專利名稱：：用cd1d配體進行免疫的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗組合物和利用疫苗組合物的免疫方法的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：第一次給予含有病原體抗原的疫苗組合物能誘導活化細胞和記憶細胞對該抗原發(fā)生初次應答。再次接觸抗原(如接觸該病原體)則能誘導記憶細胞擴增和比初次應答更快和更強的再次應答，保護機體抵抗該病原體。雖然在初次接觸該病原體后記憶細胞可持續(xù)存在數(shù)月或數(shù)年，但通常需要提供加強劑量的抗原來保證維持長期免疫記憶。因此，疫苗接種方案常常包括數(shù)次初免注射以提供初始記憶細胞庫，以及后續(xù)間隔時間遞增的加強注射以維持免疫記憶。數(shù)次初免注射的需求和加強注射所需頻率取決于疫苗和接受者年齡。能夠在免疫記憶維持不減退的情況下減少初免劑量的次數(shù)以及加強劑量的頻率和次數(shù)是有利的。理想的是，優(yōu)選完全消除對額外初免劑量和加強劑量的需求，只通過一次劑量給予疫苗。因此，本發(fā)明目的是提供在不給予加強劑量和/或沒有多次初免劑量(primingdose)的情況下誘導長期免疫記憶的免疫原性組合物。本發(fā)明的另--個目的是提供含有流感病毒、B型鏈球菌和腦膜炎球菌B血清組的抗原的免疫原性組合物。
發(fā)明內(nèi)容疫苗常常包含能刺激免疫活性的佐劑。已知佐劑的例子包括鋁鹽、水包油乳劑、皂苷、細胞因子、脂質(zhì)和CpG寡核苷酸。目前，僅批準將鋁鹽、3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A('3dMPL')和MF59用于人。已知具有佐劑特性的另一種分子是a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a-GalCer或a-GC)，它是一種糖脂，更具體說是一種糖基神經(jīng)酰胺，最初分離自海綿[l]。a-GalCer是MHCI類分子CDld的配體，由CDld分子提呈給非變異自然殺傷T(NKT)細胞。最初研究a-GalCer誘導NKT細胞對腫瘤細胞應答的能力[2]。非變異NKT細胞也能誘導B細胞激活，促進B細胞增殖和抗體產(chǎn)生[3,4]。a-GalCer能用作各種共同給予的蛋白質(zhì)抗原的佐劑[5]。共同給予a-GalCer與表達瘧疾抗原的輻射孢子體或重組病毒能夠提高小鼠的保護性抗瘧疾免疫力水平[6]。a-GalCer也能用作編碼HIV-Igag和env基因的DNA疫苗的佐劑[7]，鼻內(nèi)給予時誘導對流感病毒HA的體液和細胞免疫應答。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用CDld配體如a-GalCer作為疫苗佐劑不僅能顯著提高對疫苗中抗原的抗體應答，而且能誘導針對這些抗原的特異性B細胞記憶庫增加。具體說，已發(fā)現(xiàn)給予一次劑量的含有a-GalCer和抗原的組合物足以促進特異性B記憶庫增加，這能提高一年后用該抗原刺激時的抗體免疫應答。CDld配體促進特異性B細胞記憶庫增加的能力表明使用CDld配體作為疫苗佐劑可減少獲得長期免疫記憶所需的初免和加強免疫的次數(shù)和頻率。也發(fā)現(xiàn)，CDld配體是衍生自B型鏈球菌、腦膜炎球菌血清組B的抗原和某些流感病毒抗原的驚人有效佐劑。誘導長期免疫記憶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供在需要的患者中誘導對抗原的長期免疫記憶的方法，所述方法包括給予所述患者組合物，所述組合物含有a)所述抗原；和b)CDld配體，以便與不給予CDld配體的情況下給予所述抗原時相比，降低為使所述患者能夠在后續(xù)接觸所述抗原時產(chǎn)生免疫應答所必需的所述組合物的給藥次數(shù)和/或頻率。優(yōu)選地，與不給予CDld配體的情況下給予所述抗原時相比，本發(fā)明方法能降低使所述患者在后續(xù)接觸所述抗原時產(chǎn)生保護性免疫應答所必需的所述組合物的給藥次數(shù)和/或頻率。"保護性免疫應答"指對后續(xù)抗原接觸產(chǎn)生的免疫應答足以防止該患者患上與該抗原有關(guān)的疾病。可通過本領(lǐng)域已知的標準方法確定對抗原產(chǎn)生保護性免疫應答所需的組合物給藥次數(shù)和/或頻率的降低。本發(fā)明方法可降低誘導對后續(xù)抗原接觸的保護性免疫應答所必需的含該抗原的組合物給藥次數(shù)。一些免疫目前需要三次或四次初免抗原劑量才能對后續(xù)抗原接觸產(chǎn)生保護性免疫應答。優(yōu)選地，本發(fā)明方法將誘導針對抗原的保護性免疫應答所需的給藥次數(shù)降低至一次初免給藥。目前的免疫方法也常常需要間隔遞增的加強免疫來維持對后續(xù)抗原接觸的保護性免疫應答。例如，在嬰兒期給予的免疫一般保護在給予初次劑量后數(shù)月或數(shù)年給予的加強劑量。優(yōu)選地，本發(fā)明方法降低維持對后續(xù)抗原接觸產(chǎn)生保護性免疫應答所必需的加強給予含抗原組合物的頻率。優(yōu)選地，本發(fā)明方法允許以一年以上，優(yōu)選兩年以上，優(yōu)選5年以上、優(yōu)選10年以上的間隔給予加強劑量。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，完全消除對加強劑量的需求，單次給予該抗原足以誘導對后續(xù)抗原接觸的保護性免疫應答。按照本發(fā)明的一個方面，提供了在患者中誘導對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括給予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配體，所述抗原和CDld配體在超過一年以前也給予過所述患者。本發(fā)明也提供抗原和CDld配體在制備誘導患者免疫應答的藥物中的應用，其中所述抗原和CDId配體在超過一年以前也給予過所述患者。免疫應答優(yōu)選為保護性免疫應答。優(yōu)選地，所述抗原和CDld配體在超過18個月，優(yōu)選超過2年、5年或10年以前給予過所述患者。按照本發(fā)明這個方面給予患者抗原和CDld配體時，可以含有抗原和CDld配體的混合物，即單一組合物的形式給藥?；蛘?，可以任意順序?qū)⒖乖虲Dld配體依次給予患者的同一部位。也可將抗原和CDld配體分別給予患者的不同部位，例如不同的肢體。超過l年前給予患者的CDld配體和抗原的初始劑量也可以CDld配體和抗原的單一組合物的形式給予，或者CDld配體和抗原可依次或分開給予。給予患者以誘導免疫應答的CDld配體量取決于給予該組合物的患者的年齡和體重，但一般含有1-100pg/kg患者體重。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)低劑量CDld配體足以提高對共同給予抗原的免疫應答，并提高對該抗原的長期免疫記憶。因此，本發(fā)明組合物中CDld配體的含量可小于5(Hig/kg患者體重、小于20(ig/kg、小于10嗎/kg、小于5[ig/kg、小于4(ig/kg或小于3(ig/kg。按照本發(fā)明另一方面，提供在患者中誘導對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括給予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配體，其中所述組合物中CDld配體含量小于10嗎/kg患者體重，優(yōu)選小于5嗎/kg、小于4叱/kg或小于3嗎/kg。本發(fā)明也提供抗原和CDld配體在制備誘導患者免疫應答的藥物中的應用，其中CDld配體含量小于10嗎/kg患者體重，優(yōu)選小于5pg/kg、小于4嗎/kg或小于3^g/kg。按照本發(fā)明這個方面給予患者的抗原和CDld配體可以混合物的形式給藥；依次給予患者的同一部位(給予抗原或CDld配體的順序任意)；或分別給予患者的不同部位，如不同的肢體。CDld配體本發(fā)明組合物中所含的CDld配體可以是結(jié)合CDld分子的任何分子。CDld分子位于非變異NKT(iNKT)細胞、B細胞、樹突細胞、單核細胞和常規(guī)T細胞上，本發(fā)明CDld配體可結(jié)合位于這些細胞上的CDld分子。本發(fā)明CDld配體與CDld分子的結(jié)合可激活iNKT細胞、B細胞、樹突細胞、單核細胞、和/或常規(guī)T細胞。CDld配體與CDld分子的結(jié)合優(yōu)選激活iNKT細胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標準方法確定某分子結(jié)合CDld分子的能力。可通過測定與不存在CDld配體時釋放的細胞因子水平相比，在CDld配體存在下細胞釋放的細胞因子水平來確定CDld配體激活細胞，具體是非變異NKT細胞的能力。優(yōu)選地，與不存在CDld配體時非變異NKT細胞的細胞因子分泌水平相比，本發(fā)明組合物中所含的CDld配體能提高非變異NKT細胞的細胞因子分泌水平。本發(fā)明CDld配體可促進Thl細胞因子或Th2細胞因子的釋放。優(yōu)選地，與不存在CDld配體時非變異NKT細胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平相比，本發(fā)明CDld配體能提高非變異NKT細胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平?？蓽y試用作激活非變異NKT細胞的CDld配體的能力的候選分子包括肽和糖。優(yōu)選地，本發(fā)明CDld配體是糖脂。已知用作可包含在本發(fā)明組合物中的CDld配體的糖脂抗原的綜述參見參考文獻9。適用于本發(fā)明組合物的CDld配體的例子包括a-糖基神經(jīng)酰胺。用于本發(fā)明組合物的a-糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選為式(I)化合物式中-A代表O、CH2、-CH2CH=CH、-CH=CHCH2，Q代表(CH2)n，其中n代表0或1的整數(shù)，RM戈表H或OH，X代表l-30的整數(shù)，W代表選自以下(a)-(e)的取代基(其中Y代表5-17的整數(shù))；(a)(b)-CH(OH)(CHCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH=CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3，R3代表H、OH、NH2、NHCOCH3或單糖，R4代表OH或單糖，R5代表H、OH或單糖，R6代表H、OH或單糖，和R7代表H、CH3、CH20H或-CHr單糖。X優(yōu)選為7-27，更優(yōu)選為9-24，更優(yōu)選為13-20。Y優(yōu)選為7-15，更優(yōu)選為9-13。術(shù)語"單糖"指含有3-10個碳原子鏈的醛(醛醣)或酮(酮糖)形式的糖分子。適用于本發(fā)明的單糖包括天然產(chǎn)生和合成的單糖.單糖的例子包括丙糖，如甘油糖和二羥基丙酮；丁糖，如赤蘚糖(erythanose)和赤鮮酮糖；戊糖，如木糖、阿拉伯糖、核糖、木酮糖、核酮糖；甲基戊糖(6-脫氧已糖)，如鼠李糖和果糖；已糖，如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖和山梨糖；庚糖，如葡庚糖、半乳甘露庚糖、景天庚酮糖和甘露庚酮糖。優(yōu)選的單糖是己糖。單糖基團可連接于結(jié)構(gòu)的r3、r4、r5、rS或R"位置，以形成糖基鍵。單糖一般通過連接于單糖c-1碳的氧連接于r3、r4、r5、rS或W位置，形成配糖鍵。R3是單糖時，優(yōu)選選自a-D-吡喃半乳糖、(3-D-吡喃半乳糖、a-D-吡喃葡萄糖或卩-D-吡喃葡萄糖。W是單糖時，優(yōu)選選自(3-D-呋喃半乳糖或N-乙?；鵤-D-吡喃半乳糖。RS是單糖時，優(yōu)選選自a-D-吡喃半乳糖、(3-D-吡喃半乳糖、a-D-吡喃葡萄糖或卩-D-吡喃葡萄糖。R6是單糖時，優(yōu)選選自a-D-吡喃半乳糖、P-D-吡喃半乳糖、a-D-吡喃葡萄糖或卩-D-吡喃葡萄糖。W是單糖時，優(yōu)選選自甲基a-D-吡喃半乳糖苷、甲基(3-D-吡喃半乳糖苷、甲基a-D-吡喃葡糖苷或甲基P-D-吡喃葡糖苷。115和116優(yōu)選不同。115和116之一優(yōu)選是11。參考文獻2提供了適合包含在本發(fā)明組合物中的a-糖基神經(jīng)酰胺的其它例子。a-糖基神經(jīng)酰胺優(yōu)選是具有下式的a-半乳糖基神經(jīng)酰胺(a-GalCer)或其類似物OH本發(fā)明組合物中所含的a-GalCer和其類似物可直接分離自海綿，或者可以是化學合成的產(chǎn)品。參考文獻10和11提供適用于本發(fā)明組合物的a-GalCer類似物的例子和合成這些產(chǎn)品的方法。優(yōu)選的a-GalCer類似物是KRN7000，其結(jié)構(gòu)式如下(2S,3S,4R)-l-0-(a-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六垸酰氨基)-l,3,4-十八垸三醇。參考文獻12描述了KRN7000的合成。其它優(yōu)選的a-GalCer類似物是a-GalCer的C-連接類似物如參考文獻13、14和15所述。優(yōu)選的a-GalCer的C連接類似物是CRONY-101，其合成參見參考文獻13。與ot-GalCer相比脂肪?；満?或鞘氨醇鏈被截短的a-GalCer的截短類似物也可用于本發(fā)明。參考文獻16提供a-GalCer的截短類似物的例子。優(yōu)選的a-GalCer截短類似物是'OCH'，與優(yōu)選的a-GaICer相比其中脂肪?；湵唤囟虄蓚€烴基，鞘氨醇鏈被截短九個烴基(即R^H，X=21，R2=CH(OH)(CH2)4CH3，R3=OH，R4=OH，R5=OH，R6=H，R7=CH2OH)。其它優(yōu)選的a-GalCer截短類似物包括與a-GalCer相比脂肪?；湵唤囟虄蓚€烴基和鞘氨醇鏈被截短七個或三個烴基的類似物(即R1=H，X=21，R3=OH，R4=OH，R5=OH,R6=H，R7=CH2OH，R2是CH(OH)(CH2)6CH3或CH(OH)(CH2)10CH3)oa-GalCer、KRN7000和OCH都是含植物鞘氨醇的a-糖基神經(jīng)酰胺。然而，本發(fā)明也包括使用KRN700,OCH和其它上述a-糖基神經(jīng)酰胺的含二氫鞘氨醇的類似物。KRN7000和OCH的含二氫鞘氨醇類似物的合成參見參考文獻17。用于本發(fā)明組合物的CDld配體也可包含硫苷脂類似物，如參考文獻18所述。a-GalCer的優(yōu)選類似物3"-0-硫代-半乳糖基神經(jīng)酰胺。雖然a-GalCer最初分離自海綿，但近年來從革蘭陰性菌中分離到與a-GalCer結(jié)構(gòu)相似的CDld配體。因此，本發(fā)明組合物中可包含的其它CDld配體是細菌來源的糖脂，具體是分離自鞘氨醇單胞菌C^/z/"gomo"w)和埃里希體CE/^/ZcWa)外膜的細菌糖基神經(jīng)酰胺。