專利名稱：利用抗cd20抗體治療移植物抗宿主疾病的制作方法
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及利用抗不存在于正常人T淋巴細胞上的外源表面抗原的抗體，制備治療移植物抗宿主疾病的組合物，用以治療接受了被該外源表面抗原轉導的T淋巴細胞的患者。
盡管利用目前的標準免疫篩選技術已能夠很容易地生產出大量的純化的供體T淋巴細胞，并通過其服用達到體內誘導GVL的效果，但目前仍缺乏適當?shù)募夹g，從藥學上誘導服用的T淋巴細胞的選擇性死亡，從而達到一旦臨床上不需要時能夠消除GVHD作用。
過去已生產出許多抗人表面分子的多克隆和單克隆抗體。在許多情況下，生產抗體的直接目的在于在體內殺死對那些用于免疫治療方案的分子呈陽性的細胞。例如，在B淋巴瘤領域已生產和鑒定出抗CD20、CD19、CD40、CD22、CD52、CD38分子及其它分子的有效抗體(P.S.Multani等，J.Clin.Oncol.，16，3691-3710，1998)。在某些情況下，抗這類分子的抗體顯示出體內細胞毒性作用，可能是因為他們象CD20、CD38和C廝2一樣，能夠激活靶細胞表面的補體系統(tǒng)。在其它一些情況下，是將抗體與放射活性分子結合以誘導靶輻解，就如同CD20、Lym-1等一樣。其它一些抗體則是與細菌或植物來源的毒素結合，用于同樣目的，就如同CD19、CD40和CD22一樣。還有一些抗體則被嵌合以獲得雙特異性，從而使兩種細胞充分接近。最后，還存在許多這些抗體的人工改造的和/或人源化的形式，它們的體內給藥既降低了抗原性危險，又增強了其效力。
發(fā)明詳述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過利用本發(fā)明的方法可有效地控制移植物抗宿主疾病問題，該方法包括將外源表面抗原引入供體的T淋巴細胞，然后給受體患者服用抗該外源抗原的抗體。
外源抗原意指不存在于正常T淋巴細胞上的任何表面抗原，如CD20、CD19、CD40、CD22、CD52等表達在B淋巴細胞表面的抗原。顯然，在與相應抗體反應后將對該抗體進行篩選，以便不在有組織地表達抗原的細胞群體水平上產生負面或不良效果。
尤其優(yōu)選的是人B淋巴細胞的CD20表面抗原，抗該抗原的人源化單克隆抗體可從市場上買到(Rituximab，Roche)，它用于治療非霍奇金B(yǎng)淋巴瘤(B non Hodgkin lymphomas)。
根據(jù)本發(fā)明，首先通過適當技術用選擇的抗原轉導供體T淋巴細胞，通過免疫親和方法使其富集后將其注射到受體。如果有移植物抗宿主疾病形成，則給患者服用抗該抗原的抗體，以便通過例如補體介導的細胞毒性機制體內滅活T淋巴細胞。
所用抗體優(yōu)選為單克隆抗體，更優(yōu)選人源化的單克隆抗體。其劑量和給藥途徑取決于多種因素，包括患者的整體健康狀態(tài)、體重、性別和年齡。一般地，該抗體通過靜脈內途經(jīng)給藥，其劑量范圍約為50-500mg/m2體表，每日1-3次，直至循環(huán)T淋巴細胞幾乎完全消失。
Rambaldi等人(Blood，91，2189-2196，1998)已描述過T淋巴細胞的分離。
用所需抗原轉導T淋巴細胞的方法是熟知的?？蓞⒁奦erma.I.M和Somia的綜述(Nature，389，239-242，1997)。具體地，可使用適宜的載體，包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、慢病毒(Lentiviruses)等。
這些載體中的每一種均包括許多不同的生物類型。對于逆轉錄病毒，其例子有兼嗜性載體、親嗜性載體和異嗜性載體。而且，多年來還使用了許多不同的包裝細胞系，以便優(yōu)化這類重組逆轉錄病毒的生產，并確保易于操作和生產者的安全(I.M.Verma等，Nature，389，239-242，1997；M.A.Kay等，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。
