專利名稱：看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗藥性的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗藥性的鑒定方法，屬于雜草植物對除草劑的抗藥性測定方法，專用于看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗藥性的監(jiān)測。
二、技術(shù)背景拿捕凈屬于環(huán)己烯酮類除草劑(Cyclohexanedione，CHD)，其作用靶標(biāo)酶為乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase，)。
CHD類除草劑同以乙酰乳酸合成酶(ALS)為作用靶標(biāo)酶的磺酰鷯脲類除草劑一樣，由于作用靶標(biāo)單一，連續(xù)使用易造成雜草的抗藥性。在玉米細(xì)胞培養(yǎng)中，拿捕凈或蓋草能存在的情況下，已篩選出幾種抗藥性品系。在敏感性品系中，與未篩選品系比，拿捕凈或蓋草能對ACCase活性的抑制能力明顯下降(Wyse等1992)。據(jù)Cotterman.(1992)報(bào)道，禾草靈在澳大利亞的南澳洲連續(xù)使用4年后，瑞士黑麥草對其產(chǎn)生了抗藥性，這種抗藥性生物種很快遍布整個(gè)澳大利亞的小麥產(chǎn)區(qū)，并且對其他ACCase類抑制劑存在交互抗性。黑麥草在連續(xù)使用驃馬6年后，就會(huì)產(chǎn)生抗性，同時(shí)，約95％的該黑麥草居群對吡羧嘧黃隆產(chǎn)生交互抗性(Letouze A.等，2001)。在美國小麥田連續(xù)使用4-5年，黑麥草、多花黑麥草等產(chǎn)生抗性生物型。根據(jù)Gressel(1996)按作用靶標(biāo)、持效期、選擇壓、使用歷史等分成的3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)級中，ACCase抑制劑類除草劑屬于抗性風(fēng)險(xiǎn)分級的高風(fēng)險(xiǎn)級別(馬曉淵，2002)，一般連續(xù)使用該類除草劑6-10年，就會(huì)產(chǎn)生抗性(Devine Malcolm D，1997)。由于ACCase抑制劑類除草劑的抗性基因位點(diǎn)發(fā)生多于1個(gè)功能突變碼，故其抗性發(fā)展速度很快，而且極易發(fā)生交互抗性和多抗性，一旦雜草產(chǎn)生抗藥性，治理難度將高于ALS抑制劑類除草劑。
雖然在我國抗ACCase抑制劑類除草劑的雜草至今尚未有報(bào)道，隨著該類除草劑在油菜田，小麥田，大豆田的廣泛而連續(xù)的使用，野燕麥、硬草、罔草，看麥娘，牛筋草等對ACCase抑制劑類除草劑能否產(chǎn)生抗性必須引起高度警惕，否則必將嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量(李宜蔚，1999)。為了防止耐藥性雜草的發(fā)生和蔓延，必須對田間雜草進(jìn)行監(jiān)測，及選取恰當(dāng)合理的方法對抗性雜草進(jìn)行鑒定。開展抗藥性雜草種群的監(jiān)測工作，研究防除抗藥性雜草的方法，及早鑒定、控制、消滅抗性雜草，將抗ACCase抑制劑類除草劑控制在初發(fā)階段，具有重要意義。由于除草劑的一些弊病仍存在，須將這一措施綜合進(jìn)雜草治理體系。
目前，對ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的鑒定方法主要有整株植物測定法、幼苗實(shí)驗(yàn)法、花粉粒的檢測、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)法、PCR檢測法等。其中使用最廣的是整株植物測定法，一直是鑒定和選擇抗藥性雜草生物型的有效方法。該方法在于實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡單易行，還可進(jìn)行大批量的植株實(shí)驗(yàn)工作，適用于絕大多數(shù)除草劑抗藥性生物型的鑒定。但是這種方法的缺陷是難以保證除草劑和植物之間具有同樣藥劑的可利用性(唐正輝等，1991)，另外耗時(shí)長達(dá)約50天，工作量大，占溫室空間大。因此有必要選擇一種快速、簡單、可靠的方法來鑒定抗藥性的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中整株植物測定抗藥性方法的一些弊端，提供一種看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗藥性的鑒定方法，用該方法鑒定看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗性速度快，成本低，操作簡單，不占空間，適應(yīng)大面積種子鑒定的需要。
