專利名稱：基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶 的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景核酸適配子是針對(duì)特定目標(biāo)分子通過(guò)體外篩選出來(lái)的功能化DNA或RNA片段，核酸適配子的目標(biāo)分子可以小到無(wú)機(jī)物、有機(jī)物， 大到蛋白質(zhì)、細(xì)胞(參考文獻(xiàn)Ellington, A. D.; Szostak，J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. iV她re 1990， 346, (6287)， 818-822; Tuerk， C.; Gold, L.， Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Sc/ewce 1990， 249， (4968), 505-510)。核酸適配子對(duì)其目 標(biāo)分子有高的親和力和特異的識(shí)別能力。相對(duì)于傳統(tǒng)的抗原/抗體間 的識(shí)別作用，核酸適配子作為識(shí)別元素有易于合成、穩(wěn)定性好、易于 化學(xué)修飾、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。因而，核酸適配子被研究人員用來(lái)測(cè) 定這類目標(biāo)分子。與測(cè)定方法比較，比色方法更為簡(jiǎn)單，無(wú)需使用特殊的儀器設(shè)備， 因而越來(lái)越受到研究人員的青睞。其中，用金納米粒子作為探針的比 色方法已被用于基于核酸適配子的比色測(cè)定中(參考文獻(xiàn)Liu, J. W.; Lu， Y" A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. 乂爿m. Ozew. Soc. 2003， 125, (22)， 6642-6643; Liu, J. W.; Lu， Y" Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general senwr design involving aptamers and nanoparticles.C//ew. /W. ￡d加06， 45, (1)， 90-94)。但這類比色方法大多較 為繁瑣，需要將巰基功能化的核酸適配子標(biāo)記在金納米表面，還需要 將此"核酸適配子/金納米"從未反應(yīng)的金納米或核酸適配子中分離出來(lái)。這些操作一方面更為復(fù)雜且花費(fèi)較大，另一方面核酸適配子在 金納米表面的修飾有可能影響其與目標(biāo)分子的親和力。為簡(jiǎn)化和提高 檢測(cè)效率，發(fā)展無(wú)標(biāo)記的金納米比色傳感器便顯得尤為重要。Rothberg研究小組近來(lái)發(fā)展了一種新型無(wú)標(biāo)記的標(biāo)記比色方法來(lái) 檢測(cè)DNA(參考文獻(xiàn)Li， H. X.; Rothberg, L.， Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. /Voc.胸/. JcW. 5W. 2004， 101, (39), 14036-14039; Li, H. X.; Rothberg, L. J.， Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by the polymerase chain reaction. / Jm. Chew. Soc, 2004， 126, (35)， 10958-10961)。他們的設(shè)計(jì)基于單雙 鏈DNA在金納米表面有著的不同吸附行為。發(fā)明內(nèi)容基于和Rothberg等人研究工作類似的原理，本發(fā)明提供了一種 基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的方法。本發(fā)明目的是提供基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定 凝血酶的方法。該方法可用于凝血酶的靈敏、特異性比色檢測(cè)，從 0.83納摩爾每升到167納摩爾每升濃度范圍內(nèi)對(duì)凝血酶檢測(cè)呈現(xiàn)好的 線性響應(yīng)，檢測(cè)限為0.83納摩爾每升。

圖1為利用金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的 示意圖。從圖1可知，未結(jié)合凝血酶的核酸適配子處于自由伸展?fàn)顟B(tài)， 此單鏈的核酸適配子能夠穩(wěn)定金納米保護(hù)其不被所加入的鹽聚集，此 時(shí)金納米為酒紅色；相反，結(jié)合凝血酶后的核酸適配子呈"四極子/ 雙螺旋"結(jié)構(gòu)，無(wú)法與金納米作用，故不能保護(hù)鹽誘導(dǎo)的金納米聚集， 此時(shí)金納米為天藍(lán)色。這樣，通過(guò)金納米顏色的變化，能夠?qū)崿F(xiàn)凝血 酶的檢測(cè)。利用金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的步驟如
下
U)用參考文獻(xiàn)方法合成13nm的金納米探針(參考文獻(xiàn):Gmbar， K. C.; Freeman, R. G.; Hommer， M. B.; Natan， M. J., Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. 4wa/. C7ze肌1995， 67， (4)， 735-743);
(2) 在含有140 mM的NaCl禾Q 5 mM的KC1的20 mM pH-7.5的三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖溶液中，配制4.59ioM的核酸 適配子溶液；此核酸適配子的序列為5' AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TG A CT 3 ，；
