專利名稱：肽在控制輻射損傷中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及機體調(diào)節(jié)重要生理學過程的天然途徑，并基于PCT國際公開文本W(wǎng)O99/59617和WO01/72831和PCT國際申請PCT/NL02/00639中的認識，在此通過引用將上述文獻的全部內(nèi)容并入本申請。這些申請公開了存在于妊娠婦女體內(nèi)的、由胎盤促性腺激素如hCG的蛋白水解斷裂而產(chǎn)生的基因調(diào)節(jié)性肽。這些斷裂產(chǎn)物的長度通常僅為2到6個氨基酸，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們具有優(yōu)越的免疫活性，所述活性是通過調(diào)節(jié)編碼炎性介質(zhì)如細胞因子的基因表達而實現(xiàn)的。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)hCG的斷裂產(chǎn)生了一系列有助于維持妊娠婦女的免疫學內(nèi)穩(wěn)態(tài)的肽。這些肽平衡免疫系統(tǒng)以確保母體保持免疫學穩(wěn)定，同時其胎兒在孕期不會被排斥而是被安全地孕育直至出生。
此外，本發(fā)明涉及美國申請10/821,240，其提供了用于篩選和鑒定其他小的基因調(diào)節(jié)性肽并使用根據(jù)此類篩選的結果例如來自參照肽的肽的方法。例如，待分析的肽來自C反應蛋白(CRP)(如人CRP)，此類肽包括LTSL、FVLS、NMWD、LCFL、MWDF、FSYA、FWVD、AFTV、和WDFV；來自β-連環(huán)蛋白(如人CTNB)的肽，例如GLLG、TAPS、VCQV、CLWT、VHQL、GALH、LGTL、TLVQ、QLLG、YAIT、LCEL、GLIR、APSL、ITTL、QALG、HPPS、GVLC、LCPA、LFYA、NIMR、NLIN、LHPP、LTEL、SPIE、VGGI、QLLY、LNTI、LWTL、LYSP、YAMT、LHNL、TVLR、和LFYA；來自β-hCG(如人CG)的肽，例如GLLLLLLLS、MGGTWA、TWAS、TLAVE、RVLQ、VCNYRDV、FESI、RLPG、PRGV、NPVVS、YAVALS、LTCDDP、EMFQ、PVVS、VSYA、GVLP、FQGL、和AVAL；來自布魯頓型酪氨酸激酶(Bruton′styrosine kinase)(如人BTK)的肽，例如LSNI、YVFS、LYGV、YVVC、FIVR、NILD、TIMY、LESI、FLLT、VFSP、FILE、TFLK、FWID、MWEI、QLLE、PCFW、VHKL、LYGV、LESI、LSNI、YVFS、IYSL、和NILD；以及來自基質(zhì)金屬蛋白酶-2(如人MM02)的肽，例如FKGA、FFGL、GIAQ、LGCL、YWIY、AWNA、ARGA、PFRF、APSP、CLLS、GLPQ、TFWP、AYYL、FWPE、CLLG、FLWC、RIIG、WSDV、PIIK、GLPP、RALC、LNTF、LSHA、ATFW、PSPI、AHEF、WRTV、FVLK、VQYL、KFFG、FPFR、IYSA、和FDGI，等等。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及針對因暴露于高能電磁波(X射線/光子和/或天然伽瑪射線)和/或其他高能電離粒子(阿爾法粒子、貝塔粒子、中子、質(zhì)子、π-介子)而引起的急性輻射損傷的藥物研發(fā)領域。迄今尚無有效的藥物能夠在意外暴露于電離照射之后，或者在治療性輻射過程中或放射性模擬劑造成正常組織損傷之后減輕輻射損傷；也沒有有效的預防性藥物能夠在事件之前(例如，第一應答者)施用來預防此類損傷或者使之最小化。本發(fā)明人出乎意料地觀察到相對小的非毒性肽可有效地用作抗輻射損傷藥物。重要的是，本發(fā)明的抗輻射肽不僅可用作預防劑，當在暴露于輻射后數(shù)小時施用時還具有保護作用。這使得它們特別適合用于軍事輻射事件，例如用于對付核恐怖主義的恐怖活動。因此，本發(fā)明提供用于預防或治療有需要的對象的輻射損傷的方法，包括給所述對象施用小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物。優(yōu)選地，在輻射后給所述對象施用所述肽或其功能性類似物，即在所述對象暴露于輻射源之后。此外，本發(fā)明提供小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物在制備用于治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的藥物組合物中的用途。具體地，本發(fā)明提供抗輻射肽，其針對急性全身照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定測試何種劑量的全身照射(WBI)在WBI后30天導致測試組實驗嚙齒動物(如小鼠)出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組在WBI后立即或最多72小時內(nèi)用所述肽進行處理，與WBI后30天導致未處理對照組出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)的WBI劑量相比，其中通過將肽處理組動物的LD50/30輻射劑量除以載體處理組動物的LD50/30輻射劑量來計算所述DRF。
本發(fā)明提供治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的方法，該方法包括給所述對象提供藥物組合物，所述藥物組合物包括小于30個氨基酸的抗輻射肽。目前的輻射保護劑是非肽性的或者包括大的蛋白質(zhì)如細胞因子。本發(fā)明公開了可用于防護和治療輻射損傷的小于30個氨基酸的肽，例如MTRVLQGVLPALPQVVC。這是首次發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)暴露于輻射之后施用肽類藥物能夠降低輻射的損傷效應。例如，所述抗輻射肽由至多29、至多28、至多27、至多26、至多25、至多24、至多23、至多22、至多21、至多20、至多19、至多18、至多17、至多16或至多15個氨基酸組成。
不過，所述肽優(yōu)選地小于15個氨基酸。例如，所述抗輻射肽優(yōu)選地由至多14、至多13、至多12、至多11、至多10、至多9或至多8個氨基酸組成。一些有用的肽的實例是LPGCPRGVNPVVS、DINGFLPAL和QPLAPLVG。不過，如果肽是用于自身治療，例如在此所述的使用自用式注射器(autoinjector)進行自身治療，則出于安全性考慮，優(yōu)選地所述肽小于7個氨基酸。這樣的肽通常不會結合MHC受體，由此降低了發(fā)生由針對所施用的肽的免疫應答而引發(fā)的自身免疫的風險。
小于7個氨基酸(aa)是特別優(yōu)選的另一個原因是，發(fā)現(xiàn)大小為7個氨基酸的肽(當比較來自人的蛋白酶體的肽和來自病原體(特別是病毒或細菌)蛋白酶體的肽時(Burroughs et al.，Immunogenetics，2004，56311-320))在自身和非自身之間僅有3％的重疊。對于6個氨基酸的肽，人類自身與病原體非自身之間的重疊被確定為30％，對于5個氨基酸的肽，人類蛋白酶體中存在的肽與病原體蛋白酶體中存在的肽之間的重疊被確定為90％，而對于4個氨基酸和更小的肽，該重疊被確定為100％。基于這些數(shù)據(jù)，現(xiàn)在認識到當不存在自身-非自身差異時，不良免疫反應例如過敏性休克的風險極大地減少，這對于未受過醫(yī)學訓練的人給自己或者他人施用任何藥物而言是有益的。
因此，就預防不良反應如過敏性休克而言，優(yōu)選地所述肽由2到6個氨基酸、更優(yōu)選地由3到5個氨基酸、且最優(yōu)選地由3或4個氨基酸組成。就活性而言，基于一般性的觀點，只要能夠更長地經(jīng)受完全的蛋白水解作用則肽越大活性便越顯著，由此3個氨基酸的代謝片段仍具有活性，優(yōu)選地，所述肽由4個氨基酸組成。上文和下文所描述的組合物優(yōu)選地用于治療急性輻射損傷。
現(xiàn)有技術已經(jīng)提到使用肽來防護輻射損傷。日本專利申請JP09157291和JP09157292公開了具體的6聚體和9聚體肽序列，其具有體外抑制活性氧的作用、清除活性氧自由基和抗氧化活性。這些肽被認為可用于體內(nèi)抑制與活性氧形成相關的包括輻射損傷在內(nèi)的各種事件的不良反應。但其未進行體內(nèi)輻射實驗。
JP09176187教導了含組氨酸的6聚體肽類似物，其具有清除活性氧的活性。照射前20分鐘腹腔施用660mg/kg體重的肽使得小鼠的存活率由對照組的10％上升至處理組的70％。但其未進行體內(nèi)的照射后實驗。
WO2006/032269公開了一種血細胞勻漿物，從中已經(jīng)去除了分子量超過3kDa的成分。據(jù)報道該勻漿物適合用于改善對象的細胞免疫應答。在諸多不同的免疫學疾病和病理情況中，認為該勻漿物可在使用化療和/或放療的治療中預防性施用于患者以改善患者的一般狀況。但該研究沒有涉及任何輻射實驗。此外，盡管該勻漿物可能包括蛋白質(zhì)的混合物，但活性成分的性質(zhì)根本不清楚，而且活性成分也可能是非蛋白性的。不管怎樣，該文獻沒有分離或鑒定任何具體的肽。
EP 0572688公開了包括14個氨基酸殘基的具體的肽，該肽在20mg/kg體重能夠保護小鼠抵抗全身照射。僅在輻射前1小時施用時觀察到該肽的保護作用。而在暴露于照射后1小時施用該肽則沒有觀察到其與對照組數(shù)據(jù)具有區(qū)別。
這些現(xiàn)有技術公開的內(nèi)容與本發(fā)明形成顯著的對照；本發(fā)明的抗輻射肽甚至在全身照射后數(shù)小時施用仍有保護作用。
接受亞致死輻射劑量的對象已經(jīng)可以從本發(fā)明所鑒定的一些小肽的抗炎特性中獲益，但出乎意料的是，絕大部分獲益來自這些小肽的抗胃腸道綜合征活性，特別是來自當劑量為1mg/kg體重以上、優(yōu)選地5mg/kg體重以上、更優(yōu)選地10mg/kg體重以上時的3聚體和4聚體肽。考慮到小肽(即3到4個氨基酸的肽)的低免疫原性特征，小肽劑量可高達100mg/kg，且在一些情況下考慮到需要治療的對象的情況需要緊急治療，其劑量可高達200mg/kg、500mg/kg、或者甚至1g/kg。因此，現(xiàn)在可以對那些存在包括腸道被覆層(lining)損害即所謂的胃腸道綜合征在內(nèi)的輻射損傷的對象進行治療；所述的肽能夠使得上皮被覆層慢慢恢復。
