專利名稱：：17-氧基麥克菌素衍生物及其在癌癥和/或b-細(xì)胞惡性腫瘤的治療中的用途的制作方法17-氧基麥克菌素衍生物及其在癌癥和/或B-細(xì)胞惡性腫瘤的治療中的用途發(fā)明的背景90kDa熱休克蛋白(Hsp90)是蛋白質(zhì)折疊和裝配中涉及的豐富的分子伴侶，它們中的許多也參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(綜述參見Neckers，2002;Sreedhar等人，2004a;Wegele等人，2004和本文中的參考文獻(xiàn))。至今已經(jīng)鑒別了近50種這些所謂的客戶蛋白(clientproteins),包括類固醇受體、非受體酪氨酸激酶例如src家族、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶例如cdk4和cdk6、嚢性跨膜調(diào)節(jié)子、一氧化氮合酶和其它(Donz6和Picard，1999;McLaughlin等人，2002;Chiosis等人，2004;Wegele等人，2004;http:〃www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf)。jt匕夕卜，Hsp90在細(xì)胞對(duì)抗突變影響的應(yīng)^LA應(yīng)和保護(hù)作用中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Bagatell和Whitesell，2004;Chiosis等人，2004)。Hsp90的功能是復(fù)雜的，涉及動(dòng)態(tài)多酶復(fù)合體的形成(Bohen，1998;Liu等人，1999;Young等人，2001;Takahashi等人，2003;Sreedhar等人，2004;Wegele等人，2004)。Hsp90是導(dǎo)致客戶蛋白降解、細(xì)胞周期失調(diào)和細(xì)胞凋亡的抑制劑的靶(Fang等人，1998;Liu等人，1999;Blagosklonny，2002;Neckers,2003;Takahashi等人，2003;Beliakoff和Whitesell,2004;Wegele等人，2004)。近來，已經(jīng)確定Hsp90是肺瘤侵入的重要的胞外介體(Eustace等人，2004)。已將Hsp90視為癌癥治療的新型主要治療靶，這反映在對(duì)Hsp90功能的密集而詳細(xì)的研究(Blagosklonny等人，1996;Neckers，2002;Workman和Kaye，2002;Beliakoff和Whitesell,2004;Harris等人，2004;Jez等人，2003;Lee等人,2004)以及高通量篩選測(cè)定的研發(fā)中(Carreras等人，2003;Rowlands等人，2004)。Hsp90抑制劑包括化合物類型例如安莎霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、嘌呤、吡唑類、香豆素抗生素及其他(綜述參見Bagatell和Whitesell,2004;Chiosis等人，2004和本文中的參考文獻(xiàn))。苯型安沙霉素是一大類化學(xué)結(jié)構(gòu)，其特征是連接在芳香環(huán)結(jié)構(gòu)任一側(cè)的不同長(zhǎng)度的脂肪環(huán)。天然存在的安沙霉素包括麥克菌素(macbecin)和18,21-二氫麥克菌素(也分別稱為麥克菌素I和麥克菌素II)(1&2;Tanida等人，1980)、格爾德霉素(3;DeBoer等人，1970;DeBoer和Dietz，1976;WO03/106653和本文中的參考文獻(xiàn))，和除莠霉素家族(4;5，6，Omura等人，1979，Iwai等人，1980和Shibata等人，1986a,WO03/106653和本文中的參考文獻(xiàn))。H3CO、、、、''..'H3CO'oI」6OHOoH,、,OCH3\一H3CO、、、''、■'H3CO'OH、、OCH3、、、"麥克菌素>H3CO■'NH2VONH218,21'二氫麥克菌素(是克S素H),2O..丄L、、、'oH、、、'OH3CO'一"'、、、OHH3CQH3CO，、、、"飛O、、、、■H!H3CO,、、0R2\.、.,o格爾德霉素.3NH2除莠霉素A,4RfOCH3,R2-CH3除莠霉素B,5R^H.R2-H除^霉;C,6Rt-OCHg,R2=H最初鑒別安沙霉素是出于它們的抗細(xì)菌和抗病毒活性，然而，目前，它們作為抗癌劑的潛在應(yīng)用已經(jīng)吸引了更大的興趣(Beliakoff和Whitesell，2004)。目前，臨床實(shí)驗(yàn)正在評(píng)估許多Hsp90抑制劑(Csermely和Soti，2003;Workman,2003)。特別的，格爾德霉素具有鈉摩爾級(jí)效價(jià)，并且對(duì)依賴異常蛋白激酶的腫瘤細(xì)胞具有明顯的特異性(Chiosis等人，20(B;Workman,2003)。已經(jīng)顯示Hsp90抑制劑的治療提高了放射對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用，并且還已經(jīng)證實(shí)，通過結(jié)合Hsp90抑制劑和細(xì)胞毒劑，增加了細(xì)胞殺傷能力(例如，乳癌、慢性髓性白血病和非小細(xì)胞肺癌)(Neckers，2002;Beliakoff和Whitesell，2004)?？寡苌苫钚缘臐摿σ彩橇钊烁信d趣的Hsp90客戶蛋白HIF-la在實(shí)體腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Hur等人，2002;Workman和Kaye，2002;Kaur等人，2004)。Hsp90抑制劑還具有免疫抑制劑的作用，涉及一些類型的胂瘤細(xì)胞在Hsp卯抑制作用后的補(bǔ)體誘導(dǎo)裂解(Sreedhar等人，2004)。Hsp90抑制劑的治療還可以導(dǎo)致與免疫細(xì)胞介導(dǎo)的裂解相關(guān)的誘導(dǎo)的過氧化物產(chǎn)生(Sreedhar等人，2004)。還討論了Hsp卯抑制劑作為潛在的抗疾疾藥物的用途(Kumar等人，2003)。此外，還顯示格爾德霉素干擾復(fù)雜糖基化的哺乳動(dòng)物朊病毒蛋白Prpc的形成(Winklhofer等人,2003)。如上所述，安沙霉素還作為潛在的抗癌和抗B細(xì)胞惡性腫瘤化合物受到關(guān)注，然而目前可獲得的安沙霉素表現(xiàn)出不佳的藥理學(xué)和制藥性質(zhì)，例如它們表現(xiàn)出不佳的水溶解性、不佳的代謝穩(wěn)定性、不佳的生物利用率或不佳的配制能力(Goetz等人，2003;Workman2003;Chiosis2004)。由于強(qiáng)烈的肝臟毒性(綜述Workman,2003),除莠霉素A和格爾德霉素都凈皮認(rèn)為是臨床實(shí)驗(yàn)的不良候選物，并且格爾德霉素還由于肝臟毒性被撤出了I期臨床實(shí)驗(yàn)(Supko等人，1995;WO03/106653)。格爾德霉素是從吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的培養(yǎng)濾過物中分離的，表現(xiàn)出體外抗原生動(dòng)物的強(qiáng)活性和抗細(xì)菌和真菌的弱活性。在1994年揭示了格爾德霉素與Hsp90的聯(lián)系(Whitesell等人，19M)?？寺〔y(cè)序了格爾德霉素的生物合成基因簇(Allen和Ritchie,1994;Rascher等人，2003;WO03/106653)。用NCBI登錄號(hào)AY179507可獲得DNA序列。近來也描述了來自吸水鏈霉菌二重霉素亞種(S.hygroscopicussubsp.duamyceticus)JCM4427的、遺傳改造的格爾德霉素生產(chǎn)菌林的分離，以及4，5-二氫-7-0-脫氨甲?；?7-羥基格爾德霉素和4，5-二氫-7-0-脫氨曱?；?7-羥基-17-0-去甲基格爾德霉素的分離(Hong等人，2004)。通過向除莠霉素生產(chǎn)菌林吸7jC鏈霉菌AM-3672飼喂格爾德霉素，分離到化合物15-羥基格爾德霉素、三環(huán)格爾德霉素類似物KOSN-1633和曱基-格爾德霉素(methyl-geldanamycinate)(Hu等人，2004)。自吸水鏈霉菌K279-78分離了兩種化合物17-曱?；?17-去甲氧基-18-0-21-0-二氫格爾德霉素和17-羥甲基-17-去甲氧基格爾德霉素。吸水鏈霉菌K279-78是含有黏粒pKOS279-78的吸水鏈霉菌NRRL3602,所述黏粒具有44kbp插入片段，其含有來自除莠霉素生產(chǎn)菌林吸水鏈霉菌AM-3672的多個(gè)基因(Hn等人，2004)。在格爾德霉素生物合成簇的聚酮化合物合成酶模塊中的四個(gè)中，已經(jīng)對(duì)酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了取代(Patel等人，2004)。在模塊l、4和5中進(jìn)行的AT取代導(dǎo)致了全加工的類似物14-去甲基-格爾德霉素、8-去曱基-格爾德霉素和6-去甲氧基-格爾德霉素，以及未全加工的4，5-二氫-6-去甲氧基-格爾德霉素。模塊7?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域的取代導(dǎo)致了產(chǎn)生三種2-去甲基化合物，KOSN1619、KOSN1558和KOSN1559，其中之一(KOSN1559)，即格爾德審素的2-去甲基-4，5-二氫-"-去曱氧基-21-脫氧衍生物，與Hsp卯的結(jié)合具有比格爾德霉素高4倍的結(jié)合親和力，比17-AAG高8倍的結(jié)合親和力。然而，在使用SKBr3的ICso測(cè)量中它并沒有表現(xiàn)出改善。另一個(gè)類似物，被稱為KOS-1806的新型非笨型格爾德霉素具有單酚結(jié)構(gòu)(Rascher等人.，2005)。對(duì)KOS-1806沒有給出活性數(shù)據(jù)。1979年，自吸水鏈霉菌菌林號(hào)AM-3672的發(fā)酵肉湯中分離了安沙霉素類抗生素除莠霉素A，并根據(jù)它的潛在的除草劑活性命名。通過4吏用感染了勞斯氏肉瘤病毒(RSV)溫度敏感突變林的大鼠腎系細(xì)胞建立了抗腫瘤活性，所述細(xì)胞用于篩選逆轉(zhuǎn)這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化形態(tài)的藥物(綜述參見Uehara，2003)。推斷除莠霉素A主要通過與Hsp90分子伴侶蛋白結(jié)合發(fā)揮作用，還討論了與保守的半胱氨酸殘基的直接結(jié)合，和隨后的激酶的失活(Uehara，2003)。已經(jīng)分離了化學(xué)衍生物，與除莠霉素A相比，在在苯醌核C19處具有改變的取代基的化合物，和在安沙鏈(ansachain)中的鹵代化合物表現(xiàn)出較低的毒性和更高的抗肺瘤活性(Omura等人，1984;Shibata等人，1986b)。WO03/106653和近期的文獻(xiàn)中鑒別了除莠霉素生物合成基因簇的序列(Rascher等人，2005)。根據(jù)它們的抗真菌和抗原生動(dòng)物活性來鑒別，自諾卡氏菌屬物種(Nocardiasp)No.C-14919(珍貴束絲》文線菌珍貴亞種04"/mw^me/wfl/w"/仍tmism^7/;rW仍Mm)ATCC31280)的培養(yǎng)上清液中分離了安沙霉素化合物麥克菌素(1)和18，21-二氫麥克菌素(2)(C-14919E-1和C-14919E-1)(Tanida等人，1980;Muroi等人，1980;Muroi等人，1981;US4，315，989和US4,187,292)。18，21-二氫麥克菌素的特征是含有二氫醌形式的核。麥克菌素和18,21-二氫麥克菌素都表現(xiàn)出具有相似的抗細(xì)菌和抗腫瘤活性，這是針對(duì)例如鼠白血病P388細(xì)胞系的癌細(xì)胞系(Ono等人，1982)。麥克菌素不抑制逆轉(zhuǎn)錄酶和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的活性(Ono等人，1982)。文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了麥克菌素的Hsp90抑制功能(Bohen，1998;Liu等人，1999)。在專利US4，421，687和US4,512,975中描述了在添加到孩i生物培養(yǎng)肉湯后，麥克菌素和18，21-二氫麥克菌素轉(zhuǎn)換為在一個(gè)或多個(gè)特定位置具有羥基基團(tuán)而非甲氧基團(tuán)的化合物。在大量土壤微生物的篩選過程中，自屬于鏈霉菌屬的生產(chǎn)菌林中鑒別了化合物TAN國420A至E(7-11，EP0110710)。TAN-420A,7R^H,R2=HTAN-420C,9R一，R2=CH3TAN-420E,11RpGHg,R2=CH:NH2TAN-420B,8R，-H,R2-HTAN-420D'10RfH'R2=CH3在2000年，描述了自鏈霉菌屬物種(^/r/^附y(tǒng)c^^.)S6699的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離了格爾德霉素相關(guān)的、非苯醌安沙霉素代謝物reblastin,及其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的治療價(jià)值(Stead等人，2000)。另一個(gè)不同于化學(xué)不相關(guān)的苯醌安沙霉素的Hsp卯抑制劑是才艮赤殼素(單孢菌素)，其最初是由于抗真菌活性而自真菌波諾頓單孢菌(7l化mw/wWM附/wwonfew)中發(fā)現(xiàn)(綜述參見Uehara，2003)，還發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與自放射叢赤殼菌(Nectriaradicicola)分離的14-元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯相同。除了它的抗真菌、抗細(xì)菌、抗原生動(dòng)物和細(xì)胞毒性的活性外，隨后還鑒別了它作為Hsp90分子伴侶蛋白的抑制劑(綜述參見Uehara，2003;Schulte等人，1999)。還描述了根赤殼素的抗血管生成活性(Hur等人，2002)及其半合成的衍生物(Kurebayashi等人，2001)。目前，注意力集中在格爾德霉素的17-M衍生物作為新一代的安沙審素抗癌化合物上(Bagatell和Whitese11，2004)，例如，17-(烯丙基胺基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG,12)(Hostein等人，2001;Neckers，2002;Nimmanapalli等人，2003;Vasilevskaya等人，2003;Smith-Jones等人，2004)和17-去曱氧基-17-N，N-二甲絲乙絲-格爾德霉素(17-DMAG，13)(Egorin等人，2002;Jez等人，2003)。