最近，通過與多聚陽離子或脂質體復合物結合、電穿孔、在鹽緩沖液中沉淀及其它技術，也已將裸DNA引入靶細胞中。
許多不同細胞類型已被定向遺傳轉移T和B淋巴細胞、未成熟造血前體、肌肉細胞、成纖維細胞、肝細胞和其它細胞類型(I.M.Verma等人，Nature，389，239-242，1997；M.A.kay等人，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。
對于CD20抗原，已使用了一種兼嗜性逆轉錄病毒。該病毒來源于莫洛尼鼠類白血病毒并被包裝在胚腎人細胞(293T)中，而該胚腎人細胞已經(jīng)過人工改造，含有分散在不同質粒中的逆轉錄病毒的結構單元(Human Gene Therapy，7，1405-1413，1996)。這類載體以及用外源抗原轉導的T淋巴細胞(尤其是CD20+T淋巴細胞)是本發(fā)明的目標之一。
經(jīng)過遺傳轉移之后，顯著表達外源基因的細胞僅占到總細胞群中的少部分。利用能夠給細胞帶來選擇性優(yōu)勢的外源基因，可對轉導細胞實施篩選。也可采用其它方法如用抗外源抗原的抗體進行FACS分類，篩選轉導細胞(K.Phillips等人，Nature Medicine，2，10，1154-1155，1996)。其它方法還包括用于篩選方法中的免疫親和層析柱或預吸附的培養(yǎng)板等。
圖2用CD20感染CEM細胞系及免疫篩選。
其中上圖A利用熒光對照IgG1抗體，通過細胞熒光測定儀分析病毒感染后的CEM細胞系。
中圖B利用熒光抗CD20抗體分析同樣的細胞群。
下圖C利用熒光抗CD20抗體分析經(jīng)親和柱免疫篩選后的同樣細胞群。
圖3用CD20病毒感染人新鮮T淋巴細胞上圖A感染后淋巴細胞用PEIgG2a和FITC IgG1對照抗體標記。
下圖B同樣細胞群用抗CD20 PE和抗CD3 FITC抗體標記。在所示情況下，23％的細胞為雙陽性。
下面的實施例用于進一步詳細說明本發(fā)明。
為了放大，在含2.5mM dNTP、500ng“有義”引物(CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC)、500ng“反義”引物(CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT)和5u pfu DNA聚合酶(購自Stratagene，La Jolla，CA，USA)的0.8μl溶液存在的情況下，將40ng質粒加至由10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/ml BSA組成的溶液中，至反應終體積100μl。按下述方案將反應在循環(huán)器中進行26次循環(huán)95℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃2分鐘。反應結束時，加入25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液100μl。萃取后，在乙醇存在下于20℃過夜沉淀DNA。離心后，將DNA重懸于100μl水中，然后按附帶在“pMOS平末端克隆盒“中的生產商指示將其亞克隆至PMOS載體(AmershamItalia，srl，Italy)。將所產生的重組質粒放大并測序，然后用BamHI消化。該酶的識別位點(G/GATCC)存在于兩種PCR引物的末端。因此，該片段被亞克隆在逆轉錄病毒載體PINCO VUOTO的BamH1位點。逆轉錄病毒載體PINCO VUOTO已通過下列方法預先獲得用RcoRI和NotI從質粒PINCO(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)中切除1441bp的片段，該片段含有CMV啟動子(巨細胞病毒)和EGFP(增強的綠色熒光蛋白)，切除EcoRI-Not I片段后用klenow片段鈍化末端并將質粒環(huán)化，所得質粒稱作PINCO VUOTO。該逆轉錄病毒載體的長度為11448bp。