為了使得肽在高輻射劑量情況下具有更好的活性，優(yōu)選地選擇肽將其置于本發(fā)明的藥物組合物或者本發(fā)明的自用式注射器中，所述肽具有的針對急性伽瑪照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致測試組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組小鼠在WBI后72小時用所述肽進行處理，和測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致對照組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述對照組小鼠在WBI后72小時僅用所述肽的載體進行處理，和其中通過將肽處理組動物的LD50/30除以載體處理組動物的LD50/30來計算所述DRF。
更加優(yōu)選地，所使用的肽具有的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.20，更加優(yōu)選地為至少1.25，對于所述輻射損傷是照射損傷的情況尤其如此。本發(fā)明所鑒定的肽也稱為抗輻射肽。本發(fā)明提供用于治療照射損傷的方法和藥物組合物，所述輻射是由放射性物質(zhì)(放射性同位素)如鈾、氡、和钚發(fā)出的或者是由人造輻射源例如X射線和放療儀器所產(chǎn)生的。
本發(fā)明還提供小于30個氨基酸的肽在制備用于治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的藥物組合物中的用途。如上所述，所述肽優(yōu)選地小于15個氨基酸，且用于自我醫(yī)治或由非專業(yè)人士施用，更優(yōu)選地，所述肽小于7個氨基酸。在此鑒定的一些可用來制備用于治療輻射損傷的藥物組合物的3聚體肽是VVC、LAG、和AQG。
類似地，一些可用于治療輻射損傷的4聚體肽是LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、NMWD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SPIE、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、和LCFL，可用于治療輻射損傷的5聚體肽是TLAVE、VEGNL、和LNEAL，可用于治療輻射損傷的6聚體肽是VLPALP、MGGTWA、LTCDDP，可用于治療輻射損傷的7聚體肽是VLPAPLQ、VCNYRDV、和CPRGVNP，可用于治療輻射損傷的8聚體肽是QPLAPLVG，且可用于治療輻射損傷的9聚體肽是DINGFLPAL。
可通過在增殖分析中測試肽的抗細胞周期活性而找到其他的肽，特別是3或4聚體肽，例如通過采用在此所述的植物生長分析法。在此特別提供由2至6個氨基酸組成的肽在制備用于治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的藥物組合物中的用途。同樣，就預防不良反應如過敏性休克而言，用于制備所述藥物組合物的肽優(yōu)選地由2到6個氨基酸、更優(yōu)選地由3到5個氨基酸、且最優(yōu)選地由3或4個氨基酸組成。如果僅就活性而言，基于一般性的觀點，只要(施用后)能夠更長地經(jīng)受完全的蛋白水解作用則肽越大活性便越顯著，由此3個氨基酸的代謝片段仍具有活性，優(yōu)選地，所述肽由4個氨基酸組成。
此外，特別有用的是，那些需要治療輻射損傷的對象現(xiàn)在可以通過簡單的皮下或者肌肉內(nèi)注射進行治療，由此使得能夠以自用式注射器進行自我治療，或者由未經(jīng)訓練的或者非醫(yī)療人員進行治療，由此在成千上萬人需要治療的緊急情況下使得救護組織工作極為便捷。而假如只有靜脈注射或者同樣危險的腹腔內(nèi)注射才是有效的，那么相對于存在簡單的施用工具如本發(fā)明提供的自用式注射器的情況，需要治療的對象將更難得到救助。
具體地，本發(fā)明還提供小于30個氨基酸的肽在制備用于治療輻射損傷的藥物組合物中的用途，其中所述藥物組合物被置于自用式注射器中。自用式注射器是一種醫(yī)療裝置，用于施用單劑量的特殊藥物(典型地是急救藥物)，有時也稱為預充式注射器，用于自己注射或者由非醫(yī)療人員或非專業(yè)人士注射。在本申請中，術語＂自用式注射器＂并不是指在分析系統(tǒng)、如Husek et al.(J.of Chromatography BBiomedical Sciences & Applications，Elsevier，Amsterda，Vol.767，no.1，(2002)pg.169-174)所述的色譜裝置中用于自動化施加生物學樣品(例如肽)的注射器。
通過設計，自用式注射器易于使用并可由患者給自己施用或者由非專業(yè)人士給患者施用。注射部位典型地是大腿或者臀部內(nèi)，其中所述治療包括皮下或肌肉內(nèi)注射所述肽。由于自用式注射器可設計為自動而可靠地施用所需劑量的藥物，因此它們有助于快速、簡便和準確地施用藥物。具體而言，自用式注射器很適合由那些必須給自己施用治療物質(zhì)的對象或者由那些必須在較短時間內(nèi)給多個對象實施注射(如急診的情況)的醫(yī)護人員使用。此外，可設計具有針刺注射機構(needled injection mechanism)的自用式注射器，以便在注射操作之前、期間、甚至之后均看不到針頭，由此降低或者消除與可見針頭刺入對象組織時有關的任何焦慮。盡管針刺自用式注射器的具體規(guī)格差異很大，但它們通常包括體部或者殼體、針刺注射器或者類似裝置、以及一或多個驅(qū)動機構，后者用于將針頭刺入對象的組織并通過刺入的針頭輸送所需劑量的液體藥物?，F(xiàn)有的針刺自用式注射器中的驅(qū)動機構通常包括能夠為驅(qū)動機構提供動力的能量源。這種能量源可以是例如機械式的(即彈簧加壓式)、氣動式的、機電式的、或者化學的，見美國專利6,149,626、6,099,504、5,957,897、5,695,472、5,665,071、5,567160、5,527,287、5,354,286、5,300,030、5,102,393、5,092,843、4,894,054、4,678,461、和3,797,489，通過引用將上述各專利的內(nèi)容并入本申請。國際公開文本W(wǎng)O 01/17593、WO 98/00188、WO 95/29720、WO95/31235、和WO 94/13342也公開了包括不同驅(qū)動機構的各種注射器。大多數(shù)自用式注射器是(任選地彈簧加壓式)注射器。
本發(fā)明的自用式注射器，特別是與肽直接接觸的體部或者殼體，優(yōu)選地由與肽具有最小親和力的材料制得。這可最大程度減小肽粘附或黏著于自用式注射器。一種非常合適的材料是聚丙烯，特別是基本上純的聚丙烯。
自用式注射器最初被設計用于克服用針給自己施用藥物時的猶豫感。此類自用式注射器的實例是Epipen

或最近引入的Twinject

，后者通常用于具有過敏性反應危險的人。自用式注射器的另一個實例是用于施用干擾素β以治療多發(fā)性硬化的Rebiject

。自用式注射器時常用于陸軍以保護人員抵抗化學作戰(zhàn)劑。在美國陸軍中，每個生物或化學武器反應包中均有自用式注射器。該反應包被分發(fā)給每個可能面對生物或化學武器的士兵。一旦啟動，針會自動對人進行注射，刺透人身上的任何衣物(甚至是多層衣物)。本發(fā)明的自用式注射器不僅包括上述的注射裝置(通常是彈簧驅(qū)動的)以自動進行皮膚穿刺和/或藥物注射，還包括預充式注射器或自用式注射藥筒等等。
本發(fā)明提供可用于治療(放)輻射損傷的此類自用式注射器，而無論輻射是由放射性物質(zhì)(放射性同位素)例如鈾、氡、和钚發(fā)出的，還是由人造輻射源例如X射線和放療儀器產(chǎn)生的。本發(fā)明還提供保護的藥物組合物的自用式注射器，所述藥物組合物由小于30個氨基酸的肽(在此稱為抗輻射肽)和合適的賦形劑組成。賦形劑是本領域已知的，例如見Handbook ofPharmaceutical Manufacturing Formulations(Sarfaraz K Niazi編輯；ISBN0849317460，在此通過引用并不本申請)。
賦形劑的組成為例如水、丙二醇、乙醇、苯甲酸鈉和苯甲酸作為緩沖物、和苯甲醇作為防腐劑；或者為甘露醇、人血清白蛋白、乙酸鈉、乙酸、氫氧化鈉、以及注射用水。其他用于通過自用式注射器胃腸外施用的示例性組合物包括注射溶液或混懸液，其含有，例如，合適的非毒性、胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，例如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格氏液、等張氯化鈉溶液、或其他合適的分散劑或濕化劑和混懸劑，包括合成的甘油一酯或甘油二酯、和脂肪酸，包括油酸。
在一個實施方式中，自用式注射器包括作為活性成分的抗輻射肽(或其功能性類似物)，當在對象暴露于輻射后施用時其能夠降低輻射的不良反應。優(yōu)選地，如果在照射后至少30分鐘、更優(yōu)選地至少1小時、最優(yōu)選地至少數(shù)小時或甚至數(shù)天(如3天)施用，所述肽能夠產(chǎn)生針對輻射損傷的至少部分保護作用。此類自用式注射器也稱為＂急救自用式注射器＂，代表了其在突發(fā)緊急情況下的用途。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供含有包裝于注射器樣裝置內(nèi)的無菌溶液的自用式注射器，啟動后該注射器樣裝置能夠自動輸送其全部5mL內(nèi)容物。每mL含有100mg，優(yōu)選地200mg抗輻射肽和賦形劑，例如包括丙二醇、乙醇、苯甲酸鈉和苯甲酸作為緩沖物、和苯甲醇作為防腐劑的賦形劑。在優(yōu)選的實施方式中，用于治療輻射損傷的自用式注射器攜帶小于15個氨基酸的抗輻射肽，更優(yōu)選地小于7個氨基酸。
優(yōu)選的用于治療急性輻射損傷的自用式注射器攜帶長度為3到4個氨基酸的肽，優(yōu)選地，肽具有的抗急性伽瑪照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致測試組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組小鼠在WBI后72小時用所述肽進行處理，和測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致對照組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述對照組小鼠在WBI后72小時僅用所述肽的載體進行處理，且其中通過將肽處理組動物的LD50/30除以對照組動物的LD50/30來計算DRF。
更優(yōu)選的自用式注射器攜帶的肽所具有的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.20，更優(yōu)選地為至少1.25?？怪糜谧杂檬阶⑸淦鲀?nèi)的合適的肽還有那些如本發(fā)明所確定的在植物中具有抗細胞周期活性的肽。非常適合用于本發(fā)明的自用式注射器的肽是VVC、LAG、AQG、LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、NMWD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SPIE、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、LCFL、TLAVE、VEGNL或LNEAL。
