專利名稱：水貂IFN-γ基因的重組菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水貂IFN-Y基因的重組菌株。從分離的水貂外周 血淋巴細胞中(PBMC)擴增到y(tǒng)-干擾素基因，連接到pGM-T載體 上，構(gòu)建了 pT-MiIFN-y重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含水 貂IFN-y基因的重組菌株。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon, IFN)是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫 調(diào)節(jié)等活性的細胞因子。它是由脊椎動物的細胞產(chǎn)生的一類分泌型糖 蛋白，是發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的細胞因子。它具有廣譜抗病毒和增強 免疫應答的作用。能非特異性抑制多種病毒的增殖，在免疫應答調(diào)控 中處于中心地位。其抗病毒和抗腫瘤發(fā)生的特性使其具有用于免疫預 防和治療的潛力。
根據(jù)IFN的基因序列，染色體定位，受體特異性，分為三型，艮口I 型、II型、和m型干擾素，I型IFN主要有a、 J3兩個型，主要由淋巴細 胞和成纖維細胞產(chǎn)生；II型IFN為y-干擾素，主要由T細胞和NK細胞產(chǎn) 生。
與I型IFN相比，II型IFN有多種免疫學活性，具有促進MHCII類抗 原表達、增強APC細胞與T細胞的相互作用、增強輔助T細胞和細胞 毒性T細胞的產(chǎn)生等諸多免疫調(diào)節(jié)活性，既可以單獨作為生物制劑應用于疾病的治療，也可作為免疫佐劑增強疫苗的免疫效果。
Y-干擾素具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學活性，人Y-干 擾素在臨床疾病的防治中早有應用，動物Y-干擾素作為生物制劑或疫 苗佐劑也具有較好的應用前景，許多國家已經(jīng)將動物細胞因子的開發(fā) 利用作為研究重點。目前醫(yī)學上干擾素已經(jīng)廣泛用于病毒性疾病的治
療。研究發(fā)現(xiàn)IFN不僅能單獨作為生物制劑應用于一些疾病的防治，
而且可作為免疫佐劑，增強疫苗的免疫效果，還能與一些病源微生物 的保護性抗原基因共表達，從而增強和改善疫苗的免疫效果。
動物干擾素主要停留在基礎(chǔ)研究和臨床試驗階段。自1981年 VandenbroeckK等首次克隆了豬IFN-Y基因以來犬、牛、雞、鴨等動 物的干擾素基因也被相繼被克隆，并取得了一定進展，目前已有商品 化的豬、犬、雞等重組干擾素產(chǎn)品在市場上應用。但國內(nèi)外未見水貂 (Mink)的Y-干擾素基因克隆和相關(guān)制劑使用的報道。水貂(Martes， Mustelavison)在動物分類學上屬于哺乳綱，食肉目，鼬科，貂屬的 一種小型珍貴毛皮動物，在野生狀態(tài)下，有美洲水貂和歐洲水貂兩種， 我國現(xiàn)在人工飼養(yǎng)的水貂屬美洲水貂。2007年9月加拿大的Ochi,A.報 道了馴養(yǎng)的雪貂IFN-Y的基因序歹lJ。由于Y-干擾素具有種屬特異性，經(jīng) 比較發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的水貂IFN-Y與雪貂IFN-Y的基因序列個別位點 具有明顯差異。
水貂具有很重要的藥用與經(jīng)濟價值，其皮張與狐貍皮和波斯羔羊 毛命名為世界裘皮市場的三大支柱。目前我國養(yǎng)貂業(yè)發(fā)展較迅速，已 經(jīng)成為我國農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和增加農(nóng)民收入的重要產(chǎn)業(yè)。隨著該產(chǎn)業(yè)發(fā)展，細小病毒腸炎、犬瘟熱、阿留申等病毒性疾病嚴重危害水貂 養(yǎng)殖業(yè)的傳染病時常發(fā)生，造成嚴重經(jīng)濟損失，限制了水貂養(yǎng)殖業(yè)的 發(fā)展；由于這些病毒性傳染病發(fā)病死亡率高，普通藥物治療效果不理 想，因此研制和開發(fā)具有抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性的基因工程水貂 重組干擾素類生物制品,在水貂病毒性疾病防治上具有十分重要的意 義
