專利名稱：用于抑制b型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種用于抑制病毒的化合物，尤其是關(guān)于一種自牛樟芝
(jmra&acam^zorato)萃取物中分離純化而得且可用于抑制B型肝炎病毒的 環(huán)己烯酮化合物。
背景技術(shù)：
B型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)屬于肝病毒-+ (//e; "d"wW^^ )， 其是可以造成持續(xù)非細(xì)胞病變性(noncytopathic )肝臟感染的小型脫氧核糖核 酸類病毒體，并具有蛋白外套膜(envelope),也是目前人類肝炎病毒中唯一的 DNA病毒；B型肝炎病毒的外膜約含25。/。脂質(zhì)以及75。/。糖蛋白，糖蛋白的主 要成分為B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen; HbsAg ),而B型肝炎 病毒核心顆粒中含有B型肝炎外套膜抗原(hepatitis B envelop antigen; HbeAg),其中，B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)是一種分泌性蛋白(secretory protein),早期即可通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，此時(shí)胎兒免疫系統(tǒng)尚未成熟，因 此毒殺性T淋巴細(xì)胞會對B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)產(chǎn)生耐受性，導(dǎo)致 人體免疫系統(tǒng)無法清除B型肝炎病毒，使病毒可大量復(fù)制，故B型肝炎外套 膜抗原(HbeAg)也被-現(xiàn)為是一種耐受原(tolerogen)，因此，B型肝炎表面抗 原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)含量的偵測結(jié)果，可作為評 估B型肝炎病毒復(fù)制與分泌情況的指標(biāo)。世界衛(wèi)生組織的調(diào)查中顯示，全世 界約有超過二十億的人口曾被B型肝炎病毒感染，是個(gè)流行率相當(dāng)高的病毒， 主要通過親代垂直感染，感染后會引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、甚至是 肝癌。在臺灣地區(qū)，三十歲以上的男子約有百分之九十的人曾受B型肝炎病 毒感染，其中15%~20%的人會變成終身帶原者，并有可能轉(zhuǎn)變成肝硬化、肝 癌而死亡，故臺灣是B型肝炎感染嚴(yán)重的地方，同時(shí)也是肝癌好發(fā)的地區(qū)。
由前述可知，B型肝炎病毒的感染與肝臟疾病以及肝癌的形成關(guān)系密切， 因此，如何干擾并抑制病毒復(fù)制，徹底根除慢性感染，是抗病毒治療的主要研
究目標(biāo)；此外，近年來不論是使用干擾素、抗病毒藥物或疫苗來防治B型肝 炎病毒感染已有不錯(cuò)的成效，但在慢性B型肝炎帶原者的治療上，仍無法徹 底根除病毒，此為造成B型肝炎病毒引發(fā)肝臟相關(guān)疾病并造成高致死率的主 因，因此，開發(fā)出可有效抑制B型肝炎病毒的抗病毒藥物刻不容緩。
牛樟芝(^^ra^acawp/zorato),又稱樟芝、牛樟菇或紅樟芝等，屬于非褶 菌目(^; /iy〃o^orafey )、多孔菌科(尸o/;^ora"w)的多年生蕈菌類，為臺灣 特有種真菌，僅生長于臺灣保育類樹種-牛樟樹(C/朋awowm Ara/^/n'ra/Hay ) 的中空腐朽心材內(nèi)壁上。由于牛樟樹分布數(shù)量極為稀少，加上人為的盜伐，使 得寄生于其中方能生長的野生牛樟芝數(shù)量更形稀少，且由于其子實(shí)體生長相當(dāng) 緩慢，生長期也僅在六月至十月之間，因此價(jià)格非常昂貴。
牛樟芝的子實(shí)體為多年生，無柄，呈木栓質(zhì)至木質(zhì)，其具強(qiáng)烈的樟樹香氣， 且形態(tài)多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初生時(shí)為扁平型并呈鮮紅色， 之后其周邊會呈現(xiàn)》文射反巻狀，并向四周擴(kuò)展生長，顏色也轉(zhuǎn)變?yōu)榈t褐色或 淡黃褐色，并有許多細(xì)孔，且其是牛樟芝藥用價(jià)值最豐富的部位。
在臺灣民俗醫(yī)學(xué)上，牛樟芝具有解毒、減輕腹瀉癥狀、消炎、治療肝臟相 關(guān)疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食藥用的蕈菇類，具有"i午多復(fù)雜的成分， 已知的生理活性成分中，包括三碎類化合物(triterpenoids )、多糖體 (polysaccharides,如(3-D-葡聚糖)、腺苷(adenosine)、維生素(如維生素B、 煙堿酸)、蛋白質(zhì)(含免疫球蛋白)、超氧歧化酶(superoxide dismutase, SOD )、 微量元素(如鈣、磷、鍺)、核酸、固醇類以及血壓穩(wěn)定物質(zhì)(如antodiaacid) 等，此些生理活性成分被認(rèn)為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過敏、抗病菌、 抗高血壓、降血糖及降膽固醇等多種功效。
牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十 個(gè)碳元素結(jié)合成六角形或五角形天然化合物的總稱，牛樟芝所具的苦味即主要 來自三辟類此成分。1995年時(shí)，Chemg等人發(fā)現(xiàn)牛樟芝子實(shí)體萃取物中含有 三種新的以麥角甾烷(ergostane )為骨架的三萜類化合物antcin A、 antcin B 與antcin C ( Cherng, I. H.， and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from 」w的&a J. Nat. Prod. 58:365-371 )。 Chen等人以乙醇萃取樟芝子實(shí)