本發(fā)明還提供用于治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用有效量的抗輻射肽或其功能性類似物，或如在此所鑒定的藥物組合物以及藥用可接受的稀釋劑。本發(fā)明在此提供在有需要或者有潛在需要的對象中治療或預防輻射損傷的方法，所述方法包括給對象施用藥物組合物，所述組合物包括治療或預防輻射損傷的手段以及藥用可接受的賦形劑，其中所述手段包含在此所鑒定的抗輻射肽或藥物組合物，特別是其中所述輻射損傷包括照射損傷。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于治療患有輻射損傷的對象的方法，其包含給對象施用一種組合物，所述組合物包括寡肽，所述寡肽獲得自或衍生自肽MTRVLQGVLPALPQVVC或肽LPGCPRGVNPVVS。優(yōu)選地，所述寡肽選自由MTR、MTRV、LQG、LQGV、VLPALP、VLPALPQ、QVVC、VVC、AQG、AQGV、LAG、LAGV及其任意組合組成的組。在另一個實施方式中，優(yōu)選地，所述寡肽選自LPGC、CPRGVNP和PGCP。當所述輻射損傷包括照射損傷時，此類寡肽特別有用。本發(fā)明還提供用于治療輻射損傷的藥物組合物，其包括寡肽，所述寡肽獲得自或衍生自肽MTRVLQGVLPALPQVVC或肽LPGCPRGVNPVVS，例如寡肽選自由MTR、MTRV、LQG、LQGV、VLPALP、VLPALPQ、QVVC、VVC、AQG、AQGV、LAG、LAGV、LPGC、CPRGVNP和PGCP、及其任意組合，并提供所述(寡)肽在制備用于治療輻射損傷的藥物組合物中的用途。
先前我們報道了衍生自人絨毛膜促性腺激素的β-鏈的6聚體寡肽(VLPALP)在小鼠中抑制感染性休克。同樣，我們發(fā)現(xiàn)，衍生自hCG的β鏈環(huán)2(殘基41-57)的其他一些短肽(自三聚體肽開始)以及通過以丙氨酸進行單個氨基酸取代而得到的所述肽的一些修飾物具有類似的抗炎活性。進而，我們產(chǎn)生了在這些肽中篩選出一些以繼續(xù)研發(fā)用于治療意外暴露于電離照射后的急性炎癥的治療性化合物的推理。
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是孕婦產(chǎn)生的一種異二聚體胎盤糖蛋白激素。其在孕婦的尿中和商品化hCG制劑中存在多種形式，包括斷裂產(chǎn)物。由于推定其在妊娠過程中對預防胎兒同種異體移植物排異具有作用，因此一些研究者研究了異二聚體hCG及其變體對免疫系統(tǒng)的影響。一些報道提示完整的激素抗調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，但斷裂產(chǎn)物的此類作用還沒有被報道過。先前我們(Khan et al.，Hum.Immunol.2002 Jan；63(1)1-7)報道了衍生自人絨毛膜促性腺激素的β-鏈的6聚體寡肽(VLPALP)在小鼠中抑制感染性休克。給小鼠注射高劑量的脂多糖(LPS)后以這種六肽進行單次治療抑制了小鼠的感染性休克。Benner和Khan(Scand.J.Immunol.2005 Jul；62 Suppl 162-6)研究了體內(nèi)釋放的肽片段所可能具有的免疫學活性，所述肽片段通過hCGβ-亞單位環(huán)2的序列MTRVLQGVLPALPQVVC(殘基41-57)的斷裂而產(chǎn)生。在此報道了取自β-亞單位環(huán)2的一些3到7個氨基酸的肽——以及通過丙氨酸取代而自其衍生的一些肽——展現(xiàn)出顯著的抗炎活性(通過抑制小鼠的感染性休克綜合征而測定)，并超過了被認為可用于治療輻射損傷、特別是包括胃腸道綜合征的輻射損傷的活性，也超過了被認為可用于制備用于治療輻射損傷、特別是包括胃腸道綜合征的輻射損傷的藥物組合物的活性。
本發(fā)明還提供具有抗細胞周期活性的藥物組合物。細胞周期是一組有序的事件，其結果是細胞生長并分裂為兩個姊妹細胞。細胞周期的階段是G1-S-G2-M。G1期代表＂GAP1＂。S期代表＂合成(Synthesis)＂。這是發(fā)生DNA復制的階段。G2期代表＂GAP2＂。M期代表＂有絲分裂(mitosis)＂，是發(fā)生細胞核(染色質(zhì)分離)和細胞質(zhì)(胞質(zhì)分裂(cytokinesis))分裂的時候。術語“抗細胞周期活性”在此指的是所述肽能夠改變細胞周期動力學。例如，其包括改變，即提高或降低，細胞分裂的頻率。在一個實施方式中，其指的是抗增殖活性。
還提供了具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含PGCP；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含VGQL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含RVLQ；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含EMFQ；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含AVAL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含F(xiàn)VLS；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含NMWD；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LCFL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含F(xiàn)SYA；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含F(xiàn)WVD；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含AFTV；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LGTL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含QLLG；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含YAIT；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含APSL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含ITTL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含QALG；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含GVLC；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含NLIN；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含SPIE；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LNTI；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LHNL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含CPVQ；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含EVVR；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含MTEV；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含EALE；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含EPPE；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LGTL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含VGGI；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含RLPG；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LQGA；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LCFL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含TLAVE；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含VEGNL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LNEAL；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含MGGTWA；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含LTCDDP；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含VCNYRDV；具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含CPRGVNP；和具有抗細胞周期活性的藥物組合物，其包含DINGFLPAL。