最近，格爾德霉素在17-位衍生出17-格爾德霉素酰胺、#^甲酸酯、脲和17-芳基格爾德霉素(LeBrazidec等人，2003)。已經(jīng)報(bào)道了超過60種17-烷基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素類似物的文庫，并測(cè)試它們與Hsp90的親和力和水溶性(Tian等人，2004)。另一種降低格爾德霉素毒性的方法是通過綴合腫瘤耙向的單克隆抗體，將活性的格爾德霉素化合物選擇性的靶向和遞送到惡性細(xì)胞中(Mandler等人，2000)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>雖然許多這些衍生物表現(xiàn)出降低的肝臟毒性，但是它們?nèi)匀粌H具有有限的水溶性。例如，17-AAG需要使用增溶載體(例如，Cremophore,DMSO-卵卵磷脂)，所述載體本身可能在一些患者中導(dǎo)致副作用(Hu等人，2004)。大多數(shù)安沙霉素類的Hsp90抑制劑享有共同的結(jié)構(gòu)部分苯醌是邁克爾(Michael)受體，可以容易的與親核物質(zhì)例如蛋白質(zhì)、谷胱甘肽等形成共價(jià)鍵。苯醌部分還與二氫醌進(jìn)行氧化還原平衡，其間形成產(chǎn)生其它非特異毒性的氧自由基(Dikalov等人，2002)。例如，使用格爾德霉素治療可以導(dǎo)致誘導(dǎo)性過氧化物產(chǎn)生(Sreedhar等人，2004a)。因此，仍然需要鑒別新型安沙霉素衍生物，其可用于癌癥和/或B細(xì)胞惡性腫瘤的治療，優(yōu)選的此類安沙霉素的給藥具有改善的水溶性，改善的藥理學(xué)模式和/或降低的副作用模式。本發(fā)明公開了通過對(duì)母體生產(chǎn)菌林進(jìn)行遺傳改造而產(chǎn)生的新型安沙霉素類似物。特別的，本發(fā)明公開了新型17-氧基麥克菌素類似物，其與目前可獲得的安沙霉素相比，一般具有改善的藥理學(xué)性質(zhì)；特別的，預(yù)期它們?cè)谝粋€(gè)或多個(gè)以下性質(zhì)中表現(xiàn)出改善抗不同癌癥亞型的活性、毒性、水溶性、代謝穩(wěn)定性、生物可利用率和配制能力。優(yōu)選的，17-氧基麥克菌素類似物表現(xiàn)出改善的水溶性和/或生物可利用率。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新型17-氧基麥克菌素類似物(其在C17位具有羥基或甲氧基基團(tuán))，制備這些化合物的方法，和在醫(yī)學(xué)或作為中間體在生產(chǎn)其它化合物中使用這些化合物的方法。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了麥克菌素的類似物，其在C17位具有羥基或甲氧基，麥克菌素的類似物可以具有苯醌(即，它們是麥克菌素I的類似物)或具有二氫醌部分(即，它們是18,21-二氫麥克菌素或麥克菌素n的類似物)。在更特定的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)下列式(IA)或(IB)的17-氧基麥克菌素類似物，或其可藥用的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中代表H、OH或OCH3;R2代表H或CH3R3代表H或CONH2R4和Rs或者都代表H或者一起代表鍵(即，C4至C5是雙鍵)；和R6代表H或OH;和R7代表H或CH3.上述才艮據(jù)式(IA)或(IB)的麥克菌素類似物在本文中還被稱為"本發(fā)明的化合物"，此類術(shù)語在本文中可互換的使用。式(IA)和(IB)的化合物在上述中被統(tǒng)稱為式(I)的化合物。上述結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出典型的互變異構(gòu)體，本發(fā)明包括式(I)的化合物的所有互變異構(gòu)體，例如，酮類化合物，其中可舉例烯醇類化合物，反之亦然。發(fā)明包括上文顯示的結(jié)構(gòu)(I)定義的化合物的所有立體異構(gòu)體。在另一方面，本發(fā)明提供了麥克菌素的類似物例如式(I)的化合物，或其可藥用的鹽，用作為藥物。定義本文所用的冠詞"一個(gè)(a)"和"一種(an)"指冠詞的一個(gè)或指超過一個(gè)(即至少一個(gè))語法對(duì)象。例如，"類似物"意指一個(gè)類似物或超過一個(gè)類似物。如本文所用的，術(shù)語"類似物"指另一種化合物結(jié)構(gòu)上相似的化學(xué)化合物，但其在組成上輕微的不同(如由一個(gè)原子置換另一個(gè)，或者存在或缺少特定的官能團(tuán))。如本文所用的，術(shù)語"同源物"指基因的或由本文中公開基因編碼的蛋白質(zhì)的同源物，所述基因來自不同的麥克菌素生產(chǎn)菌株中的可選的麥克菌素生物合成蔟，或者來自備選的安沙霉素生物合成基因簇的同源物，例如，來自格爾德霉素、除莠霉素或利布拉霉素(reblastatin)。此類同源物編碼的蛋白質(zhì)執(zhí)行(可以自身執(zhí)行)與所述基因或蛋白質(zhì)在麥克菌素或相關(guān)的安沙霉素聚酮化合物的合成中相同的功能。優(yōu)選的，此類同源物具有與本文中公開的特定基因的序列至少40%序列同一性、優(yōu)選的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性(特別參見表3，SEQIDNO:ll，其是麥克菌素生物合成基因簇中的所有基因的序列，可以從中推斷特定基因的序列，以及參見附圖6A和6B，SEQIDNO:20和21，其顯示了gdmL的核酸以及所編碼的^tJ^酸序列)。百分比同一性可以4吏用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序來計(jì)算，例如在NCBI網(wǎng)站可獲得的BLASTn或BLASTp。如本文所用的，術(shù)語"癌癥"指細(xì)胞在皮膚或身體器官中惡性或良性的新生長(zhǎng)，例如但不限于在乳房、前列腺、肺、腎、胰腺、腦、胃或腸中。癌傾向于滲透到鄰近組織并擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)到遠(yuǎn)處器官上，如轉(zhuǎn)移到骨、肝、肺或腦中。本文所用的術(shù)語癌包括轉(zhuǎn)移性肺瘤細(xì)胞類型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、和肥大細(xì)胞瘤)和組織癌類型(例如但不限于結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(gliobastoma)、原發(fā)性肝癌和卵巢癌。本文所用的術(shù)語"B-細(xì)胞惡性腫瘤，，包括一組疾病，其包括慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多發(fā)性骨髓瘤，和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。它們是血液和造血器官的瘤性疾病。它們?cè)斐晒撬韬兔庖呦到y(tǒng)功能障礙，其使宿主對(duì)于感染和出血高度易感。如本文所用的，術(shù)語"生物利用率，，指施用后藥物或其他物質(zhì)被吸收或變得在生物活性位點(diǎn)上可利用的程度或速率。該性質(zhì)依賴于許多因素，包括化合物的溶解性、腸中的吸收率、蛋白質(zhì)結(jié)合和代謝的程度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知各種生物利用率測(cè)試，例如在Egorin等人(2000)中描述的。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語"水溶性，，指在水介質(zhì)例如pH7.3的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)中的溶解度。在后述實(shí)施例中給出了示例性的水溶性測(cè)定。如本文所用的，術(shù)語"后-PKS基因"指聚酮化合物的后-聚酮化合物合1|#飾作用需要的基因，例如但不限于單加氧酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶和氨甲?；D(zhuǎn)移酶。該術(shù)語還特別涵蓋了向C17位添加氧所需要的基因，例如gdmL及其同源物。特別的，術(shù)語"麥克菌素后-PKS基因"指那些修飾在麥克菌素PKS基因蔟中的基因的基因，即，mbcM、mbcN、mbcP、mbcMTl、mbcMT2和mbcP450。本發(fā)明的化合物，例如式(I)的化合物，的可藥用的鹽包括由可藥用的無機(jī)或有機(jī)酸或堿形成的常規(guī)的鹽以及季銨酸加成鹽。合適酸式鹽的更特定的實(shí)例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、棕櫚酸(palmok)、丙二酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、7jC楊酸、富馬酸、甲苯磺酸、曱磺酸、^2-磺酸、苯磺酸、羥基萘?xí)跛?、氫碘酸、蘋果酸、steroic、單寧酸等的鹽。其他酸，如草酸，它們本身不是可藥用的，可用于制備鹽，所迷鹽用作為中間體獲得本發(fā)明的化合物和它們的可藥用的鹽。合適的堿式鹽的更特定實(shí)例包括鈉、鋰、鉀、鎂、鋁、鈣、鋅、N，N，-二千基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普魯卡因鹽。本發(fā)明以后談及本發(fā)明的化合物時(shí)包括式(I)的化合物及其可藥用的鹽。如本文中使用的，術(shù)語"18，21-二氫麥克菌素"和"麥克菌素II"(麥克菌素的二氫醌形式)是可互換的使用的。附圖的簡(jiǎn)要描述圖1:麥克菌素的生物合成的示意，顯示笫一個(gè)推定的無酶中間體、前麥克菌素和后-PKS加工為麥克菌素。附圖中的PKS加工步驟的列表不是意在代表事件的順序。下列縮寫用于簇中的特定基因AL0-AHBA加栽結(jié)構(gòu)域；ACP-酰基載體蛋白質(zhì)；KS-p-酮基合酶；AT-酰基轉(zhuǎn)移酶；DH-脫水酶；ER-烯酰還原酶；KR-P-酮基還原酶。圖2:產(chǎn)生麥克菌素的前麥克菌素的后-PKS加工位點(diǎn)的描述。圖3:產(chǎn)生珍責(zé)束絲放線菌(JcftVi仍j;w/ie附a/)f油Vw"附)菌林的圖示，其中，已經(jīng)符合讀框地缺失了mbcP、mbcP450、mbcMTl和mbcMT2基因。圖4:擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物l+2a的序列(SEQIDNO:14)。圖5:擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3b+4的序列(SEQIDNO:17)。圖6:A-含有g(shù)dmL的PCR產(chǎn)物的核酸序列B-GdmL的^J^^列發(fā)明描述如上所述，本發(fā)明提供了17-氧基麥克菌素類似物，制備這些化合物的方法，和在醫(yī)學(xué)中使用這些化合物的方法，和這些化合物作為中間體或才莫板用于進(jìn)一步半合成衍生作用或通過生物轉(zhuǎn)化方法的衍生作用的用途。合適地17-氧基麥克菌素類似物具有根據(jù)式IA的結(jié)構(gòu)。合適地17-氧基麥克菌素類似物具有根據(jù)式IB的結(jié)構(gòu)。合適地R3代表CONH2合適地R6代表OH?？蛇x的R^、表H。合適地R7代表H。在特定的實(shí)施方案中，17-氧基麥克菌素類似物具有根據(jù)式(IA)的結(jié)構(gòu)，其中I^代表H,R2代表H,R3代表CONH2、114和Rs^f戈表H、代表OH以及R7代表H。在特定的實(shí)施方案中，17-氧基麥克菌素類似物具有才艮據(jù)式(IB)的結(jié)構(gòu)，其中R，代表H，R2代表H，R3代表CONH2、114和115各代表11、以及R7代表H。在特定的實(shí)施方案中，17-氧基麥克菌素類似物具有才艮據(jù)式(IA)的結(jié)構(gòu)，其中R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H、Rg代表OH以及R7代表CH3。在特定的實(shí)施方案中，17-氧基麥克菌素類似物具有才艮據(jù)式(IB)的結(jié)構(gòu)，其中Ri代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H以及R7代表CH3。在特定的實(shí)施方案中，17-氧基麥克菌素類似物具有根據(jù)式(IA)的結(jié)構(gòu)，其中Ri代表H，R2代表H,R3代表CONH2、R4和Rs各代表H、Rg代表H以及R7代表H。在特定的實(shí)施方案中，17-氧基麥克菌素類似物具有才艮據(jù)式(IA)的結(jié)構(gòu)，其中Rj代表H，R2代表H，R3代表CONH2、Rj和Rs各代表H、代表H以及R7代表CH3。附圖1和2中顯示了對(duì)于麥克菌素，非氫側(cè)鏈相對(duì)于柄型環(huán)(ansaring)的優(yōu)選的立體化學(xué)(也就是說優(yōu)選的立體化學(xué)遵循麥克菌素的立體化學(xué))。當(dāng)本發(fā)明的化合物的Re代表OH時(shí)，可以從發(fā)酵肉湯中以其苯醌形式或以其二氫醌形式分離出來。本領(lǐng)域普遍已知苯醌類可以化學(xué)轉(zhuǎn)化為二氫醌類(還原作用)，反之亦然(氧化作用)，因此，這些形式可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的方法方便的互變。例如但不限于，如果分離了苯醌形式，則可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二氬醌類。作為示例(但不出于限制)，其可以在具有氫化物源的有機(jī)介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)，例如但不限于LiAlH4或SnCl2-HCl?？蛇x的，可以通過將本發(fā)明的化合物的苯醌形式溶解在有機(jī)介質(zhì)中，然后用還原劑的水溶液洗滌來介導(dǎo)該轉(zhuǎn)化，所述還原劑例如但不限于，連二亞石危酸鈉(NazS204或sodiumthionite)。優(yōu)選的，該轉(zhuǎn)化是通過將本發(fā)明的化合物溶解在乙酸乙酯中，并強(qiáng)力的混合該溶液與連二亞石克酸鈉的水溶液來實(shí)現(xiàn)的(Muroi等人，1980)。