專利名稱：用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的干細(xì)胞制劑，尤其是涉及 用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑。
背景技術(shù)：
骨髓移植是目前治療許多惡性血液疾病和自身免疫性疾病的其中一種有效 的方法，由于異基因骨髓移植日益普遍，使異基因骨髓移植后移植物抗宿主病 (graft versus host disease, GVHD)的發(fā)生率和致死率不斷升高，GVHD的發(fā)生 主要是由于供、受者之間除主要組織相容性抗原一致外，還存在免疫遺傳學(xué)的 差異，供者淋巴細(xì)胞(主要是T淋巴細(xì)胞)對受者產(chǎn)生的免疫攻擊反應(yīng)所造成 的，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，并成為導(dǎo)致移植后非復(fù)發(fā)相關(guān)死亡的主要原 因。為了降低GVHD，通常采用去除T細(xì)胞的造血細(xì)胞移植，但不利于免疫重 建，更容易發(fā)生移植后感染。由于上述問題相互交織，至今也難于找到各方面 均可兼顧的綜合處理方案，因此嚴(yán)重影響了同種造血干細(xì)胞移植的治療效果。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenehymal stem cells, MSCs)是骨髓中具有強(qiáng)大的體外 增殖和分化能力的干細(xì)胞。近年更發(fā)現(xiàn)MSCs具有獨特的免疫學(xué)特征。 Klyushnenkova等發(fā)現(xiàn)人MSCs在體外同樣可抑制同種異體混合淋巴細(xì)胞反 應(yīng)。而Bartholomew等率先報道了靈長類動物的MSCs可抑制同種異體混合淋 巴細(xì)胞反應(yīng)，體內(nèi)注射供者來源的體外擴(kuò)增MSCs可延長同種異體移植皮膚的 壽命，顯示MSCs具有獨特的免疫學(xué)特性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑， 將該干細(xì)胞制劑應(yīng)用于骨髓移植后的病人，可降低急性移植物抗宿主病 (GVHD)的發(fā)生率，并且明顯降低其嚴(yán)重程度，從而為綜合解決造血千細(xì)胞移植后的問題提供了新的途徑。本發(fā)明所述的一種用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑，為間質(zhì)干 細(xì)胞與造血干細(xì)胞的聯(lián)合移植的干細(xì)胞制劑；所述的間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法是取同種異體健康骨髓，收獲單個核細(xì)胞 進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純 的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng) 樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳 代擴(kuò)增，移植前細(xì)胞活度檢測>95%;所述的造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案。所述的干細(xì)胞制劑經(jīng)靜脈輸入人體受體，間質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量為 0.5-1.5X10S細(xì)胞/Kg體重，造血干細(xì)胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。發(fā)明人是在參考造血干細(xì)胞移植劑量(CD34+細(xì)胞>3乂106/1^體重，單 個核細(xì)胞〉3X 1C)S/kg體重)的基礎(chǔ)上，確定上述間質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量，經(jīng)實 驗證明，輸入上述劑量的間質(zhì)干細(xì)胞后，受體無不良反應(yīng)，而且療效確切。本發(fā)明所述的另一種用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑，為間質(zhì) 干細(xì)胞與造血干細(xì)胞的聯(lián)合移植的干細(xì)胞制劑；所述的間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法是取同種異體健康骨髓，收獲單個核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，移植前細(xì)胞活度檢測>95%;所述的造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；所述的干細(xì)胞制劑經(jīng)靜脈輸入大鼠受體，間質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量為6X106個/只體重，造血干細(xì)胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。 關(guān)于間質(zhì)干細(xì)胞輸入大鼠的劑量是根據(jù)預(yù)實驗所得的。 應(yīng)用本發(fā)明所述的千細(xì)胞制劑，即間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞的聯(lián)合移植的干細(xì)胞制劑，可預(yù)防骨髓移植(BMT)后急性移植物抗宿主病(GVHD)的出 現(xiàn)，不僅明顯降低GVHD的發(fā)生率，而且一H出現(xiàn)GVHD時可明顯降低其嚴(yán) 重程度；同時可促進(jìn)造血重建和免疫重建，從而極大地提高造血干細(xì)胞移植的治療效果。