圖1以AQGV(肽EA-230)處理的全身照射的小鼠 ＂WBI＂代表全身照射。使用麻醉的C57B1/6小鼠，在WBI(6.5至9.8Gy，Philips MG 30，81cGy/min)之后評估對輻射損傷的體內(nèi)保護作用，通過Kaplan-Meirer分析測量存活的差異。所有組的小鼠在WBI后3小時均首先注射肽或載體(對照組動物)。注射安慰劑的組死亡率為80％，與對該模型的預測一致。已知8.6戈瑞(＝8.6Gy)的輻射劑量能夠在該物種造成大約80％的死亡率，因此稱為LD80(80％致死劑量)。死亡在第10天左右開始出現(xiàn)——這在動物或人的WBI是通常的情況在第10天左右，腸道被覆層因輻射而損傷和泄漏導致細菌進入循環(huán)并引起胃腸道綜合征，而骨髓的損傷導致無法產(chǎn)生足夠的白細胞以抵抗感染(“骨髓綜合征”)，繼而出現(xiàn)死亡。符號＂x＂代表的組接受首次靜脈注射，首次注射3小時后第二次皮下注射(SC)。這些動物100％存活。圖中沒有顯示它們其實根本沒有出現(xiàn)任何疾病征象。對于不知情的觀察者來說，它們看上去與完全正常的小鼠一樣。三角符號代表的組通過SC途徑首次注射肽，然后每48小時進行額外的SC注射，共3劑(除首劑之外)——即在第3、5、和7天。這些動物中僅有一只死亡。方塊符號代表的組除了48小時SC注射持續(xù)進行共6劑(除首劑之外)之外，其他與三角符號組的程序相同。因此其給藥持續(xù)至第13天。這種延長的治療帶來了完全的保護作用(該組無一死亡)。該組動物中沒有出現(xiàn)任何疾病征象。從這些數(shù)據(jù)中我們可以得出結論，如果動物在第一天接受兩倍劑量的肽(首劑為靜脈注射)，可對致死劑量的WBI產(chǎn)生完全的保護作用。如果動物接受較低水平的治療(僅SC)，則將治療延長至第二周也產(chǎn)生完全的保護作用。
圖2以肽AQGV進行的第二組放射防護實驗 采用劑量漸增的全身照射(WBI)，對于各組均為單次暴露，而隨后的組暴露劑量逐漸升高。皮下施用單劑肽EA-230(AQGV)，但治療延遲至WBI后3天(72hr)進行。該測試稱為劑量降低系數(shù)(“DRF”)，其被定義為處理組的LD50與對照組的LD50之間的比值。LD50代表的是導致50％的測試動物死亡的劑量?？山邮艿腄RF值為1.20。為通過該測試，在WBI后第30天，一種候選藥物必須使得LD50輻射劑量比對照動物的LD50劑量高至少20％(系數(shù)為1.20的升高)。例如，如果對照動物的LD50是8.2Gy，那么候選藥物造成的LD50應該高至少20％，即在這種情況下該劑量應該為8.2 x 1.20＝10.4 Gy。
圖3寡肽在擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞周期分析中作用?；衔颪AK4(LQGV)和NAK9(VVC)對標測試的記物顯示出明確的影響。對于細胞周期標記物(pCDG)，在兩個時間點均觀察到對根有明確影響。在過渡區(qū)和子葉觀察到了時間和/或劑量依賴性的影響。對于植物生長激素應答標記物(DR5::GUS)，觀察到了與細胞周期標記物相同的情況。NAK 26(DINGFLPAL)顯示出不太一致的時間依賴性影響。僅在根及時觀察到了影響。在過渡區(qū)和子葉沒有觀察到影響。
圖4測試代表性寡肽在通過CD3誘導的鼠單核細胞快速生長過程中當細胞發(fā)生迅速分裂時對細胞增殖的作用。小鼠(n＝5)腹腔注射PBS、Nak4(LQGV)、Nak47(LAGV)、Nak46(AQGV)(Ansynth BV，The Netherlands提供)、或Nak46*(Diosynth BV，The Netherlands提供的AQGV)。以0.5mg/kg或5mg/kg的肽處理小鼠1小時，隨后分離脾臟制備脾細胞懸液。匯集各組的脾細胞懸液并在存在PBS或抗CD3抗體的條件下體外培養(yǎng)(三份)，在培養(yǎng)后0、12、24和48小時測定增殖。
發(fā)明詳述 在本申請中，“純化的、合成的或分離的”肽是已經(jīng)自其天然來源或生物技術來源純化出的肽，或者更優(yōu)選地，是如本發(fā)明所述合成的肽。
在本申請中，“組合物”指的是含有寡肽或者由寡肽組成的多種化合物。優(yōu)選地，寡肽被分離之后再加入到組合物中。優(yōu)選地，寡肽由2至6個氨基酸組成，更優(yōu)選地，由3至4個氨基酸組成。
例如，在一個實施方式中，優(yōu)選的化合物可以是NT A Q G V CT，其中N末端的NT選自H--、CH3--、?；⒒蛞话愕谋Ｗo基團；而C末端的CT選自小肽(如1至5個氨基酸)、--OH、--OR1、--NH2、--NHR1、--NR1R2、或--N(CH2)1-6NR1R2，其中R1和R2，如果存在的話，獨立地選自H、烷基、芳基、(芳)烷基，且其中R1和R2可彼此連接成環(huán)。
在本申請中，“烷基”優(yōu)選地是飽和的支鏈或直鏈的烴，具有1到6個碳原子，例如甲基、乙基和異戊基。
在本申請中，“芳基”是芳烴基，優(yōu)選地具有6到10個碳原子，例如苯基或萘基。
在本申請中，“(芳)烷基”是芳烴基(同時具有脂肪族部分和芳香族部分)，優(yōu)選地具有7到13個碳原子，例如芐基、乙基芐基、正丙基芐基、和異丁基芐基。
在本申請中，“寡肽”是由肽鍵連接在一起的具有2到12個氨基酸的肽。寡肽的等價物是具有與寡肽中的特定氨基酸相同或等同側鏈的化合物，且其排列順序與所述肽的順序相同，但通過非肽鍵連接在一起，例如通過等排連接(isosteric linkages)如酮等排物、羥基等排物、二酮等排物、或酮-二氟甲基等排物。
“組合物”還包括例如寡肽的可接受的鹽或標記的寡肽。在本申請中，“可接受的鹽”指的是保留寡肽或等價化合物的所需活性的鹽，優(yōu)選地不會對寡肽或使用所述寡肽的系統(tǒng)中的其他組分產(chǎn)生不良影響。此類鹽的實例為由無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸硝酸等等形成的酸加成鹽。鹽也可以是與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、雙羥萘酸、海藻酸、聚谷氨酸等等形成的。鹽可以是與多價金屬陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳等等、或是與由N，N′-二芐乙烯二胺(N，N′-dibenzylethylenediamine)或乙二胺形成的有機陽離子、或它們的組合(如鞣酸鋅)形成的。
這樣的藥物組合物可通過胃腸外或口服施用于對象。這樣的藥物組合物可基本上由寡肽和PBS組成。優(yōu)選地，寡肽是合成的。合適的治療例如需要將藥物組合物中的寡肽靜脈施用于患者，施用的量為大約0.1至大約35mg/kg體重。藥物組合物可以基本上由一至三種不同的寡肽組成。
這樣產(chǎn)生的化學實體可全身性地、表面地或局部地施用和引入體內(nèi)。肽或其修飾物可以其實體本身施用或者作為藥用可接受的酸或堿加成鹽而施用，所述的酸或堿加成鹽通過與無機酸(如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)反應而形成；或通過與有機酸(如甲酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸)反應而形成；或通過與無機堿(如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀)反應而形成；或通過與有機堿(如單胺、二胺、三胺、和芳胺以及取代的乙醇胺)反應而形成。選定的肽和任何衍生的實體還可偶聯(lián)于糖、脂質(zhì)、其他多肽、核酸和PNA；并作為偶聯(lián)物在原位起作用或在達到靶組織或器官之后局部釋放起作用。
就各種氨基酸而言，“取代”通常涉及以例如烷氧基、鹵素、羥基、氮或低級烷基的基團取代芳環(huán)上存在的氫。取代還可在連接芳香族部分與肽主鏈的烷基鏈上進行，例如以低級烷基取代氫。其他的取代還可在氨基酸的α位進行，也使用烷基。
優(yōu)選的取代使用氟或氯作為鹵素以及使用甲氧基作為烷氧基。至于烷基和低級烷基，通常，具有較少(1至3個)碳原子的烷基是優(yōu)選的。
可采用制備這些化合物的常規(guī)方法制備符合通式的化合物。為此，將合適的N端α被保護(以及，如果存在反應性側鏈時，側鏈被保護的)氨基酸類似物或肽活化并在溶液中或固相支持物上偶聯(lián)于合適的羧基被保護的氨基酸或肽衍生物。α-氨基官能團的保護通常以烏拉坦官能團進行，如使用耐酸的叔丁氧羰基(tertiary-butyloxycarbonyl group，“Boc”)、芐氧羰基(benzyloxycarbonyl，“Z”)和取代的類似物、或耐堿的9-芴甲氧羰基(9-fluoremyl-methyloxycarbonyl，“Fmoc”)。Z基團還可通過催化氫化作用而去除。合適的其他保護基包括Nps，Bmv，Bpoc，Aloc，MSC等等。氨基保護基團的綜述見The peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.3，E.Gross and J.Meienhofer，eds.(Academic Press，New York，1981)。羧基保護可通過酯化進行，例如耐堿酯如甲酯或乙酯、耐酸酯如叔丁酯或取代的、苯甲酯或通過氫解反應進行。可使用前述基團進行側鏈官能團如賴氨酸和谷氨酸或天冬氨酸的側鏈的保護。巰基(雖然并不總是需要的)、胍基、醇和咪唑基團的保護可采用多種試劑實現(xiàn)，例如參見The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，id.或見Pure and Applied Chemistry，59(3)，331-344(1987)。對合適的被保護的氨基酸或肽的羧基進行活化可使用疊氮化物、混合酸酐、活性酯、或碳二亞胺方法，特別是采用添加催化性的抑制外消旋化作用的化合物如1-N-N-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀酰亞胺、3-羥基-4-氧代-3，4-二氫-1，2，3，-苯并三嗪、N-羥基-5降冰片烯-2，3-二羧酸亞胺。也可使用含磷的酸的酸酐。見，例如，The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，supra andPure and Applied Chemistry，59(3)，331-344(1987)。
還可通過Merrifield的固相方法制備所述化合物。不同的固相支持物和不同的策略是已知的，例如見Barany and Merrifield，The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.2，E.Gross and J.Meienhofer，eds.(Acad.Press，NewYork，1980)；Kneib-Cordonier and Mullen，Int.J.Peptide Protein Res.，30，705-739(1987)；和Fields and Noble，Int.J.Peptide Protein Res.，35，161-214(1990)。那些其中肽鍵被等排物取代的化合物通?？刹捎们笆龅谋Ｗo基團和活化方法進行合成。合成修飾的等排物的方法可參考文獻，例如有關--CH2--NH--等排物和--CO--CH2--等排物的文獻。
根據(jù)保護基團的性質(zhì)和固相肽合成方法中使用的連接于固相支持物的接頭的類型，可采用不同方法去除保護基團以及自固相支持物上裂解。通常在酸性條件下和存在清除劑的情況下進行去保護。例如見volumes 3，5and 9 of the series on The Peptides Analysis，Synthesis，Biology，supra。