這類糖基神經(jīng)酰胺的例子包括來自鞘氨醇單胞菌的a-葡糖醛酸基神經(jīng)酰胺(a-glucuronosylceramide)和a-半乳糖醛酸基神經(jīng)酰胺(a-galacturonsylceramide)，其生產(chǎn)參見參考文獻19。來自鞘氨醇單胞菌和埃里希體的其它CDld配體的產(chǎn)生參見參考文獻18。本發(fā)明也包括使用不屬于鞘糖脂家族的CDld配體。具體說，本發(fā)明提供使用屬于糖甘油脂的CDld配體?？捎糜诒景l(fā)明的糖甘油脂包括二酰甘油，具體是單半乳糖基二酰甘油。適用于本發(fā)明的單半乳糖基二酰甘油參見參考文獻20。組合物的抗原性組分誘導上述長期免疫記憶的組合物中包含的抗原可以是已知用于誘導免疫應答的任何抗原。該抗原可包括蛋白質(zhì)抗原或糖抗原。糖抗原該抗原是糖抗原時，優(yōu)選偶聯(lián)于載體蛋白。糖抗原優(yōu)選為細菌糖，具體是細菌莢膜糖。可包含在本發(fā)明組合物中的細菌莢膜糖的例子包括膜炎奈瑟球菌(A^wen'ame"/"g/"fife)(血清組A、B、C、W135或Y)、肺炎鏈球菌(&re;^ococcM/7"e"mom'ae)(血清組4、6B、9V、14、18C、19F或23F)、無乳鏈球菌(Sfre;^ococc^rflga/ac"ae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型)、流感嗜血桿菌(i/aemo;W/w/My/wwzae)(可分型菌株a、b、c、d、e或f)、綠膿假單胞菌(尸w油mo顧"erwg/"OM)、金黃色葡萄球菌(&^/z;;/ococcwawww)等的莢膜糖。本發(fā)明組合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白色念珠菌(Ow&^fl/Wcfl"力的葡聚糖)和真菌莢膜糖，如新型隱球菌(Co^ococcwsweo/onwam)莢膜的莢膜糖。腦膜炎奈瑟球菌血清組A(MenA)莢膜是(a1—6)-連接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-l-磷酸的均聚物，在C3和C4位部分O-乙?；?。腦膜炎奈瑟球菌血清組B(MenB)莢膜是(a2—8)-連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清組C(MenC)莢膜糖是(a2—9)-連接的唾液酸的均聚物，在位置7和/或8含有可變的O-乙?；?。腦膜炎奈瑟球菌血清組W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖單元[—4)-D-Neu;5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-(1—]組成的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上含有可變的0-乙?；痆21]。腦膜炎奈瑟球菌血清組Y糖類似于血清組W135糖，除了二糖重復單元用葡萄糖代替了半乳糖[—4)-D-Neu/5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—]。它也在唾液酸的7位和9位含有可變的O-乙酰化。B型流感嗜血感覺莢膜(Hib)糖是核糖、核醣醇和磷酸的聚合物['PRP'，(聚-3-(3-0-核糖-(1，1)-0-核醣醇-5-磷酸)]。本發(fā)明組合物可含有糖抗原偶聯(lián)物的混合物。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清組的糖抗原，例如該組合物可包含血清組A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選組合物包含血清組C和Y的糖偶聯(lián)物。其它優(yōu)選組合物包含血清組C、W135和Y的糖偶聯(lián)物。當混合物包含血清組A腦膜炎球菌的糖和至少一種其它血清組的糖時，MenA糖與其它血清組糖的比例(w/w)可以大于l(如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。血清組A:C:W135:Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)為1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;和2:2:2:1。本發(fā)明的其它優(yōu)選組合物包含Hib糖偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎奈瑟球菌血清組，優(yōu)選一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清組的糖偶聯(lián)物。例如，本發(fā)明組合物可包含Hib偶聯(lián)物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和Y的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括含有肺炎鏈球菌糖偶聯(lián)物的組合物。該組合物優(yōu)選包含來自一種以上肺炎鏈球菌血清組的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選組合物包含肺炎鏈球菌血清組4、6B、9V、14、18C、19F和23F(7-價)的糖偶聯(lián)物。組合物還可包含肺炎鏈球菌血清組4、6B、9V、14、18C、19F23F、1和5(9價)的糖偶聯(lián)物，或者可包含肺炎鏈球菌血清組4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、3和7F(11價)的糖偶聯(lián)物。本發(fā)明其它優(yōu)選的組合物包含肺炎球菌糖偶聯(lián)物和來自Hib和/或腦膜炎奈瑟球菌的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物和Hib糖偶聯(lián)物。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和Y的糖偶聯(lián)物。本發(fā)明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物、Hib糖偶聯(lián)物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和Y的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選的是，單個糖抗原偶聯(lián)物的保護效力不會因合并而消除，但實際免疫原性(如ELISA效價)可能降低。莢膜糖抗原的制備制備莢膜糖抗原的方法是熟知的。例如，參考文獻22描述了腦膜炎奈瑟球菌糖抗原的制備。參考文獻86第14章描述了流感嗜血桿菌糖抗原的制備?，F(xiàn)有技術(shù)描述了肺炎鏈球菌糖抗原和偶聯(lián)物的制備。例如，PrevenarTM是一種7-價肺炎球菌偶聯(lián)疫苗。參考文獻23和24中詳細描述了無乳鏈球菌糖抗原的制備方法。糖抗原可以經(jīng)化學修飾。例如，可修飾它們，用封閉基團取代一個或多個羥基。這種方法對腦膜炎球菌血清組A特別有用，其中用封閉基團取代乙?；煞乐顾鈁25]。這種修飾的糖仍然是本發(fā)明意義上的血清組A糖。所用的莢膜糖可以是寡糖形式。通過純化莢膜多糖的片段化(如通過水解)方便地形成寡糖，片段化后通常要純化所需大小的片段。優(yōu)選進行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小于30?？赏ㄟ^離子交換色譜或比色測定方便地測定DP[26]。如果進行水解，通常對水解產(chǎn)物進行篩分，以去除短鏈寡糖[27]?？捎酶鞣N方法，如超濾后離子交換色譜實現(xiàn)此目的。對于血清組A，優(yōu)選去除聚合程度小于或等于約6的寡糖；對于血清組W135和Y，優(yōu)選去除聚合程度小于4左右的寡糖。載體載體優(yōu)選蛋白質(zhì)。本發(fā)明組合物中偶聯(lián)糖抗原的載體蛋白優(yōu)選是細菌毒素，如白喉類毒素或破傷風類毒素。合適的載體蛋白包括白喉毒素CRM197突變體[28-30]、白喉類毒素、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[31]、合成肽[32,33]、熱激蛋白[34,35]、百日咳蛋白[36,37]、細胞因子[38]、淋巴因子[38]、激素[38]、生長因子[38]、含有不同病原體衍生抗原的多種人004+T細胞表位的人工蛋白[39]如N19蛋白[40]、流感嗜血桿菌蛋白D[41,42]、肺炎球菌表面蛋白PspA[43]、肺炎鏈球菌溶血素[44、攝鐵蛋白[45]、來自艱難梭菌C."驕c〃e)的毒素A和B[46]、人血清白蛋白(優(yōu)選重組蛋白)等。優(yōu)選通過-NH2基團，例如載體蛋白中賴氨酸殘基側(cè)鏈或精氨酸殘基側(cè)鏈中的-NH2基團連接糖抗原與載體。當糖具有游離醛基時，醛基可與載體中的氨基反應，通過還原胺化形成偶聯(lián)物。也可通過-SH基團，如半胱氨酸側(cè)鏈中的-SH基團連接。該組合物含有一種以上糖抗原時，可能使用一種以上載體來降低載體抑制的風險。因此，可將不同載體用于不同糖抗原，例如腦膜炎奈瑟球菌血清組糖可偶聯(lián)于CRM197，而C型糖可偶聯(lián)于破傷風類毒素。也可能將一種以上載體用于一種具體的糖抗原。糖可以分成兩組，一些偶聯(lián)于CRM197而另一些偶聯(lián)于破傷風類毒素。然而，通常優(yōu)選所有糖使用同一種載體。一種載體蛋白可攜帶一種以上糖抗原[47,48]。例如，一種載體蛋白可偶聯(lián)于不同病原體或同一病原體的不同血清組的糖。為了實現(xiàn)這一目的，可以在偶聯(lián)反應之前混合不同糖。然而，通常優(yōu)選單獨得到各血清組的偶聯(lián)物，偶聯(lián)后混合不同糖。單獨的偶聯(lián)物可基于同一載體。優(yōu)選糖:蛋白質(zhì)之比(w/w)為l:5(即蛋白質(zhì)過量)-5:l(即糖過量)的偶聯(lián)物。優(yōu)選1:2-5:1的比例，以及1:1.25-1:2.5之間的比例。偶聯(lián)物可與游離載體聯(lián)用[49]。當本發(fā)明組合物中給定載體蛋白存在游離和偶聯(lián)形式時，未偶聯(lián)形式優(yōu)選不多于組合物中載體蛋白總量的5%，更優(yōu)選少于2%重量?？刹捎萌魏魏线m的偶聯(lián)反應，必要時采用任何合適的接頭。一般在偶聯(lián)前活化或官能化糖。活化可包括例如用氰化試劑如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[50，51等])。其它合適技術(shù)采用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也參見參考文獻52的引言)可用任何已知方法，如參考文獻53和54所述的方法通過接頭基團進行連接。一種連接類型包括多糖的還原性胺化，將得到的氨基與己二酸接頭基團的一端偶聯(lián)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于該己二酸接頭基團的另一端[55，56]。其它接頭包括B-丙酰胺基[57]、硝基苯基-乙基胺[58]、鹵代?；u化物[59]、配糖鍵[60]、6-氨基己酸[61]、ADH[62]、C4-C12部分[63]等。作為采用接頭的替代方法，可以采用直接連接。直接連接蛋白質(zhì)可包括氧化多糖，然后與蛋白質(zhì)進行還原性胺化，如參考文獻64和65所述。優(yōu)選包括以下步驟的方法將氨基引入糖(如用-NH2取代末端K)基團)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生后，與載體蛋白反應。偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)的糖。有許多合適的分離方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等。[也參見參考文獻66和67等]。當本發(fā)明組合物包含解聚的糖時，優(yōu)選在偶聯(lián)之前進行解聚。適合包含在本發(fā)明組合物中的糖偶聯(lián)物抗原的制備參見參考文獻68。蛋白質(zhì)抗原本發(fā)明組合物中包含的抗原是蛋白質(zhì)抗原時，該抗原可選自腦膜炎奈瑟球菌血清組B的蛋白質(zhì)抗原，如參考文獻69-75所述的抗原。使用參考文獻73的標準命名法時，NMB2132、NMB1870和NMB0992是可用作合適抗原基礎(chǔ)的三種優(yōu)選蛋白。-肺炎鏈球菌(如PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、Spl01、Spl28、Spl30和Sp133，如參考文獻76所述)的蛋白質(zhì)抗原。-甲型肝炎病毒，如滅活病毒的抗原[如77，78;參考文獻86的第15章]。-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如78，79;參考文獻86的第16章〗。-丙型肝炎病毒的抗原[如80]?？梢允褂玫谋透窝撞《究乖砂ㄒ韵乱环N或多種抗原HCVE1和/或E2蛋白，El/E2異源二聚體復合物、核心蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，這些抗原的片段，其中可任選地修飾所述非結(jié)構(gòu)蛋白，以便在保持免疫原性的同時消除酶活性(如81、82和83)。-百日咳博德特菌(5oWefe〃apeWws^)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3組合使用[例如，參考文獻84和85;參考文獻86的第21章]。-白喉抗原，如白喉類毒素[例如，參考文獻86的第13章]。-破傷風抗原，如破傷風類毒素[例如，參考文獻86的第27章]。陽淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)抗原[例如，69、70、71]。-肺炎衣原體((^/0附>^/0^朋"附0"/^)抗原[例如，87、88、89、90、91、92、93]。-沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)抗原[例如，94]。-牙齦卟啉單胞菌(尸0/7^>^0附0"05g/wg/va/Z力抗原[例如，95]。-脊髓灰質(zhì)炎抗原例如，96、97;參考文獻86的第24章]如IPV。-狂犬病抗原[如98]如凍干的失活病毒[如99，RabAvert]。-麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原[如參考文獻86的第19、20和26章]。幽門螺桿菌(//6/^0^"";;;/on')抗原如CagA[100-103]、VacA[104、105]、NAP[106、107、108]、HopX[如109]、HopY[如109]和/或脲酶。