體后發(fā)現(xiàn)zhankuic acid A、 zhankuic acid B及zhankuic acid C等三種三萜類化
合物(Chen, C. H., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from cz'wwamcw ea， 一 a fUngus parasitic on CV"wawomwm wn'crawAwm. J. Nat. Prod. 58:1655-1661 )。此外，Chiang等人于1995年也由子實(shí)體萃取物中發(fā)現(xiàn)另外三 種分別為倍半裕內(nèi)西旨(sesquiterpene lactone )與兩種雙酚類書f生物的新三碎類 化合物，此即 antrocin, 4,7- 二甲氧基-5-曱基-1,3-苯并二氧環(huán)
(4,7-dimethoxy-5-methy-l,3畫benzodioxole )與2,2',5，5'-四曱氧基-3，4，3',4,-雙匿 亞曱二氧基畫6，6'-二曱基聯(lián)苯 (2，2'，5，5'-teramethoxy-3,4,3'，4'-bi- methylenedioxy畫 6,6'畫dimethylbiphenyl) ( Chiang, H. C., Wu, D. P., Cherng， I. W" and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from
Phytochemistry. 39:613-616)。到了 1996年，Chemg等人以同樣 分析方法再度發(fā)現(xiàn)四種新的三辟類化合物antcinE、 antcinF、 methyl antcinate G、 methyl antcinate H ( Cherng, I. H., Wu, D. P" and Chiang, H. C. 1996. Triteroenoids from爿w^W/a c/朋麵謹(jǐn)肌Phytochemistry. 41:263-267 );而Yang 等人則發(fā)現(xiàn)了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuic acid D、 zhankuic acidE和三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物15 a-乙酰-去氫硫 色多孑L菌酸 (15 a -acetyl畫dehydrosulphurenic acid )、 去氳齒孑L酸
(dehydroeburicoic acid )與去7JC石克色多孑L菌酸(dehydrasulphurenic acid) ( Yang， S. ^V" Shen， Y. C., and Chen， C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of ^wf/x^Z/a czVmamomea 一 a fbngus parasitic on CVw打awowww w/crow決ww. Phytochemistry. 41:1389-1392 )。
雖然由目前諸多的實(shí)驗(yàn)可得知牛樟芝萃取物具有前述功效，且其所含成分 也陸續(xù)被分析出，但究竟牛樟芝萃取物中何種有效成分可抑制B型肝炎病毒 感染并治療與B型肝炎病毒相關(guān)的肝臟疾病，仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究來厘清， 故若能找出牛樟芝萃取物中所含真正有效抑制B型肝炎病毒的成分，對于急 性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等與B型肝炎病毒相關(guān)肝臟疾病的治療 將產(chǎn)生莫大的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
為明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分可有效抑制B型肝炎病毒感染，本 發(fā)明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式(1)結(jié)構(gòu)式的化合物； <formula>formula see original document page 7</formula> ( 1 )
其中，X是氧(O)或硫(S), Y是氧或硫；R,是氫基(H)、曱基(013)
或(CH2)m-CH3， R2是氫基、曱基或(CH2)m-CH3， 113是氫基、甲基或(CH2)m-CH3,
m = 1 ~ 12; n = 1 ~ 12。
如式(1)結(jié)構(gòu)式的化合物中，較佳者為如下所示式(2)的化合物
<formula>formula see original document page 7</formula> ( 2 )
式(2)的化合物，其化學(xué)名為4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三 曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,ll-trimethyl-dodeca-2，6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )，分子式為C24H3804， 外觀為淡黃色粉末狀，分子量為3卯。
本發(fā)明中式(1 )、式(2 )的化合物是分離純化自牛樟芝水萃取物或有機(jī) 溶劑萃取物，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙 酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣代烷(例如氯曱烷、氯乙烷)，l旦并不以此為 限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。