技術(shù)方案 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗性的室內(nèi)鑒定法的步驟如下1)破除看麥娘休眠將看麥娘種子于4℃條件下800-1000ppm濃度的GA3或0.2％(m/v)KNO3為浸種液浸種5天；2)抗拿捕凈適宜濃度的篩選將浸種后的種子播在直徑為9cm，鋪有濾紙的塑料培養(yǎng)皿中，加入濃度梯度為0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8mg/L的除草劑7mL，4次重復(fù)，放入18℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每兩天加入1ml蒸餾水；3)抗藥性鑒定六天后測量幼苗的苗長或根長、胚芽鞘的長度，用SAS或SPSS統(tǒng)計(jì)軟件非線形回歸得出抑制中濃度GR50，根據(jù)非線形回歸方程得出抗性比R/S即抗性居群抑制中濃度RGR50/敏感性居群抑制中濃度SGR50；4)抗藥性判斷抗性比R/S＞10為高抗，3＜R/S＜10為中抗，R/S＜3為敏感。
有益效果 本方法所提供的室內(nèi)種子對拿捕凈產(chǎn)生抗性方法除了鑒定結(jié)果準(zhǔn)確外，還具有如下優(yōu)點(diǎn)1)方法簡便，結(jié)果可靠。一般工作人員即可操作；種子鑒定與整株測定及生理指標(biāo)的反映一致。
2)速度快，檢測居群樣品多，占空間小，一批樣品只需10天即可拿出抗性鑒定結(jié)果。
3)成本低廉，不需購置特殊儀器設(shè)備，只需一個(gè)培養(yǎng)箱，不需光照。每處理浸種4天，6天18℃暗培養(yǎng)幼苗，一次可測定所有提供的樣品。比整株測定法大大節(jié)約人力、物力。
4)季節(jié)、溫度、光照的限制，適合于大面積看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗性的鑒定，及時(shí)監(jiān)控抗性雜草產(chǎn)生，為田間管理提供有效依據(jù)。
由于剛采收的看麥娘存在1-3月的休眠期，而且普遍存在發(fā)芽不齊，時(shí)間長，所以有必要首先研究快速破除休眠或者使對已解除休眠的種子發(fā)芽一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明打破休眠不僅與處理物質(zhì)有關(guān)也與處理時(shí)間有很大的關(guān)系。
在看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗性的鑒定方法確定后，又進(jìn)行了整株測定，，表1，圖3，圖4，圖5說明種子鑒定出的JXRI，JXRII表現(xiàn)為高抗，HFRI，HFRII，LYR為中抗，JJSI，JJSII，NAU，HFS為敏感，與整株測定結(jié)果反映一致。
四

本發(fā)明不僅可用于看麥娘，也可用于日本看麥娘，罔草等其他禾本科雜草。
圖1為看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗性的室內(nèi)鑒定法步驟圖2為不同處理對看麥娘發(fā)芽率的影響1 GA200，2 GA400，3 GA800，4 0.2％KNO3冷凍，5 0.2％KNO3常溫，6水冷凍，7水常溫。
圖3為拿捕凈處理與幼苗長度的關(guān)系圖4為拿捕凈處理15天后對不同居群看麥娘的藥效圖5為拿捕凈處理15天后對不同居群看麥娘的鮮重防效的影響五具體實(shí)施方式