然后，可以用水洗滌所獲得的有機(jī)溶液，干燥，在減壓下去除溶劑，產(chǎn)生幾乎定量的本發(fā)明化合物的18,21-二氬形式。為了將二氫醌氧化為醌，可使用一些方法，包括但不限于以下方法將本發(fā)明化合物的二氫醌形式溶解在有機(jī)溶劑中，例如乙酸乙酯，然后強(qiáng)力的混合該溶液與氯化鐵(III)(FeCb)的水溶液。然后，用水洗涂有機(jī)溶液，干燥，在減壓下去除溶劑，產(chǎn)生幾乎定量的麥克菌素化合物的苯醌形式。本發(fā)明還"^供藥物組合物，其包含17-氧基麥克菌素類似物，或其可藥用的鹽，以及可藥用的載體。本發(fā)明還提供使用17-氧基麥克菌素類似物作為底物，用于通過生物轉(zhuǎn)化或通過合成化學(xué)進(jìn)行其它修飾的用途。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了17-氧基麥克菌素類似物在生產(chǎn)藥物中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了17-氧基麥克菌素類似物在生產(chǎn)用于治療癌癥和/或B細(xì)胞惡性肺瘤的藥物中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了17-氣基麥克菌素類似物在生產(chǎn)用于治療疾疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、依賴血管發(fā)生的疾病、自身免疫疾病和/或作為癌癥的預(yù)防性預(yù)治療的藥物中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了17-氧基麥克菌素類似物在醫(yī)學(xué)中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了17-氧基麥克菌素類似物在治療癌癥和/或B細(xì)胞惡性腫瘤中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了17-氧基麥克菌素類似物在生產(chǎn)用于治療瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病、依賴血管發(fā)生的疾病、自身免疫疾病和/或作為癌癥的預(yù)防性預(yù)治療的藥物中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥和/或B-細(xì)胞惡性腫瘤的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治療有效量的17-氧基麥克菌素類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病、依賴血管發(fā)生的疾病、自身免疫疾病和/或癌癥的預(yù)防性預(yù)治療的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治療有效量的17-氧基麥克菌素類似物。如上所述，可以預(yù)期本發(fā)明的化合物可用于癌癥和/或B-細(xì)胞惡性胂瘤的治療。本發(fā)明的化合物在其它適應(yīng)證的治療中也是有效的，例如但不限于瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病、依賴血管發(fā)生的疾病、自身免疫疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或作為癌癥的預(yù)防性預(yù)治療。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病包括但不限于，阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、朊病毒病、脊髓和延髓性肌萎縮(SBMA)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)。依賴血管發(fā)生的疾病包括但不限于，年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和多種其它眼病、動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。自身免疫病包括但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、全身性紅斑性狼疳和銀屑病。"患者"涵蓋人類和其它動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)對(duì)象，優(yōu)選的人對(duì)象。相應(yīng)的本發(fā)明的17-氧基麥克菌素類似物的方法和用途是在人醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中的用途，優(yōu)選的人類醫(yī)學(xué)。上述本發(fā)明的化合物或其制劑可通過任何常規(guī)方法施用，例如但不限于，腸胃外(包括靜脈內(nèi)給藥)、口服、局部(包括口聘、舌下或經(jīng)皮)、通過醫(yī)療設(shè)備(如支架)、通過吸入或經(jīng)注射(皮下或肌內(nèi))的施用。治療可由單次劑量或一段時(shí)間的多次劑量構(gòu)成。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)施用，但優(yōu)選的將它與一種或多種可接受的載體一起，以藥物制劑提供。因此，提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物，和一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。稀釋劑或載體必須是"可接受的"，含義是與本發(fā)明的化合物相容并且對(duì)其接受者無害。合適的載體例子在以下將更詳細(xì)地描述。本發(fā)明的化合物可單獨(dú)或與其他治療劑共施用。共施用兩種(或更多)物質(zhì)可以允許顯著降低每種使用的劑量，由此減少可見的副作用。它還可允許疾病例如癌癥，對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生耐受性的在先治療效果復(fù)敏。其還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物和其它治療劑，以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的化合物在與第二種物質(zhì)的聯(lián)合療法中的用途，所迷第二種物質(zhì)例如用于治療癌癥或B細(xì)胞惡性腫瘤的第二種物質(zhì)如細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物與另一種治療劑共施用，所述另一種治療劑例如用于治療癌癥或B-細(xì)胞惡性腫瘤的治療劑如細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。示例性的其它物質(zhì)包括細(xì)胞毒劑，例如烷化劑和有絲分裂抑制劑(包括拓樸異構(gòu)酶II抑制劑和微管蛋白抑制劑)。其它示例性的其它物質(zhì)包括DNA結(jié)合劑、抗代謝物和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，例如蛋白激酶抑制劑和酪氨酸激酶受體阻斷劑。合適的物質(zhì)包括但不限于，氨甲蝶呤、亞葉酸(Leukovorin)、潑尼;^(prenisone)、博來霉素、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)、多柔比星(doxorubicin)(亞德里亞霉素)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2單克隆抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)，商標(biāo)名Hercq>tinTM)、卡培他濱(capecitabine)、鹽酸雷洛昔芬、EGFR抑制劑(例如吉非替尼(gefitinib),商標(biāo)名1ressa⑧、埃羅替尼(erlotinib)，商標(biāo)名TarcevaTM、西妥昔單抗(cetuximab),商標(biāo)名ErbituxTM)、VEGF抑制劑(例如貝伐珠單抗(bevaciziimab)，商標(biāo)名AvastinTM)、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib)，商標(biāo)名VelcadeTM)。其它合適的物質(zhì)包括但不限于常規(guī)化療藥物如順鉑(cisplatin)、阿糖胞苷、環(huán)己基氯乙基亞硝基脲、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺(ifosfamid)、甲酰四氫葉酸(leucovorin)、絲裂霉素、米托蒽醌(mitoxantone)、奧沙利柏(oxaliplatin)、包括紫杉醇(taxol)在內(nèi)的紫杉烷類和長(zhǎng)春地辛(vindesine);激素療法；單克隆抗體療法例如西妥昔單抗(抗-EGFR);蛋白激酶抑制劑如達(dá)沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib);組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑如伏立諾他(vorinostat);血管發(fā)生抑制劑如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、來那度胺(lenalidomide)和mTOR抑制劑如坦西莫司(temsirolimus)。其它適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)是伊馬替尼(imatinib)，商標(biāo)名為Glivec。另外，本發(fā)明的化合物可以與其它療法(包括但不限于放射療法或手術(shù))組合施用。制劑可以方便地以單位劑型存在并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域的任何眾知方法制備。此類方法包括使活性成分(本發(fā)明的化合物)與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，制劑通過使活性成分與液體載體或精細(xì)M的固體載體或這兩者均一和緊密地結(jié)合，并且l^根據(jù)需要使產(chǎn)物成型而制備。本發(fā)明的化合物通常經(jīng)口地或通過任何腸胃外途徑以包含活性成分的藥物制劑形式，任選地以無毒的有機(jī)或無機(jī)酸或堿、加成鹽的形式，以可藥用的劑型進(jìn)行施用。根據(jù)待治療的疾病和患者，以及施用途徑，該組合物可以以變動(dòng)的劑量施用。例如，本發(fā)明的化合物可以經(jīng)口地、口含地或舌下地以可含有調(diào)p木劑或著色劑的片劑、膠嚢劑、胚珠制劑(ovules)、酏劑、溶液劑或混懸劑形式施用，用于立即、延遲或受控釋放應(yīng)用。此類片劑可以含有賦形劑(如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鉤、磷酸氬鈞和甘氨酸)，崩解劑(如淀粉(優(yōu)選玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉)、淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)雜硅酸鹽)，和顆粒化粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。另外，可以包括潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。相似類型的固體組合物也可以作為填充劑應(yīng)用于明膠膠嚢中。在這個(gè)方面的優(yōu)選賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。對(duì)于含水混懸劑和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可以與多種甜味劑或調(diào)味劑、著色物質(zhì)或染色劑、與乳化劑和/或助懸劑以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油以及其組合進(jìn)行合并。片劑可以通過壓縮或模制，任選地連同一種或多種輔助成分而產(chǎn)生。壓制片劑可以通過在合適的機(jī)器中壓縮處于自由流動(dòng)形式(如粉末或顆粒)下的活性成分而制備，其中所述活性成分任選地與粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或M劑混合。模印片可以通過在合適的機(jī)器中模壓以惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉狀化合物的混合物而制備。片劑可以任選地包衣或刻痕并且可以如此進(jìn)行配制，使用例如旨在提供所需釋放模式的變動(dòng)比例的羥丙基曱基纖維素而^f吏得片劑的活性成分緩慢釋放或受控釋放。適于經(jīng)口施用的本發(fā)明制劑可以作為不連續(xù)的單元如膠嚢劑、扁嚢劑或片劑(每個(gè)單元含有預(yù)定量的活性成分)；作為散劑或顆粒劑；作為在含水液體或非含水液體中的溶液劑或混懸劑或作為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑而存在。活性成分還可以作為大丸劑、煎骨劑或糊劑而存在。適于局部施用于口中的制劑包括在調(diào)味基材(通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中包含活性成分的錠劑；在惰性基材如明皿甘油或者蔗糖及阿拉伯膠中包含活性成分的軟錠劑；和在合適液體載體內(nèi)包含活性成分的漱口劑。應(yīng)當(dāng)理解除了以上具體提到的成分之外，本發(fā)明的制劑可以包括與所討論的制劑類型有關(guān)的本領(lǐng)域內(nèi)常用的其它制劑，例如，適于經(jīng)口施用的那些制劑可以包M味劑。適應(yīng)于局部施用的藥物組合物可以配制為軟膏劑、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、浸漬敷料、噴霧劑、氣霧劑或油劑、透皮裝置、撒粉劑等。這些組合物可以經(jīng)常規(guī)方法制備，含有活性物質(zhì)。因此，它們還可以包含相容性常規(guī)載體和添加劑，如防腐劑、輔助藥物滲透的溶劑、乳膏劑或軟膏劑中的軟化劑以及用于洗劑的乙醇或油醇。