通過前述化合物，本發(fā)明將其應(yīng)用于抑制B型肝炎病毒感染上，使能進(jìn) 一步用于治療B型肝炎病毒所致相關(guān)肝臟疾病的醫(yī)藥組合物中，增益急性肝 炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等與B型肝炎病毒相關(guān)的肝臟疾病的治療效 果。結(jié)果顯示，當(dāng)以本發(fā)明式(1)和/或式(2)的化合物處理可分泌具感染 能力的B型肝炎病毒的肝癌細(xì)胞株HepG2 2.2.15時(shí)，其可有效抑制該肝癌細(xì) 胞株的細(xì)胞相對存活率，并降低由B型肝炎病毒所生成的B型肝炎表面抗原 (HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量，達(dá)到抑制B型肝炎
病毒復(fù)制及分泌的目的，進(jìn)而可將由天然成分所萃取出的該化合物利用于與B
型肝炎病毒相關(guān)的肝臟疾病的治療上。
另一方面，本發(fā)明中也可將式(1)和/或式(2)的化合物利用于治療B 型肝炎病毒所致相關(guān)肝臟疾病的醫(yī)藥組合物的成分中，藉以4中制B型肝炎病 毒的復(fù)制及分泌，進(jìn)而減緩急性或慢性肝炎感染，并降低肝炎帶原者轉(zhuǎn)變?yōu)楦?硬化或肝癌而死亡的發(fā)生率。前述醫(yī)藥組合物除包括有效劑量的式(1)和/ 或式(2)的化合物外，還可以包括藥學(xué)上可接受的載體。載體可為賦形劑(如 水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、 吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并不僅限于此。本發(fā)明醫(yī)藥組合物可依一般悉知藥學(xué) 的制備方法生產(chǎn)制造，將式(1)和/或式(2)有效成分劑量與一種以上的載 體相混合，制備出所需的劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠嚢或其它 液體制劑，^旦未以此為限。
以下將配合圖式進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例用以 闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發(fā) 明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附 的權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例所分離出的4-羥基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對人類肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.1存活率的 影響結(jié)果。(A)圖是4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三甲基-2,6，10-十 二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮；(B)圖是牛樟芝粗萃取物。垂直線代表三次獨(dú)立試 驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例所分離出的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成 量的影響結(jié)果。(A)圖是4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,ll-三曱基-2,6,10-十二碳三烯) -2-環(huán)己烯酮； (B)圖是牛樟芝粗萃取物。垂直線代表三次獨(dú)立 試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例所分離出的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生
成量的影響結(jié)果。(A )圖是4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5( 3,7,11 -三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮；(B)圖是牛樟芝粗萃取物。垂直線代表三次獨(dú)立試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值。
具體實(shí)施例方式
首先取牛樟芝(Antrodia camphorata)菌絲體、子實(shí)體或二者的混合 物，利用悉知萃取方式，以水或有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，藉以耳又得牛樟芝水 萃取物或有機(jī)溶劑萃取物。其中，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙 醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣代烷(例如 氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。
經(jīng)萃取過后的牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，可進(jìn)一步通過高 效液相層析加以分離純化，之后再對每一分液(fraction)進(jìn)4亍抑制B型 肝炎病毒復(fù)制的相關(guān)生化測試。最后，則針對具抑制B型肝炎病毒復(fù)制 效果的分液進(jìn)行成分分析，再進(jìn)一步分別做相關(guān)的生化測試，例如各 分液中所含有效成份對于肝癌細(xì)胞林HepG2 2.2.15的細(xì)刀包毒性的影響以 及檢測B型肝炎表面抗原(HbsAg)與B型肝炎外套膜抗原(HbeAg) 含量等測試。最終即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中如式(1) /式(2)的化合物具有抑制 B型肝炎病毒復(fù)制的效果。