(3) 將13 nm的金納米探針溶液和4.59 (iM的核酸適配子溶液 混合；所述的13nm的金納米探針溶液4.59 的核酸適配子溶液 體積比為20: 3;
(4) 接著，將待測(cè)濃度的凝血酶加入至(3)的混合液中，反應(yīng) 5min;所述的凝血酶溶液13nm的金納米探針溶液4.59 的核
酸適配子溶液體積比為3: 20: 3;待測(cè)凝血酶的濃度范圍從0.83納 摩爾每升到167納摩爾每升；
(5) 向(4)中的反應(yīng)液中，加入0.5M氯化鈉溶液；加入氯化 鈉溶液后，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液 的顏色變化，完成基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血 酶的方法；所述的0.5M氯化鈉溶液13 nm的金納米探針溶液體積
比為1: 2。利用本發(fā)明的比色方法對(duì)凝血酶檢測(cè)的表征如圖2和圖3所示。 從圖2數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的方法對(duì)于凝血酶有很好的比
色響應(yīng)；通過(guò)金納米探針溶液的顏色變化，很容易用肉眼進(jìn)行凝血酵
的比色檢測(cè)。
從圖3數(shù)據(jù)可以看出，該方法對(duì)于凝血酶的檢出限為0.83納摩 爾每升，線性范圍是0483納摩爾每升到167納摩爾每升。
為考察利用金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶方
法的特異性，按歩驟如下進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)
(1) 參考文獻(xiàn)方法合成13nm的金納米探針(參考文獻(xiàn)Gmbar, K. C.; Freeman, R. G; Hommer， M. B.; Natan, M.丄，Preparation and Ch咖cterization of Au Colloid Monolayers. Jwa/. CTzem. 1995， 67, (4), 735-743);
(2) 在含有140 inMNaCl, 5 mM KC1和20 mM pH=7.5的三羥 甲基氨基屮烷-鹽酸緩沐溶液中，配制4.59 核酸適配子溶液；此 核酸適配子的序列為5 AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGACT3,;
(3) 將13 nm的金納米探針溶液和4.59 核酸適配子溶液混 合；所述的13nm的金納米探針溶液4.59 核酸適配子溶液體積 比為20: 3;
(4) 接著，將83.3納摩爾每升的牛血清白蛋白加入至(3)的 渴合液中，反應(yīng)5min，所述的牛血清白蛋白溶液13nm的金納米
探針溶液4.59:(iM核酸適配子溶液體積比為3: 20: 3;(5)向(4)中的反應(yīng)液中，加入0.5M氯化鈉溶液；加入氯化 鈉溶液后，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液 的顏色變化；所述的0.5M氯化鈉溶液13 nm的金納米探針溶液體 積比為1: 2。
利用本發(fā)明的比色方法對(duì)于凝血酶檢測(cè)的表征如圖2所示。 從圖2數(shù)據(jù)可以看出，牛血清白蛋白對(duì)該金納米比色方法沒(méi)有響 應(yīng)，這證明該方法對(duì)凝血酶的比色檢測(cè)有好的特異性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用無(wú)修飾的金納米探針，實(shí)現(xiàn)了基
于核酸適配子對(duì)凝血酶的簡(jiǎn)單靈敏的比色檢測(cè)。該方法具有如下優(yōu)
勢(shì)l)通過(guò)金納米探針顏色的變化，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)；2) 制備金納米探針?biāo)柙狭畠r(jià)易得；3)金納米探針無(wú)需進(jìn)行修飾， 這一方面省去了修飾和分離的操作，另一方面免修飾可以保持核酸適 配子的生物活性；4)利用核酸適配子作為識(shí)別元素，原則上可以推廣 到其它任何核酸適配子在結(jié)合目標(biāo)分子前后發(fā)生了構(gòu)象變化的"核酸 適配子-目標(biāo)分子"體系。 附圃說(shuō)明
圖1為利用金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的示 意圖。
圖2為利用金納米探針進(jìn)行蛋白質(zhì)比色測(cè)定的照片。向30 ^iL4.59 ^tM核酸適配子穩(wěn)定的200 pL 13 nm的金納米探針溶液中，加入待測(cè) 樣品后，再加入100pL0.5M的NaCl的比色結(jié)果，從左至右分別為 83.3nM凝血酶、83.3ftM牛血清白蛋白和水。圖3為30min內(nèi)，加入不同濃度凝血酶后，金納米探針溶液的吸 收比率(A620/A520)隨時(shí)間變化曲線(A); 30min時(shí)，吸收比率 (A620/A520)與凝血酶濃度的關(guān)系圖(B)。 (A)中，1到6號(hào)樣品 對(duì)應(yīng)凝血酶濃度依次為0納摩爾每升、0.833納摩爾每、8.33納摩爾 每升、83.3納摩爾每升和167納摩爾每升。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
利用金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的步驟如
下
(1) 參考文獻(xiàn)方法合成13nm的金納米探針(參考文獻(xiàn)Grabar， K. C.; Freeman, R. G; Hommer， M. B.; Natan, M. J., Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. Jwa/. C7z綴1995， 67, (4)， 735-743);