-流感抗原[如參考文獻86的第17和18章]，如血細胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)抗原[如110]。-無乳鏈球菌(B型鏈球菌)的蛋白抗原[如111、112]。-釀膿鏈球菌057";^70"^;7"^"")(八型鏈球菌)的抗原[如112、113、114]。-金黃色葡萄球菌抗原[如U5]。-副粘病毒如呼吸道合胞病毒(1^￥[116、U7])和/或副流感病毒(PIV3[118])的抗原。-炭疽桿菌0^"7/^""^^(^)抗原[如119、120、121]。-黃病毒屬病毒(黃病毒種)，如黃熱病病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒的四種血清型、蜱媒腦炎病毒、西尼羅河病毒的抗原。-瘟病毒抗原，如經(jīng)典的豬熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或邊界病病毒的抗原。-細小病毒，如細小病毒B19的抗原。-單純皰疹病毒(HSV)抗原。用于本發(fā)明的優(yōu)選HSV抗原是膜糖蛋白gD。優(yōu)選使用HSV-2毒株的gD('gD2'抗原)。該組合物可使用C-末端膜錨定區(qū)缺失的gD形式[122]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短的gD。這種蛋白質(zhì)形式包括信號肽，信號肽被切割后產(chǎn)生成熟的283個氨基酸的蛋白質(zhì)。缺失錨定物，以便將該蛋白制備成可溶形式。-人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。用于本發(fā)明的優(yōu)選HPV抗原是L1衣殼蛋白，該蛋白可組裝形成稱為病毒-樣顆粒(VLP)的結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^在酵母細胞(例如釀酒酵母(S.cerev&'ae))或昆蟲細胞(例如夜蛾(印odo;7fera)細胞，如草地貪夜蛾(S./n^peWa)，或果蠅(ZVosopMa)細胞)中重組表達Ll產(chǎn)生VLP。在酵母細胞中，質(zhì)粒載體可攜帶L1基因；在昆蟲細胞中，桿狀病毒載體可攜帶L1基因。更優(yōu)選地，該組合物包含來自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已證明這種二價組合非常有效[123]。除了HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含來自HPV-6和HPV-11毒株的L1VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含20-60Hg/ml(如約40(ig/ml)的L1/HPV毒株。該組合物可包含一種或多種這些抗原，需要時可使其脫毒(例如，通過化學和/或遺傳學手段使百日咳毒素脫毒)。當混合物中包含白喉抗原時，也優(yōu)選包含破傷風抗原和百日咳抗原。相似地，當包含破傷風抗原時，也優(yōu)選包含白喉和百日咳抗原。相似地，當包含百日咳抗原時，也優(yōu)選包含白喉和破傷風抗原。混合物中各抗原的濃度一般是至少1ng/ml。通常，任何給定抗原的濃度將足以引發(fā)針對該抗原的免疫應答。作為混合物中使用蛋白質(zhì)抗原的另一種替代方式，可使用編碼該抗原的核酸。因此，混合物的蛋白質(zhì)組分可被編碼該蛋白的核酸(優(yōu)選DNA，如質(zhì)粒形式的DNA)取代。相似地，本發(fā)明組合物可包含模擬抗原的蛋白質(zhì)，如模擬表位[124]或抗獨特型抗體?；蛘呋虺鲜隹乖?，該組合物可包含來自腦膜炎奈瑟球菌血清組B的外膜泡(OMV)制劑，如參考文獻125、126、127、128等所述。其它組合物本發(fā)明的另一個目的是提供針對B型鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌血清組B和/或流感病毒產(chǎn)生保護作用的疫苗組合物。已發(fā)現(xiàn)，對病原體抗原而言，CDld配體是令人驚訝的有效佐劑。下述組合物包含來自B型鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌血清組B或流感病毒的至少一種抗原。這些組合物可包含其它抗原。例如，這些組合物也可包含一種或多種偶聯(lián)于一種或多種載體的糖抗原，所述載體例如上述包含在組合物中用于誘導長期免疫記憶的載體?；蛘呋虼送猓@些組合物可包含一種或多種上述蛋白質(zhì)抗原。B型鏈球菌因此，本發(fā)明提供含有以下組分的組合物a)CDld配體；和b)B型鏈球菌抗原。包含在組合物中的B型鏈球菌(無乳鏈球菌)抗原的例子參見參考文獻111和112。因此，該組合物可包含含有以下一種或多種序列的蛋白質(zhì)(i)參考文獻112中的無乳鏈球菌氨基酸序列(參考文獻112的SEQIDNO:2-10960中偶數(shù)編號的序列)；(ii)與(i)的無乳鏈球菌氨基酸序列序列相同性為至少80%的氨基酸序列；含有(i)的無乳鏈球菌氨基酸序列的表位的氨基酸序列。優(yōu)選地，該組合物包含參考文獻112中所述的GBS1-GBS689蛋白中一種或多種蛋白(參見其中的表IV)。更優(yōu)選地，該組合物包含GBS80蛋白抗原。腦膜炎球菌本發(fā)明也提供包含以下組分的組合物a)CDld配體；和b)腦膜炎奈瑟球菌抗原。該組合物中所含的腦膜炎奈瑟球菌抗原可以是蛋白質(zhì)抗原或外膜泡(OMV)制劑?？砂谠摻M合物中的OMV制劑的例子包括來自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、B、C、W135或Y的OMV制劑。上文中也提供了可包含在該組合物中的腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)抗原的例子。蛋白質(zhì)抗原優(yōu)選衍生自腦膜炎奈瑟球菌血清組B，給予患者時能引發(fā)與腦膜炎奈瑟球菌血清組B細胞發(fā)生交叉反應的免疫應答。能引發(fā)與腦膜炎奈瑟球菌血清組B細胞發(fā)生交叉反應的免疫應答的優(yōu)選蛋白質(zhì)抗原包括'AG287nz-953'、'936-741'和'961c'蛋白質(zhì)抗原[129]。優(yōu)選地，該組合物包含一種以上腦膜炎奈瑟球菌抗原。優(yōu)選地，該組合物包含所有三種'AG287nz-953'、'936-741鄰'961c'蛋白質(zhì)抗原。其它有用的蛋白質(zhì)抗原基于NMB2132、NMB1870和NMB0992。流感病毒本發(fā)明也提供包含以下組分的組合物a)CDld配體；和b)流感病毒抗原。流感病毒抗原一般由流感病毒顆粒制備，但作為另一種方式，可以在重組宿主中表達(例如在昆蟲細胞系中用桿狀病毒載體表達)抗原如血細胞凝集素，并以純化形式使用[130,131]。然而，抗原通常來自病毒顆粒?？乖梢圆扇』畈《镜男问?，或者更優(yōu)選地，采取滅活病毒的形式。采用滅活病毒時，該疫苗可包含完整的病毒顆粒、分裂病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。流感抗原也可以病毒體形式出現(xiàn)[132]。流感病毒可被減毒。流感病毒可以是溫度敏感型。流感病毒可以是冷適應性病毒。這三種可能性特別適用于活病毒。用于疫苗的流感病毒毒株隨季節(jié)而變。在目前的大流行間期，疫苗一般包括兩種A型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種B型流感毒株，一般是三價疫苗。本發(fā)明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群沒有與其發(fā)生過免疫接觸的毒株)的病毒，如H2、H5、H7或H9亞型毒株(聚體是A型流感病毒)，大流行毒株的流感疫苗可以是單價疫苗，或者可以基于補充有大流行毒株的正常三價疫苗。然而，根據(jù)季節(jié)和疫苗中包含的抗原特性，本發(fā)明可保護免受一種或多種HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16的感染?？捎杏玫匕诒景l(fā)明組合物中的其它毒株是對抗病毒治療有抗性(例如對奧塞米韋[133]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[134]。本發(fā)明佐劑組合物特別可用于獲得對大流行毒株的免疫?？赡芤鸫罅餍斜l(fā)的流感毒株的特征是(a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有數(shù)十年在人群中沒有發(fā)現(xiàn)的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥群體中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接觸過該毒株的血凝素；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它能使人致病。含有H5血凝素類型的病毒優(yōu)選用于獲得對大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現(xiàn)的大流行毒株。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(如1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括流感A病毒和/或流感B病毒的抗原。疫苗包含一種以上流感毒株時，一般單獨培養(yǎng)不同毒株，收獲病毒后將它們混合在一起，然后制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。流感病毒可以是再分類毒株，并可通過逆向遺傳學技術(shù)獲得。逆向遺傳學技術(shù)[如135-139]能夠用質(zhì)粒在體外制備含有所需基因組節(jié)段的流感病毒。該技術(shù)一般包括表達(a)例如，由poll啟動子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII啟動子編碼病毒蛋白的DNA分子，以便在細胞中表達兩種類型的DNA，導致組裝成完整的感染性病毒顆粒。DNA優(yōu)選提供所有病毒RNA和蛋白質(zhì)，但也可能用輔助病毒提供一些RNA和蛋白質(zhì)。優(yōu)選采用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA的質(zhì)粒方法[140-142]，這些方法也包括使用質(zhì)粒表達所有或一些(例如僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法中至多使用12種質(zhì)粒。為了降低所需的質(zhì)粒數(shù)量，近期方法[143]將多個RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于合成病毒RNA)合并到同一質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感AvRNA節(jié)段的序列)上，并且將多個蛋白編碼區(qū)與RNA聚合酶II啟動子合并到另一個質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感AmRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)上。參考文獻143方法的優(yōu)選方面包括(a)PB1、PB2和PAmRNA編碼區(qū)在同一質(zhì)粒上；和(b)所有8個vRNA編碼節(jié)段在同一質(zhì)粒上。可能使用poll和polll雙啟動子由一個模板同時編碼病毒RNA和可表達的mRNA[144,145]。因此，病毒可包含來自A/PR/8/34病毒(一般是來自A/PR/8/34的6個節(jié)段，HA和N節(jié)段來自疫苗毒株，即6:2再造毒株)的一個或多個RNA節(jié)段。也可包含來自A/WSN/33病毒，或用于產(chǎn)生疫苗制劑的再造病毒的任何其它毒株的一個或多個RNA節(jié)段。本發(fā)明一般保護免受能夠在人之間傳播的毒株的感染，因此該毒株的基因組通常包含在哺乳動物(如人)流感病毒中起源的至少一個RNA節(jié)段。可以在雞蛋或細胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)用作抗原來源的病毒。目前培養(yǎng)流感病毒的標準方法采用含胚的雞蛋，由雞蛋內(nèi)容物(尿囊液)純化病毒。然而，更近一段時間以來，已經(jīng)在動物細胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)病毒，出于速度和患者變態(tài)反應的原因，優(yōu)選這種培養(yǎng)方法。細胞底物一般是哺乳動物細胞系，如MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MR.C-5;PER.C6;WI-38;等。用于培養(yǎng)流感病毒的哺乳動物細胞系優(yōu)選包括衍生自MadinDarby犬腎的MDCK細胞[146-149];衍生自非洲綠猴腎(Cerco;油ea^aeAZo;w)的Vero細胞[150-152];或衍生自人胚視網(wǎng)膜母細胞的PER.C6細胞i;i53]。這些細胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)[154]、Coriell細胞庫[155]或歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各種不同Vero細胞，目錄號為CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587;并提供MDCK細胞，目錄號為CCL-34。PER.C6可獲自ECACC，保藏號為96022940。哺乳動物細胞系的一個較不優(yōu)選的替代方式是，可以在禽細胞系上培養(yǎng)[例如參考文獻156-158],包括衍生自鴨(如鴨視網(wǎng)膜)或雞如雞胚胎成纖維細胞(CEF)等的細胞系。在哺乳動物細胞系上培養(yǎng)病毒時，該組合物不含雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類粘蛋白)和雞DNA，從而降低變應原性。為了在細胞系，如MDCK細胞上生長，可以在懸浮[146]或貼壁培養(yǎng)的細胞上培養(yǎng)病毒。一種適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞系是MDCK33016(保藏號為DSMACfc2219)?；蛘撸刹捎梦⑤d體培養(yǎng)。在細胞系上培養(yǎng)病毒時，生長培養(yǎng)物優(yōu)選不含(即經(jīng)污染檢測且得到陰性污染結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細小病毒。