為方便說明本發(fā)明，以下將以式(2)的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱 基-5 ( 3,7,11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物進(jìn)行說明。 此外，為證實(shí)4-羥基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5 (3，7，11-三甲基-2，6，10-十二 碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物對肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.15生長的細(xì)胞毒性影 響，并研究該牛樟芝環(huán)己烯酮化合物是否可有效抑制B型肝炎病毒的復(fù) 制，本發(fā)明中以MTT分析法，根據(jù)美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.15進(jìn)行細(xì)胞 存活率的測試，并利用半定量酶聯(lián)免疫分析法偵測由B型肝炎病毒所分 泌的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg) 的含量。由這些測試證實(shí)，牛樟芝環(huán)己烯酮化合物可降低肝癌腫瘤細(xì)胞 HepG2 2.2.15的存活率，并有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B
型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的形成，進(jìn)而達(dá)到抑制B型肝炎病毒復(fù)制 與分泌的目的。茲對前述實(shí)施方式詳盡iJt明如下
實(shí)施例1:
4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)
己烯酮的分離
將100克左右的牛樟芝菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，置入三角 錐形瓶中，加入適當(dāng)比例的水與醇類(例如70%以上的醇類水溶液)， 于20 25。C下攪拌萃取至少1小時(shí)以上，之后以濾紙及0.45 (im濾膜過濾， 收集萃取液。
將前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效液相色語儀(High Performance Liquid chromatography ), 以RP18的色譜柱(column )進(jìn)行 分析，并以曱醇(A)及0.1%~0.5%醋酸水溶液(B )做為移動(dòng)相(mobile phase)(其溶液比例是0 10分鐘，B比例為95% ~20°/。； 10~20分鐘， B比例為20%~10%; 20~35分鐘，B比例為10% 10%; 35~40分鐘，B比 例為10%~95%)，在每分鐘1 ml的速度下沖提，同時(shí)以紫外-可見光全 波長偵測器分析。
將25分鐘至30分鐘的沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀的固體 產(chǎn)物，此即4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三甲基-2，6,10-十二碳 三烯)-2-環(huán)己烯酮。經(jīng)分析，其分子式為C24H38 04，分子量390，熔點(diǎn) (m.p.)為48。C 52。C。核磁共振(NMR )分析值則如下所示 !H-NMR(CDCl3)S(ppm): 1.51、 1.67、 1.71、 1.75、 1.94、 2.03、 2,07、 2.22、 2.25、 3.68、 4.05、 5.07與5.14。 13C-NMR(CDCl3)S(ppm): 12.31、 16.1、 16.12、 17.67、 25.67、 26.44、 26.74、 27.00、 39.71、 39.81、 4.027、 43.34、 59.22、 60.59、 120.97、 123.84、 124.30、 131.32、 135.35、 135.92、 138.05、 160.45與197.12。
實(shí)施例2:
牛樟芝環(huán)己烯酮化合物體外對肝癌腫瘤細(xì)胞的毒性測試
為進(jìn)一步測試實(shí)施例1中的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物對肝癌腫瘤細(xì)胞
的抑制效果，本實(shí)施例是根據(jù)美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI)抗胂瘤藥物篩枱r才莫式進(jìn)行的，首先取實(shí)施例1中所分離的 4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán) 己烯酮，加入HepG2 2.2.15人類肝肺瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存 活性的測試。細(xì)胞存活性的測試可采用悉知的MTT分析法進(jìn)行分析，而 HepG2 2.2.15是人類的肝癌腫瘤細(xì)胞系，且該細(xì)胞系可分泌具感染能力 的B型肝炎病毒。
MTT分析法是一種常見用于分析細(xì)胞增殖(cell proliferation)、存 活率(percent of viable cells )以及細(xì)胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。 其中，MTT ( 3-[4，5- dimethylthiazol國2-yl]2,5畫diphenyltetrazolium bromide ) 為黃色染劑，它可被活細(xì)J!包吸收并被線4立體中的琥珀酸四唑還原酶 (succinate tetrazolium reductase )還原成不溶水性且呈藍(lán)紫色的 formazan，因此通過曱騰(formazan )形成與否，即可判斷并計(jì)算細(xì)胞的 存活率。