(2) 在含有140 mM NaCl， 5 mM KC1和20 mM pH=7.5的三羥 甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，配制4.59 核酸適配子溶液；此 核酸適配子的序列為5, AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGACT3，；
(3) 將200 13 nm的金納米探針溶液和30 4.59 |aM核酸 適配子溶液混合；
(4) 接著，將30tiL待測(cè)濃度的凝血酶加入至(3)的混合液中， 反應(yīng)5 nrin;待測(cè)凝血,的濃度依次為0納摩爾每升、0.833納摩爾每、 8.33納摩爾每升、83.3i納摩爾每升和167納摩爾每升；(5)向(4)中的反應(yīng)液中，加入100pL0.5M氯化鈉溶液；加入氯化鈉溶液后，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化。實(shí)施例2
為考察利用金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶方
法的特異性，按步驟如下進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)
(1) 參考文獻(xiàn)方法合成13nm的金納米探針(參考文獻(xiàn)Gmbar，K. C.; Freeman, R. G.; Hommer， M. B.; Natan， M. J., Preparation andCharacterization of Au Colloid Monolayers.爿wa/. CTie/w. 1995， 67， (4),735-743);
(2) 在含有140 mM NaCl， 5 mM KC1和20 mM pH-7.5的三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖溶液中，配制4.59 (_iM核酸適配子溶液；此核酸適配子的序列為5' AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGGTGACT3，；
(3) 將200 13 nm的金納米探針溶液和30 4.59 核酸適配子溶液混合；
(4) 接著，將30^iL濃度為83.3納摩爾每升的牛血清白蛋白加入至(3)的混合液中，反應(yīng)5min;
(5) 向(4)中的反應(yīng)液中，加入100^iL0.5M氯化鈉溶液；加入氯化鈉溶液后，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化。
從圖2數(shù)據(jù)可以看出，樣品有牛血清白蛋白時(shí)，金納米仍然為紅色，說(shuō)明牛血清白蛋白對(duì)該金納米比色方法沒(méi)有響應(yīng)，這證明該方法對(duì)凝血酶的比色檢測(cè)有好的特異性。
權(quán)利要求
1、基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的方法，其特征在于，步驟和條件如下(1)用參考文獻(xiàn)方法合成13nm的金納米探針(參考文獻(xiàn)Grabar，K，C.；Freeman，R.G.；Hommer，M.B.；Natan，M.J.，Preparation andCharacterization of Au Colloid Monolayers.Anal.Chem.1995，67，(4)，735-743)；(2)在含有140mM的NaCl和5mM的KCl的20mMpH＝7.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，配制4.59μM的核酸適配子溶液；此核酸適配子的序列為5’AGT CCG TGG TAG GGCAGG TTG GGG TGA CT 3’；(3)將13nm的金納米探針溶液和4.59μM的核酸適配子溶液混合；所述的13nm的金納米探針溶液4.59μM的核酸適配子溶液體積比為20∶3；(4)接著，將待測(cè)濃度的凝血酶加入至(3)的混合液中，反應(yīng)5min；所述的凝血酶溶液13nm的金納米探針溶液4.59μM的核酸適配子溶液體積比為3∶20∶3；待測(cè)凝血酶的濃度范圍從0.83納摩爾每升到167納摩爾每升；(5)向(4)中的反應(yīng)液中，加入0.5M氯化鈉溶液；加入氯化鈉溶液后，馬上測(cè)定反應(yīng)溶液的吸收光譜，或者直接用肉眼觀察溶液的顏色變化，完成基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的方法；所述的0.5M氯化鈉溶液13nm的金納米探針溶液體積比為1∶2。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于基于金納米探針和核酸適配子無(wú)標(biāo)記比色測(cè)定凝血酶的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。未結(jié)合凝血酶的核酸適配子處于自由伸展?fàn)顟B(tài)，此單鏈的核酸適配子能夠穩(wěn)定金納米保護(hù)其不被所加入的鹽聚集，此時(shí)金納米為酒紅色；相反，結(jié)合凝血酶后的核酸適配子呈“四極子/雙螺旋”結(jié)構(gòu)，無(wú)法與金納米作用，故不能保護(hù)鹽誘導(dǎo)的金納米聚集，此時(shí)金納米為天藍(lán)色。這樣，通過(guò)金納米顏色的變化，能夠?qū)崿F(xiàn)凝血酶的檢測(cè)。本發(fā)明方法對(duì)于凝血酶的檢出限為0.83納摩爾每升，線性范圍是0納摩爾每升到167納摩爾每升。此種比色方法檢測(cè)凝血酶，選擇性高、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需復(fù)雜儀器。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101672770SQ200810051068
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2008年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日
發(fā)明者敬 李, 李冰凌, 汪爾康, 董紹俊, 輝 魏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所