此類栽體可以占組合物的約1%至多到約98%。更通常地，它們將形成組合物的至多到約80%。僅作為說明，乳膏劑或軟膏劑通過如此方式制備，即混合足量的親水性材料與水(含有重量約5-10%的化合物)以產(chǎn)生具有所需稠度的乳膏劑或軟膏劑。適應(yīng)于透皮施用的藥物組合物可以作為分立的貼劑而存在，其中所迷的貼劑意圖保持與受者表皮的緊密接觸延長(zhǎng)的時(shí)間段。例如，活性物質(zhì)可以通過離子電滲療法自貼劑中送遞出來。對(duì)于應(yīng)用于外部組織，例如口和皮膚，組合物優(yōu)選地作為局部用軟骨劑或乳膏劑施加。當(dāng)配制在軟膏劑中時(shí)，活性物質(zhì)可以隨石蠟或水混溶性軟膏劑基質(zhì)一起應(yīng)用。另外，活性物質(zhì)可以隨水包油乳膏劑基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制在乳骨劑中。對(duì)于腸胃外施用，流體單位劑型使用活性成分和無菌運(yùn)載體進(jìn)行制備，其中所述的運(yùn)載體例如是但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油，優(yōu)選是水。根據(jù)所用的運(yùn)載體和濃度，活性成分可以懸浮或溶解于運(yùn)載體中。在制備溶液劑中，活性成分可以溶解在注射用水中并且在裝填至合適的小瓶或安瓿前過濾消毒并密封。有利地，物質(zhì)如局麻藥、防腐劑和緩沖劑可以溶解于運(yùn)載體中。為增強(qiáng)穩(wěn)定性，組合物可以在裝填至小瓶后冷凍并且將水在真空下除去。干燥的凍干粉末隨后密封于小瓶?jī)?nèi)并且可以提供附帶的注射用水小瓶以便在用前復(fù)水液體。腸胃外混懸劑以如溶液劑那樣的基4^目同方式制備，除了活性成分懸浮而不非溶解在運(yùn)載體中并且消毒不能通過過濾進(jìn)行。活性成分可以在懸浮于無菌運(yùn)栽體中之前通過暴露于環(huán)氧乙烷得到消毒。有利地，可以在組合物中包括表面活性劑或潤(rùn)濕劑以促進(jìn)活性成分均勻分布。本發(fā)明的化合物也可以使用本領(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置施用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以用無針頭的皮下注射裝置，如在U.S.5,399,163;U.S.5,383,851;U.S.5,312,335;U.S.5,064,413;U.S.4,941,880;U.S.4,790,824或U.S.4,596,556中公開的裝置而施用。用于本發(fā)明中的眾所周知的植入物和計(jì)量單元(module)的實(shí)例包括US4,487,603，其^Hf了用于以受控速率分配藥物的可^v性-微量輸注泵；US4,486,194,其公開了用于施用藥物穿過皮膚的治療裝置；US4，447，233,其/>開了用于以精確輸注速率送遞藥物的藥物輸注泵；US4,447,224，其公開了用于連續(xù)性藥物送遞的流量可變的可植入輸注裝置；US4,439,196，其公開了具有多腔室容器的滲透性藥物送遞系統(tǒng)；以及US4,475,196，其公開了滲透性藥物送遞系統(tǒng)。眾多的其它裝置如植入物、送遞系統(tǒng)和計(jì)量單元是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明化合物的待施用劑量將根據(jù)特定化合物、所涉及疾病、受試者和疾病性質(zhì)及嚴(yán)重性以及受試者的身體狀況，和選擇的施用途徑而變化。適合的劑量可以毫不費(fèi)力地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。組合物可以含有0.1%重量、優(yōu)選5-60%、更優(yōu)選10-30%重量的本發(fā)明化合物，這取決于施用的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)iU只到本發(fā)明化合物的最佳量和單個(gè)劑量的間隔期將由正在治療的病癥的性質(zhì)和程度、施用的形式、途徑和部位和正在治療的具體受試者的年齡和條件決定，并且內(nèi)科醫(yī)生將最終確定待使用的合適劑量。這個(gè)劑量可以根據(jù)需要經(jīng)常地重復(fù)使用。如果出現(xiàn)副作用，該劑量的量和/或頻率可以按照正常臨床慣例加以改變或降4氐。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)17-氧基麥克菌素類似物的方法?？梢哉J(rèn)為麥克菌素以兩個(gè)階段進(jìn)行生物合成。在第一個(gè)階段，核心-PKS基因通過2-碳單位的重復(fù)裝配來裝配大環(huán)內(nèi)酯核，所述大環(huán)內(nèi)酯核然后環(huán)化形成第一個(gè)無酶中間體"前-麥克菌素"，參見附圖1。在第二個(gè)階段，一系列"后-PKS，，剪裁酶(tailoringenzyme)(例如，P450加氧酶、曱基轉(zhuǎn)移酶、FAD-依賴性加氧酶和氨甲?；D(zhuǎn)移酶)作用將多個(gè)其它基團(tuán)添加到前麥克菌素模板上，獲得最終的母體化合物結(jié)構(gòu)，參見附圖2?？梢杂妙愃频姆绞缴锖铣杀景l(fā)明的17-氡基麥克菌素類似物?？梢酝ㄟ^合適的生產(chǎn)菌林的遺傳改造來開發(fā)該生物合成生產(chǎn)，來獲得新型化合物的生產(chǎn)。特別的，本發(fā)明提供了生產(chǎn)17-氧基麥克菌素類似物的方法，所述方法包括a)提供第一個(gè)宿主菌株，其在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)麥克菌素或其類似物；b)插入一個(gè)或多個(gè)能夠氧化麥克菌素C17位的后-PKS基因；c)在用于新型化合物的生產(chǎn)的合適的條件下培養(yǎng)所述修飾的宿主菌林；和d)任選的分離所生產(chǎn)的化合物。在步驟(a)中，"麥克菌素或其類似物"意指麥克菌素或被&的定義涵蓋的麥克菌素的那些類似物。在步驟(b)中，插入的后-PKS基因優(yōu)選的是^/zw1,或其同源物。該方法還可以包括下列步驟e)缺失或滅活一個(gè)或多個(gè)麥克菌素后-PKS基因或其同源物，所述步驟通常在步驟c)前發(fā)生并且可以在步驟b)前發(fā)生。在步驟e)中，缺失或滅活一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因合適地將有選擇的完成?？蛇x的方法還包括步驟f)再引入一個(gè)或多個(gè)缺失的麥克菌素后-PKS基因，所述步驟通常在步驟c)前發(fā)生；和/或g)引入來自其它PKS簇的后-PKS基因，所述步驟通常在步驟c)前發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟e)包括滅活一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，或其同源物，這是通過在基因中整合DNA從而不生產(chǎn)功能性蛋白質(zhì)。在可選的實(shí)施方案中，步驟e)包括產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因或其同源物的靶向缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因或其同源物通過定點(diǎn)誘變失活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)步驟a)的宿主菌抹進(jìn)行突變，選擇這樣的修飾的菌林，其中一個(gè)或多個(gè)后-PKS酶或其同源物是無功能的。本發(fā)明還涵蓋了調(diào)控一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因或其同源物的調(diào)節(jié)子的突變，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解調(diào)節(jié)子的缺失或滅活可以具有與基因缺失或滅活相同的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟e)的菌林用已經(jīng)缺失或滅活的一個(gè)或多個(gè)基因，或其同源物補(bǔ)充(complement)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟e)的菌林用來自不同的PKS簇的一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因補(bǔ)充(complement)，所述基因例如但不限于這樣的基因，其表達(dá)能夠?qū)趸D(zhuǎn)移到C17的羥基的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，選擇性插入后PKS基因的方法包括(i)使用基因組DNA做模板，通過PCR擴(kuò)增分離負(fù)責(zé)C17-羥基化的基因，其中基因組DNA是自身生產(chǎn)相關(guān)的合適的羥化分子的菌林的基因組DNA，例如通過4吏用特定引物或簡(jiǎn)并引物從格爾德霉素生產(chǎn)者中分離W附丄基因，所述特定引物基于公開的^m丄序列，所述簡(jiǎn)并引物基于公開的^/附丄序列，如果模板是^//wZ基因或其序列是不可獲得的的同(ii)將該基因克隆到用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適的載體中，其將在細(xì)胞中維持，并將允許^/附丄基因或其同源物的表達(dá)，來生產(chǎn)功能性的C17-羥化酶。例如但不限于，克隆吸7jC鏈霉菌NRRL3602g^Ml基因，將其放置在載體中的fl"/啟動(dòng)子之下，所述栽體還含有fl"http://-01^4激活子，從而有利于^/w丄的表達(dá)。實(shí)施例2中使用的載體還含有用于接合轉(zhuǎn)移的w,'r，phiBTl附著位點(diǎn)和阿泊拉霉素抗性標(biāo)記。(iii)通過例如接合，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于接受宿主細(xì)胞內(nèi)的DNA片段可以通過多種標(biāo)準(zhǔn)方法來維持。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以按實(shí)施例2的描述，將啟動(dòng)子和^/w丄或其同源物引入鏈霉菌噬菌體phiBTl的染色體噬菌體附著位點(diǎn)中(Gregory等人，2003)本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，表達(dá)耙基因不限于在此噬菌體附著位點(diǎn)引入載體，或者確實(shí)使用附著位點(diǎn)。因此，例如通過使用pSET152的衍生物(Bierman等人，1992)，可以將表達(dá)載體引入其它噬菌體附著位點(diǎn)，例如鏈霉菌噬菌體phiC31的附著位點(diǎn)?？梢允褂闷渌色@得的整合功能元件(integrationfunction)來類似地實(shí)施此類整合，包括但不限于基于pSAM2整合敏例如，在pPM927中(Smovkina等人，1990))、R4整合酶(iru在pAT98(Matsimra等人，1996))、VWB整合酶(例如，在pKT02中(VanMellaert等人，1998))，和L5整合酶(例如，Lee等人，1991)的栽體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將i人識(shí)到有許多》文線菌(Actinomycete)噬菌體，其可預(yù)期含有整合功能元件，所述整合功能元件可以與合適的啟動(dòng)子一起轉(zhuǎn)移到遞送栽體上，產(chǎn)生可用于將基因引入珍貴束絲放線菌(A/^ft'ww附)的其它系統(tǒng)。確實(shí)，已經(jīng)M線菌中鑒別了許多噬菌體，并且可以從其中獲得整合功能元件并以相似的方式使用。隨著越來越多的噬菌體#^征，可以期待將有其它可以類似的使用的、可獲得的整合酶。在一些情況下，這可能需要通過向整合酶添加特定的W詔位點(diǎn)來改變宿主菌林，從而獲得高效率的整合。在合適的啟動(dòng)子下引入或其同源物還可以不受限制地受到以下的影響染色體中向中性位置的同源重組，染色體中向非中性位置的同源重組(例如中斷選定的基因)。還可以使用自我復(fù)制的載體，例如但不限于，含有來自pSG5(例如，pKC1139Bierman等人，1992)、pIJ101(例如，pIJ487，Kieser等人，2000)和SCP2*(例如，pIJ698,Kieser等人，2000)的鏈霉菌復(fù)制起點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將容易的接受有許多啟動(dòng)子可用于GdmL或其同源物的生產(chǎn)，例如，可以使用來自次生^R謝物生物合成簇的啟動(dòng)子如啟動(dòng)子，如實(shí)施例2中與其關(guān)聯(lián)激活子actlI-ORF4通常一起使用的actl或aetIII啟動(dòng)子(Rowe等人，1998)，應(yīng)答壓力的啟動(dòng)子例如抗原始霉素的啟動(dòng)子(Blane等人，1995)和紅霉素抗性基因ermE啟動(dòng)子，PermE(Bibb等人，1985)和突變形式P在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，選擇性缺失或滅活后PKS基因的方法包括(i)基于目標(biāo)基因的同源物(例如，來自格爾德霉素PKS生物合成簇和/或來自除莠霉素生物合成簇)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡聚物，從合適的麥克菌素生產(chǎn)菌林中分離目標(biāo)基因(或其同源物)的內(nèi)部片段，例如通過在PCR反應(yīng)中使用這些引物，(ii)將含有該片段的質(zhì)粒通過同源重組整合到相同或不同的麥克菌素生產(chǎn)菌林中，導(dǎo)致靶向基因(或其同源物)的中斷，(iii)在適合麥克菌素類似物生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)如此生產(chǎn)的菌林。