另一種可能的方法是使用酶合成此類化合物。例如參見綜述H.D.Jakubke in The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.9，S.Udenfriend andJ.Meienhofer，eds.(Acad.Press，New York，1987)。
盡管從環(huán)境出發(fā)可能不太合適，但也可以采用重組DNA方法制備本發(fā)明的寡肽。此類方法涉及通過在合適的宿主微生物中表達重組多核苷酸的方法制備所需寡肽，所述多核苷酸的序列編碼感興趣的一或多個寡肽。此方法通常涉及將編碼一或多種具體寡肽的DNA序列導入克隆載體(如質(zhì)粒、噬菌體DNA、或能夠在宿主細胞中復制的其他DNA序列)，將克隆載體導入合適的真核或原核宿主細胞，并培養(yǎng)如此轉化的宿主細胞。如果使用真核宿主細胞，化合物會含有糖蛋白部分。
在本申請中，肽的“功能性類似物”包括氨基酸序列或其他序列單體，其序列已經(jīng)被改變，使得序列的功能特性在性質(zhì)上基本相同，但在量上不必完全相同。
肽或其功能性類似物的功能可采用體內(nèi)和/或體外測試來確定。體外測試是優(yōu)選的。在一個實施方式中，對功能性肽類似物進行比較測試，其中采用參比或者對照肽，例如僅由L氨基酸組成的肽類似物。合適的測試包括確定候選肽影響細胞周期動力學的能力。例如，可采用植物模型系統(tǒng)確定對細胞周期進程的影響，例如在此所例舉的擬南芥系統(tǒng)，或采用培養(yǎng)的(哺乳動物)細胞。在另一方面其涉及確定候選肽抑制凋亡的能力，例如通過誘導(暫時性)G2-M細胞周期停滯。
可以多種方式產(chǎn)生類似物，例如通過“保守性氨基酸取代”。此外，可設計肽模擬物化合物，它們能夠在功能上或結構上類似于作為起始點的原始肽，但例如由非天然氨基酸或聚酰胺組成。通過“保守性氨基酸取代”，一種氨基酸殘基被另一種性質(zhì)大體類似(大小、疏水性)的殘基取代，由此總體功能基本不會受到嚴重影響。不過，一般更加期望能夠改善具體的功能。也可通過全面提高氨基酸序列的至少一種所需特性而產(chǎn)生類似物。這可以例如通過Ala掃描(Ala-scan)和/或置換網(wǎng)制圖(replacement net mapping)方法而實現(xiàn)。采用這些方法，可以基于原始的氨基酸序列產(chǎn)生很多不同的肽，但每一種均含有至少一個氨基酸殘基的取代。氨基酸殘基可被丙氨酸取代(Ala-掃描)或通過任何其他氨基酸殘基取代(置換網(wǎng)制圖)。這樣便合成了原始氨基酸序列的許多位置性變體(positional variant)。篩選每個位置性變體的比活性。產(chǎn)生的數(shù)據(jù)用于設計特定氨基酸序列的改良的肽衍生物。
也可通過例如將L-氨基酸殘基替換為D-氨基酸殘基而產(chǎn)生類似物。這種取代導致產(chǎn)生非天然存在的肽，可改善氨基酸序列的特性?？衫缣峁┠嫦蚍崔D(retro inversion)形式的全部由D氨基酸組成的已知活性的肽序列，由此能夠保持其活性并增加半衰期。通過產(chǎn)生原始氨基酸序列的許多位置性變體并篩選其比活性，可設計具有進一步改進的特性的包括此類D氨基酸的改良的肽衍生物。現(xiàn)有技術已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在一端或兩端用D氨基酸保護的肽比僅由L氨基酸組成的肽更加穩(wěn)定。其他類型的修飾包括本領域已知的研發(fā)肽類藥物使之具有可用于藥物組合物的有益效應的修飾。這些效應可包括功效提高、藥代動力學改變、穩(wěn)定性提高并導致半衰期延長、以及對冷鏈處理嚴格性要求的降低。
在本發(fā)明的一個實施方式中，抗輻射肽包括由其氨基和羧基之間的肽鍵連接在一起的氨基酸序列，其中至少一個氨基酸是D氨基酸。例如，抗輻射肽選自如下一組VVC、LAG、AQG、LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、NMWD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SPIE、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、LCFL、TLAVE、VEGNL、LNEAL、VLPALP、MGGTWA、LTCDDP、VLPAPLQ、VCNYRDV、CPRGVNP、QPLAPLVG和DINGFLPAL，其中至少一個由標準的單字母代碼表示的氨基酸殘基是D氨基酸。
本領域人員能夠產(chǎn)生氨基酸序列的類似物化合物。這可通過例如篩選肽文庫而進行。這種類似物基本上具有與原序列相同的功能特性，但在量上不必完全相同。此外，肽或類似物可以被環(huán)化，例如通過給它們提供(末端)半胱氨酸；被二聚化或多聚化，例如通過連接于賴氨酸或半胱氨酸或其他具有允許發(fā)生連接或多聚化的側鏈的化合物；形成串聯(lián)或重復構型；偶聯(lián)或以其他方式連接于本領域已知的載體，只要通過允許解離的可靠連接即可。如上所述的這些寡肽的合成物以及功能性類似物或斷裂產(chǎn)物，可用于治療輻射損傷和后續(xù)疾病的方法中。
在本申請中，肽的“功能性類似物”優(yōu)選地小于衍生出它的肽，因此最好是通過缺失和/或取代來制備，而非增加其長度。此外，在本申請中，肽的“功能性類似物”不涉及那些含有在此被鑒定為抗輻射肽的氨基酸序列同時其一側或兩側存在更多氨基酸的更大的蛋白質(zhì)或肽。
術語“藥物組合物”在此旨在同時涵蓋本發(fā)明的活性組合物本身和含有本發(fā)明的組合物以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。藥物組合物可含有至少兩種在此所述的抗輻射肽或類似物的混合物。在此詳述的寡肽的可接受的稀釋劑例如為生理學鹽溶液或磷酸緩沖鹽溶液。在一個實施方式中，寡肽或組合物以有效濃度全身性施用于動物或人，例如通過靜脈、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)施用。另一種施用途徑包括器官或組織灌注，可以在體內(nèi)或體外，使用包括本發(fā)明的寡肽或組合物的灌注液進行?？梢詥我粍┝渴┯?，不連續(xù)的多劑量施用，或持續(xù)一段足以允許充分調(diào)節(jié)基因表達的時間。對于持續(xù)施用，持續(xù)施用的時間隨多種因素而變，這是本領域人員容易理解的。
活性分子的施用劑量可以有相當大的范圍?？墒┯玫幕钚苑肿拥臐舛韧ǔＪ艿捷^低濃度時的功效以及較高濃度時化合物的溶解度限制。對具體患者的最佳劑量應該而且能夠由有關的醫(yī)生或醫(yī)學專家確定，其中藥考慮到熟知的相關因素例如患者的病情、體重和年齡等等。
活性分子可在合適的載體中直接施用，例如磷酸緩沖液(“PBS”)或酒精或DMSO中的溶液。不過，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，采用藥物輸送系統(tǒng)通過單劑輸送施用活性分子。合適的藥物輸送系統(tǒng)應該是藥理學無活性的或至少是可耐受的。其優(yōu)選地既不具有免疫原性也不引起炎癥反應，并且應該使得活性分子的釋放能夠在所需時間內(nèi)維持其有效水平。適合于控釋目的的可選方案是本領域已知的并屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。合適的輸送載體包括但不限于微膠囊或微球；脂質(zhì)體和其他基于脂質(zhì)的釋放體系；粘滴(viscous instillates)；可吸收和/或可生物降解的機械屏障和植入物；以及聚合物輸送材料，如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物、聚酯、交聯(lián)聚乙烯醇、聚酐、聚甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酰胺水凝膠、陰離子碳水化合物聚合物等等?？捎玫妮斔拖到y(tǒng)是本領域熟知的。
實現(xiàn)活性分子釋放的一種制劑包括注射用微膠囊或微球，其由可生物降解聚合物制得，如聚(dl-丙交酯)、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)、聚已酸內(nèi)酯、聚乙交酯、聚乳酸-共-乙交酯、聚(羥丁酸)、聚酯或縮醛樹脂。包括直徑為大約50微米至大約500微米的微膠囊或微球的注射用系統(tǒng)較其他輸送系統(tǒng)具有優(yōu)勢。例如，它們通常使用較少的活性分子并可由輔助醫(yī)療人員施用。此外，通過選擇微膠囊或微球的大小、裝藥量和施用劑量，此類系統(tǒng)在不同藥物釋放的時間和速度的設計上具有內(nèi)在的靈活性。此外，可通過伽瑪照射使其無菌化。
微膠囊和微球的設計、制備和使用是本領域人員熟知的，有關這方面的具體技術細節(jié)可參見文獻。也可用可生物降解聚合物(如丙交酯、乙交酯和己內(nèi)酯聚合物)制備微膠囊和微球以外的制劑；如含有活性分子的預制膜和噴涂膜可用于本發(fā)明。包含活性分子的濾膜或纖維也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另一種高度適合用于單劑輸送本發(fā)明的活性分子的制劑是脂質(zhì)體。將活性分子包囊化于脂質(zhì)體或多層囊泡是靶向藥物輸送和延長藥物存留的熟知技術。裝有藥物的脂質(zhì)體的制備和使用是本領域人員已知的并在文獻中有詳細描述。
單劑輸送本發(fā)明的活性分子的另一種合適的方式涉及粘滴。在該技術中，高分子量載體與活性分子混合使用，得到的結構可產(chǎn)生具有高粘度的溶液。合適的高分子量載體包括但不限于葡聚糖和環(huán)糊精；水凝膠；(交聯(lián))粘性材料，包括(交聯(lián))粘彈性材料；羧甲纖維素；透明質(zhì)酸；和硫酸軟骨素。裝有藥物的粘滴的制備和使用是本領域人員已知的。
根據(jù)另一種方式，活性分子可與可吸收機械屏障如氧化再生纖維素組合施用?；钚苑肿涌晒矁r或非共價(如通過離子鍵)結合于這種屏障，或僅僅是分散于其上即可。
通過以下示例性實施例進一步解釋本發(fā)明。
實施例 肽的選擇 基于hCGβ-亞單位環(huán)2的序列MTRVLQGVLPALPQVVC(殘基41-57)上已知的優(yōu)先裂解位點進行選擇(Cole et al.，J.Clin.Endocr.Metab.1993；76704-710；H.Alfthan，U.H.Stenman，Mol.Cell.Endocrinol.1996；125107-120；A.Kardana，et al.，Endocrinology 1991；1291541-1550；Cole etal.，Endocrinology 1991；1291559-1567；S.Birken，Y.Maydelman，M.A.Gawinowicz，Methods 2000；213-14)，并在來自C反應蛋白(CRP)(β-連環(huán)蛋白，如人CTNB)、布魯頓型酪氨酸激酶(如人BTK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和p-53的氨基酸序列上進行選擇。