圖1為骨髓移植后各組大鼠的生存曲線(n=10)。圖中，A組單純骨髓 移植組；B組GVHD組；C組MSCs共移植組；D組單純照射組。圖2為移植后第18天GVHD組大鼠的照片，圖中顯示大鼠腹部明顯脫毛。圖3為MSCs共移植組大鼠(左側(cè))與GVHD組大鼠(右側(cè))的對照； 照片顯示，右側(cè)的GVHD組大鼠已發(fā)病，腹部見明顯脫毛，左側(cè)的MSCs共移 植組大鼠未見脫毛等發(fā)病表現(xiàn)。圖4為GVHD組大鼠的肝臟病理組織切片(x200)，肝臟見淋巴細(xì)胞浸潤 門管區(qū)，膽小管破壞。圖5為GVHD組大鼠的皮膚病理組織切片(x200)，皮膚病理改變包括基 底細(xì)胞空泡變性或壞死，表皮與真皮之間出現(xiàn)裂隙，表皮各層結(jié)構(gòu)紊亂，部分 區(qū)域表皮接近缺失，符合ni-IV度GVHD病變。圖6為MSCs共移植組大鼠的肝臟病理組織切片(x200),肝細(xì)胞濁腫， 匯管區(qū)少許淋巴細(xì)胞浸潤。圖7為MSCs共移植組大鼠的皮膚病理組織切片(x200)，皮膚結(jié)構(gòu)接近 正常。
具體實施方式
(一) 間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增移植前，取同種異體健康骨髓，收獲單個核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助MSC的 貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。通過形態(tài) 學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒 定，證實分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，備用。(二) 脾細(xì)胞懸液的制備取供體大鼠的脾臟，用剪刀剪成小塊后，在200目鋼絲網(wǎng)上用注射器針芯輕輕研磨，使其通過，形成脾細(xì)胞懸液。離心后去上清，Tris—NHCU溶液溶 解紅細(xì)胞后，用無血清RPM11640洗2次，臺盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和確定 細(xì)胞活力。制備后的脾細(xì)胞活力達(dá)98%以上。將脾細(xì)胞調(diào)成4X1011cells/L。(三)間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植實驗移植前處理造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；按步驟A備用的間質(zhì) 干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測>95%，在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞，同 時經(jīng)靜脈輸入受體。實驗動物分為單純骨髓移植組(A組)、GVHD組(B組)、造血干細(xì)胞 與間質(zhì)干細(xì)胞共移植組(C組)、單純照射組(D組)。GVHD組是在常規(guī)骨 髓移植的基礎(chǔ)上加入脾細(xì)胞，同時經(jīng)靜脈輸入受體，輸入劑量為1.2X10S個脾 細(xì)胞/只。MSCs共移植組是按步驟A備用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測>95%， 在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞和脾細(xì)胞，同時經(jīng)靜脈輸入受體，間 質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量為6X10S細(xì)胞/只，造血干細(xì)胞的的輸入劑量同常規(guī)骨髓移 植方案，脾細(xì)胞的輸入劑量為1.2乂108個/只。常規(guī)骨髓移植方案(1) 供者大鼠的骨髓細(xì)胞制備取6-8周齡Fischer344雄性大鼠，頸椎脫臼處死，放于75。/。酒精中浸泡5 分鐘，無菌狀態(tài)下取出雙側(cè)股骨和腓骨，用注射器吸取不含血清RPMI1604培 養(yǎng)基沖出骨髓腔中細(xì)胞，收集后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清，用 Tris-NH4CI溶解紅細(xì)胞2分鐘，離心去上清，用不含血清RPMM604培養(yǎng)基洗 2次后，用培養(yǎng)基重懸，臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞活力和數(shù)目，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1 X108/mL，細(xì)胞活力為99%以上。(2) 受者大鼠預(yù)處理受者大鼠為體重200g左右的雌性Wistar大鼠，移植前3天開始飲用含慶 大霉素(320mg/mL)和紅霉素(250mg/mL)的食水。移植當(dāng)天采用全身照射法進(jìn)行預(yù)處理。照射劑量為8.5Gy，劑量率為0.7Gy/min。 (3)骨髓移植經(jīng)預(yù)處理的受者鼠用0.2%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，在腹股溝處剪開皮 膚，暴露腹股溝靜脈，將細(xì)胞經(jīng)該靜脈輸進(jìn)受者體內(nèi)。輸注后壓迫止血，并縫 合皮膚。移植后的大鼠均飼養(yǎng)于無菌層流架內(nèi)進(jìn)行觀察。(四) 移植后各組GVHD發(fā)生情況的檢測1、 一般情況觀察2、 病理組織學(xué)觀察3、 各組GVHD發(fā)生時間的比較4、 各組存活時間的比較(五) 效果評價單純照射組(D組)10只大鼠在預(yù)處理后的第二周內(nèi)全部死亡(平均存 活時間為9.7±1.4天)，外周血白細(xì)胞數(shù)目平均為(3.07±0.97) X108/L，表 明預(yù)處理的照射劑量是致死性的，而且大鼠均死于造血衰竭。