特別優(yōu)選不存在單純皰疹病毒。在細胞系上培養(yǎng)病毒時，本發(fā)明組合物優(yōu)選含有小于10ng(優(yōu)選小于1ng，更優(yōu)選小于100pg)殘留的宿主細胞DNA/劑量，但可能存在痕量宿主細胞DNA。通常，需要從本發(fā)明組合物中排除長于100bp的宿主細胞DNA。現(xiàn)在，殘留宿主細胞DNA的測定是生物制品的常規(guī)管理要求，它在技術(shù)人員的普通能力范圍內(nèi)。用于測定DNA的實驗一般是已驗證的實驗[159,160]。可通過數(shù)學和可以量化的條件來描述驗證實驗的性能特征，并鑒定可能的誤差來源。通常測試該實驗的某些特征，如精確性、準確性、特異性。一旦校正(例如用已知標準量的宿主細胞DNA校正)并檢測了某個實驗，則可按常規(guī)進行定量DNA測定?？刹捎萌NDNA定量的基本技術(shù)雜交方法，如Southern印跡或狹線印跡[161];免疫測定方法，如ThresholdTM系統(tǒng)[162];和定量PCR[163]。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法，但各方法的準確特征，例如雜交探針的選擇、引物的選擇和/或用于擴增的引物等可能取決于所研究的宿主細胞。來自分子設(shè)備公司(MolecularDevices)的ThreshokFM系統(tǒng)是皮克水平總DNA的定量實驗，己用于監(jiān)測生物藥品中污染DNA的水平[162]。典型實驗包括生物素化ssDNA結(jié)合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗ssDNA抗體和DNA之間以非序列特異性方式形成反應復合物。購自生產(chǎn)商的總DNA測定試劑盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有實驗組分。多個商業(yè)生產(chǎn)商均提供用以檢測殘留宿主細胞DNA的定量PCR實驗，例如AppTec實驗室服務公司(AppTecLaboratoryServices)、BioRdianceTM公司奧西科技公司(AltheaTechnologies)等。對測定人病毒疫苗的宿主細胞DNA污染的化學發(fā)光雜交實驗和總DNAThresholdTM系統(tǒng)的比較參見參考文獻164。在疫苗制備過程中可采用標準純化方法，如層析法等去除污染的DNA?？赏ㄟ^核酸酶處理，例如DNA酶處理來改進對殘留宿主細胞DNA的清除效果。參考文獻165和166公開了一種減少宿主細胞DNA污染的方便方法，該方法包括兩步處理，先使用DNA酶(如Benzonase)處理，然后使用陽離子去污劑(如CTAB)處理。優(yōu)選每15嗎血凝素中宿主細胞DNA含量〈10ng(如^ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.25ml體積中宿主細胞DNA含量〈10ng(如〈lng、〈100pg)的疫苗。更優(yōu)選每50嗎血凝素中宿主細胞DNA含量〈10ng(如〈lng、〈100pg)的疫苗，以及每0.5ml體積中宿主細胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基和/或無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)支持流感病毒復制的細胞系。在本發(fā)明中，如果培養(yǎng)基中沒有人或動物來源的血清的添加劑，則稱為無血清培養(yǎng)基。無蛋白應理解為在不含蛋白質(zhì)、生長因子、其它蛋白添加劑和非血清蛋白質(zhì)的情況下發(fā)生細胞增殖的培養(yǎng)物，但可任選包含諸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生長所必需的蛋白質(zhì)。在這類培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細胞在天然情況下本身含有蛋白質(zhì)。支持流感病毒復制的細胞系優(yōu)選在37。C[167](如30-36"C)培養(yǎng)。血細胞凝集素(HA)是滅活流感疫苗中的主要免疫原，參考一般通過單徑向免疫擴散(SRID)試驗測定的HA水平使疫苗標準化。疫苗一般含有約15嗎HA/毒株，但(例如)兒童使用時，或者在大流行情況下，也可采用較低劑量。釆用了分數(shù)劑量如1/2(即7.5嗎HA/毒株)、1/4和1/8[168、169]，以及較高劑量(如3x或9x劑量[170、171])。因此，疫苗可包含0.1-150昭HA/流感毒株，優(yōu)選0.1-50ng，例如0.1-20嗎、0.1-15嗎、O.l-lO嗎、0.1-7.5嗎、0.5-5嗎等。具體劑量包括例如，約15、約IO、約7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5嗎等/毒株。因此，疫苗可包含0.1-20嗎HA/流感毒株，優(yōu)選0.1-15)ig，例如0.1-10嗎、0.1-7.5嗎、0.5-5嗎等。具體劑量包括例如，約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9嗎等。在本發(fā)明疫苗中存在佐劑時這些較低劑量最有用。本發(fā)明所用HA可以是天然HA，如病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者可以是經(jīng)修飾的HA。例如，己知修飾HA以去除能使病毒在禽類動物中具有高度致病性的決定簇(超堿性區(qū)域(hyper-basicregion)),因為這些決定簇可防止病毒在雞蛋中生長。滅活但非完整的細胞疫苗(如分裂病毒疫苗或純化的表面抗原疫苗)可包括基質(zhì)蛋白，以獲益于位于此抗原內(nèi)部的其它T細胞表位。因此，包含血細胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的非完整細胞疫苗(特別是分裂疫苗)還可包含Ml和/或M2基質(zhì)蛋白。存在基質(zhì)蛋白時，優(yōu)選包含可檢測水平的M2基質(zhì)蛋白。也可存在核蛋白。藥物組合物的制劑上述抗原和CDld配體特別適合包含在免疫原性組合物和疫苗中。因此，本發(fā)明方法可包括將抗原和CDld配體配制成免疫原性組合物或疫苗的步驟。本發(fā)明提供可以此方式獲得的組合物或疫苗。除抗原和CDld配體外，本發(fā)明免疫原性組合物和疫苗一般包含'藥學上可接受的載體'，其包括本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的運載體一般是代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[172]、脂質(zhì)聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)，和滅活的病毒顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這類載體。疫苗也可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，也可存在輔助劑，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等。藥學上可接受的賦形劑的充分討論參見參考文獻173。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它上述組分。'免疫有效量'指以一次劑量或一系列劑量的一部分，將某劑量給予個體能有效治療或預防。此量取決于所治療個體的健康和身體狀況、年齡、所治療個體的分類組(如非人靈長動物、靈長動物等)、個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對醫(yī)學情況的評估和其它相關(guān)因素。預計該量將落入可通過常規(guī)試驗測定的相對較寬的范圍內(nèi)。該疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給藥。CDld配體用作本發(fā)明免疫原性組合物中的佐劑。該疫苗可包含其它佐劑。這類佐劑包括但不限于可用于本發(fā)明的佐劑包括但不限于，包含鈣鹽和鋁鹽(或其混合物)的含礦物質(zhì)組合物。鈣鹽包括磷酸鈣(如參考文獻174公開的"CAP"顆粒)。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，所述鹽取任何合適形式(如凝膠、晶體、無定形態(tài)等)。優(yōu)選吸附于這些鹽。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[175]。下面開始更詳細地描述鋁鹽佐劑。，水包油乳劑，如下文所詳述。，免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酸鍵連接于鳥嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、TpG基序[176]、或雙鏈RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或(除RNA外)單鏈。參考文獻177-179公開了可能的類似取代，例如用2，-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻180-185中進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[186]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，例如CpG-AODN(寡脫氧核糖核苷酸)，或更特異地誘導B細胞應答，例如CpG-BODN。參考文獻187-189中討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選構(gòu)建CpG寡核苷酸時使其5'端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3，端相連接形成"免疫聚體"。參見例如，參考文獻190-192。有用的CpG佐劑是CpG7909，也稱為ProMune(科雷制藥集團公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20個核苷酸。它們可含有少于100個核苷酸。，3-0-脫酰化單磷酰脂質(zhì)A('3dMPL'，也稱為'MPIJM')[193-196]。3dMPL可由明尼蘇達沙門菌0^/歸加//"m/朋Moto)的無庚糖突變體制備，在化學上類似于脂質(zhì)A，但缺少酸-不穩(wěn)定性磷酰基和堿-不穩(wěn)定性?；?。參考文獻197最先描述了3dMPL的制備。3dMPL可以取?；煌南嚓P(guān)分子(如具有3、4、5或6個酰基鏈，它們的長度可以不同)的混合物的形式。兩個葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-?；?'位上也有O-?；?。咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特("R-837")[198,199]、瑞喹莫德("R-848")[200]和其類似物；及其鹽(如鹽酸鹽)。有關(guān)免疫刺激性咪唑喹啉的其它細節(jié)可參見參考文獻201-205?？s氨基硫脲化合物，如參考文獻206所述的化合物。參考文獻206中也描述了配制、制備和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。色胺酮化合物，如參考文獻207所述的化合物。參考文獻207中也描述了配制、制備和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。核苷類似物，如(a)埃索他賓(Isatorabine)(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)及其前藥<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻208-210所述的化合物；(f)具有下式的化合物其中式中R,和R2各自獨立地是氫、鹵素、-NRaRb、-OH、Cu6烷氧基、取代的CL6烷氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、Cw()芳基、取代的Q.k)芳基、d-6烷基或取代的Cl6焼基；R3不存在，或者是H、CM烷基、取代的Cl6焼基、Q.k)芳基、取代的(36.1()芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R4和Rs各自獨立地是氫、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(O)-Rd、d-6烷基、取代的Cl6焼基，或結(jié)合在一起形成5元環(huán)，如R4—5:X2R冬5在所示的化學鍵處實現(xiàn)結(jié)合，X,和X2各自獨立地是N、C、O或S;Rs是氫、鹵素、-OH、Q-6垸基、C2-6烯基、<:2.6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-0-((^.6垸基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;Rg是氫、C^垸基、取代的Cl6院基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或R9a，其中R9a是:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>在^所示的化學鍵處實現(xiàn)結(jié)合，RK)禾QRu各自獨立地是氫、鹵素、CL6烷氧基、取代的CL6烷氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自獨立地是氫、Cu6烷基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、(36.10芳基；Rc各自獨立地是氫、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C,-6烷基或取代的Rd各自獨立地是氫、鹵素、Cl6院基、取代的Cl6院基、CL6烷氧基、取代的C,-6烷氧基、-NH2、-NH(C"垸基)、-NH(取代的C!-6垸基)、-N(C"垸基)2、-^取代的(31.6烷基)2、C6-k)芳基或雜環(huán)基；&各自獨立地是氫、C,-6垸基、取代的Cl6院基、(:6.1()芳基、取代的<:6.10芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；Rf各自獨立地是氫、&.6垸基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯基；n各自獨立地是O、1、2或3;p各自獨立地是O、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一項的藥學上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項的互變異構(gòu)體，或互變異構(gòu)體的藥學上可接受的鹽。'