肽的合成 通過專有方法(Diosynth BV)或使用基于9-芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基的方法以2-氯三苯甲基氯樹脂(2-chlorotrityl chloride resin)作為固相支持物通過固相合成法(Ansynth BV)商品化制備在此所述的肽。以三苯甲基官能團保護谷胺酰胺的側鏈。手工合成了這些肽。每個偶聯(lián)包括以下步驟(i)以二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶去除α-氨基的Fmoc保護，(ii)將Fmoc氨基酸(3eq)與二異丙基碳二亞胺(DIC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)在DMF/N-甲基甲酰胺(NMP)中偶聯(lián)，和(iii)以乙酸酐/二異丙基乙胺(DIEA)在DMF/NMP中對剩余的氨基官能團進行加帽。合成完畢，以三氟乙酸(TFA)/H2O/三異丙基硅烷(TIS)95:2.5:2.5的混合物處理肽樹脂。30分鐘后，加入TIS直至脫色。溶液在真空中脫水，以乙醚沉淀肽。粗制的肽溶解于水(50-100mg/ml)并通過反相高效液相層析(RP-HPLC)純化。HPLC條件柱Vydac TP21810C18(10 x 250mm)；洗脫體系梯度系統(tǒng)為0.1％TFA溶于水v/v(A)和0.1％TFA溶于乙腈(ACN)v/v(B)；流速6ml/分鐘；在190-370nm測定到吸收。使用了不同的梯度體系。例如對于肽LQG和LQGV10分鐘100％A，繼之以線性梯度0-10％B，50分鐘。例如對于肽VLPALP和VLPALPQ5分鐘5％B，繼之以線性梯度1％B/分鐘。通過在40℃低壓條件旋轉膜蒸發(fā)將收集的組分濃縮至大約5ml。通過在醋酸鹽形式的陰離子交換樹脂(Merck II)柱上洗脫兩次，使得殘余的TFA與醋酸鹽發(fā)生交換。濃縮洗脫物并凍干28小時。隨后將肽溶解于PBS，備用。
實施例1和實施例2 在第一個實驗中，給12-周齡雌性BALB/c小鼠腹腔內(nèi)單次注射PBS(n＝9)或肽(LGQV、VLPALP、LPGCPRGVNPVVS、MTRVLQGVLPALPQVVC；n＝8，10mg/kg)。處理后1個半小時小鼠全身暴露于單劑10 Gy137Cs-γ-照射。在第二個實驗中，12-周齡雌性BALB/c小鼠先全身暴露于單劑10 Gy137Cs-γ-照射，然后在照射后1.5小時腹腔內(nèi)單次注射PBS(n＝9)或肽(n＝8或9，10mg/kg)。實驗過程中在不同時間點觀察死亡率和臨床征象(如，眼睛流淚代表結膜炎，以及體重減輕)。從表2可見，所有的測試肽在處理組小鼠中均具有良好的減輕結膜炎的作用，而對死亡率沒有影響，這促使我們?nèi)ミx擇一種最適合對抗急性炎癥的肽，以便在后期進行的重復劑量的較低照射中對其進行測試。


實施例3 在雙盲動物實驗中測試了6種寡肽(即ALAGV，BAQGV，CLAG，DAQG，EMTR，和FMTRV)并與PBS(對照)比較，測試各個肽在小鼠腎臟缺血再灌注試驗中促進恢復的相對能力。實驗中，將小鼠麻醉，切除一側腎臟。另一側腎臟結扎25分鐘，血清尿素水平升高。結扎前后給30只不同小鼠靜脈施用每種不同的肽(5mg寡肽/kg體重)，隨后在2小時、24小時和72小時確定各種肽處理的小鼠的死亡率以及BUN濃度。結果見表3(不包括實施例3獲得的肽A(LAGV(SEQ ID NO4))的結果)。
在吸入麻醉條件下，分離出左側腎臟連同其動脈和靜脈并以微血管鉗阻斷25分鐘。手術中動物放置在加熱墊上以保持體溫在37℃。放置血管鉗之前5分鐘和松開血管鉗之前5分鐘，給動物靜脈施用5mg/kg的肽，溶解于0.1mL的無菌鹽水中。左側腎臟再灌注之后切除右腎。通過測定夾閉之前和再灌注后2、24、和72小時的血尿素氮評價腎功能。
結果-表3(再灌注后72小時的死亡率) *2 x 2卡方檢驗。df＝1 肽A(SEQ ID NO4)是在腎臟缺血再灌注試驗中施用的第一種肽。進行實驗的人員在使用肽A時在熟悉學習曲線。在下腔靜脈施用該肽過程中，一些動物在注射部位出現(xiàn)中度失血，但其他動物沒有。無意中將這些動物送回籠子但在術后第一夜沒有在籠中放飲用水。此外，這些動物本應該在72小時處死，但卻錯誤地在再灌注后48小時被處死。對于肽B-F，實驗過程中沒有出現(xiàn)這些或者其他問題。
可以看出，施用了寡肽MTRV且特別是AQGV的動物在存活(相對于PBS對照組死亡率明顯降低)以及BUN濃度下降方面較對照組(PBS)或施用其他寡肽的組要好得多，有更多的小鼠存活且血清尿素水平較其他組低得多。不過，寡肽LAG、AQG、和MTR在本實驗中沒有降低BUN濃度，但與PBS對照組相比分別明顯降低了死亡率，其中MTR甚至在72小時時使測試小鼠的BUN水平升高。
實施例4 出于前面提到的原因，重新測試了一種寡肽(A)降低小鼠BUN水平的能力。結果見表4?？梢钥闯?，接受寡肽LAGV的小鼠相對于對照組(PBS)在存活(相對于PBS對照組死亡率明顯降低)和降低BUN濃度方面均好得多。
實施例5 在如上所述的小鼠實驗中測試了另外4種寡肽(G(VLPALPQ)，H(VLPALP)，I(LQGV)和J(LQG))降低BUN水平的能力。結果見表4。可以看出，接受了寡肽LQG的小鼠在實驗早期顯示出BUN濃度降低(再灌注后24小時)，而接受了VLPALPQ的小鼠在實驗后期(再灌注后72小時)的降低BUN濃度方面較對照組(PBS)或其他寡肽處理組要好得多，有更多小鼠存活且血清尿素水平較其他組低得多。
表4腎臟缺血25分鐘的小鼠以肽A-J處理后的BUN

再灌注后2小時統(tǒng)計學分析得到的P值A p＝0.0491 NMPF-47 LAGV -B p＝0.0008 NMPF-46 AQGV -C p＝0.9248 NMPF-44 LAG -D p＝0.4043 NMPF-43 AQG -E p＝0.1848 NMPF-12 MTR -F p＝0.0106 NMPF-11 MTRV -G p＝0.1389 NMPF-7 VLPALPQ -H p＝0.5613 NMPF-6 VLPALP -I p＝0.9301 NMPF-4 LQGV -J p＝0.0030 NMPF-3 LQG 再灌注后24小時統(tǒng)計學分析得到的P值A p＝0.0017 NMPF-47 LAGV -B p<0.0001 NMPF-46 AQGV -C p＝0.8186 NMPF-44 LAG -D p＝0.2297 NMPF-43 AQG -E p＝0.0242 NMPF-12 MTR -F p＝0.0021 NMPF-11 MTRVG p＝0.0049 NMPF-7 VLPALPQH p＝0.3297 NMPF-6 VLPALP -I p＝0.8328 NMPF-4 LQGV -J p＝0.9445 NMPF-3 LQG 通過Mann Whitney U-檢驗(SPSS for Windows)計算出P值。
實施例6 為了確定劑量應答關系，在如上所述的小鼠腎衰實驗中測試了兩種肽(D(AQG，在實施例3測試的小鼠中對死亡率表現(xiàn)出很好的結果)和B(AQGV，在實施例3測試的小鼠中對BUN具有優(yōu)越的結果)的劑量應答方式。如實施例3所述以0.3、1、3、10和30mg/kg的劑量測試所述肽。相對于PBS的血清尿素水平，肽D組在夾閉后72小時的P值(通過MannWhitney U-test(SPSS for Windows)計算)為0.3mg/kg 0.001，1mg/kg0.009，3mg/kg 0.02，10mg/kg 0.000，和30mg/kg 0.23，對于肽B組，這些P值為0.88，0.054，0.000，0.001和0.003?？梢钥闯?，相對于肽B(AQGV)，肽D(AQG)在所測試的較低劑量在降低BUN水平方面出乎意料地好，而且在所測試的較低劑量對死亡率的有益作用也是顯著的。


設置感染性休克實驗以確定哪種肽最適合抵御急性炎癥。
用于敗血癥或感染性休克實驗的小鼠8-12周齡的雌性BALB/c小鼠用于所有實驗。按照Report of European Laboratory Animal ScienceAssociations(FELASA)Working group on Animal Health(Laboratory Animals281-24，1994)的方案，將動物飼養(yǎng)在無特定病原體條件下的設施中。
注射方案對于內(nèi)毒素模型，給BALB/c小鼠腹腔注射150-300μg LPS(E.coli 026:B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。對照組僅腹腔注射PBS。為了測試肽的作用，將肽溶解于PBS并在PBS處理后的預定時間點腹腔注射。
采用如下測量方案對小鼠疾病嚴重程度評分 0 無異常 1 毛皮滲出液，但與正常小鼠相比沒有可檢測到的行為差異 2 毛皮滲出液，卷縮反射，應答于刺激(如拍打籠子)，在觸碰過程中同健康小鼠一樣表現(xiàn)活躍 3 對拍打籠子反應遲緩，觸碰時被動或溫順，但獨自處于新環(huán)境中仍然好奇 4 缺乏好奇感，對刺激極少或沒有應答，很少活動 5 呼吸費力，不動或在被翻倒后緩慢擺正(垂死，處死) D 死亡 設置第一組感染性休克實驗以確定哪種肽LQG、LQGV、VLPALP、VLPALPQ、MTR、MTRV、VVC或QVVC能夠在小鼠中抑制脂多糖(LPS)誘導的感染性休克，在LPS處理后2小時以單劑肽處理小鼠。使用5mg/kg體重的肽給BALB/c小鼠腹腔注射，LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)的劑量是漸增的，預計LPS在24至72小時導致80-100％死亡。對照組僅腹腔注射PBS，無死亡。
設置第二組感染性休克實驗以確定哪種肽LQG、LQGV、VLPALP、VLPALPQ、MTR、MTRV、VVC或AQG、AQGV、LAG和LAGV能夠在小鼠中抑制高劑量LPS誘導的感染性休克，在LPS處理后2和24小時以雙倍劑量的肽處理小鼠。在各處理組中，使用5mg/kg體重的肽。給BALB/c小鼠腹腔注射高劑量LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)，預計LPS在24至72小時導致80-100％死亡。對照組僅腹腔注射PBS，無死亡。
設置另一組感染性休克實驗以確定所研究的哪種肽LQG、LQGV、VLPALP、VLPALPQ、MTR、MTRV、VVC或AQGV最適合在休克發(fā)生早期和/或后期或整個過程中使用。為了確定以肽進行后期或早期處理的內(nèi)毒素休克存活率的百分數(shù)，給BALB/c小鼠腹腔注射300μg LPS(E.coli026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)，預計無肽處理情況下在48小時導致100％死亡。對照組僅腹腔注射PBS，無死亡。