PINCO VUOTO與CD20 cDNA間的重組體稱為LTR-CD20-LTR，對其測序以檢測CD20 cDNA的克隆及完整性以及第一個ATG上游終止密碼子的缺失(


圖1)。
因此，對于逆轉錄病毒部分，構建體LTR-CD20-LTR由得自莫洛尼鼠類白血病毒(MOMLV)的LTR、得自莫洛尼病毒的其它逆轉錄病毒序列、BamHI位點的CD20 cDNA以及附
圖1中詳細給出的第二個LTR組成。該質粒的其余部分相同個PINCO質粒(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)。如附圖所示，該質粒含有EB病毒的EBNA-1和Orip元件，復制起點(pUC)、氨芐青霉素抗性基因以及處于PGK-1啟動子控制下的嘌呤霉素抗性基因。
Phoenix-Ampho細胞得自人胚腎293細胞系，但經(jīng)過了如下改造首先用腺病毒的EIA基因對其進行轉染，然后再用兩個單獨的質粒對其進行轉染，該兩種質粒編碼位于羅氏肉瘤病毒啟動子控制之下的莫洛尼MLV的結構基因gag和pol，以及位于巨細胞病毒啟動子控制下的莫洛尼MLV的env基因。
于實驗前一天，將1.5×106細胞在直徑10cm的平皿中倒平板，其中含10ml DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Seromed，Berlin，Germany)，并添加了10％FCS(Hiclone Laboratories，Steril System，Logan，UK)，然后放置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中。實驗當天，加入16μl氯奎(原液25mM于PBS)，1分鐘后加入10μg質粒DNA溶液1ml。為獲得該DNA溶液，將500μl 2xHB5溶液(50mM HEPES，pH7.05，10mMkCl，12mMDextrose，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(FW141.96))加至一15ml圓形試管中，在第二個15ml圓形試管中制備含10μgDNA、61μlCaCl 2M和無菌水的溶液500μl。然后將該DNA混合物滴加至第一試管中，并將所得沉淀物加至細胞中。
8小時后用10ml新鮮DMEM置換培養(yǎng)基。
第二天，用添加了10％FCS的5ml新鮮RPMI1640培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基。
第三天，通過移出5ml含有在培養(yǎng)過程中釋放的逆轉錄病毒的培養(yǎng)基而感染。
然后將平板在室溫下以1800rpm離心45分鐘，除去上清液，用1ml添加了10％FCS的新鮮RPMI1640替換，接著再培養(yǎng)6小時。
培養(yǎng)結束時，利用前面制備的包裝細胞的不同平皿，第二次重復感染步驟。
將0.1×106細胞轉移至1.5ml Eppendorf管中，以4000rpm離心3分鐘后重懸于50μl熒光抗CD20 1F5抗體(Becton Dickinson)溶液中，并于4℃維持30分鐘。然后加入含0.9％NaCl、5％FCS、0.02％疊氮化鈉的溶液500μl。以4000rpm離心細胞5分鐘后，將樣品重懸于含1％甲醛的100μl PBS溶液中，于4℃放置，直到在熒光細胞計數(shù)儀上讀數(shù)。
在多次實驗中，該感染方法總是產生從30％到60％不同范圍的CEMCD20+細胞，而非感染的細胞系則對CD20表達呈完全陰性(如見附圖2，其中間圖中顯示CEM群體變?yōu)?0％CD20+)。
最后將細胞重懸于KPMI1640培養(yǎng)基中，并通過在SuperMACS系統(tǒng)(Milteny Biotech)中的XS+柱進行篩選。然后用添加了2.5％白蛋白生理溶液洗柱，從Super MACs中取出柱并洗滌，以回收陽性級分。