Loxoribine(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[211]。*參考文獻212所述化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[213,214]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、異》i唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[215]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和(J引哚化合物[216]。參考文獻217所述的化合物，包括3,4-二(lH-吲哚-3-基)-lH-吡咯-2，5-二酮，星孢素類似物、衍生的噠嗪、色原-4-酮、吲哚滿酮、喹唑啉和核苷類似物。*氨垸基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[218,219]。*磷腈，如參考文獻220和221中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷月青](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，"PCPP"。"J、分子免疫增強劑(SMIP)，例如N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；^2-丁基-1-(2-甲基丙基)-舊-咪唑[4，5《]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)^2-戊基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；.l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；'2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；'4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l，3-二氫-2H-咪唑[4,5-c]喹啉-2-酮；'N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉隱2,4-二胺；l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4,N4-二芐基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。皂苷[參考文獻249的第22章]是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。己廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹(gw'〃a/arapo"an'a)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜CSVm7axomato)(墨西哥菝葜)、滿天星(G^/wop/n7/a;am'CM/ato)(婚紗花)和肥皂草(&^0朋〃》0#"'朋^^)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以商標Stimulon出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。制備QS21的方法參見參考文獻222。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[223]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻249的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可采用任何己知的皂苷。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻223-225中進一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[226]。開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻227和228。*細菌ADP-核糖基化毒素(如大腸桿菌(E.co/0不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脫毒衍生物，如稱為LT-K63和LT-R72的突變毒素[229]。參考文獻230中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻231中描述了將其用作胃腸道外佐劑。生物粘附劑和粘膜粘附劑，如酯化透明質(zhì)酸微球[232]或殼聚糖及其衍生物[233]。，由可生物降解和無毒材料(例如聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直徑約lOOnm-150pm，更優(yōu)選約200nm-30pm，最優(yōu)選約500nm-10nm的顆粒)，任選處理以具有帶負電表面(如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。脂質(zhì)體(參考文獻249第13和14章)。適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見參考文獻234-236所述。，聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑[237]。這種制劑還包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑和辛苯糖醇[238]以及聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[239]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自.-聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steorylether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。*胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-A1-D-異谷氨酰-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺("DTP-DPP"或"TheramideTM")和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。*由第一種革蘭陰性菌制備的外膜蛋白蛋白質(zhì)體制劑與衍生自第二種革蘭陰性菌脂多糖(LPS)制劑的組合，其中外膜蛋白蛋白質(zhì)體和LPS制劑形成穩(wěn)定的非共價連接佐劑復合物。這類復合物包括"IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌外膜和LPS組成的復合物。*甲基肌苷5'-單磷酸酯("MIMP")[240]。，多聚羥化吡咯雙烷類化合物[241]，如下式化合物式中，R選自氫，直鏈或支鏈、未取代或取代、飽和或不飽和的?；?、垸基(如環(huán)垸基)、烯基、炔基和芳基，或其藥學上可接受的鹽或衍生物。例子包括但不限于木麻黃(casuarine)、木麻黃-6-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃、7-表-木麻黃、3,7-二表-木麻黃等。7菊糖[242]或其衍生物，如algammulin。式I、II或III的化合物或其鹽iniii如參考文獻243所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如與OH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>大腸桿菌C&cAen'cA/aco/Z)如OM174的脂質(zhì)A的衍生物(如參考文獻244和245所述)。,離子脂質(zhì)與(通常為中性)共脂質(zhì)(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙銨-二植?；字?乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-雙十二烷基氧基-溴化丙銨-二油?；字?乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制劑。優(yōu)選含有-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(順-9-四癸烯氧基)-l-丙銨鹽的制劑[246]。含有連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物，如TLR4拮抗劑E5564[247,248]:參考文獻249和250中更詳細地討論了這些和其它佐劑活性物質(zhì)。醫(yī)學方法和應用一旦配制好后，本發(fā)明組合物可直接給予對象。治療對象可以是動物；具體說，可治療人類對象。該疫苗特別可用于接種兒童和青少年。已證明疫苗在目(311-/-動物模型中有效，因此認為它們可用于治療免疫削弱的對象?？赏ㄟ^全身和/或粘膜途徑給予它們。一般地，將該免疫原性組合物制備成溶液或懸液形式的注射劑；適合在注射前用液體載體溶解或懸浮的固體形式。也可乳化該制劑或?qū)⑵浒b到脂質(zhì)體中以提高佐劑作用。通常通過胃腸道外(如注射，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)，或者遞送至組織間隙)直接遞送該組合物。也可將該組合物給予病灶。其它給藥方式包括口服給藥和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮施用(參見例如參考文獻251)，針注射和無針注射。給藥治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強劑量)。本發(fā)明疫苗優(yōu)選為無菌疫苗。它們優(yōu)選無熱原。優(yōu)選用緩沖液使(例如)pH6-pH8，通常約為pH7。本發(fā)明疫苗可包含低水平(如O.01。/。)去污劑(如吐溫，如吐溫80)。本發(fā)明疫苗可含有(如)約15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是凍干時?？蓱{經(jīng)驗評估各抗原的最佳劑量。然而通常，本發(fā)明抗原的給藥劑量為每劑量各種抗原0.1-100pg，典型劑量體積為0.5ml。劑量一般為每劑每種抗原5-20嗎。給予患者以誘導免疫應答的CDld配體量取決于給予該組合物的患者的年齡和體重，但一般含有1-100嗎/kg患者體重。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)低劑量CDld配體足以提高對共同給予抗原的免疫應答，并提高對該抗原的長期免疫記憶。因此，本發(fā)明組合物中CDld配體的含量可小于50pg/kg患者體重、小于20pg/kg、小于10pg/kg、小于5pg/kg、小于4嗎/kg或小于3pg/kg。本發(fā)明疫苗可以是預防性(即預防感染)或治療性(即在感染后治療疾病)疫苗，但一般是預防性疫苗。本發(fā)明提供醫(yī)用的CDld配體和B型鏈球菌抗原。本發(fā)明提供醫(yī)用的CDld配體和腦膜炎奈瑟球菌血清組B抗原。本發(fā)明提供醫(yī)用CDld配體和流感病毒抗原，所述抗原選自能夠或可能引起大流行爆發(fā)的流感毒株。本發(fā)明也提供了誘導患者產(chǎn)生免疫應答的方法，所述方法包括給予患者本發(fā)明疫苗。具體說，本發(fā)明提供在患者中產(chǎn)生免疫應答的方法，所述方法包括給予患者CDld配體和B型鏈球菌抗原。本發(fā)明提供在患者中產(chǎn)生免疫應答的方法，所述方法包括給予患者CDld配體和腦膜炎奈瑟球菌血清組B抗原。本發(fā)明提供在患者中產(chǎn)生免疫應答的方法，所述方法包括給予CDld配體和流感病毒抗原，所述流感病毒抗原選自能夠或可能引起大流行爆發(fā)的流感毒株。所述抗原和CDld配體可以同時、依次或單獨給予。例如，可以在給予該抗原之前或之后給予CDld配體以初免該哺乳動物，以提高該哺乳動物對該偶聯(lián)物的免疫應答。給予一種以上抗原時，可同時將該抗原與相對該抗原混合物單獨、同時或依次給予的CDld配體一起給予。產(chǎn)生免疫應答的方法可包括給予第一劑量的抗原和CDld配體，隨后給予任選的第二無佐劑劑量的抗原。第一劑量的抗原和CDld配體可同時、依次或單獨給予。免疫應答優(yōu)選為保護性免疫應答，可包括體液免疫應答和/或細胞免疫應答。該患者可以是成年人或兒童。該患者的年齡可以是0-6個月、6-12個月、1-5歲、5-15歲、15-55歲或55歲以上。該患者優(yōu)選為兒童。該患者可以是免疫削弱的患者。該患者可患有與免疫系統(tǒng)功能缺失有關(guān)的疾病，具體是與CD4T細胞應答功能缺失有關(guān)的疾病。這類疾病的例子包括但不限于AIDS、共濟失調(diào)毛細血管擴張、迪格奧爾格綜合征、全丙種球蛋白過少血癥、威-奧二氏綜合征和補體缺陷。本發(fā)明提供B型鏈球菌抗原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，該藥物與CDld配體一起給藥。本發(fā)明提供CDld配體原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，該藥物與B型鏈球菌抗原一起給藥。本發(fā)明提供B型鏈球菌抗原和CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用。本發(fā)明也提供B型鏈球菌抗原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用CDld配體預先治療過該患者。本發(fā)明提供CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用B型鏈球菌抗原預先治療過該患者。本發(fā)明提供B型鏈球菌抗原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用B型鏈球菌抗原和CDld配體預先治療過所述患者。本發(fā)明也提供腦膜炎球菌血清組B抗原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，該藥物與CDld配體一起給藥。