在特定的實(shí)施方案中，步驟(i)中的麥克菌素生產(chǎn)菌林是奇跡束絲放線菌(y4"/wftsj;wwe附a附/>附)(A/iM'm附)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(ii)中的麥克菌素生產(chǎn)菌林是珍貴束絲放線菌(A/^ft'仍"附)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以使用上述方法的備選方法來獲得等價(jià)的菌林，例如可以使用筒并的寡聚物從多種麥克菌素生產(chǎn)菌林之一中擴(kuò)增目標(biāo)基因，所述菌林例如但不限于珍貴束絲放線菌或奇跡束絲放線菌可以設(shè)計(jì)不同的簡(jiǎn)并寡聚物，其將成功的擴(kuò)增麥克菌素生產(chǎn)者的耙基因或其同源物的合適區(qū)域?？梢允褂谜滟F束絲放線菌的把基因序列產(chǎn)生對(duì)珍貴束絲放線菌的靶基因特異的寡聚物，然后可以從任何麥克菌素生產(chǎn)菌林(例如珍貴束絲放線菌或奇跡束絲放線菌)中擴(kuò)增內(nèi)部片段?？梢耘c同源基因序列一起使用珍貴束絲放線菌菌林的靶基因的序列來產(chǎn)生簡(jiǎn)并寡聚物，然后可以從任何麥克菌素生產(chǎn)菌林(例如珍貴束絲放線菌或奇il^絲放線菌)中擴(kuò)增內(nèi)部片段。附圖2顯示了麥克菌素生物合成蔟中的后-PKS基因的活性。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒別需要缺失或滅活的額外后-PKS基因，從而實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)目標(biāo)化合物的菌林。在這些系統(tǒng)中可以觀察到，當(dāng)產(chǎn)生這樣的菌林時(shí)可以生產(chǎn)一種以上的麥克菌素類似物，所述菌株中已經(jīng)插入了額外的后-PKS基因，并且任選地其中一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因或其同源物沒有功能(作為描述過的方法之一包括滅活或缺失的結(jié)果)，并且任選地還已經(jīng)重新插入了其它后-PKS基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該做法有多種可能的理由。例如，存在后-PKS步驟的優(yōu)選順序，去除單個(gè)活性導(dǎo)致在對(duì)于所涉及的酶而言非天然的底物上執(zhí)4亍所有后續(xù)步驟。由于對(duì)于呈遞至后-PKS酶上的新底物效率的降低，其可以導(dǎo)致中間體在培養(yǎng)肉湯中積累，或者，可能由于步驟順序已經(jīng)改變，不再是剩余酶的底物的產(chǎn)物被分流?？蛇x的，可以對(duì)生物合成途徑中的一些基因的表ii^"影響c本領(lǐng)域才支術(shù)人員將理解，通過利用生長(zhǎng)務(wù)降的變化，可以操*混合物中觀察到的化合物的比例。當(dāng)觀察到化合物的混合物時(shí)，可以容易的使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離，一些技術(shù)描述在下列實(shí)施例中?？梢酝╥t^文中描述的一些方法篩選17-M麥克菌素類似物，并且在當(dāng)單個(gè)化合物表現(xiàn)出有利的性質(zhì)的情況下，可以改造菌林使該化合物是優(yōu)選的。在不常見卻也并非不可能的情況下，可以產(chǎn)生中間體，然后將其生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)需要的化合物。本發(fā)明"^供了新的麥克菌素類似物，其產(chǎn)生是通過一個(gè)或多個(gè)能夠氧化麥克菌素17位的后-PKS基因的選擇性插入，任選的結(jié)合一個(gè)或多個(gè)來自麥克菌素PKS基因簇的后-PKS基因的缺失或滅活。特別地，本發(fā)明涉及新的17-lu^麥克菌素類似物，這是通過^/附丄或其同源物的插入，任選的結(jié)合一個(gè)或多個(gè)來自麥克菌素PKS基因簇的后-PKS基因或其同源物的選擇性缺失或滅活來產(chǎn)生。在特定的實(shí)施方案中，宿主菌林中額外缺失或滅活了一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自附6c尸、w6cM、/w6dV、/w6ci^50、附6dWT7和/w6cAfr2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外缺失或滅活了兩個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自w6c尸、wi6c3/、附6c7V、附6c/^/50、附6cMT7和/n6dWT2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外缺失或滅活了三個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自/wAc戶、附6cM、附&7V、附&尸45。、附AdW77和附6cAfT7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外缺失或滅活了四個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自wi6cP、附6cM、附6dV、附Z^iV5"、附6cM77和附6dWT2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外缺失或滅活了五個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自附6c戶、附6cAf、附6c7V、附6c尸450、在特定的實(shí)施方案中，缺失了/w6c尸、附6c/^50、/w6cM77和w6dWT2，引入(例如，在噬菌體附著位點(diǎn))并在啟動(dòng)子下表達(dá)g^/附/:，來產(chǎn)生4，5-二氫-1l-O-去甲基-15-去曱7-羥基麥克菌素。在特定的實(shí)施方案中，缺失了附6cM，引入(例如，在噬菌體附著位點(diǎn))并在啟動(dòng)子下表達(dá)^//丄，來產(chǎn)生4，5-二氫-11-0-去甲基-15-去甲氧基-17-羥基-21-去氡基麥克菌素。在特定的實(shí)施方案中，缺失了w&M，引入(例如，在噬菌體附著位點(diǎn))并在啟動(dòng)子下表達(dá)^/附丄，來產(chǎn)生4,5-二氫-11-0-去甲基-15-0-去曱基-17-羥基-21-去氧基麥克菌素。在特定的實(shí)施方案中，缺失了柳6dVf、附k尸、附6c/V5。、柳6dWT7和附6dWT2，引入(例如，在噬菌體附著位點(diǎn))并在啟動(dòng)子下表達(dá)^/附1，來產(chǎn)生4，5-二氫-ll-0-去曱基-15-去曱氧基-17-甲氧基-21-去l^麥克菌素。在特定的實(shí)施方案中，缺失了附6cAf、附6c尸、附6c/V5^附6cM77和柳6dWT2，引入(例如，在噬菌體附著位點(diǎn))并在啟動(dòng)子下表達(dá)^/m丄，來產(chǎn)生4，5-二氫-ll-0-去甲基-15-0-去甲基-17-甲氧基-21-去氧基麥克菌素。本領(lǐng)域沖支術(shù)人員將理解，導(dǎo)致基因無功能并不需要完*失基因，因此，本文中使用的術(shù)語"缺失或滅活"涵蓋了任何導(dǎo)致基因無功能的方法，包括但不限于缺失完整的基因、缺失基因的一部分、靼基因中的插入滅活、導(dǎo)致基因不表達(dá)或表達(dá)失活形式的定點(diǎn)誘變、導(dǎo)致基因不表達(dá)或表達(dá)失活形式的宿主菌林誘變(例如，通M射或暴露給誘變化學(xué)物、原生質(zhì)體融合或轉(zhuǎn)座子誘變)?？蛇x的，可以用抑制劑化學(xué)的損傷活性基因的功能，例如甲基雙吡啶丙酮(metapyrone)(備選名稱2-甲基-l，2-雙(3-吡咬基-l-丙酮)，EP0627009)和嘧咬醇是加氧酶的抑制劑，可以在生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加這些化合物來產(chǎn)生類似物。此外，西奈芬凈是甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可類似的使用但是用于在體內(nèi)抑制曱基轉(zhuǎn)移酶活性(McCammon和Parks1981)。在可選的實(shí)施方案中，在插入了一個(gè)或多個(gè)能夠氧化17位的后-PKS基因的菌林中，可以缺失或滅活所有的后-PKS基因，然后可以通過補(bǔ)充作用(complementation)(例如，在附著位點(diǎn)處，在自我復(fù)制的質(zhì)粒上，或在染色體的同源區(qū)域上插入)重新引入一個(gè)或多個(gè)基因。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生17-氧基麥克菌素類似物的方法，所述方法包括a)提供第一個(gè)宿主菌株，其在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)麥克菌素；b遞擇性的插入一個(gè)或多個(gè)能夠氧化麥克菌素C17位的后-PKS基因，c)選擇性的缺失或滅活所有的后-PKS基因，d)在用于生產(chǎn)新型化合物的合適的條件下培養(yǎng)所述修飾的宿主菌林；和e)任選的分離所生產(chǎn)的化合物。優(yōu)選的，在步驟b)中，后-PKS基因是grf附L，或其同源物。在可選的實(shí)施方案中，重新引入了在步驟c)中缺失或滅活的一個(gè)或多個(gè)麥克菌素后-PKS基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重新引入了一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自挑6c尸、附6cAf、/w6cTV、柳6ciV50、附6ciWT7和附6dWT2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重新引入了兩個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自m6ci>、附6cAf、/wkiV、附6cf50、附6cAf77和附6c3f72。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重新引入了三個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自附6c尸、附6cM、附6dV、m6c戶450、附6dWT7和附6dWT2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重新引入了四個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自附6c戶、附6cM、/w6dV、附6ci^50、附6dWT7和附6ciWT2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重新引入了五個(gè)或多個(gè)后-PKS基因，其選自wk戶、附6cAf、附6ciV、附6ciW50、附6cAfJ7和附6cAfT7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重新引入了/w6c尸、iw6cM、/w6dV、附6ciV50、附6cAfT7和附6ciWT7。此外，在已經(jīng)插入一個(gè)或多個(gè)能夠氧化C17位的后-PKS基因(其中至少一個(gè)所述后-PKS基因是^/wi或其同源物)的菌林中，可以缺失或滅活麥克菌素后-PKS基因的子集，并且重新引入所^-PKS基因的更小的子集，從而得到生產(chǎn)17-^麥克菌素類似物的菌林，i^t本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，有多種方法產(chǎn)生含有麥克菌素生物合成基因簇的菌林，其還額外表達(dá)一個(gè)或多個(gè)能夠氧化C17位的后-PKS基因，其中至少一個(gè)所述后-PKS基因是或其同源物。本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知，聚酮化合物基因簇可以在異源宿主中表達(dá)(Pfeifer和Khosla，2001)。因此，本發(fā)明包括將麥克菌素生物合成基因簇轉(zhuǎn)移到異源宿主中，所述基因簇具有^^|￡或其同源物，具有或沒有抗性和調(diào)節(jié)基因，此外是完整的或者含有額外缺失。可選的，可以將麥克菌素生物合成基因簇轉(zhuǎn)移到天然含有^/wl或其同源物的菌林中。如上所述用于轉(zhuǎn)移此類大DNA片段的方法和載體是本領(lǐng)域普遍已知的(Rawlings，2001;Staunton和Weissman，2001)，或在本文中在^>開的方法中提供。在本上下文中，優(yōu)選的宿主細(xì)胞林是原核生物，更優(yōu)選的是放線菌或大腸桿菌(五5r/^r/c/rZaM/Z)，仍然更優(yōu)選的包括但不限于奇跡束絲放線菌(A鵬vwm)、珍貴束絲放線菌珍貴亞種、吸水鏈霉菌、吸水鏈霉菌物種(S.hygroscopicus.sp)、吸7jc鏈霉菌子嚢霉素變種/^gmscw'c"sv<mfl5W考c"Zc附)、筑波鏈霉菌(/SV"to附j(luò)ces1加A:"6ae/isis)、天藍(lán)色鏈霉菌(5V/^/7to附j(luò);cesc<e//co/w)、變鉛青鏈霉菌(5^"e尸to附j(luò)i;ces//v/V/fl/ts)、糖多孢紅霉菌^y"cc/rtfn3/w/wo/vze/j幼/wflf)、脆弱鏈霉菌(5y，to附y(tǒng)c"/"ff^'"e)、阿維鏈霉菌(Sfre/to挑;;cesflve/7m'ft7/s)、肉桂地鏈霉菌(&r印to附j(luò);c""'""a附o"ert5^)、龜裂鏈霉菌(5^pto考cesnVwosw)、白色鏈霉菌(5^尸e/^0附y(tǒng)ces"/6m51)、灰褐鏈霉菌(jS^e/7to附y(tǒng)c^sgn'5^o/"sc"s)、黃色長(zhǎng)孢鏈霉菌(&r印to附y(tǒng)cM/0/ig/spwo/7av"s)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(5^印to附y(tǒng)"sveez"e/"e)、白色鏈霉菌(5"/r印to附j(luò);cM"/A附)、微單孢菌屬物種(M/crowwio5poms/7.)、灰紅微單孢菌(M/cm附o"osponig^yewMWrfa)、地中海擬無枝酸菌(/4附y(tǒng)coZ"to/M7s附^Z/te,m"g/)或游動(dòng)放線菌屬物種(J"/朋/;/做^印.)N902-109。其它實(shí)例包括吸水鏈霉菌去勢(shì)亞種0SV，似考cay/y^msr—cms1s"As/;.ge/</fl/iws)和紫黑鏈霉菌(iSV"epto附^cesWo/ace"s"/ge尸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移具有^/附丄或其同源物的完整的生物合成蔟。