按照前面所述的免疫熒光方法進行細胞標記后，在細胞熒光測定儀上對陽性級分作進一步分析。
該方法結束時CD20+細胞的百分數(shù)始終在90％以上。如圖2中下圖所示，在通過免疫親和富集后CD20+陽性的CEM群體為98％。
最后將CEM CD20+細胞群懸浮并平展于添加10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期研究該細胞群中CD20標記物在表面的表達。結果顯示，標記物的穩(wěn)定性大于2個月，且90％以上的選擇細胞陽性。
第二天，加入人重組IL-2(Proleukin，ChironItalia，Milan，Italy)至終濃度100μ/ml。
第三天，經(jīng)洗滌和細胞計數(shù)后，于24孔平板中一個平底孔中的1ml培養(yǎng)基中感染1×106細胞。以1200rpm旋轉10分鐘后，去上清，并在Polybrene存在下用1ml過濾病毒置換，然后按前述方法于室溫下以1800rpm離心45分鐘。
最后，去除病毒上清液，用完全培養(yǎng)基替換，并保溫6小時。重復離心感染步驟后，在I1-2存在下將細胞重懸于完全培養(yǎng)基中，并于培養(yǎng)箱中過夜移置。
在隨后2天重復整個過程，最后在培養(yǎng)箱中將細胞于培養(yǎng)基中再保持兩天。
然后按前面所述同樣方法，用抗CD20 FITC、抗CD3PE、抗CD4 PE和抗CD8 FITC單克隆抗體(Becton Dickinson)標記細胞，并在細胞熒光測定儀上進行分析。
在正常供體上進行的多次實驗顯示，約5％-25％的CD3+T淋巴細胞在雙熒光分析中獲得了CD20標記。該實驗之一如圖3所示，在該具體實例中獲得了23％的CD3/CD20雙陽性。
或者，加入人AB血清至終濃度30％以作為補體來源。在連續(xù)攪拌下，將細胞于37℃恒溫水溶中放置1小時。向細胞懸液中加入等體積的1x吖啶橙的PBS溶液(原液100x溶液含30mg于100ml蒸餾水中)，然后通過細胞熒光測定儀評估細胞懸液活細胞發(fā)出綠色熒光，算出其占所分析的總細胞群的百分數(shù)。利用這一快速方法，通過比較雙陽性CD3/CD20細胞在各個研究細胞群中的百分比與加入Rituximab后死亡細胞的百分比，可評估Rituximab對CD20+細胞的致死效力。如下表所示，對照細胞群為單獨暴露于抗體或單獨暴露于補體的同樣細胞。表中數(shù)據(jù)表明，暴露于Rituximab 1小時誘導約90％CD3/CD20+細胞死亡。
表CD20轉導的新鮮人T淋巴細胞的補體依賴性細胞毒性具體裂解％％CD3/CD20+ Rituximab補體 Rituximab淋巴細胞 單獨單獨 +補體供體1 300 14 33供體2 230 11 35供體3 150 5 18經(jīng)吖啶染色后在FACS中測定裂解百分比。
權利要求
1.利用抗正常人T淋巴細胞中不存在的外源表面抗原的抗體制備組合物，用于對已接受了被該外源表面抗原轉導的T淋巴細胞的患者進行移植物抗宿主疾病的治療。
2.根據(jù)權利要求1的用途，其中使用抗CD20表面抗原的抗體和被CD20抗原轉導的淋巴細胞。
3.根據(jù)權利要求2的用途，其中抗CD20抗體為人源化的單克隆抗體。
4.一種載體，用于用外源表面抗原轉染人T淋巴細胞。
5.根據(jù)權利要求4的載體，其中包括編碼人CD20抗原的基因。
6.用外源表面抗原轉導的人T淋巴細胞。
7.根據(jù)權利要求6的T淋巴細胞，它被人CD20抗原轉導。
全文摘要
本發(fā)明描述了用抗不存在于正常人T淋巴細胞上的外源表面抗原的抗體制備組合物,用于對已接受了被該外源表面抗原轉導的T淋巴細胞的患者進行移植物抗宿主疾病的治療。
文檔編號C12N15/85GK1355712SQ00808833
公開日2002年6月26日 申請日期2000年6月7日 優(yōu)先權日1999年6月11日
發(fā)明者J·高雷, M·因特拿, A·倫巴迪, A·比翁迪 申請人:國家研究委員會