本發(fā)明也提供CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，該藥物與腦膜炎球菌血清組B抗原一起給藥。本發(fā)明也提供B型鏈球菌抗原和CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用。本發(fā)明也提供腦膜炎球菌血清組B抗原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用CDld配體預先治療過該患者。本發(fā)明還提供CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用腦膜炎球菌血清組B抗原預先治療過該患者。本發(fā)明也提供腦膜炎球菌血清組B抗原在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用腦膜炎球菌血清組B抗原和CDld配體預先治療過所述患者。本發(fā)明也提供流感病毒抗原(如上所述)在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，該藥物與CDld配體一起給藥。本發(fā)明也提供CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，該藥物與流感病毒抗原(如上所述)一起給藥。本發(fā)明也提供流感病毒抗原(如上所述)和CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用。本發(fā)明也提供流感病毒抗原(如上所述)在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用CDld配體預先治療過該患者。本發(fā)明也提供CDld配體在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用流感病毒抗原(如上所述)預先治療過該患者。本發(fā)明提供流感病毒抗原(如上所述)在制備產(chǎn)生患者免疫應答的藥物中的應用，其中用流感病毒抗原(如上所述)和CDld配體預先治療過所述患者。所述藥物優(yōu)選為免疫原性組合物(如疫苗)。該藥物優(yōu)選用于預防和/或治療B型鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌(如腦膜炎、敗血癥等)或流感病毒引起的疾病?？捎脴藴蕜游锬Ｐ蜋z測這些疫苗(例如參見參考文獻252)。本發(fā)明還提供了一種藥盒，其裝有B型鏈球菌抗原和CDld配體。本發(fā)明還提供裝有腦膜炎奈瑟球菌血清組B抗原和CDld配體的藥盒。本發(fā)明還提供裝有流感病毒抗原和CDld配體的藥盒。優(yōu)選以藥盒單獨組分的形式提供抗原和配體，以使其適應單獨給予(例如)不同的肢體。定義術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由…組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如x士l(Fo。術(shù)語"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。必要時，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語"基本上"。附圖簡要說明圖l顯示Ig效價圖。A)用a-GC和細菌(破傷風類毒素TT或白喉類毒素DT)或病毒蛋白質(zhì)(流感毒株A的血凝素-神經(jīng)氨酸酶亞基H3N2)肌肉內(nèi)免疫的C57/BL6小鼠中蛋白質(zhì)特異性抗體的血清效價。用蛋白質(zhì)和a-GC(實心框)免疫的小鼠中抗體效價高于只用蛋白質(zhì)免疫的小鼠(空心框)。X軸表示以天計算的時間。B)甩H3N2和a-GC(實心框)免疫的攜帶iNKT細胞(Jal8+/+)的小鼠的H3N2-特異性抗體血清效價高于只用H3N2免疫的攜帶iNKT細胞的小鼠。用H3N2和a-GC(實心框)免疫的缺乏iNKT細胞(Jal8-/-)的小鼠的H3N2-特異性抗體血清效價并未高于只用H3N2免疫的缺乏iNKT細胞的小鼠。所有免疫均為皮下免疫。圖2顯示平均IgG效價圖。A)在產(chǎn)生IgGl和IgG2a抗體方面，與CFA、CpG、MF59和Alum相比oc-GC同樣強效?？乖荰T。B)用H3N2皮下免疫的固。11-/-小鼠產(chǎn)生可檢測的抗體(^0)效價，而只用H3N2或者以明砜為佐劑的H3N2皮下免疫MHC-IW-小鼠時則不產(chǎn)生可檢測的抗體(IgG)效價。圖3:a-GC和MF59在流感病毒感染的小鼠模型中的比較。所有免疫均為肌肉內(nèi)免疫。A)HlNl-特異性IgG效價(幾何平均值)。用H1N1和a-GC免疫的小鼠的抗體效價與用H1N1和MF59免疫的小鼠相當，并且明顯高于只用蛋白質(zhì)疫苗免疫的小鼠的效價。B)存活百分數(shù)與刺激后天數(shù)。用流感病毒刺激后，80%用H1N1和a-GC免疫的小鼠和100%用H1N1和MF59免疫的小鼠存活。圖4顯示H3N2Ig效價(幾何平均值)。白色框是無佐劑，陰影框為a-GC佐劑A)WT、IL-4-A和IFN-yR-A小鼠對用H3N2和a-GC皮下免疫(存在時用黑色表示)或單用H3N2皮下免疫(存在時用白色表示)的IgGl和IgG2a應答。單用H3N2免疫野生型小鼠能誘導IgGl應答(Th2)，而用H3N2和a-GC免疫能誘導IgGl和lgG2a應答(ThO)。單用H3N2免疫IL4-A小鼠不會誘導IgG應答，而用H3N2和a-GC免疫能誘導IgGl和IgG2a應答(ThO)。單用H3N2免疫IFN-YRV-小鼠能誘導IgGl應答(Th2)，用H3N2和a-GC免疫誘導的IgGl應答(Th2)明顯較高。虛線顯示測試血清的最低稀釋度。B)用H3N2和a-GC皮下免疫之前或期間用抗CD40L單克隆抗體治療的小鼠顯示的H3N2抗體效價明顯低于用對照IgG治療小鼠的觀察值。圖5:A)單用H3N2或用H3N2和a-GC在第0周和第2周初免小鼠。初次免疫30周后，單用H3N2蛋白加強免疫這兩組小鼠。該圖顯示H3N2-Ig效價(幾何平均數(shù))與時間(周)。箭頭顯示免疫時間。用兩個劑量的H3N2和a-GC初免，隨后單用蛋白質(zhì)加強免疫的小鼠(實心框)的抗體效價顯著高于單用H3N2初免和加強免疫的小鼠(空心框)。免疫是皮下免疫。B)按照圖5A初免的小鼠中H3N2-抗體分泌細胞前體的頻率(H3N2-IgGASC前體/一百萬個B細胞)。第30周時，用H3N2和a-GC免疫兩次的小鼠(陰影)中H3N2-抗體分泌細胞前體的頻率明顯高于單用H3N2免疫兩次的小鼠(白色)。圖6:H3N2-Ig效價(幾何平均值)與時間(周)。單用H3N2皮下免疫兩次的缺乏iNKT細胞的小鼠(Jaa18-/-)和攜帶iNKT細胞的小鼠(Jaa18+/+)中H3N2-特異性抗體的降解(decay)。與攜帶iNKT細胞的小鼠(圓形)相比，缺乏iNKT細胞的小鼠(三角形)中抗原-特異性抗體降解得較快。圖7顯示用破傷風類毒素+A佐劑最后一次(共兩次)免疫6周后C57BL/6小鼠的ASC前體(即記憶B細胞)頻率，表示為每一百萬個B細胞中的數(shù)量。在第0天和第14天用不含佐劑、a-GC或明礬的破傷風類毒素肌肉內(nèi)免疫C57BL/6小鼠。用破傷風類毒素和a-GC免疫的小鼠的TT-特異性記憶B細胞頻率明顯高于單用破傷風類毒素免疫的小鼠，用明礬為佐劑的破傷風類毒素免疫的小鼠則不。4表明相對于無抗原給藥p0.05，"表明p〈0.01。***表明相對于TTw/o佐劑p〈0.05。圖8:用于評價初免所用的所有疫苗劑量中是否需要存在a-GC的免疫方案。將20只6-8周齡C57BL/6雌性小鼠分成4組，每組5只小鼠。在第0周用PBS配制的H3N2免疫第1組，用H3N2+a-GC在2周后免疫。在第0周用H3N2+a-GC免疫第2組，用PBS配制的H3N2在2周后免疫。用PBS配制的H3N2在第0周和第2周免疫第3組。用H3N2和a-GC在第0周和2周后免疫第4組)。初次免疫后56周，用PBS配制的3嗎H3N2刺激所有組的小鼠，在第58周評估回憶應答。所有免疫均為肌肉內(nèi)免疫。圖9:將圖8第3組的小鼠的H3N2-抗體應答(用PBS配制的H3N2免疫兩次)與以下應答作比較A)圖8第4組小鼠的應答(用a-GC配制的H3N2免疫兩次)；B)圖8第1組小鼠的應答(用PBS配制的H3N2免疫，然后用a-GC配制的H3N2免疫)；和C)圖8第2組小鼠的應答(a-GC配制的H3N2和用PBS配制的H3N2免疫)?？贵w半衰期沒有差異。圖10:比較H3N2-抗體應答觀察到A)用a-GC免疫兩次(第4組)與a-GC僅用于第二次免疫(第1組)；B)用a-GC免疫兩次(第4組)與a-GC僅用于第一次免疫(第2組)的小鼠；和C)a-GC僅用于第一次免疫(第2組)與a-GC僅用于第二次免疫(第1組)。圖ll:如圖8所述免疫小鼠的回憶應答。單用H3N2加強免疫2周后(第56周時給予)，用一個或兩個劑量的a-GC初免的小鼠的回憶應答高于單用兩個劑量的H3N2初免的小鼠。數(shù)據(jù)是第56和58周的H3N2Ig效價(幾何平均值)。圖12:測定如圖13所述免疫小鼠的脾臟中MenB-特異性記憶B細胞的頻率。與明磯相比，用a-GC或MF59免疫小鼠的脾臟中MenB特異性記憶B細胞的頻率較高。該圖顯示每一百萬B淋巴細胞中的MenB-特異性IgG記憶B細胞。*和**:相對于無佐劑時p0.05和pO.Ol。圖13:用與0.1叱a-GC、0.6mg明礬、100piMF59混合或無佐劑的3種MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各自為20嗎/劑量、5嗎/劑量或2.5嗎/劑量)的混合物免疫小鼠。在第0天、第21天和第35天給予一系列三次免疫，每次免疫后評估各抗原的IgG效價，一直到第105天。a-GC和MF59誘導的殺菌抗體效價均高于明礬。圖14:將第0天和第21天肌肉內(nèi)免疫的小鼠對重組MenB抗原的CD4T細胞應答與下述應答作比較a)含有3種MenB抗原和a-GC的組合疫苗；b)含有3種MenB抗原和明礬的組合疫苗；或c)只含有3種MenB抗原的組合疫苗。第二次免疫兩周后，通過將總脾細胞與所示量的MenB重組蛋白培育16小時(最后14小時在布雷菲德菌素A存在下)評價CD4T細胞應答。通過胞內(nèi)染色和FACS分析產(chǎn)生TNFa的CD4T細胞數(shù)量。與含有明礬或無佐劑的MenB抗原組合免疫的小鼠相比，用三種MenB抗原和a-GC的組合免疫的小鼠一致地顯示出較高的CD4應答。作為陽性對照，檢測了所有三組小鼠對多克隆刺激的應答。所有三組小鼠對抗-CD3抗體(IaCD3)多克隆刺激的應答相同，如該圖的插圖所示。Y軸顯示產(chǎn)生TNFa的CD4T細胞占所有CD4+T細胞的百分數(shù)。圖15:效價(幾何平均數(shù))。比較用GBS抗原免疫的小鼠的IgG、IgGl和IgG2a效價。用1嗎GBS80和a-GC免疫的小鼠的IgGl和IgG2a效價明顯高于只用1嗎GBS80免疫的小鼠，而用明礬配制的GBS80免疫的小鼠則不。用20嗎GBS80和a-GC免疫的小鼠的IgGl效價與用20嗎GBS80和明礬免疫的小鼠相同，而lgG2a效價較高。*，**相對于GBS80w/o佐劑p0.05，pO.Ol。圖16:在第0天和第21天聯(lián)合使用三種MenB抗原(DG287nz-953、936-741或961c)之一或所有三種抗原的混合物與下述物質(zhì)免疫小鼠a)a-GC;b)明礬；或c)無佐劑。在第二次免疫兩周后和第三次免疫兩周后評估對MenB菌株MC58、2996、H44/76和NZ98/254的殺菌抗體的水平。與明砜相比，組合疫苗與佐劑ot-GC—起給藥時殺菌抗體明顯較高。所有免疫均為肌肉內(nèi)免疫。圖17:用GBS80免疫的母鼠脾臟中記憶B細胞的頻率。用GBS80和a-GC免疫的母鼠脾臟中產(chǎn)生GBS80-特異性抗體的漿細胞頻率明顯高于只用GBS80或用GBS80和明礬免疫的母鼠脾臟。該圖顯示每一百萬B淋巴細胞中GBS80IgG漿細胞的數(shù)量。圖18:比較用GBS80和a-GC免疫的母鼠和用GBS80和明砜免疫的母鼠中的漿細胞頻率。用GBS80和a-GC免疫的母鼠中漿細胞頻率明顯較高。該圖顯示每一百萬B淋巴細胞中GBS80IgG漿細胞的數(shù)量。圖19:單用3種MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各20昭/劑量)的混合物，用上述混合物和O.lpga-GC，或者用上述混合物和0.6mg明礬免疫小鼠。在第O天、第21天和第35天給予一系列三次免疫，每次免疫后評估各抗原的IgG效價。在提高對組合疫苗中所有三種MenB抗原的抗體應答方面，a-GC和明礬同樣有效。所有免疫均為肌肉內(nèi)免疫。實施本發(fā)明的方式有關(guān)實施本發(fā)明的方式的其它信息可參見參考文獻253。實施例i:求變,Mrr欲應祭勵產(chǎn)主沐/^疾^性貧體應芬，并麥勵遂存丑潘應記憶概述CDld-限制性非變異自然殺傷T(iNKT)細胞是識別糖脂抗原如a-半乳糖基神經(jīng)酰胺(cx-GC)的先天性淋巴細胞。為了研究先天免疫系統(tǒng)對體內(nèi)適應性免疫應答的作用，我們評價iNKT細胞能否影響抗體應答的重要特征，例如保護免受感染和B細胞記憶。我們用細菌或病毒蛋白與a-GC的組合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)用蛋白質(zhì)和a-GC免疫的小鼠的抗體效價比單用蛋白質(zhì)誘導的效價高一至兩個對數(shù)，最重要的是，它們防止感染如流感的保護力更高。用蛋白質(zhì)和常規(guī)佐劑刺激時，缺少MHCII類分子的小鼠不產(chǎn)生抗體，然而，用蛋白質(zhì)和a-GC免疫這些小鼠時能引發(fā)可檢測的蛋白質(zhì)特異性IgG，表明iNKT細胞可通過II類限制性CD4+T細胞部分替代對B細胞的輔助。最后，我們發(fā)現(xiàn)用蛋白質(zhì)和a-GC免疫的小鼠產(chǎn)生的蛋白質(zhì)特異性記憶B細胞的頻率高于單用蛋白質(zhì)免疫的小鼠的頻率。而且，缺少iNKT細胞的小鼠的循環(huán)抗體效價降低得比野生型小鼠快，這表明iNKT細胞對獎細胞壽命產(chǎn)生了出于預料的影響?？傊@些發(fā)現(xiàn)指出iNKT細胞在體內(nèi)調(diào)節(jié)抗體應答和B細胞記憶維持中的重要作用。結(jié)果iNKT細胞的激活提高體內(nèi)對蛋白質(zhì)抗原的抗體應答。近年來，我們證明人iNKT細胞可幫助B淋巴細胞在體外增殖和產(chǎn)生免疫球蛋白。為了測定此發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)相關(guān)性，我們用含有或不含NKT特異性糖脂a-GC的細菌(破傷風類毒素TT或白喉類毒素DT)或病毒蛋白質(zhì)(流感毒株A的血凝素-神經(jīng)氨酸酶亞基H3N2)免疫C57/BL6小鼠，并評價不同時間點上蛋白質(zhì)特異性抗體的血清效價。圖1A顯示使用所有抗原時，用蛋白質(zhì)和a-GC免疫的小鼠(實心框)的抗體效價比單用蛋白質(zhì)免疫的小鼠(空心框)高一至兩個對數(shù)。