首先將人類肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.1置于含有10。/。胎牛血清以及200 pg/ml抗生素G418的僅含12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素的 J氐P艮量基石出培養(yǎng)基(minimum essential medium, MEM) ( Gibco Co., USA ) 中培養(yǎng)24小時(shí)。將增殖后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以l倍的胰蛋白酶 -EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200 rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上 清液。之后加入10 ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將5000 個(gè)細(xì)胞分置于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)。測試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入以二曱 基硫酸(dimethyl sulfoxide, DMSO )所配制的0.1、 1、 10 (ag/ml牛樟芝 粗萃取物(對照組，未經(jīng)純化分離的牛樟芝乙醇總萃取物)以及4-鞋基 -2，3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮 (實(shí)驗(yàn)組)，并以完全不添加任何物質(zhì)者為對照組，于37。C、 5% C02下 培養(yǎng)22小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5 mg/ml的MTT, 反應(yīng)2小時(shí)后，移除培養(yǎng)基，并加入50 jil 二曱基硫酸(DMSO)溶解結(jié) 晶。最后以酶免疫分析儀在570nm吸光波長下測定其吸光值，并將此測
得數(shù)值與未經(jīng)處理的對照組的細(xì)胞數(shù)值相比較，藉以計(jì)算得細(xì)胞相對的 存活率(％ ),其結(jié)果如圖1所示。
請參閱圖l，該圖是本發(fā)明實(shí)施例所分離出的4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對人類肝癌細(xì)胞 HepG2 2.2.1存活率的影響結(jié)果。由圖l中可知，相對于對照組牛樟芝粗 萃取物的細(xì)胞相對存活率結(jié)果，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮可有效降低人類肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.1的存活率，且經(jīng)濃度為10 )ig/ml牛樟芝環(huán)己烯酮化合物處理后的癌 細(xì)胞存活率可低至約81%以下，因此可證實(shí)分離自牛樟芝萃取物的4-羥 基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯 酮確實(shí)能夠利用于肝癌肺瘤細(xì)胞HepG2 2.2.1生長的抑制。
實(shí)施例3:
牛樟芝環(huán)己烯酮化合物體外對B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝 炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的影響
為測試實(shí)施例1分離純化出的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物對B型肝炎病 毒所產(chǎn)生的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原 (HbeAg)生成量的影響，本實(shí)施例先培養(yǎng)人類肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.1, 并于此細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，再以半定量的酶聯(lián) 免疫分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assy， ELISA ) 4全測培養(yǎng)基中 B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成 量，通過此兩病毒指針來評估牛樟芝環(huán)己烯酮化合物可否有效抑制B型 肝炎病毒。其中，H印G2 2.2.1細(xì)胞系利用包含B型肝炎病毒基因組(HBV genome)的質(zhì)體(plasmid )轉(zhuǎn)染人類肝腫瘤細(xì)胞抹HepG2，并經(jīng)過抗生 素G418篩選所得可分泌B型肝炎表面抗原(HbsAg) 、 B型肝炎外套膜 抗原(HbeAg)、核蛋白衣殼(nucleocapsid)以及病毒顆粒(virion)的 細(xì)胞林(Sells, M. A.， Chen， M. L. and Acs, G. 1987. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1005-1009 )。