發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的在于提供一種水貂IFN-Y基因的重組菌株，克服了 現(xiàn)有技術(shù)上的不足，從分離的水貂淋巴細胞中擴增出水貂y-干擾素基 因，并將其插入克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行單克隆篩選鑒定，獲 得含水貂，干擾素基因的重組子，為研制和開發(fā)具有抗病毒活性和免 疫調(diào)節(jié)活性的基因工程水貂重組干擾素類生物制品奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的水貂IFN-y基因的重組菌株， 其特征在于是從經(jīng)植物血凝素(pha)刺激的水貂外周血淋巴細胞 (PMBC)中克隆的水貂ifn，基因序列，它含有如下核苷酸序是一種含有核苷酸序列的重組質(zhì)粒載體；即使用了質(zhì)粒載體pGM-T， 由一種克隆載體在^boRV酶切為點處切開，再兩側(cè)的3'端加入"T"
而成；所述從水貂淋巴細胞中擴增的編碼y-干擾素的核苷酸序列進行 TA克隆，構(gòu)建含水貂y-干擾素的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。并將質(zhì)粒 載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，大腸桿菌宿主。
本發(fā)明的積極效果是為研制和開發(fā)具有抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié) 活性的基因工程水貂重組干擾素類生物制品奠定基礎(chǔ)。


圖l、水貂y-干擾素基因氨基酸序列
圖2、 RT-PCR產(chǎn)物鑒定RT-PCR擴增產(chǎn)物；1、水貂IFN-Y擴增 產(chǎn)物，2、陰性對照，3、 DNA分子量標準
圖3、 pT-MiIFN-y質(zhì)粒酶切鑒定￡coR I雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠 電泳鑒定；1、酶切產(chǎn)物，2， 3、 DNA分子量標準
圖4、 pT-MiIFN-y質(zhì)粒PCR鑒定；1、 DNA分子量標準，2， 3、 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，4、陰性對照
圖5、水貂y-干擾素基因測序圖譜
圖6、水貂與雪貂(登錄號EF492064)、犬(登錄號AF126247) 的IFN-y基因的氨基酸序列比較
具體實施例方式
1、材料與方法(1) 限制性內(nèi)切酶、Taq酶、DNA分子量標準均購自寶生物(大連) 有限公司。細菌培養(yǎng)酵母提取物、蛋白胨購自英國Oxford。無 機鹽世紀均為國產(chǎn)分析純。
(2) 菌種與質(zhì)粒，大腸桿菌DH5a為申請人保存。
質(zhì)粒的制備，感受態(tài)的制備，DNA的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選，限 制性內(nèi)切酶的水解等常見方法均參見(分子克隆)
2、鑒于水貂與犬在動物分類學上同屬關(guān)系和親緣關(guān)系較近的特 征，根據(jù)GenBank發(fā)表的犬科動物Y-干擾素基因序列，序列登錄號 為(NM001003174)，設(shè)計合成了一對特異引物，引物序列為
pl: ATGACCAGTAGATGCATC，
p2: TTCAGTTCTGGAGATAAT。
3、 無菌采取健康水貂外周血5mL，置于加有抗凝劑(38g/L檸檬酸 鈉)的滅菌容器中，然后在無菌條件下加入RPMI-1640培養(yǎng)液1: 1 稀釋；取5mL稀釋的外周血緩慢加入5mL人用淋巴細胞分離液上， 室溫下2 000r/min水平轉(zhuǎn)子離心40min;用折彎的滅菌長針頭小心將 白細胞層移于另一試管，加2倍體積的RPMI-1640液混勻后2 000r/min離心10min，去上清，沉淀物再加入等量RPMI-1640，相同 方法洗滌沉淀2次，去上清，沉淀細胞用含10 OOOU/mL雙抗、100mL/L 小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮；取lOiuL細胞懸液計數(shù)，按計數(shù) 結(jié)果將細胞懸液稀釋至lxl(^個/mL濃度，置于24孔細胞培養(yǎng)板中， 37°C， 5。/。C02培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h后，加入PHA誘導物培養(yǎng)24 h;