在BALB/c、CDl和C3H/HeJ小鼠中獲得相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。為了證明a-GC佐劑活性是由于激活iNKT細胞而產(chǎn)生，我們用含有或不含a-GC的Flu蛋白H3N2免疫攜帶(Jal8+/+和Jal8+A)或缺少(Jal8-/-)iNKT細胞的小鼠。用含有或不含a-GC的Flu蛋白H3N2如圖1B所示，無論是否存在iNKT細胞，單用H3N2免疫的所有小鼠(空心框)產(chǎn)生的抗體應答相當。然而，圖1B顯示用H3N2和a-GC免疫時(實心框)，攜帶iNKT細胞的小鼠的H3N2-特異性抗體血清效價明顯提高，而缺乏iNKT的小鼠則未見明顯提高。以下發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)進一步證明這些結(jié)果在缺少CDld的小鼠(CDW-)中a-GC不顯示佐劑活性，CDld是將a-GC遞呈給iNKT細胞T細胞受體的限制元件。為了比較a-GC活性與更常用佐劑的活性，用單獨給予的遞增劑量的TT，以及包含a-GC或最優(yōu)劑量的以下佐劑之一的抗原免疫小鼠CFA(用于小鼠的最強佐劑之一[254])，CpG(目前進行人類試驗的強效Th0/Thl免疫刺激劑[255])，MF59和明礬(批準用于人類的兩種佐劑[256，257]，被認為是ThO/Th2誘導物)。如圖2A所示，在幫助產(chǎn)生IgGl和IgG2a抗體方面，a-GC總體效力與上述基準佐劑相當。最后，我們評價了對蛋白質(zhì)抗原的抗體應答是否伴隨iNKT淋巴細胞的幫助而不需要常規(guī)CD4+T細胞的幫助，這種情況是常規(guī)佐劑無法提供幫助的情況。因此，用單獨的H3N2或含有a-GC或明礬的H3N2免疫兩組缺少MHCn類分子的C57BL/6小鼠(MHC-II-/-)兩次。不出所料，單用H3N2或以明礬為佐劑的H3N2免疫的目。11-/-小鼠不產(chǎn)生任何抗原特異性抗體(圖2B)。相反，用H3N2和a-GC免疫的^[11(:-11-/-小鼠產(chǎn)生可檢測的抗體(1§0)效價?？傊?，這些結(jié)果證明在體內(nèi)通過a-GC激活的iNKT細胞能通過與常規(guī)佐劑相當?shù)姆绞郊訌妼Φ鞍踪|(zhì)抗原的抗體應答。與這些佐劑不同的是，a-GC不需要MHC-II類分子限制性CD4T淋巴細胞來產(chǎn)生抗體應答。iNKT細胞幫助免疫證明a-GC能提高對病原體蛋白的抗體應答后，我們開始研究應答的質(zhì)量和這些抗體能否提供感染的保護。為此，我們比較了小鼠流感病毒感染模型中a-GC與MF59(批準用于人的流感疫苗佐劑)的佐劑作用。在第0天和第15天單用H1N1蛋白(來自甲型人流感病毒/新喀里多尼亞/20/99)、用含有a-GC或MF59的H1N1蛋白免疫成年C57BL/6小鼠。最后一次免疫兩周后，用90%致死劑量(LD)的小鼠-適應性A/WS/33流感病毒刺激小鼠，在接下來兩周研究其存活情況。如圖3A所示，刺激前一天，用H1N1和a-GC免疫的小鼠的抗體效價與用H1N1和MF59免疫的小鼠相當，并明顯高于單用該蛋白免疫的小鼠的效價。而且，圖3B顯示刺激兩周后，80%用H1N1和a-GC免疫的小鼠和100%用該蛋白和MF59免疫的小鼠存活，而在后續(xù)研究結(jié)束時，只有10%用單以該蛋白為基礎(chǔ)的疫苗免疫的小鼠仍存活?？傊?，我們從這些結(jié)果可以得出結(jié)論，a-GC-依賴性iNKT細胞激活可提高疫苗對抗感染性疾病的功效。iNKT細胞幫助B細胞的機制下一步，我們檢測了體內(nèi)驅(qū)動iNKT細胞幫助B細胞的機制。首先，為了研究細胞因子的作用，我們評價a-GC在C57BL/6小鼠和缺少細胞因子IL4或IFN-Y受體(IFN-YR)的同類系小鼠中的佐劑作用。圖4A(左圖)顯示，在野生型小鼠中，單用flu蛋白H3N2免疫(如白色所示)能誘導Th2應答(存在IgGl而不存在IgG2a)，而用該蛋白和a-GC免疫能引發(fā)平衡的ThO應答(同時存在IgGl和IgG2a)(如黑色所示)。圖4A的中圖顯示單用蛋白質(zhì)免疫時缺少IL-4的小鼠沒有發(fā)生任何抗體應答，而用該蛋白和a-GC免疫時它們產(chǎn)生平衡的Th0應答(如黑色所示)。最后，單用該蛋白免疫時缺少IFN-y受體的小鼠(圖4A，右圖)顯示出Th2應答(IgGl抗體)(如白色所示)。雖然用蛋白質(zhì)和a-GC免疫的小鼠中IgGl效價明顯提高(如黑色所示)，但IgG2a抗體水平?jīng)]有提高至背景水平以上?？傊@些發(fā)現(xiàn)證明，就a-GC依賴性iNKT細胞輔助B淋巴細胞而言，單獨IL-4不是必需的，而IFN-y是iNKT細胞的平衡(ThO)輔助效應所必需的。其次，我們想研究a-GC依賴性iNKT細胞的體內(nèi)輔助作用是否需要CD40/CD40L相互作用.。因此，我們評價了用飽和量的中和性抗CD40LmAb處理的小鼠對H3N2的抗體應答。如圖4B所示，用H3N2和a-GC免疫后，用抗CD40LmAb處理的小鼠的H3N2抗體效價明顯低于用對照IgG處理的小鼠。a-GC能提高回憶抗體應答并幫助維持B細胞記憶。適應性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵特征是對之前接觸的抗原較快產(chǎn)生"回憶"應答的能力。為了評價a-GC的佐劑作用是否影響回憶抗體應答，在第0周和第2周單用H3N2或用含a-GC的H3N2免疫小鼠兩次。然后，在第30周單用H3N2第三次(回憶)免疫所有小鼠。圖5A顯示，與圖l所示數(shù)據(jù)相一致，前兩次給藥后，用H3N2和a-GC免疫的小鼠的抗體效價明顯高于單獨接受H3N2的小鼠。兩組中H3N2-特異性抗體隨時間下降，約在第30周時達到背景水平，此時單用H3N2對所有小鼠進行第三次加強免疫。兩周后，我們評價抗體應答并發(fā)現(xiàn)，前兩次免疫時給予蛋白質(zhì)和a-GC的小鼠在第三次免疫后的抗體效價明顯高于所有三次免疫均單用蛋白質(zhì)免疫的小鼠(圖5A)。與這些結(jié)果相一致，在平行實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在第30周(恰好在第三次免疫前)在H3N2和a-GC免疫兩次的小鼠脾臟中檢測到的H3N2-抗體分泌細胞(ASC)前體頻率明顯高于單用H3N2免疫兩次的小鼠脾臟的頻率(圖5B)。為了進一步研究iNKT細胞在調(diào)節(jié)B細胞記憶中的作用，我們評價單用蛋白質(zhì)(H3N2)誘導的抗原特異性抗體在攜帶(Jal8+/+和Jal8+Z-)或缺乏(Jal8-/-)iNKT細胞的小鼠血清中的持續(xù)性。在所有小鼠組中，在第二次免疫兩周后，抗原特異性抗體效價達到峰值，其水平相當。然而，圖6顯示，雖然在攜帶iNKT細胞的小鼠中抗原特異性抗體以相似的緩慢速率下降，但在缺乏iNKT細胞的小鼠中抗體效價下降得明顯較快。由于這些小鼠均未接受a-GC，我們認為一定水平的iNKT"自發(fā)"活性可影響循環(huán)抗體的半衰期?？傊@些發(fā)現(xiàn)證明iNKT細胞激活導致回憶免疫的抗體應答較高，這是由于抗原特異性記憶B細胞庫增加。而且，iNKT體內(nèi)自發(fā)活性似乎在維持循環(huán)抗體水平中起到穩(wěn)態(tài)作用。實施例2:在不進行加強免疫時用a-GalCer初免顯著提高抗體應答如上所述，在第30周(恰好在第三次免疫前)在H3N2和a-GC免疫兩次的小鼠脾臟中檢測到的H3N2-抗體分泌細胞(ASC)前體(即記憶B細胞)頻率明顯高于單用H3N2免疫兩次的小鼠脾臟的頻率(圖5B)。在破傷風類毒素免疫的小鼠中進行的實驗獲得相似結(jié)果(圖7和18)。圖7顯示用不含佐劑、含a-GC佐劑或含明礬佐劑的破傷風類毒素在第0天和第14天進行兩次免疫，最后一次免疫6周后，C57BL/6小鼠的ASC前體頻率。與使用明礬佐劑相比，a-GC用作佐劑能顯著提高ASC前體的頻率。同樣，圖18顯示與用GBS80和明礬免疫相比，用GBS80和a-GC免疫兩次，最后一次免疫3個月后，CD1小鼠的ASC前體頻率明顯較高。作為佐劑在兩次免疫中給予時，與明礬相比a-GC顯著提高記憶B細胞頻率的能力表明，用作單次免疫中的佐劑時a-GC可能誘導特異性記憶B細胞增多。因此，進行實驗來評價單次給予a-GC和H3N2抗原對特異性B細胞記憶庫的影響(圖8-11)。圖8顯示了用于該實驗的免疫方案。將20只68周齡C57BL/6雌性小鼠分成4組，每組5只小鼠。在第0周用PBS配制的H3N2免疫第1組，用H3N2+01-0<3在2周后免疫。在第0周用H3N2+a-GC免疫第2組，用PBS配制的H3N2在2周后免疫。用PBS配制的H3N2在第0周和第2周免疫第3組。用H3N2和a-GC在第0周和2周后免疫第4組。初次免疫56周后，用PBS配制的3嗎H3N2刺激所有組的小鼠。所有免疫均為肌肉內(nèi)免疫。圖9比較了第3組小鼠(用PBS配制的H3N2免疫)的H3N2-抗體應答與兩次免疫中用a-GC免疫(圖A)、僅在第一次免疫中用a-GC免疫(圖B)和僅在第二次免疫中用a-GC免疫(圖C)的小鼠的應答。發(fā)現(xiàn)即使僅在第一或第二次免疫中給予，a-GC也能提高抗體應答。沒有觀察到四組之間的抗體半衰期差異。圖10提供采用以下方案觀察到的抗體應答的成對比較A訴a-GC免疫兩次與a-GC僅用于第二次免疫；B)用a-GC免疫兩次與a-GC僅用于第一次免疫的小鼠；和C)a-GC僅用于第一次免疫與a-GC僅用于第二次免疫。在第一次疫苗給藥中給予a-GC時觀察到最大功效。在第一次疫苗給藥中提供a-GC產(chǎn)生的抗體應答高于在第二次疫苗給藥中提供a-GC(圖IOC)，在第一次疫苗給藥中提供a-GC時的抗體應答與兩次疫苗給藥中均提供a-GC時的應答相似(圖IOB)。圖11確認用a-GC初免的小鼠對免疫接種的回憶應答高，即使a-GC僅包含在兩次初免注射的第一次給藥或第二次給藥中。這些結(jié)果提示，疫苗組合物中包含佐劑a-GC可降低實現(xiàn)長期免疫記憶所需的初免免疫次數(shù)并降低加強免疫的頻率和次數(shù)。實施例3:a-GC能提高無乳鏈球菌誘導的新生兒敗血癥小鼠模型中的保護性抗體應答檢測a-GC提高無乳鏈球菌感染誘導的新生兒敗血癥小鼠模型中保護性抗體應答的能力。將雌小鼠分成3組。在第0天用不含佐劑的20嗎GBS80初免第1組，在第21天用相同組合物加強免疫。在第23天使小鼠交配，在第43-36天采血，以評價GBS80-IgG效價，然后在第50-53天生產(chǎn)小鼠后代。在出生后0-48小時用90%致死劑量的無乳鏈球菌刺激后代。加強免疫3個月后，處死母鼠，取出脾臟，評價GBS80-IgG血漿細胞前體頻率。對第2組和第3組實施相同的免疫方案，不同之處在于用GBS80和明礬初免和加強免疫第2組的小鼠，用GBS80和0.1嗎a-GC初免和加強免疫第3組的小鼠。結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>**相對于GBS-80pO.01;§相對于明磯配制的GBS-80pO.OOl因此，a-GC用作佐劑在母鼠中誘導的GBS80-IgG應答比明礬誘導的IgG應答高8倍。母鼠中較高的抗體應答導致保護其后代免受GBS感染的保護力提高。用GBS80和a-GC免疫的母鼠后代中70。/。經(jīng)無乳鏈球菌刺激后存活下來，相比較而言用GBS80和明礬免疫的母鼠后代中只有30%存活。用20嗎或l昭GBS80免疫的小鼠重復實驗。第O天初免所有小鼠，第20天加強免疫，第34天交配，第48天放血，接著在第54-58天生產(chǎn)后代。立即用90%致死劑量的無乳鏈球菌剌激后代，48小時時評價存活率。加強免疫3個月后處死母鼠，取出脾臟評價GBS80-IgG漿細胞前體頻率。用含有明礬、a-GC或不含佐劑的1嗎GBS80;含有明礬、a-GC或不含佐劑的20嗎GBS80;或單用PBS或明礬佐劑免疫小鼠。如圖15所示，用l嗎GBS80和a-GC免疫的小鼠IgGl和IgG2a效價明顯高于用1嗎GBS80和明礬免疫的小鼠。用20嗎GBS80和a-GC免疫的小鼠的IgGl效價與用20嗎GBS80和明礬免疫的小鼠相同，而IgG2a效價較高。結(jié)果如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>單尾費氏檢驗^目對于GBS80w/o佐劑p〈0.05因此，用GBS80和a-GC免疫的小鼠的％存活率等于用GBS80和明礬免疫的小鼠的存活率。用GBS80和a-GC免疫的母鼠脾臟也含有明顯較高頻率的GBS80IgG漿細胞和記憶B細胞(分別參見圖17和18)，通過評價在單獨的培養(yǎng)基中或在CpG和IL-2存在下培育的脾細胞有限稀釋培養(yǎng)物的10-天上清液中GBS80-特異性抗體的存在來確定GBS80-特異性漿細胞和記憶b細胞的頻率，如參考文獻258所述。在另一個實驗中，用PBS、GBS80、GBS80+明礬或GBS80+a-GC免疫懷孕CD1雌小鼠。在各組免疫的CD1雌鼠或未經(jīng)免疫的CD1雌鼠分娩前1周采集血清，收集該血清，皮下注射(3W/劑，終體積為20pl)給未經(jīng)免疫的CD1母鼠的出生后24小時的新生小鼠。3小時后，用1LD90的活無乳鏈球菌腹膜內(nèi)刺激所有新生小鼠。繼續(xù)觀察幼鼠的存活率2天。用經(jīng)GBS80免疫的母鼠血清免疫的幼鼠全部死亡(28只幼鼠死亡28只)，用經(jīng)PBS免疫的母鼠血清免疫的27只幼鼠中只有1只存活。佐劑(明礬或a-GC)的存在提高存活率，在提高存活率方面用a-GC免疫比用明礬免疫更有效。用經(jīng)GBS+a-GC免疫的母鼠血清免疫的幼鼠存活率比用GBS+明礬免疫的母鼠血清免疫的幼鼠存活率高165%。這些數(shù)據(jù)表明，令人驚訝地，與明礬相比，a-GC明顯能更有效地誘導對無乳鏈球菌的保護性免疫應答。實施例4:a-GC能提高對含有腦膜炎奈瑟球菌血清組B的幾種蛋白質(zhì)抗原的組合疫苗的抗體應答評價a-GC用作腦膜炎奈瑟球菌血清組B(MenB)抗原組合的佐劑的能力。用3種MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各20pg/劑量)的混合物，用上述混合物和O.l嗎a-GC，或者用上述混合物和0.6mg明礬免疫小鼠。在第0天、第21天和第35天給予一系列三次免疫，每次免疫后評估各抗原的IgG效價。如圖19所示，在提高對組合疫苗中所有三種MenB抗原的抗體應答方面，a-GC和明礬同樣有效。a-GC也能提高對這些抗原的殺菌應答。圖16比較了用含有明礬、a-GC或不含佐劑的3種MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c的混合物或單個抗原免疫的小鼠血清樣品中，對MenB菌株MC5S、2996、H44/76和NZ98/254的殺菌抗體應答。對MenB抗原和a-GC免疫的殺菌應答一致高于對MenB抗原和明礬免疫的應答。進行第二個實驗，以評價MenB抗原的離體CD4T細胞應答。用PBS、明礬或a-GC配制的MenB抗原混合物免疫6只CD1雌小鼠的小組兩次。第二次免疫10天后，每組處死3只小鼠，取出其脾臟。用MenB抗原培育來自單個小鼠的全脾細胞懸液16小時，后12小時在布雷菲德菌素A存在下培養(yǎng)，以便在細胞內(nèi)蓄積細胞因子。