設置比較實驗以比較肽MTR和AQGV，均是商品化來源的。比較實驗有6組，每組6只動物，其中兩組(1A和1B)接受安慰劑(PBS)，一組(2)接受肽MTR(來源Pepscan)，一組(3)接受肽MTR(來源Ansynth)，一組(4)接受肽AQGV(來源Pepscan)，以及另一組接受AQGV(來源Ansynth)。肽/安慰劑在LPS之后2小時施用。LPS(來源)劑量為10-11mg/kg。在注射LPS后0、2、22、26、42和48小時進行疾病評分。
結果 肽的選擇 我們選擇合成肽MTR、MTRV、LQG、LQGV、VLPALP和VLPALPQ，以及QVVC和VVC。在研究的后期，我們還選擇合成衍生自LQG和LQGV的丙氨酸取代的肽變體，其中將一個氨基酸取代為丙氨酸，對其中的4種(AQG、AQGV、LAG、和LAGV)，結果如下。
感染性休克實驗 為了測試肽在休克發(fā)生早期的作用，在以不同劑量的LPS處理后2小時或24小時給小鼠腹腔注射測試肽，劑量為5mg/kg體重。對無肽處理的小鼠，LPS的劑量在48-72小時導致100％死亡。結果見表8。在測試的7種肽中，肽VLPALP和LQGV顯示出顯著的抗LPS誘導的敗血癥的保護作用。





為了評價肽處理在休克發(fā)生早期或后期的作用，在注射LPS處理后2小時或24小時給小鼠腹腔注射測試肽，劑量為5mg/kg體重。觀察小鼠84小時而不是先前實驗中的48小時。結果見表10。在測試的所有肽中，僅有AQGV在發(fā)生休克的早期或后期給藥時能夠在LPS處理后84小時保持100％存活且沒有遺留臨床征象。

比較測試MTR和AQGV，兩種肽均有兩種來源，均以5mg/kg劑量施用。
表11 LPS＝10-11mg/kg #970＝5mg/kg LPS化合物 #971＝5mg/kg 處理 處理 #Ansynth 12 #Ansynth 46 疾病評分
表11 LPS＝10-11mg/kg #970＝5mg/kg LPS化合物 #971＝5mg/kg 處理 處理 #Ansynth 12 #Ansynth 46 疾病評分
一些報道提示完整的hCG可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，但其斷裂產(chǎn)物的此類在科技文獻中未見報道。Benner and Khan(Scand.J.Immunol.2005 Jul；62 Suppl162-6)研究了hCGβ-亞單位環(huán)2的序列MTRVLQGVLPALPQVVC(殘基41-57)裂解產(chǎn)生的體內(nèi)釋放肽片段可能具有的免疫活性，盡管事實是小到3至7個氨基酸的肽通常被認為沒有明顯的生物學活性。
我們設計了在小鼠中能夠完全阻斷LPS誘導的感染性休克的肽，在一些情況下甚至在注射LPS后24小時開始以這些肽進行處理仍然有效。這些肽還能夠抑制MIF的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)為使用這些肽來治療患有輻射損傷的患者的治療用途提供了可能性。
實施例7 本實施例顯示了肽AQGV對8.6Gy全身照射(WBI)的小鼠的實驗結果，其中所有組的小鼠均在TBI后3小時接受第一次注射。接受安慰劑注射組的動物80％死亡，正如對該模型所預計的那樣。已知所施用的輻射(8.6戈瑞＝8.6Gy)的輻射劑量能夠在該物種造成大約80％的死亡率，因此稱為LD80(80％致死劑量)。死亡在第10天左右開始出現(xiàn)——這在動物或人的WBI是通常的情況在第10天左右，腸道被覆層因輻射而損傷和泄漏導致細菌進入循環(huán)并因胃腸道綜合征而引起敗血癥，而骨髓的損傷導致無法產(chǎn)生足夠的白細胞以抵抗感染(“骨髓綜合征”)，繼而出現(xiàn)死亡。
以符號＂x＂代表(圖1)的第一組肽處理小鼠組接受首次的靜脈注射AQGV，該首次注射3小時后接受第二次的皮下注射(SC)。出乎意料的是，這些動物100％存活。此外，這些動物沒有出現(xiàn)任何疾病征象。對于不知情的觀察者來說，它們看上去與完全正常的小鼠一樣，特別是肽處理的這些小鼠沒有出現(xiàn)GI綜合征。
第二組小鼠通過SC途徑接受首次的肽注射，然后每48小時進行額外的SC注射，共3劑(除首劑之外)——即在第3、5、和7天。這些動物中僅有一只死亡，其他沒有出現(xiàn)任何GI綜合征的癥狀。
除了48小時的SC注射持續(xù)進行共6劑(除首劑之外)之外，第三組的小鼠與第二組的程序相同。因此其給藥持續(xù)至第13天。這種延長的治療帶來了完全的保護作用(該組無一死亡)。該組動物中沒有出現(xiàn)任何疾病征象，同樣沒有出現(xiàn)任何GI綜合征的癥狀。
從這些數(shù)據(jù)中我們可以得出結論，如果動物在第一天接受兩倍劑量的肽(首劑為靜脈注射)，AQGV可對致死劑量的WBI產(chǎn)生完全的保護作用，且特別是針對該劑量所伴隨的GI綜合征產(chǎn)生保護作用。如果動物接受較低水平的治療(僅SC)，則將治療延長至第二周也產(chǎn)生完全的保護作用，且特別是針對該高劑量所伴隨的GI綜合征產(chǎn)生保護作用。
當將這些結果與在第51屆輻射研究學會(2004年4月)上報告的有關代號為ON-01210的藥物的輻射防護作用的研究相比較時，可以發(fā)現(xiàn)該藥物ON-01210(與目前正在研究的針對輻射暴露的其他藥物類似)僅在輻射暴露前施用才有保護作用。這使得該藥在對“臟彈”的防護上不是十分有用。該藥物具有巰基成分(4-carboxystyrl-4-chlorobenzylsulfone)，可作為抗氧化劑起作用，將輻射損傷細胞時產(chǎn)生的自由基清除掉。但如果在輻射暴露的當時體內(nèi)沒有該藥，那么無論如何它都不會有作用。相反，使用本發(fā)明的肽來治療可以在暴露后起作用。
同樣，回顧以其他現(xiàn)有藥物進行的治療，關于這些藥物的所有數(shù)據(jù)(即有關使用蛋白同化甾類的治療)均顯示現(xiàn)有的非肽類藥物需要在WBI之前(即24小時)施用，以后施用對急性輻射損傷的防護沒有支援作用。
實施例8DRF研究 在本實施例中，我們報道了對劑量漸增的全身照射(WBI)的研究，對于各組均為單次暴露，而隨后的各組暴露劑量逐漸升高。皮下施用單劑肽AQGV，但治療延遲至WBI后3天(72hr)進行。該測試稱為劑量降低系數(shù)(“DRF”)，其被定義為處理組的LD50與對照組的LD50之間的比值。LD50代表的是導致50％的測試動物死亡的劑量。
可接受的DRF比值是該系數(shù)至少為1.10；但優(yōu)選地是至少1.20或甚至是至少1.25。為通過DRF 1.20的測試，在WBI后第30天，一種候選藥物必須使得LD50輻射劑量比對照動物的LD50劑量高至少20％(系數(shù)為1.20的升高)。例如，如果對照動物的LD50是8.2Gy，那么為了通過該測試，候選藥物造成的LD50應該高至少20％，即在這種情況下該劑量應該為8.2 x 1.20＝10.4Gy。
DRF測試中測試動物的數(shù)量和結果見表12。
表12 討論將治療延遲72小時這一決定的理由是十分重要的在一些放射性暴露的情況下(如暴露于運輸輪船的核裂變裝置，或飛機撞擊到鄰近中心城市的核反應堆等等)，其破壞力之大可能導致需要數(shù)天才能將所有傷者送至治療中心。因此軍事科學家(其關注保護最初的反應者)和民間科學家(其關注治療大量傷亡人員)會自然地需要確定一種候選藥物是否能夠以任何方式消除急性輻射的毒性(GI綜合征，骨髓綜合征)，否則其將在如此長的延遲后突然爆發(fā)。
AQGV的DFR測試結果。殺死50％對照組動物的輻射劑量為～8.2Gy。肽AQGV的保護作用如此之好，以至于必須將輻射劑量提高25％(系數(shù)為1.25)直至達到～10.4Gy，才能殺死50％的動物，而這是在延遲3天治療的情況下得到的結果。假如這種治療能夠更快施用，例如在24hr或48hr時，那么殺死50％的動物的輻射將會更高。
實施例9 為了進一步研究不同寡肽的抗細胞周期活性，在擬南芥幼苗中進行了增殖實驗。目的是要測試一組140種不同長度的寡肽在發(fā)生迅速分裂的細胞快速生長過程中對植物標記物基因表達的影響。兩種標記物基因均涉及細胞周期進程，高標記物活性代表高細胞周期活性，而無標記物活性代表沒有細胞周期活性，因此也就沒有增殖。寡肽在擬南芥細胞周期分析中的作用的實例見圖3。
方法 肽重懸于1x磷酸緩沖液(PBS)pH8，終濃度為5mg/ml。所得溶液分配到96-孔圓底板中(Corning Incorporated)，每孔40微升。板在-20℃存放4天備用。將擬南芥生態(tài)變種Ws-0的種子置于2％商品化漂白劑(Glorix)中10分鐘進行表面消毒，以無菌MQ水洗滌5次。然后將種子重懸于0.1％的瓊脂中并鋪在MS20板上，其中補充了80mg/l的卡那霉素。
板在4℃放置兩夜，然后轉移至氣候室210℃，光照周期16/8小時。生長4天后，將幼苗轉移至含有肽溶液的96-孔板中(每孔4株幼苗)，孵育4到8小時。
為了本實驗，使用了攜帶融合于GUS的兩種報告基因的擬南芥純合子幼苗。使用的第一個報告基因是細胞周期標記物，pCDG(Carmona et al.，The Plant Journal，1999，20(4)，503-508)，第二個是植物生長激素應答標記物，DR5::GUS(Ulmasov et al.，The Plant Cell，Vol.9，1963-1971)。與化合物孵育后，針對GUS對幼苗進行染色。染色反應在100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)(含有10mM EDTA，10％ DMSO，0.1％ Triton X-100，2mM X-Gluc，0.5mM K3Fe(CN)6和0.5mM K4Fe(CN)6)中于37℃進行16小時。為了終止GUS反應并去除葉綠素，幼苗隨后以96％乙醇處理1小時，然后存放于70％乙醇中。在立體顯微鏡下觀察染色的幼苗，以出現(xiàn)化合物處理作用的幼苗制備切片。在水合氯醛溶液中固定并清潔幼苗以便顯微鏡下仔細觀察，并在裝備了DIC鏡片的顯微鏡下拍照。
結果 測試了肽對快速生長的擬南芥幼苗標記物基因表達的影響。通過GUS在不同器官內(nèi)分布的變化對此進行監(jiān)測根、根-胚軸過渡區(qū)和子葉。
在所測試的140種化合物中，共有43種顯示出對測試的兩種標記物的表達有明確的影響。圖3詳細顯示了測試化合物引起的明顯變化的實例，肽LQGV，VVC和DINGFLPAL引起的顯微鏡水平的變化。出乎意料的是，這種作用明顯與不同測試肽的長度相關。自表13可以看出，抗細胞周期活性在短肽中表現(xiàn)極強，而長度超過9個氨基酸的肽無一能夠降低細胞周期活性。長度為5至9個氨基酸的肽中，大約22％顯示出降低，但在測試的3聚體和4聚體中超過50％顯示出降低細胞周期活性。
表13擬南芥細胞周期測試中發(fā)現(xiàn)的陽性測試肽/肽長度的頻率分布。#AA＝肽的長度(氨基酸)；#＝測試的數(shù)量；#+＝陽性的數(shù)量；％+＝陽性百分數(shù)