首先將人類肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.1置于含有10%胎牛血清以及200 嗎/ml抗生素G418的MEM培養(yǎng)基(GibcoCo., USA)中培養(yǎng)24小時(shí)。 將增殖后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞， 隨后于1,200 rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入 10 ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將5000個(gè)細(xì)胞分置于 96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)。測試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入以二曱基硫酸(dimethyl sulfoxide, DMSO)配置且濃度分別為0.1、 1、 10 pg/ml的牛樟芝粗萃取 物(對照組，未經(jīng)純化分離的牛樟芝乙醇總萃取物)以及4-幾基-2,3-二 甲氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮，并以 完全不添加任何物質(zhì)者為對照組，于37。C、 5% C02下培養(yǎng)22小時(shí)。 再取適量的各培養(yǎng)液，通過抗人類B型肝炎病毒表面抗原的單抹抗體 (monoclonal antibody)及抗人類B型肝炎病毒外套膜抗原的多源抗體 (multiclonal antibody )的酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)試劑分析試劑盒(general biologicals corp., Taiwan, ROC.),利用抗體一抗原一抗體酶接合體的三 明治復(fù)合體，以含過氧化氬的鄰苯二胺(O-phenylenediamine， OPD )溶 液使之顯色，再以酶聯(lián)免疫分析儀于450 nm的波長下，測得培養(yǎng)液中B 型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的含量， 其陰性判定是依照以下公式cutoff value = O.D.negativec。ntr。l + 0.025,其中 若OD45o的吸光值超過此值則為陽性，其結(jié)果如圖2與圖3中所示。
請參閱圖2，該圖是本發(fā)明實(shí)施例所分離出的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對B型肝炎表面 抗原(HbsAg)生成量的影響結(jié)果，由圖中結(jié)果顯示，相對于對照組牛樟 芝粗萃取物的B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量結(jié)果，4-羥基-2,3-二曱 氧基-6-曱基-5 ( 3,7,1 l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮可有效抑 制B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成，且隨著牛樟芝環(huán)己烯酮化合物 施予濃度的增加，B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成量便隨之下降，經(jīng) 前述各濃度牛樟芝環(huán)己烯酮化合物處理后的B型肝炎表面抗原(HbsAg) 生成量可降低至60%以下，其中又以濃度為10 jug/ml牛樟芝環(huán)己烯酮化 合物對B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的抑制效果為最佳，其B型
肝炎表面抗原(HbsAg)生成量可低至28%以下，因此可證實(shí)由牛樟芝 萃取物中分離出的4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠有效降低B型肝炎表面抗原(HbsAg ) 的生成量，這也顯示牛樟芝環(huán)己烯酮化合物具有抑制B型肝炎病毒繁殖 的功效。
請參閱圖3,該圖是本發(fā)明實(shí)施例所分離出的4-羥基-2,3-二曱氧基 -6-甲基-5 ( 3,7,1 l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對B型肝炎外 套膜抗原(HbeAg)生成量的影響結(jié)果。由圖中結(jié)果可知，相對于對照組
牛樟芝粗萃取物的B型肝炎外套膜抗原(1^6八§)生成量結(jié)果，4-幾基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 ( 3,7,1 l-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮可有 效抑制B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成，經(jīng)牛樟芝環(huán)己烯酮化合物 處理后的B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量可低至84%以下，其中 又以濃度為1 pg/ml的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物對B型肝炎外套膜抗原
(HbeAg)生成量的抑制效果為最佳，其B型肝炎外套膜抗原(HbeAg) 生成量可低至57%以下，因此可證實(shí)由牛樟芝萃取物中分離出的4-羥基 -2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮 確實(shí)能夠有效降低B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量。
另一方面，相對于前述4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱 基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對HepG2 2.2.15細(xì)胞毒性測試的結(jié)果
(請參閱圖1)可觀察到，該牛樟芝環(huán)己烯酮化合物抑制B型肝炎表面 抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的數(shù)值相對高 于該牛樟芝環(huán)己烯酮化合物抑制人類肝癌細(xì)胞HepG2 2.2.15存活率的數(shù) 值，這表示4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳 三烯)-2-環(huán)己烯酮對B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜 抗原(HbeAg)生成量的抑制效果并非因其對細(xì)胞具毒性所致。