固定刺激的脾細胞，通透，并用抗-CD3、抗-Cd4、抗-CD69、抗-IFNg和抗-TNFa單克隆抗體染色。通過FACS分析測定整個CD4+細胞群體中CD3+CD4+CD69+細胞因子+細胞的百分數(shù)。結(jié)果見圖14。發(fā)現(xiàn)與明磯相比，a-GC能更有效地擴增因MenB抗原而產(chǎn)生TNFa的CD4T細胞，這表明a-GC能夠?qū)enB抗原誘導至少與明礬相同的細胞介導的免疫應答。作為陽性對照，檢測了所有三組小鼠對多克隆刺激的應答。所有三組小鼠對抗-CD3抗體(IaCD3)多克隆剌激的應答相同，如圖14插圖所示。進行另一個實驗，以評價與明礬或MF59相比，a-GC用作同樣三種MenB抗原的佐劑的能力。用與O.lpga-GC、0.6mg明礬、100piMF59混合或無佐劑的3種MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各自為20嗎/劑量、5嗎/劑量或2.5pg/劑量)的混合物免疫小鼠。在第0天、第21天和第35天給予一系列三次免疫，每次免疫后評估各抗原的IgG效價。如圖13所示，a-GC和MF59誘導的殺菌抗體效價均高于明礬。也測定免疫小鼠的脾臟中MenB-特異性記憶B細胞的頻率。如圖12所示，與明礬相比，用a-GC或MF59免疫的小鼠脾臟中MenB特異性記憶B細胞的頻率較高。這些數(shù)據(jù)表明，a-GC誘導對抗MenB抗原的殺菌免疫應答和誘導長期免疫記憶所需的Men-B特異性記憶B細胞的有效性高于明礬，與MF59相當。應理解，通過實施例只是描述了本發(fā)明，可對詳細描述作一些修改但仍屬于本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。參考文獻Natori等，Tetrahedron,1994，50:2771-2783。[2]EP-A-1018548。Galli等，Vaccine,2003，21:S2/48-S2/54。[4]Galli等，J.Exp.Med.，2003，197:1051-1057。[5]WO03/009812。Gonzalez-Aseguinolaza等，J.ExpMed，2002，5:617-624。[7]Huang等，2003，摘要396，第10屆逆轉(zhuǎn)錄病毒和機會性感染會議(10thConferenceonretrovirusesandopportunisticinfection)。[8]Ko等，J.Immunol,2005，175:3309-3317。[9]DeLibero等，NatureReviewsImmunology，2005，5:485-496。[10]US5,936,076。WO03/I05769。Oki等，J.Clin.Investig.，113:1631-1640。US2005/0192248。Yang等，Angew.Chem.Int.Ed，2004，43:3818-3822。Goff等，J.Am.Chem.Soc，2004，126:13602-13603。Ndonye等，J.Org.Chem.，2005，70:10260-10270。Wu等，PNAS，2005，102(5):1351-1356。Mattner等，Nature,2005，434:525-529。Kinjo等，Nature,2006，7(9):978-986。WO03脂985。Wessels等(1990)JClinInvest86:1428-33。Wessels等(1989)InfectImmun57:1089-94。國際專利申請PCT/IB03/01436。Ravenscroft等(1999)Vaccine17:2802-2816。Costantino等(1999)Vaccine17:1251-1263。Anonymous(2002年1月)ResearchDisclosure,453077。Anderson(1983)InfectImmun39(l):233-238。Anderson等(1985)JClinInvest76(l):52-59。EP-A-0372501。EP-A-0378881。EP-A-0427347。W093/17712WO94/03208。W098/58668。Falugi等(2001)EurJImmunol31:3816-3824。40]Baraldo等(2004)InfectImmun.72:4884-7。41JEP-A-0594610?！?2]WO00/56360?！?3]WO02顧998?！?4]Kuo等(1995)InfectImmun63:2706-13?！?5]WO01/72337?！?6]WO00/61761?！?7]WO99/42130。「48]WO2004/011027?！?9]WO96/40242。50]Lees等(1996)Vaccine14:190-198。51]WO95/08348。52]W098/42721。53]美國專利4,882,317。54]美國專利4,695,624。55]Mol.Immunol,1985，22，907-919。56]EP-A-0208375。57]WO00/10599。58]Gever等，Med.Microbiol.Immunol,165:171-288(1979)。59]美國專利4,057,685。60]美國專利4,673,574;4,761,283;4,808,700。61]美國專利4,459,286。62]美國專利4,965,338。63]美國專利4,663,160?！?4]美國專利4,761,283?！?5]美國專利4,356,170。「66〗Lei等(2000)DevBiol(巴塞爾)103:259-264?！?7]WO00/38711;美國專利6,146,902。[68〗WO2006膨685。[69]W099/24578。[70]W099/36544。[71]WO99/57280。[72]WO00/22430。Tettelin等(2000)Science287:1809-1815。[74]W096/29412。Pizza等(2000)Science287:1816-1820。[76]WO02/22167。Bell(2000)PediatrInfectDisJ19:1187-1188。Iwarson(1995)APMIS103:321-326。Gerlich等(1990)Vaccine8增刊S63-68和79-80。Hsu等(1999)ClinLiverDis3:901-915。WOO1/37869WO04/005473Gustafsson等(1996)N.Engl.J.Med.334:349-355。[85]Rappuoli等(1991)TIBTECH9:232-238。Vacdnes(疫苗)(2004)，Plotkin禾C1Orenstein編，ISBN0-7216-9688-0。WO02/02606。Kalman等(1999)NatureGenetics21:385-389。Shirai等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊3):S524隱S527。WO99/27105。WO00/27994。WO00/37494。W099/28475。Ross等(2001)Vaccine19:4135-4142。121896]Sutter等(2000)PediatrClinNorthAm47:287-308。97]Zimmerman禾卩Spann(1999)AmFamPhysician59:113-118，26。98]Dreesen(1997)Vaccine15增刊S2-6。99]MMWRMorbMortalWklyRep1998年1月16日；47(1):12，19。100101102103104105106107108109110111112113114115116117118119120121122Covacci禾口Rappuoli(2000)J.Exp.Med.19:587-592。WO93/18150。Covacci等(1993)Proc.NatlAcad.Sci.USA90:5791-5795。Tummuru等(199勺Infect,Immun.61:1799-1809。Marchetti等(1998)Vaccine16:33-37。Telford等(1994)J.Exp.Med.179:1653-1658。Evans等(1995)Gene153:123-127。WO96/01272和WO96/01273,特別是SEQIDNO:6。W097/25429。WO98/04702。McMichael(2000)Vaccine19增刊1:S101-107。Schuchat(1999)Lancet353(9146):51-6。WO02/34771。Dale(1999)InfectDisClinNorthAm13:227-43，viii。Ferretti等(2001)PNASUSA98:4658-4663。Kuroda等(2001)Lancet357(9264):1225-1240;也參見第1219頁。Anderson(2000)Vaccine19增刊1:S59-65。Kahn(2000)CurrOpinPediatr12:257-262。Crowe(1995)Vaccine13:415-421。JToxicolClinToxicol(2001)39:85-100。Demicheli等(1998)Vaccine16:880-884。Stepanov等(1996)JBiotechnol44:155-160。EP-A-0139417。[123]Harper等(2004)Lancet364(9447):1757-65。Charalambous禾口Feavers(2001)JMedMicrobiol50:937-939。WO01/52885。Bjune等(1991)Lancet338(8775):1093-1096。Fukasawa等(1999)Vaccine17:2951-2958。Rosenqvist等(1998)Dev.Biol.Stand.92:323-333。WO2004/032958。W096/37624。W098/46262。Herlocher等(2004)JInfectDis190(9):1627-30。Le等(2005)Nature437(7062):1108。Hoffmann等(2002)Vaccine20:3165-3170。Subbarao等(2003)Virology305:192-200。Liu等(2003)Virology314:580-590。Ozaki等(2004)J.Virol.78:1851-1857。Webby等(2004)Lancet363:1099-1103。WO00/60050。WO01/04333。US6649372。Neumann等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9。WO01/83794。Hoffmann等(2000)Virology267(2):310隱7。WO97/37000。Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100。Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7。Tree等(2001)Vaccine19:3444-50。Kistn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給予過所述患者。26.抗原和CDld配體在誘導患者免疫應答中的用途，其中所述抗原和CDld配體在超過一年以前也給予過所述患者。27.如權(quán)利要求25所述的方法或如權(quán)利要求26所述的用途，其特征在于，所述免疫應答是保護性免疫應答。28.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法或用途，其特征在于，同時、依次或單獨給予所述抗原和CDld配體。29.如權(quán)利要求18-28中任一項所述的方法或用途，其特征在于，給予所述患者的所述CDld配體給藥量小于10pg/kg患者體重。30.—種在患者中誘導針對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括給予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配體，其中所述組合物中CDld配體的含量小于10昭/kg患者體重。31.抗原和CDld配體在誘導患者免疫應答中的用途，其中所述CDld配體用量小于10pg/kg患者體重。32.如權(quán)利要求30或31所述的方法或用途，其特征在于，所述免疫應答是保護性免疫應答。33.如權(quán)利要求30-32中任一項所述的方法或用途，其特征在于，同時、依次或單獨給予CDld配體和抗原。34.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法或用途，其特征在于，所述抗原是偶聯(lián)于載體蛋白的糖抗原。35.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法或用途，其特征在于，所述抗原是蛋白質(zhì)抗原。36.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、用途、組合物或藥盒，其特征在于，所述CDld配體激活非變異NKT細胞。37.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、用途、組合物或藥盒，其特征在于，與不存在CDld配體時非變異NKT細胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平相比，所述CDld配體提高了非變異NKT細胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平。38.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、用途、組合物或藥盒，其特征在于，所述CDld配體是糖脂。39.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、用途、組合物或藥盒，其特征在于，所述CDId配體是a-糖基神經(jīng)酰胺。40.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、用途、組合物或藥盒，其特征在r-，所述CDld配體是a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺或其類似物。41.如前述任一項權(quán)利要求所述的方法、用途、組合物或藥盒，其特征在于，所述CDld配體是選自KRN7000、OCH或CRONY-101的a-半乳糖基神經(jīng)酰胺類似物。全文摘要本發(fā)明涉及含有在不給予加強劑量和/或不給予多次初免劑量的情況下能誘導長期免疫記憶的CD1d配體的免疫原性組合物。本發(fā)明還涉及含有CD1d配體和流感病毒、B型鏈球菌和腦膜炎球菌血清組B抗原的免疫原性組合物。文檔編號A61K39/39GK101443039SQ200780017402公開日2009年5月27日申請日期2007年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日發(fā)明者G·蓋利申請人:諾華疫苗和診斷有限公司