實施例10 為了進一步研究不同寡肽的抗細胞周期活性，使用經(jīng)抗CD3抗體刺激的小鼠外周血細胞進行體外實驗。目的是測試在CD3誘導的鼠單核細胞快速生長過程中當細胞發(fā)生迅速分裂時一些代表性寡肽對細胞增殖的作用。小鼠(n＝5)腹腔注射PBS、Nak4(LQGV)、Nak47(LAGV)、Nak46(AQGV)(Ansynth BV，The Netherlands提供)、或Nak46*(Diosynth BV，TheNetherlands提供的AQGV)。以0.5mg/kg或5mg/kg的肽處理小鼠1小時，隨后分離脾臟制備脾細胞懸液。匯集每組的脾細胞懸液并在存在PBS或抗CD3抗體的條件下體外培養(yǎng)(三份)，在培養(yǎng)后0、12、24和48小時測定增殖。所有的測試肽均顯示出能夠降低增殖(見圖4)。
實施例9和10的結果 根據(jù)植物中的細胞周期研究和體外降低外周血細胞增殖的研究，經(jīng)鑒定可用于治療輻射損傷的3聚體肽是VVC、LAG、AQG。類似地，可用于治療輻射損傷的4聚體肽是LQGV、QVVC、MTRV、AQGV、LAGV、LQAV、PGCP、VGQL、RVLQ、EMFQ、AVAL、FVLS、NMWD、LCFL、FSYA、FWVD、AFTV、LGTL、QLLG、YAIT、APSL、ITTL、QALG、GVLC、NLIN、SPIE、LNTI、LHNL、CPVQ、EVVR、MTEV、EALE、EPPE、LGTL、VGGI、RLPG、LQGA、LCFL，可用于治療輻射損傷的5聚體肽是TLAVE、VEGNL、LNEAL，可用于治療輻射損傷的6聚體肽是VLPALP、MGGTWA、LTCDDP，可用于治療輻射損傷的7聚體肽是VLPAPLQ、VCNYRDV、CPRGVNP，可用于治療輻射損傷的8聚體肽是QPLAPLVG，以及可用于治療輻射損傷的9聚體肽是DINGFLPAL。
參考文獻
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權利要求
1.治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的方法，所述方法包括給所述對象施用小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物或衍生物。
2.權利要求1的方法，其中所述肽小于15個氨基酸。
3.權利要求1或2的方法，其中所述肽小于7個氨基酸。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述肽由2至6個氨基酸組成。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述肽由3至5個氨基酸組成。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述肽由4個氨基酸組成。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述輻射損傷包含急性輻射損傷。
8.權利要求1至7中任一項的方法，其中所述輻射損傷包含破壞所述對象的腸道被覆層，即所謂的胃腸道綜合征。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述肽具有的針對急性伽瑪照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定
a.測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致測試組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組小鼠在WBI后72小時用所述肽進行處理，和
b.測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致對照組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述對照組小鼠在WBI后72小時僅用所述肽的載體進行處理，和
c.其中通過將肽處理組動物的LD50/30除以載體處理組動物的LD50/30來計算所述DRF。
10.權利要求9的方法，其中所述肽具有的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.20，更優(yōu)選地為至少1.25。
11.權利要求1至10中任一項的方法，其中所述輻射損傷是照射損傷。
12.權利要求1至11中任一項的方法，其中所述治療包含皮下或肌肉內(nèi)注射所述肽。
13.小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物或衍生物在制備用于治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的藥物組合物中的用途。
14.權利要求13的用途，其中所述肽小于15個氨基酸。
15.權利要求13或14的用途，其中所述肽小于7個氨基酸。
16.權利要求13至15中任一項的用途，其中所述肽由2至6個氨基酸組成。
17.權利要求13至16中任一項的用途，其中所述肽由3至5個氨基酸組成。
18.權利要求13至17中任一項的用途，其中所述肽由4個氨基酸組成。
19.權利要求13至18中任一項的用途，其中所述輻射損傷包含急性輻射損傷。
20.權利要求13至19中任一項的用途，其中所述輻射損傷包含破壞所述對象的腸道被覆層，即所謂的胃腸道綜合征。
21.權利要求13至20中任一項的用途，其中所述肽具有的針對急性伽瑪照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定
a.測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致測試組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組小鼠在WBI后72小時用所述肽進行處理，和
b.測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致對照組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述對照組小鼠在WBI后72小時僅用所述肽的載體進行處理，和
c.其中通過將肽處理組動物的LD50/30除以載體處理組動物的LD50/30來計算所述DRF。
22.權利要求21的用途，其中所述肽具有的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.20，更優(yōu)選地為至少1.25。
23.權利要求13至22中任一項的用途，其中所述輻射損傷是照射損傷。
24.權利要求13至23中任一項的用途，其中所述治療包含皮下或肌肉內(nèi)注射所述肽。
25.權利要求13至24中任一項的用途，其中所述藥物組合物被置于自用式注射器中。
26.一種自用式注射器，其包含小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物或衍生物。
27.權利要求26的自用式注射器，其中所述肽小于15個氨基酸。
28.權利要求26或27的自用式注射器，其中所述肽小于7個氨基酸。
29.權利要求26至28中任一項的自用式注射器，其中所述肽由2至6個氨基酸組成。
30.權利要求26至29中任一項的自用式注射器，其中所述肽由3至5個氨基酸組成。
31.權利要求26至30中任一項的自用式注射器，其中所述肽由4個氨基酸組成。
32.權利要求26至31中任一項的自用式注射器，其中所述輻射損傷包含急性輻射損傷。
33.權利要求26至32中任一項的自用式注射器，其中所述輻射損傷包含破壞所述對象的腸道被覆層，即所謂的胃腸道綜合征。
34.權利要求26至33中任一項的自用式注射器，其中所述肽具有的針對急性伽瑪照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定
a.測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致測試組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組小鼠在WBI后72小時用所述肽進行處理，和
b.測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致對照組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述對照組小鼠在WBI后72小時僅用所述肽的載體進行處理，和
c.其中通過將肽處理組動物的LD50/30除以載體處理組動物的LD50/30來計算所述DRF。
35.權利要求34的自用式注射器，其中所述肽具有的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.20，更優(yōu)選地為至少1.25。
36.權利要求26至35中任一項的自用式注射器，其中所述輻射損傷是照射損傷。
37.權利要求26至36中任一項的自用式注射器，其中所述輻射是由放射性物質(zhì)發(fā)出的。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對因暴露于高能電磁波(X射線、伽瑪射線)或粒子(阿爾法粒子、貝塔粒子、中子)而引起的急性輻射損傷的藥物研發(fā)領域。迄今尚無有效的藥物能夠減輕意外暴露于電離照射之后的輻射損傷。本發(fā)明提供用于治療患有輻射損傷的對象的方法，其包含給所述對象施用小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物或衍生物。此外，本發(fā)明提供小于30個氨基酸的肽或其功能性類似物或衍生物在制備用于治療患有輻射損傷或被認為患有輻射損傷的對象的藥物組合物中的用途。本發(fā)明具體提供抗輻射肽，其針對急性伽瑪照射的劑量降低系數(shù)(DRF)為至少1.10，所述DRF可如下確定測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致測試組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述測試組小鼠在WBI后72小時用所述肽進行處理；測試何種劑量的輻射在全身照射(WBI)后30天導致對照組小鼠出現(xiàn)50％的死亡率(LD50/30)，所述對照組小鼠在WBI后72小時僅用所述肽的載體進行處理；其中通過將肽處理組動物的LD50/30除以載體處理組動物的LD50/30來計算所述DRF。
文檔編號A61K38/08GK101443080SQ200780016562
公開日2009年5月27日 申請日期2007年3月6日 優(yōu)先權日2006年3月7日
發(fā)明者R·貝內(nèi), N·A·卡恩, R·M·卡爾頓 申請人:比奧滕普特公司