2003年春季，對新采集的看麥娘種子進(jìn)行種子鑒定，共6個(gè)居群。將所取種子樣本在4℃條件下用800ppm濃度的GA3浸種5天后，將浸種后的種子播在鋪有2層濾紙，直徑9cm的塑料培養(yǎng)皿中。每皿加入7ml的拿捕凈水配溶液，濃度梯度為0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2mg/L的拿捕凈除草劑范圍內(nèi)。18℃暗培養(yǎng)，6天后測定苗長，用SAS或SPSS統(tǒng)計(jì)軟件非線形回歸，非線形回歸方程Y＝k/(1+ebxc)，其中x除草劑劑量(ml/l)；y苗長(cm)；b，c曲線的參數(shù)；k對照的苗長(cm)；GR50＝e-g(g＝b/c)。進(jìn)而得出抗性比(R/S)，結(jié)果見表1。JXRI(R/S＝32.9)，JXRII(R/S＝40.8)表現(xiàn)為高抗，HFRI(R/S＝8.7)，HFRII(R/S＝9)，LYR(R/S＝4.55)為中抗，JJSII(R/S＝1.14)，NAU(R/S＝1.02)，HFS(R/S＝1)為敏感。圖3。
同時(shí)選取了JXRI，HFRI，JJSI進(jìn)行了整株測定。即采集的JXRI，HFRI，JJSI種子進(jìn)行催芽，分別移入直徑9cm的花盆中，每盆40株，配12.5％拿捕凈梯度劑量100，300，900，2700ml/ha，于雜草三葉期莖葉噴霧處理，重復(fù)4次，約15天統(tǒng)計(jì)其死亡率，計(jì)算株防效，其中JJSI在300ml/ha劑量下株防效達(dá)到50％以上，較為敏感；HFRI在900ml/ha劑量下株防效達(dá)到40％，為中抗；而JXRI在2700ml/ha劑量下株防效達(dá)到18％，表現(xiàn)為高抗，見圖4。
2003年11月，對采集的看麥娘種子月居群JXRII，NAU，JJSII進(jìn)行了整株測定，分別移入直徑9cm的花盆中，每盆40株，配12.5％拿捕凈梯度劑量300，600，1200，2400，4800ml/ha于雜草四葉期莖葉噴霧處理，重復(fù)4次，約15天稱量地上部分的鮮重，計(jì)算鮮重防效，其中NAU、JJSII在600ml/ha劑量下鮮重防效就已達(dá)到70％以上，較為敏感；而JXRII在4800ml/ha劑量下鮮重防效才到15％左右，表現(xiàn)為高抗，見圖5。
表1，圖3，圖4，圖5說明種子鑒定出的JXRI，JXRII表現(xiàn)為高抗，HFRI，HFRII，LYR為中抗，JJSI，JJSII，NAU，HFS為敏感，與整株測定結(jié)果反映一致。
以上測量苗長技術(shù)的實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可相應(yīng)通過測量幼苗根長或胚芽鞘的長度，用SAS或SPSS統(tǒng)計(jì)軟件非線形回歸得出抑制中濃度GR50，根據(jù)非線形回歸方程得出抗性比R/S，即抗性居群抑制中濃度RGR50/敏感性居群抑制中濃度SGR50，判斷抗藥性抗性比R/S＞10為高抗，3＜R/S＜10為中抗，R/S＜3為敏感。
表1 幼苗長度與除草劑劑量非線形方程參數(shù)

Y＝k/(1+ebxc)表中括號為標(biāo)準(zhǔn)差
權(quán)利要求
1.看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗藥性的鑒定方法，包括1)破除看麥娘休眠將看麥娘種子于4℃條件下800-1000ppm濃度的GA3或0.2％(m/v)KNO3為浸種液浸種5天；2)抗拿捕凈適宜濃度的篩選將浸種后的種子播在直徑為9cm，鋪有濾紙的塑料培養(yǎng)皿中，加入濃度梯度為0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8mg/L的除草劑7mL，4次重復(fù)，放入18℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每兩天加入1ml蒸餾水；3)抗藥性鑒定六天后測量幼苗的苗長或根長、胚芽鞘的長度，用SAS或SPSS統(tǒng)計(jì)軟件非線形回歸得出抑制中濃度GR50，根據(jù)非線形回歸方程條得出抗性比R/S即抗性居群抑制中濃度RGR50/敏感性居群抑制中濃度SGR50；4)抗藥性判斷抗性比R/S＞10為高抗，3＜R/S＜10為中抗，R/S＜3為敏感。
全文摘要
本發(fā)明看麥娘對拿捕凈產(chǎn)生抗藥性的鑒定方法，屬于雜草抗藥性測定方法，將看麥娘種子于4℃條件下800－1000ppm濃度的GA
文檔編號G01N33/00GK1544936SQ20031010627
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
發(fā)明者王慶亞, 張守棟, 黃世霞, 董立堯 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)