在可選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移沒有任何相關(guān)的麥克菌素后-PKS基因，但具有^/wl或其同源物的完整PKS。任選地，其可以分步進(jìn)行。任選地，可以合適的引入一些后-PKS基因。任選地，可以合適的引入來自其它簇(例如格爾德霉素或除務(wù)霉素途徑)的額外的基因。在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移具有^/附丄或其同源物的完整的麥克菌素生物合成簇，然后^艮據(jù)本文描述進(jìn)行^Mt。在本發(fā)明的可選的方面，還可以通過合適菌林的生物轉(zhuǎn)化來處理本發(fā)明的17-氡基麥克菌素類似物。合適的菌林或者是可獲得的野生型菌林，例如但不限于奇跡束絲放線菌、珍貴束絲放線菌珍貴亞種、吸水鏈霉菌、吸7K鏈霉菌物種(S.hygroscopicussp.)?？蛇x的，合適的菌林可以被改造，從而允許用特定的后-PKS酶生物轉(zhuǎn)化，所述的后-PKS酶例如但不限于，那些由/w6cAf、w6ciV、附6c/V5〃、附6cM77、附AcM77(如本文中定義的)、gd附7V、^f附Af、grf附尸、(Rascher等人2003)格爾德霉素O-甲基轉(zhuǎn)移酶、/^附W、A/wi丄、/^附戶、(Rascher等人2005)除莠霉素O-曱基轉(zhuǎn)移酶和其它除莠霉素單力口氧酶、os附7、fls附J0、os附JJ、os附J2、aw柳79和flw附27(Cassady等人，2004，Spiteller等人，2003)所編碼的。當(dāng)基因尚需鑒別或序列尚未位于公眾領(lǐng)域時(shí)，通過標(biāo)準(zhǔn)方法獲得此類序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。例如，編碼格爾德霉素O-曱基轉(zhuǎn)移酶的基因序列不屬于公眾領(lǐng)域，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生探針(使用相似的O-甲基轉(zhuǎn)移酶來生產(chǎn)異源探針，或通過自可獲得的同源基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物并從生產(chǎn)的生物體中擴(kuò)增DNA片段來生產(chǎn)同源探針)，所述探針隨后可用于對(duì)格爾德霉素生產(chǎn)菌林進(jìn)行Southern印跡，從而獲得該基因來產(chǎn)生生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。相似的，除莠霉素簇的公開序列看起來沒有最終結(jié)構(gòu)需要的一個(gè)P450單加氧酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生探針(使用相似的P450生產(chǎn)異源探針，或通過使用可獲得的同源基因的序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物并從生產(chǎn)的生物體中擴(kuò)增DNA片段來分離同源探針)，所述探針隨后用于對(duì)除莠霉素生產(chǎn)菌林進(jìn)行Southern印跡，從而獲得該基因來產(chǎn)生生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在可選的實(shí)施方案中，C17-0-甲基轉(zhuǎn)移酶與或其同源物共表達(dá)，來生產(chǎn)C17甲氡基麥克菌素類似物?？梢允褂蒙鲜龅暮?jiǎn)并引物從格爾德霉素生產(chǎn)菌林中分離O-甲基轉(zhuǎn)移酶。在特定的實(shí)施方案中，菌林可以有一個(gè)或多個(gè)其天然的聚酮化合物簇被完整的或部分的缺失，或者失活，從而阻止所述天然的聚酮化合物簇生產(chǎn)的聚酮化合物產(chǎn)生。所述被改造的菌林可以選自，例如但不限于，奇跡束絲放線菌、珍貴束絲放線菌珍貴亞種、吸7JC鏈霉菌、吸7K鏈霉菌物種(S.hygroscopicus.sp)、吸7jC鏈霉菌子嚢霉素變種、筑波鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、糖多孢紅霉菌、脆弱鏈霉菌、阿維鏈霉菌、肉桂地鏈霉菌、龜裂鏈霉菌、白色鏈霉菌、灰褐鏈霉菌、黃色長(zhǎng)孢鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、微單孢菌屬物種、灰紅微單孢菌、地中海擬無枝酸菌或游動(dòng)放線菌屬物種N902-109。其它可能的菌林包括吸7JC鏈霉菌去勢(shì)亞種和紫黑鏈霉菌。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了天然生產(chǎn)麥克菌素或其類似物的宿主菌林，其中已經(jīng)插入了grf附JL基因或其同源物，從而其因此生產(chǎn)17-氧基麥克菌素或其類似物(例如，如式(I)化合物定義的17-氧基麥克菌素類似物)，并且提供了它們?cè)谏a(chǎn)17-氧基麥克菌素或其類似物中的用途。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了遺傳改造的菌林，其以其未改變狀態(tài)天然的生產(chǎn)麥克菌素，所述菌林具有插入的一個(gè)或多個(gè)能夠氧化C17位的后-PKS基因(其中至少一個(gè)所述后-PKS基因是^/w丄或其同源物)，以及任選地，缺失了一個(gè)或多個(gè)來自麥克菌素PKS基因簇的后-PKS基因。本發(fā)明涵蓋了本文中描述的發(fā)明過程的所有產(chǎn)物。雖然上述本發(fā)明的制備17-氧基麥克菌素類似物的方法基本上或完全是生物合成的，但是并不排除通過包括標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)方法的方法來生產(chǎn)或相互轉(zhuǎn)換本發(fā)明的17-氡基麥克菌素類似物。為了允許麥克菌素PKS基因簇的遺傳操作，首先測(cè)序來自珍貴束絲i文線菌珍貴亞種的基因簇，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解有備選的生產(chǎn)麥克菌素的菌林，例如但不限于奇跡束絲放線菌。可以如在本文對(duì)于珍貴束絲放線菌珍貴亞種所述的，對(duì)來自這些菌株的麥克菌素生物合成基因簇測(cè)序，信息用于產(chǎn)生等價(jià)的菌林。本發(fā)明的其他方面包括-基于麥克菌素產(chǎn)生菌林的改造的菌林，其中已經(jīng)引入了編碼能夠在17-位氧化麥克菌素的活性的基因，例如^/柳￡。任選的，可以缺失或滅活其它后-PKS基因例如附6c尸、附6ci^/50、附6cM77和附6ciV/77，并且任選的可以重新引入這些基因的一些或全部，和/或任選的可以引入一個(gè)或多個(gè)來自異源簇的后-PKS基因?？梢砸粤婧禹樞驁?zhí)行這些步驟。合適的麥克菌素產(chǎn)生菌林是W"束絲放線菌或奇跡束絲放線菌。畫生產(chǎn)17-氧基麥克菌素類似物的方法，其包括培養(yǎng)上述菌林?？梢栽诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌林，并提供合適的飼養(yǎng)物例如合適的起始酸。-這樣的方法，其還包括分離17-氧基麥克菌素或其類似物的步驟。可以通過常規(guī)方法例如色i普(例如HPLC)實(shí)施分離。-此類改造的菌林在制備17-氧基麥克菌素類似物中的用途。發(fā)明的化合物的優(yōu)點(diǎn)在于預(yù)期它們具有一個(gè)或多個(gè)下列性質(zhì)與母體化合物相比，良好的抗一種或多種不同癌癥亞型的活性；良好的毒理學(xué)特性例如良好的肝毒性特性、良好的腎毒性、良好的心臟安全性；良好的水溶性；良好的代員定性；良好的制劑能力；良好的生物利用率；良好的藥物動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)性質(zhì)例如與Hsp90的緊密結(jié)合、快速的與Hsp90的結(jié)合率和/或良好的腦藥物動(dòng)力學(xué)；良好的細(xì)胞攝取；和低的與紅細(xì)胞的結(jié)合。實(shí)施例一般方法培養(yǎng)物的發(fā)酵用于生長(zhǎng)細(xì)菌菌林珍貴束絲放線菌珍貴亞種ATCC31280(US4，315,989)和奇跡束絲放線菌DSM43827(KCCA-0225,Watanabe等，1982)的條件在專利US4,315,989和US4,187,292中描述。本文中所用方法改編自這些專利中并且如下用于在震搖培養(yǎng)箱內(nèi)的管或燒瓶的肉湯里培養(yǎng)，在實(shí)施例中指出對(duì)已公開方案的改變。菌林在ISP2瓊脂(培養(yǎng)基3，Shirling，E.B.和Gottlieb,D.，1966)上在28°C培育2-3天并且用來接種種子培養(yǎng)基(培養(yǎng)基l，見改編自US4，315，989和US4,187,292的下文)。接種的種子培養(yǎng)基隨后于5或2.5cm的拋距(throw)以200-300轉(zhuǎn)/分鐘震搖，在28。C孵育48小時(shí)。為產(chǎn)生麥克菌素、18，21-二氫麥克菌素和麥克菌素類似物如17-氧基麥克菌素，將發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2，見下文和US4,315,989及US4，187，292)用2.5%-10%的種子培養(yǎng)物接種并于5或2.5cm的拋3巨以200-300轉(zhuǎn)/分鐘之間的震搖，開始是在28°C孵育24小時(shí)，隨后26°C孵育4-6天。隨后收獲培養(yǎng)物用于提取。培養(yǎng)基培養(yǎng)基1-種子培養(yǎng)基在1L蒸餾水中<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>來自乳固體的胨(西格瑪公司(Sigma))<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>在121。C高壓滅菌20分鐘進(jìn)行消毒。根據(jù)需要，在高壓滅菌后添加安泊拉霉素以產(chǎn)生終濃度50mg/L。培養(yǎng)基2-發(fā)酵培養(yǎng)基在1L蒸餾水中<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在121。C高壓滅菌20分鐘進(jìn)行消毒。提取培養(yǎng)肉湯用于LCMS分析加入培養(yǎng)肉湯(lmL)和乙酸乙酯(lmL)并混合15-30分鐘，然后離心10分鐘。收集0.5mL的有機(jī)層，蒸發(fā)干燥，然后重溶于0.25mL的甲醇，或0.23mL的甲醇+0.02mL的1。/。FeCl3溶液中。LCMS分析流程可以^(吏用AgilentHP1100HPLC系統(tǒng)結(jié)合BrukerDaltonicsEsquire3000+電噴射質(zhì)i脊儀在陽離子和/或陰離子模式操作下來實(shí)施LCMS。可以在PhenomenexHyperclone柱上(C18BDS，3u，150x4.6mm)實(shí)施色^普，在lmL/分鐘的流速下洗脫，使用下列梯度洗脫過程T=0，10%B;T=2，10%B;T=20，100%B;T=22，100%B;T=22.05,10%B;T=25，10%B。流動(dòng)相A-水+0.1。/。曱酸；流動(dòng)相B-乙腈+0.1。/。甲酸。在l卯和400nm之間記錄UV語，在210、254和276nm獲得提取的色語。在100和1500amu之間記錄質(zhì)譜。NMR結(jié)構(gòu)^兌明方法可以在BrukerAdvance500分光計(jì)上，以298K，在500MHz和125MHz操作，分別對(duì)^和13C記錄NMR語?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的Bruker脈沖序列獲得iH」HCOSY、APT、HMBC和HMQC譜。NMR譜可以用其所運(yùn)行的溶劑中的剩余質(zhì)子或標(biāo)準(zhǔn)碳共振作為參照?；衔锛兌鹊脑u(píng)價(jià)可以使用上述LCMS方法分析純化的化合物。可以通過MS在多波長(zhǎng)下(210、254和276nm)評(píng)價(jià)純度。所有的化合物可以在所有波長(zhǎng)下>95%純。最終可以通過，H和13CNMR譜的檢查來確定純度。水溶性的評(píng)價(jià)可以按如下檢測(cè)水溶性在室溫下在100%DMSO中制備17-氧基麥克菌素類似物的10mM儲(chǔ)液。將一式三份0.01mL等分試樣，在安培(amper)瓶中用0.1MPBS，pH7.3溶液或100%DMSO補(bǔ)充到0.5mL。在黑暗中振蕩所獲得的0.2mM溶液，室溫下在IKAvibraxVXR振蕩器上振蕩6小時(shí)，然后將獲得的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)移到2mLEp管中，在13200rpm離心30分鐘。然后用如上所述LCMS分析上清液的等分試樣。在258nm通過峰值區(qū)域測(cè)量來定量化合物。所有分析均一式三份的實(shí)施，通過比較PBS溶液和DMSO中的0.2mM(假設(shè)DMSO中的溶解度為100°/。)計(jì)算17-氧基麥克菌素化合物的溶解度。抗癌活性的體外生物測(cè)定可以在實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究所腫瘤檢測(cè)公司的腫瘤檢測(cè)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室(OncotestTestingFacility,InstituteforExperimentalOncology,OncotestGmbH，F(xiàn)reiburg)進(jìn)行化合物的抗癌活性的體外評(píng)價(jià)，這是在一組人腫瘤細(xì)胞系中在單層增殖測(cè)定中進(jìn)行。表l中總結(jié)了挑選的細(xì)胞系的特征。表l-測(cè)試細(xì)胞系#細(xì)胞系特征51CNXF498NLCNS2CXFHT29結(jié)腸3LXF1121L肺、大細(xì)胞ca4MCF-7乳腺、NCI標(biāo)準(zhǔn)5MEXF394NL黑素瘤1G6DU145前列腺-PTEN陽性O(shè)ncotest細(xì)胞系是按Roth等人，(1999)描述的>^腫瘤異種移植物中建立的。Fiebig等人，(1999)描述了供體異種移植物的起源。其它的細(xì)胞系是自NCI(DU145，MCF-7)獲得的或自DSMZ公司(DSMZ)，Braunschweig,德國購買的。除非另作說明，所有的細(xì)胞系均在加濕的大氣中(95%空氣,5%C02)，37。