綜上所述，本發(fā)明自牛樟芝萃取物中所分離出的新4-羥基-2,3-二甲 氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮可有效抑 制人類肝癌腫瘤細(xì)胞HepG2 2.2.15的存活率，且可抑制B型肝炎表面抗 原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的形成，因此這些化合
物可用于抑制B型肝炎病毒的復(fù)制與分泌，同時(shí)可利用于與B型肝炎病 毒相關(guān)的肝臟疾病的治療上。另外，也可將其制備成醫(yī)藥組合物，此醫(yī) 藥組合物除包含有效劑量的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三曱 基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮外，還可以包括藥學(xué)上可接受的載體。 載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、翻合劑(如纖維 素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并不僅限于此。 本發(fā)明醫(yī)藥組合物可依一般悉知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將有效成分 劑量的這些牛樟芝化合物與 一種以上的載體相混合，制備出所需的劑型， 此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠嚢或其它液體制劑，但未以此為限。
權(quán)利要求
1.一種用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，具有下列結(jié)構(gòu)式 其中，X是氧(O)或硫(S)，Y是氧或硫；R1是氫基(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2是氫基、甲基或(CH2)m-CH3，R3是氫基、甲基或(CH2)m-CH3，m＝1～12；n＝1～12。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合 物，其中，所述化合物由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中分離制得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合 物，其中，所述有機(jī)溶劑選自酯類、醇類、烷類或卣代烷所組成的組中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合 物，其中，所述醇類是乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合 物，其中，所述化合物由牛樟芝的水萃取物中分離制得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合 物，其中，所述化合物是4-羥基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,ll-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮 化合物，其中，所述化合物通過降低B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型 肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量而抑制B型肝炎病毒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合 物，其中，所述化合物降低B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的較佳使用濃 度為10 pg/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己歸酮化合 物，其中，所述化合物降低B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的較佳使用 濃度為1 pg/ml。
10. —種用于治療B型肝炎病毒所引起疾病的醫(yī)藥組合物，其至少包括 有效劑量的權(quán)利要求1所述的化合物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
11. 一種用于治療B型肝炎病毒所引起疾病的醫(yī)藥組合物，其至少包括 有效劑量的權(quán)利要求6所述的化合物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的用于治療B型肝炎病毒所引起疾病的 醫(yī)藥組合物，其中，所述B型肝炎病毒所引起疾病包含急性肝炎、慢性肝炎、 肝硬化以及肝癌。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝萃取物中所分離出的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5[3，7，11-trimethyl-dodeca-2，6，10-trienyl]-cyclohex-2-enone)，并可有效抑制B型肝炎病毒。本發(fā)明中，牛樟芝環(huán)己烯酮化合物對于能分泌B型肝炎病毒的人類肝癌細(xì)胞株HepG2 2.2.15具細(xì)胞毒性，并可降低B型肝炎病毒顆粒的生成量，且可有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)，藉以達(dá)到抑制B型肝炎病毒的目的。
文檔編號A61P31/12GK101362679SQ20071014028
公開日2009年2月11日 申請日期2007年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日
發(fā)明者劉勝勇, 溫武哲, 郭茂田 申請人:國鼎生物科技股份有限公司