單純骨髓移植組(A組)10大鼠中，除在第30和45天有各有一只大鼠 不明原因死亡外，其余均在50天的觀察期內(nèi)存活，平均存活時間為47.5±6.3 天，該組大鼠未見典型GVHD的表現(xiàn)。GVHD組(B組)10只大鼠在移植后15天左右(15.6±1.5天)出現(xiàn)腹 瀉、脫毛和體重嚴(yán)重下降等急性GVHD的表現(xiàn)(見圖2與圖3)，并逐漸加重， 全部在30天左右死亡(平均存活時間為25.4±6.0天)，病理切片確認(rèn)為急性 GVHD (見圖4與圖5)。MSCs共移植組(C組)大鼠的急性GVHD發(fā)病時間推遲，平均為19.1 土1.7天(與GVHD組相比，P<0.05)(見圖1)，該組10只大鼠均發(fā)生急 性GVHD，但病理切片顯示程度較GVHD組輕(見圖6與圖7)，平均存活時 間為35.6±7.0天(與GVHD組相比，P<0.05)。各組動物的存活情況見圖1。 圖3為MSCs共移植組大鼠(左側(cè))與GVHD組大鼠(右側(cè))的對照照片。如圖所示移植后第18天，右側(cè)GVHD組大鼠已發(fā)病3天，腹部見明顯脫毛，左側(cè)MSCs 共移植大鼠未見脫毛等表現(xiàn)，該大鼠在過2天后即移植后第20天才發(fā)病。從圖1和圖3可以看出共移植組發(fā)病時間推遲，存活時間延長。并經(jīng)統(tǒng)計 學(xué)分析有統(tǒng)計學(xué)意義。從病理組織看，B組GVHD發(fā)病大鼠肝臟病理組織切片見圖4，肝臟見局 灶性壞死，淋巴細(xì)胞浸潤；而C組MSCs共移植組大鼠的肝臟病理組織切片 見圖6，肝細(xì)胞濁腫，匯管區(qū)少許淋巴細(xì)胞浸潤。B組GVHD發(fā)病大鼠皮膚病 理組織切片見圖5，皮膚病理改變包括基底細(xì)胞空泡變性或壞死，表皮與真皮 之間出現(xiàn)裂隙，表皮各層結(jié)構(gòu)紊亂，部分區(qū)域表皮接近缺失，符合III一IV度 GVHD病變。而C組MSCs共移植組大鼠的皮膚病理組織切片見圖7，皮膚結(jié) 構(gòu)接近正常。
權(quán)利要求
1. 一種用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑，其特征在于為間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞的聯(lián)合移植的干細(xì)胞制劑；所述的間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法是取同種異體健康骨髓，收獲單個核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，移植前細(xì)胞活度檢測＞95％；所述的造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；所述的干細(xì)胞制劑經(jīng)靜脈輸入人體受體，間質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量為0.5～1.5×106細(xì)胞/Kg體重，造血干細(xì)胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。
2、 一種用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的千細(xì)胞制劑，其特征在于為間 質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞的聯(lián)合移植的干細(xì)胞制劑；所述的間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法是取同種異體健康骨髓，收獲單個核細(xì)胞 進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純 的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng) 樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳 代擴(kuò)增，移植前細(xì)胞活度檢測>95%;所述的造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；所述的干細(xì)胞制劑經(jīng)靜脈輸入大鼠受體，間質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量為6X106 個/只，造血干細(xì)胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。
全文摘要
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑。本發(fā)明所述的用于預(yù)防急性移植物抗宿主病的干細(xì)胞制劑，為間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞的聯(lián)合移植的干細(xì)胞制劑；所述的干細(xì)胞制劑經(jīng)靜脈輸入人體受體，間質(zhì)干細(xì)胞的輸入劑量根據(jù)受體而調(diào)整，造血干細(xì)胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。將本發(fā)明所述的干細(xì)胞制劑應(yīng)用于骨髓移植后的病人，可降低急性移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率，并且明顯降低其嚴(yán)重程度，從而為綜合解決造血干細(xì)胞移植后的問題提供了新的途徑。
文檔編號A61L27/38GK101269237SQ200710027279
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日
發(fā)明者張金麗, 鵬 項 申請人:中山大學(xué)