C下，在含有RPMI1640培養(yǎng)基、10。/。胎牛血清和0.1mg/mL慶大霉素(PAA，Cmbe,德國)的"即用混合(ready-mix)，，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)?？梢允褂酶牧嫉牡饣V測(cè)定來評(píng)價(jià)測(cè)試化合物對(duì)人腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)的影響(Dengler等人，(1995))。簡(jiǎn)而言之，通過胰酶消化從指數(shù)期培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并置于96孔平底微量滴定板上，所放置的細(xì)胞密度取決于細(xì)胞系(5-10,000活細(xì)胞/孔)?；謴?fù)24小時(shí)以允許細(xì)胞重新指數(shù)生長(zhǎng)后，向孔內(nèi)添加O.OlOmL的培養(yǎng)基(每個(gè)平板6個(gè)對(duì)照孔)或含有麥克菌素的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度一式三份放置?；衔镆詢蓚€(gè)濃度(1照/mL和10|Lig/mL)應(yīng)用。在連續(xù)暴露4天后，用0.2mL的含水碘化丙錠(PI)溶液(7mg/L)替換具有或沒有測(cè)試化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基。為了測(cè)量活細(xì)胞的比例，通過冷凍平板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理。在平板融化后，使用Cytofluor4000微量平板讀數(shù)儀測(cè)量熒光(激發(fā)530nm，發(fā)射620nm)，產(chǎn)生與活細(xì)胞總數(shù)的直接關(guān)系。用處理/對(duì)照x100(%T/C)來表示生長(zhǎng)抑制。實(shí)施例1-對(duì)麥克菌素PKS基因簇的測(cè)序基因組DNA使用Kieser等(2000)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案從珍貴束絲放線菌(ATCC31280)和奇跡束絲放線菌(DSM43827，ATCC29888)分離。DNA測(cè)序通過位于劍橋CB21QW的TennisCourt路的劍橋大學(xué)生物化學(xué)系的測(cè)序設(shè)備，使用標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施。4吏用引物BIOSG1045'畫GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3，(SEQIDNO:1)和BIOSG1055'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3'(SEQIDNO:2)，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增來自吸7JC鏈霉菌NRRL3602(序列登錄號(hào)AY179507)的格爾德霉素生物合成基因簇中的氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因^/附見Southern印跡實(shí)驗(yàn)使用DIG試劑和用于非放射性核酸標(biāo)記和檢測(cè)的試劑盒根據(jù)制造商的說明書(羅切公司(Roche))實(shí)施。DIG標(biāo)記的gd附7VDNA片段用作異源探針。使用^mTV產(chǎn)生的探針和從珍貴束絲放線菌2112分離的基因組DNA，在Southern印跡分析中鑒定到大約8kbEcoRI片段。該片段采用標(biāo)準(zhǔn)方法被克隆至Litmus28并且通過菌落雜交法鑒定轉(zhuǎn)化體?？寺3被分離并對(duì)大約7.7kb插入片段測(cè)序。從克隆p3中分離的DNA用EcoRI和EcoRI/SacI消化并且分別分離在約7.7kb和在約1.2kb處的條帶。標(biāo)記反應(yīng)根據(jù)制造商的方案實(shí)施。使用載體SuperCos1和GigapackIIIXL包裝試劑盒(斯萊特因^^司(Stratagene))根據(jù)制造商的說明書產(chǎn)生以上所提及兩個(gè)菌林的黏粒文庫。這兩個(gè)文庫使用標(biāo)準(zhǔn)方案加以篩選并且使用來自克隆p3的7.7kbEcoRI片段的DIG標(biāo)記片段作為探針?？h粒52從珍貴束絲放線菌的黏粒文庫中鑒定并提交至劍橋大學(xué)生物化學(xué)系測(cè)序設(shè)備進(jìn)行測(cè)序。類似地，勦粒43和黏粒46從奇跡束絲放線菌的黏粒文庫鑒定。這三種黏粒如Southern印跡分析所示均含有7.7kbEcoRI片段。黏粒43的PKS區(qū)的約0.7kbp片段4吏用引物BIOSG1245'國CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3，(SEQIDNO:3)和BIOSG1255'-GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3'(SEQIDNO:4)采用標(biāo)準(zhǔn)方案擴(kuò)增、克隆并且用作探針對(duì)珍貴束絲放線菌黏粒文庫篩選重疊克隆。黏粒52的序列信息也用來產(chǎn)生用于篩選珍貴束絲放線菌黏粒文庫的衍生自DNA片段的探針，其中所述的DNA片段由引物BIOSG1305'-CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG隱3'(SEQIDNO:5)和BIOSG1315-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-3'(SEQIDNO:6)以及BIOSG1325'-GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC畫3'(SEOIDNO:7)和BIOSG1335隱GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3,(SEQIDNO:8)擴(kuò)增。分離黏粒311和352并且將黏粒352送交測(cè)序。黏粒352含有與黏粒52的大約2.7kb重疊區(qū)。為篩選其它黏粒，使用引物BIOSG1365'-CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGGCTGC-3'(SEQIDNO:9)和BIOSG1375'-CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGCACAGCGAG-3'(SEQIDNO:10)和黏粒311作為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)方案擴(kuò)增大約0.6kbPCR片段。篩選珍貴束絲放線菌的黏粒文庫并分離黏粒410。黏粒410與|*粒352重疊大約17kb并將黏粒410送交測(cè)序。將三個(gè)重疊黏粒(恭粒52、黏粒352和黏粒410)的序列裝配起來。測(cè)序的區(qū)域覆蓋約100kbp并且鑒定可能構(gòu)成麥克菌素生物合成基因簇(SEQIDNO:ll)的23個(gè)可讀框。每個(gè)可讀框在SEQIDNO:ll中的位置在表3顯示。表2-縣粒的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>糾立52珍貴束絲放線菌ATCC31280黏粒311珍貴束絲放線菌ATCC31280黏粒352珍貴束絲放線菌ATCC31280黏粒410珍貴束絲放線菌ATCC31280表3-每個(gè)可讀框在SEQIDNO:ll中的位置SEQIDNO:11中的核苷酸位置基因名稱所編碼蛋白質(zhì)的功能14925-17卯9*mbcRII轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物18025-l卯74cmbcO氨基氫化奎尼酸(Amiiiohydroquiiiate)合酶19263-20066C*mbc未知，AHBA生物合成20330-40657mbcAIPKS40654-50859mbcAIIPKS50867-62491AmbcAIIIPKS62500-63276*mbcF酰胺合酶63281-64852*mbcMC21單加氧酶64899-65696c*PH磷酸酶65693-66853c*OX氧化還原酶66891-68057c*AhsAHBA合酶68301-68732*AdhADHQ脫水酶68690-69661c*AHkAHBA激酶70185-72194c*mbcN氨曱酰基轉(zhuǎn)移酶<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>注1:c表示該基因由互補(bǔ)DNA鏈編碼；注2:有時(shí)候可以鑒定出多于一個(gè)的潛在候選起始密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)出這種情況并且能夠鑒定備選的可能起始密碼子。我們已經(jīng)用符號(hào)'*'標(biāo)出具有多于一個(gè)可能起始密碼子的那些基因。盡管我們標(biāo)出了我們所認(rèn)為的起始密碼子，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以有使用備選起始密碼子產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)的可能實(shí)施例2——4，5-二氫-ll-0-去曱基-15-去甲氧基-17-羥基-麥克菌素的生產(chǎn)產(chǎn)生珍貴束絲放線菌菌株，其中，已經(jīng)符合讀框地缺失了w&尸、柳6c/M50、附6d^T77和柳6cMr2基因，在該菌林中，還額外表達(dá)^/附丄來生產(chǎn)4，5-二氫-11-0-去甲基-15-去甲M-17-羥基-麥克菌素。2.1克隆與附6cM77下游側(cè)翼區(qū)域同源的DNA使用黏粒52(來自實(shí)施例1)作為模板以及PfuDNA聚合酶，使用寡聚物ls4del1(SEQIDNO:12)和ls4del2a(SEQIDNO:13),在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)中從珍貴束絲it線菌(ATCC31280)中擴(kuò)增1595bp的DNA區(qū)域。在寡聚物ls4del2a中設(shè)計(jì)了5，延伸，來引入爿vrll位點(diǎn)，幫助擴(kuò)增片段的克隆(附圖3)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(l+2a，附圖4SEQIDNO:14)編碼附6dWT2的3'端的196bp,以及下游同源的另外1393bp。將該1595bp片段克隆到已經(jīng)用5>"1線性化的pUC19中，獲得質(zhì)粒pLSSl+2a。ls4del1(SEQIDNO:12)5，-GGTCACTGGCCGAAGCGCACGGTGTCATGG-3"ls4del2a(SEQIDNO:13)5，一CTAGGCGACTACCCCGCACTACTACACCGAGCAGG-3"2.2克隆與附6dlf上游側(cè)翼區(qū)域同源的DNA使用黏粒52(來自實(shí)施例1)作為模板和PfuDNA聚合酶，使用寡聚物ls4del3b(SEQIDNO:15)和ls4del4(SEQIDNO:16)，在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)中從珍貴束絲放線菌(ATCC31280)中擴(kuò)增1541bp的DNA區(qū)域。在寡聚物ls4del3b中設(shè)計(jì)了5，延伸，來引入爿wll位點(diǎn)，幫助擴(kuò)增片段的克隆(附圖3)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(3b+4，附圖5SEQIDNO:17)編碼附Ac尸的5，端的95bp,以及上游同源的另外1440bp。將該1541bp片段克隆到已經(jīng)用線性化的pUC19中，獲得質(zhì)粒pLSS3b+4。ls4del3b(SEQIDNO:15)5，一CCTAGGAACGGGTAGGCGGGCAGGTCGGTG-3'ls4del4(SEQIDNO:16)5,-GTGTGCGGGCCAGCTCGCCCAGCACGCCCAC-3'將產(chǎn)物l+2a和3b+4克隆到pUC19中，以利用pUC19多聚接頭中的和5a附HI位點(diǎn)用于下一克隆步驟。將來自pLSSl+2a的1621bp/4wII////"dIII片段，和來自pLSS3b+4的1543bp^vrlI/5fl附HI片段克隆到pKC1132的3556bpi7/"dlII/Ba附HI片段中，產(chǎn)生pLSS315。因此，pLSS315含有歷wdlII/jB"附HI片段，其編碼與在爿vrll位點(diǎn)融合的所需的四個(gè)ORF缺失區(qū)域的側(cè)翼區(qū)域同源的DNA(附圖3)。2.3珍貴束絲放線菌珍貴亞種的轉(zhuǎn)化使用pLSS315用電穿孔轉(zhuǎn)化具有質(zhì)粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567,產(chǎn)生用于接合的大腸桿菌供體菌林。通過營(yíng)養(yǎng)接合(Matsushima等人，1994)使用該菌林轉(zhuǎn)化珍貴束絲放線菌珍貴亞種。將接合后體涂布在MAM培養(yǎng)基(1%小麥淀粉、0.25%玉米漿固體、0.3%酵母提取物、0.3%碳酸4丐、0.03%硫酸鐵、2%瓊脂)上，在28。C孵育。在24小時(shí)后用50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酮酸涂布平板。由于pLSS315在珍貴束絲放線菌珍貴亞種中不能復(fù)制，預(yù)計(jì)阿泊拉霉素抗性菌落是包含質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，其中所述質(zhì)粒藉由質(zhì)粒來源的同源性區(qū)域通過同源重組被整合到染色體中，2.4篩選次級(jí)交換(secondarycross)選擇6個(gè)麥克菌素生產(chǎn)接合后體用于進(jìn)一步分析。從6個(gè)接合后體中分離基因組DNA，消化并用Southern印跡分析。印跡顯示，6個(gè)分離體中的5個(gè)已經(jīng)在同源性的RHS區(qū)域中發(fā)生整合，6個(gè)分離體中的1個(gè)已經(jīng)在LHS區(qū)域中發(fā)生了同源整合。