用自來(lái)水洗滌膜，干燥且掃描用于呈現(xiàn)。通過(guò)將結(jié)果與陽(yáng)性和陰性對(duì)照比較，可以確定豬是否被豬痢疾短螺旋體感染。盡管本發(fā)明已就具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)是的，可以使用這些方法和組合物的變化形式，并且預(yù)期本發(fā)明可以用如本文具體描述之外的其他方式進(jìn)行實(shí)踐。因此，本發(fā)明包括涵蓋在權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有修飾形式。權(quán)利要求多核苷酸，其包括選自SEQIDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的序列。2.質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸。3.權(quán)利要求2的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒是表達(dá)載體。4.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求2的質(zhì)粒。5.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求3的質(zhì)粒。6.免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求3的質(zhì)粒。7.用于治療或預(yù)防豬痢疾短螺旋體的疫苗組合物，其包括權(quán)利要求3的表達(dá)載體。8.用于治療或預(yù)防豬痢疾短螺旋體的疫苗組合物，其包括權(quán)利要求4的細(xì)胞。9.DNA分子，其包括與權(quán)利要求1的多核苷酸具有至少70%同一性的序列。10.質(zhì)粒，其包括權(quán)利要求9的多核苷酸。11.權(quán)利要求9的DNA分子，其中所述DNA分子與權(quán)利要求1的多核苷酸具有至少80%同一性。12.質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求11的多核苷酸。13.權(quán)利要求9的DNA分子，其中所述DNA分子與權(quán)利要求1的多核苷酸具有至少90%同一性。14.質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求13的多核苷酸。15.多肽，其包括選自SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66的序列。16.多核苷酸，其包括編碼權(quán)利要求15的多肽的序列。17.質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求16的多核苷酸。18.權(quán)利要求17的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒是表達(dá)載體。19.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求17的質(zhì)粒。20.免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求19的細(xì)胞。21.蛋白質(zhì)，其包括與權(quán)利要求15的多肽具有至少70%同源性的序列。22.權(quán)利要求21的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與權(quán)利要求15的多肽具有至少80%同源性。23.權(quán)利要求22的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與權(quán)利要求15的多肽具有至少90%同源性。24.免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求23的蛋白質(zhì)。25.免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求15的多肽。26.用于治療或預(yù)防豬痢疾短螺旋體的疫苗組合物，其包括權(quán)利要求15的多肽。27.單克隆抗體，其與權(quán)利要求15的多肽結(jié)合。28.用于診斷動(dòng)物中豬痢疾短螺旋體的存在的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求27的單克隆抗體。29.用于診斷動(dòng)物中豬痢疾短螺旋體的存在的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求15的多肽。30.用于診斷動(dòng)物中豬痢疾短螺旋體的存在的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1的多核苷酸。31.在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求24的免疫原性組合物。32.在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求25的免疫原性組合物。33.在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求6的免疫原性組合物。34.在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求20的免疫原性組合物。35.治療或預(yù)防在需要所述處理的動(dòng)物中由豬痢疾短螺旋體引起的疾病的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求7的疫苗組合物。36.治療或預(yù)防在需要所述處理的動(dòng)物中由豬痢疾短螺旋體引起的疾病的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求8的疫苗組合物。37.治療或預(yù)防在需要所述處理的動(dòng)物中由豬痢疾短螺旋體引起的疾病的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求26的疫苗組合物。38.權(quán)利要求23的蛋白質(zhì)在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。39.權(quán)利要求15的蛋白質(zhì)在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。40.權(quán)利要求3的質(zhì)粒在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。41.權(quán)利要求19的細(xì)胞在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)豬痢疾短螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。42.權(quán)利要求3的表達(dá)載體在制備用于治療或預(yù)防在需要所述處理的動(dòng)物中由豬痢疾短螺旋體弓I起的疾病的藥物中的用途。43.權(quán)利要求4的細(xì)胞在制備用于治療或預(yù)防在需要所述處理的動(dòng)物中由豬痢疾短螺旋體引起的疾病的藥物中的用途。44.權(quán)利要求15的多肽在制備用于治療或預(yù)防在需要所述處理的動(dòng)物中由豬痢疾短螺旋體弓丨起的疾病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明描述了新的豬痢疾短螺旋體的多核苷酸和氨基酸。這些序列可以用于診斷動(dòng)物中的豬痢疾短螺旋體疾病，和在動(dòng)物中治療或預(yù)防豬痢疾短螺旋體疾病。這些序列還可以用于診斷以及治療和/或預(yù)防動(dòng)物中由其他短螺旋體屬物種，包括B.intermedia、B.suanatina、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛腸短螺旋體，引起的疾病。文檔編號(hào)A61K39/40GK101821284SQ200780100937公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2007年8月3日優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日發(fā)明者D·J·漢普森,M·貝爾伽德,T·拉申請(qǐng)人:斯拜爾基因私人有限公司