選擇由LHS區(qū)域中的同源性整合產(chǎn)生的一林菌林(BIOT-3829;珍貴束絲放線菌pLSS315#9)和由RHS區(qū)域中的同源性整合產(chǎn)生的兩林菌林(BIOT-3826;珍貴束絲放線菌pLSS315#3和BIOT-3830;珍貴束絲放線菌pLSS315#12)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，來篩選次級(jí)交換。將菌林涂斑(patch)至MAM培養(yǎng)基上(補(bǔ)充以50mg/L阿泊拉霉素)并在28°C生長(zhǎng)4天。每個(gè)菌斑(patch)的1cm2區(qū)域被用來接種在50ml福爾肯管(falcon)中的7mL的ISP2(0.4%酵母提取物、1%麥芽提取物、0.4%右旋葡萄糖，未補(bǔ)充抗生素)。培養(yǎng)物生長(zhǎng)2-3天，然后傳代培養(yǎng)(5%接種物)至50mL福爾肯管中的7mLISP2中。在4-5輪傳代培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物超聲處理，連續(xù)稀釋，涂布到MAM培養(yǎng)基上，并在M。C孵育4天。然后將單個(gè)菌落一式兩份涂斑到含有阿泊拉霉素的MAM培養(yǎng)基上和不含抗生素的MAM培養(yǎng)基上，并且將平板在28°C孵育4天。將生長(zhǎng)在無抗生素平板上、但沒有生長(zhǎng)在阿泊拉霉素平板上的菌斑，重新涂斑到+/-阿泊拉霉素平板上，驗(yàn)證它們已經(jīng)丟失了抗生素標(biāo)志物。需要的突變菌林具有麥克菌素蔟的3892bp缺失，包含基因w6c尸、附6c/V50、附6dWT7和附6dWT2。從含有正確缺失的珍貴束絲放線菌pLSS315M2產(chǎn)生的一個(gè)菌落被命名為BIOT-3852。按一般方法中描述的提取和分析來自該菌林的發(fā)酵肉湯。LCMS分析表明沒有生產(chǎn)麥克菌素，但是觀察到保留時(shí)間為15.0分鐘，和m/z-515.5[M-H-，539.5[M+Na]+的單個(gè)、更高極性的、主要組分"。通過LCMS和NMR無法區(qū)分該組分(在分離后)與另外生產(chǎn)的化合物4，5-二氫-11-0-去甲基-15-去甲緣麥克菌素，2.5質(zhì)粒Lit28gdmL的分離使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從吸7JC鏈霉菌NRRL3602的格爾德霉素生物合成基因簇(序列登錄號(hào)AY179507)中，使用寡聚物BioSGllO(SEQIDNO:18)和BioSGlll(SEQIDNO:19)，擴(kuò)增1512bp的DNA區(qū)域。(SEQIDNO:20;附圖6A，還顯示了gdmL的^J^酸序列，附圖6B，SEQIDNO:21)。在引物末端引入的和iVrfel限制性酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)示。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆到已經(jīng)預(yù)先用JcoRV線性化的載體Litmus28中。分離質(zhì)粒Lit28gdmL，并用DNA序列分析證實(shí)。BioSGllO(SEQID脆19):5，-GGCATATGTTGACGGAGAGCACGACCGAGGTCGTTG-3"BioSGlll(SEQIDNO:18):5，畫GGTCTAGAGGTCAGGGCACCCTCGCGAGGTCGCCGG畫3'2.6質(zhì)粒pGP9gafwl的分離用7Vrfel/AT/ml消化質(zhì)粒Lit28gdmL,分離約1.5kb插入DNA片段，并克隆到A^el/AT^iI處理的栽體pGP9中。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離質(zhì)粒pGP9gdmL。通過限制性消化分析驗(yàn)證構(gòu)建體。2.7用pGP9gdmL補(bǔ)充BIOT-3852使用質(zhì)粒pGP9gdmL對(duì)BIOT-3852的接合實(shí)驗(yàn)按如下進(jìn)行。使用具有質(zhì)粒pUZ8002的大腸桿菌ET12567通過電穿孔轉(zhuǎn)化pGP9gdmL，產(chǎn)生用于接合的大腸桿菌供體菌林。該菌林與BIOT-3852組合用于接合實(shí)驗(yàn)(Matsushima等人，1994)。將接合后體涂布到培養(yǎng)基4(MAM培養(yǎng)基)上，并且在28。C孵育。在24小時(shí)后將平板用50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘咬酮酸涂布。將轉(zhuǎn)化體涂斑至含有50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘咬酮酸的MAM平板(培養(yǎng)基4)上。使用來自每個(gè)菌斑的6mm環(huán)形塞(circularplug)接種含有補(bǔ)充了50mg/L阿泊拉霉素的10mL種子培養(yǎng)基(由培養(yǎng)基1調(diào)整的一2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、0.5。/。玉米漿固體、1%豆粉、0.5%胨、0.3。/。氯化鈉、0.5%碳酸4丐)的各個(gè)50mL福爾肯管中。這些種子培養(yǎng)物在28°C、以2英寸拋距的200rpm孵育2天。然后，這些種子培養(yǎng)物用于接種(0.5mL至10mL中)生產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2-5%甘油、1%玉米漿固體、2。/o酵母提取物、2%磷酸二氫鉀、0.5%氯化鎂、0.1%碳酸鈞)，并在28。C生長(zhǎng)24小時(shí)，然后在26。C生長(zhǎng)另外6天。按一般方法中描述的實(shí)施發(fā)酵肉湯的提取和后續(xù)的LCMS檢測(cè)。在一個(gè)此類提取物中，除了產(chǎn)生14以外，還觀察到保留時(shí)間為13.4分鐘洗脫的少量新化合物(15)的產(chǎn)生。其表現(xiàn)的特征性離子具有m/z=531.4[M-H]—和555.4[M+Na+,這與15為化合物4,5-二氫-11-0-去甲基-15-去甲氧基-17-羥基麥克菌素一致。在本申請(qǐng)中參考的所有文獻(xiàn)，包括專利和專利申請(qǐng)，都以其最完整的程度整合到本文中作為參考。在說明書和以下的權(quán)利要求中，除非上下文另外要求，詞語"包含"，及其變體例如"含有，，和"包括"都將理解為包括所述整體或整體的步驟或群組，但不排除任何其他的整體或整體的步驟或群組或者步驟。參考文獻(xiàn)Allen,I.W.和Ritchie,D.A.(1994)CloningandanalysisofDNAsequencesfrom5^re/;to附3;cesAj;gmsc甲'c"sencodinggeldanamycinbiosynthesis.Mol.Gen.Genet.243:593-599.Bagatell，R.和Whitesell，L.(2004)AlteredHsp90functionincancer:Auniquetherapeuticopportunity.MolecularCancerTherapeutics3:1021-1030.Beliakoff，J.和Whitesell,L.(2004)Hsp90:anemergingtargetforbreastcancertherapy.Anti-CancerDrugs15:651-662.Bibb,M.J"G.R.Janssen，等人(1985)."CloningandanalysisofthepromoterregionoftheerythromycinresistancegeneofSfre尸to考ceye/j幼rae"s."Gene38(1-3》215-26.Bierman，M.，Logan,R.，O'Brien,K.，Seno,ET.，NagarajaRao，R.和Schemer,BE.(1992)"PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfrom^"5r/rm'c/r/flrco/i'to5^尸ep似考cess//."Gene116:43-49.Blagosklonny,M.V.(2002)Hsp-90-associatedoncoproteins:multipletargetsofgeldanamycinanditsanalogues.Leukemia16:455-462.Blagosklonny,M.V"Toretsky，J.，Bohen,S.和Neckers，L.(1996)Mutantconformationofp53translatediVfor//iv/vorequiresfunctionalHSP卯.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8379-8383.Blanc，V.;Salah-Bey，K.;Folcher,M.;Thompson,C.J.MAM/m^/.1995,77,989-999.Bohen，S.P.(1998)Geneticandbiochemicalanalysisofp23andansamycinantibioticsinthefunctionofHsp90-dependentsignalingproteins.MolCellBiol18:3330-3339.Carreras，C.W.，Schirmer，A.，Zhong，Z.和SantiD.V.(2003)Filterbindingassayforthegeldanamycin-heatshockprotein90interaction.AnalyticalBiochemistry317:40-46.Cassady，J.M.，Chan,K.K"Floss,H.G.和LeistnerE.(2004)Recentdevelopmentsinthemaytansinoidantitumouragents.Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26.Chiosis,G.,Huezo，H.，Rosen,N.，Mimnaugh，E.，Whitesell，J.和Neckers,L.(2003)17AAG:Lowtargetbindingaffinityandpotentcellactivity—findinganexplanation.MolecularCancerTherapeutics2:123-129.Chiosis，G.，Vilenchik，M.，Kim,J.和Solit，D.(2004)Hsp90:thevulnerablechaperone.DrugDiscoveryToday9:881-888.Csermely,P.和Soti，C.(2003)InhibitionofHsp90asaspecialwaytoinh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(gè)所述后-PKS基因是grfwl，或其同源物；c)在用于生產(chǎn)新型化合物的合適的條件下培養(yǎng)所述修飾的宿主菌林；和d)任選的分離所生產(chǎn)的化合物。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其額外包括步驟e)缺失或滅活一個(gè)或多個(gè)麥克菌素后-PKS基因或其同源物，所迷步驟通常在步驟c)前發(fā)生。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其額外包括步驟f)再引入一個(gè)或多個(gè)缺失的后-PKS基因，所述步驟通常在步驟c)前發(fā)生。27.根據(jù)權(quán)利要求24至26的任一項(xiàng)方法，其額外包括步驟g)引入來自其它PKS簇的后-PKS基因，所述步驟通常在步驟c)前發(fā)生。28.遺傳改造的宿主菌林，其在其未改變的狀態(tài)下天然的生產(chǎn)麥克菌素，所述菌林具有插入的一個(gè)或多個(gè)與麥克菌素PKS基因簇不天然相關(guān)的后-PKS基因，其中至少一個(gè)所述后-PKS基因是^//￡或其同源物。29.權(quán)利要求28的宿主菌林，其中已經(jīng)額外缺失了來自麥克菌素PKS基因簇的一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因。30.權(quán)利要求29的宿主菌株，其中已經(jīng)重新引入了一個(gè)或多個(gè)缺失的后-PKS基因。31.權(quán)利要求28至30的任一項(xiàng)的宿主菌林，其中已經(jīng)重新引入了來自異源PKS簇的一個(gè)或多個(gè)后-PKS基因。32.權(quán)利要求29的宿主菌林，其中已經(jīng)缺失了附Ac戶、w6c/V50、附&厘77和附6dlf77，并且已經(jīng)引入了。33.根據(jù)權(quán)利要求28至32的任一項(xiàng)的宿主菌林，其是珍貴束絲放線菌(J./v幼Vmwi)或奇跡束絲i丈線菌(爿.附,V""附)。34.生產(chǎn)17-氧基麥克菌素或其類似物的方法，其包括培科艮據(jù)權(quán)利要求28至33的任一項(xiàng)的菌林。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其還包括分離17-M麥克菌素或其類似物的步驟。36.根據(jù)權(quán)利要求28至33的任一項(xiàng)的宿主菌株生產(chǎn)17-IL&麥克菌素或其類似物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及在例如治療癌癥、B細(xì)胞惡性腫瘤、瘧疾、真菌感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病、依賴血管發(fā)生的疾病、自身免疫疾病中和/或作為癌癥的預(yù)防性預(yù)治療中有效的根據(jù)式(IA)或(IB)的17-氧基麥克菌素類似物或其可藥用鹽，其中R₁代表H、OH或OCH₃；R₂代表H或CH₃，R₃代表H或CONH₂，R₄和R₅每個(gè)都代表H或它們一起代表鍵(即C4至C5是雙鍵)；以及R₆代表H或OH；以及R₇代表H或CH₃。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)這些化合物的方法和它們?cè)谒幬镏械挠猛?，特別是在癌癥或B細(xì)胞惡性腫瘤的治療和/或預(yù)防中的用途。文檔編號(hào)A61K31/395GK101437802SQ200780016588公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2007年5月9日優(yōu)先權(quán)日2006年5月9日發(fā)明者C·馬丁,M·張,N·科茨,S·蓋瑟申請(qǐng)人:百奧帝卡技術(shù)有限公司