4、 用植物血凝素(PHA)誘導后外周血淋巴細胞總RNA的提取收集誘導24h后的淋巴細胞于15ml離心管，2 000r/min離心10min，棄 上清，將沉淀用lmlTRIzolReagent重懸后凍存于-70。C備用。取出裝 有淋巴細胞的凍存管，室溫自然融化后，加入l/5Trizol體積的的氯仿， 充分混勻后靜置3min， 12 000r/min離心10min，小心吸取上清，加入 1/2Trizol體積的異丙醇，充分混勻后放置于一2(TC沉淀lh， 12 000 r/min離心15min，將沉淀用75%的乙醇緩慢洗滌兩遍，倒置控干后用 9.5pl的lmL/L的DEPC處理的滅菌水溶解沉淀，即獲得淋巴細胞總 RNA。
5、水貂IFN-Y基因的擴增
采用RT-PCR方法擴增目的基因，具體操作如下
(1) 在9.5jli1的RNA溶液中加入1ili1 0ligo(dT)15引物(50pmol/jaL)， 混勻后置70。C水浴作用5min，立即冷卻，依次加入10 mmol/L dNTP 5pL， AMV Buffer 4jiL, RNase Inhibitor 0.5)iL， AMVljiL充分混勻， 42'C反應lh， 95°C 3min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，冷卻后直接用于下一步PCR 反應；
(2) PCR反應體系10x五xTaq Buffer 2.5[il， 2.5mmol/|J dNTP 2[il， 上、下游引物(25pmol/nD各l!il， TaqDNA聚合酶(2u/!iD 0.125^1， 加入滅菌去離子水至25ul;將25(al反應液混勻后，于PCR儀上進行擴 增，循環(huán)參數(shù)為95。C預變性5min; 94。C45s， 52.5。Clmin， 72。Clmin， 32個循環(huán)后，72。C延伸6min;擴增完畢后，取6^于1.5%瓊脂糖凝膠 電泳觀察結(jié)果；
(3) 用膠回收試劑盒回收與理論值大小相同的基因片段，構(gòu)建TA克隆，經(jīng)PCR及酶切鑒定后，初步鑒定為陽性的克隆送上海英駿生物技 術(shù)有限公司測序，應用DNAStar對測序結(jié)果進行分析。 6、水貂IFN-y基因序列分析
以PHA誘導培養(yǎng)水貂外周血淋巴細胞總RNA作為模板，經(jīng) RT-PCR獲得MiIFN-Y基因。取RT-PCR產(chǎn)物于1.5。/。 (m/v)瓊脂糖凝 膠上電泳，結(jié)果顯示，獲得的PCR擴增產(chǎn)物為501bp的基因片段，與 預期的目的基因片段大小相符；測序結(jié)果表明，克隆MiIFN-Y基因大 小為501bp，含有501bp的開放閱讀框，與GenBank上發(fā)表的雪貂 (EF492064)和犬(AF126247)的IFN-Y序列核苷酸同源性分別為 99.4%和93.8%，氨基酸同源性分別為98.2%和88%;由SignalP 3.0 Server和SIG-Pred軟件預測編碼的前20個氨基酸為信號肽。
序歹ij表
Mink (Mustela putorius fbro) IFN-y堿基序歹ll: 序列長度501bp
鏈 數(shù)雙鏈 序列種類DNA 起源生物水貂 序列特征
表示特征的記號CDS 存在位置1-501
決定特征的方法和鼬科及其它犬科動物對比 表示特征的記號信號多肽 存在位置1-60
決定特征的方法與雪貂和犬科比對 表示特征的記號寡肽 存在位置61-501GTGTGTTTCCCGGCCGCAGAGCATCGAAATAA Mink (Mustelaputoriusfuro) IFN誦y氨基酸序歹ij:
DLQVQRKAINELIKV畫DLSPRSNLRKRKRSHSVFPGRRASK.
權(quán)利要求
1、水貂IFN-γ基因的重組菌株，其特征在于是從經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激的水貂外周血淋巴細胞(PMBC)中克隆的水貂IFN-γ基因序列，它含有如下核苷酸序列ATGAATTATACAAACTATATCTTAGCTTTTCAGCTTTGCGTGATTTTCTGTTCTTCTGGCTATTACTGTCAGGCCATGTTTTTTAAAGAAATAGAAGACCTAAAGGAATATTTTAATGCAAGTAATCCAGATGTAGCAGATGGTGGGCCTCTTTTCTTAGATATTTTGAAGAACTGGAGAGAGGAGAGTGACAAAACAATCATTCAAAGCCAAATTGTCTCCTTCTACTTGAAACTGTTTGAAAACTTCAAAGATAACCAGATCATTCAAAGGAGCATGGATACCATCAAGGAAGACATGCTTGTCAGGTTCTTCAATAACAGCAGCAGTAAGCGGGAGGACTTCCTTAAGCTGATTCGAATTCCCGTGAATGATCTGCAGGTCCAGCGCAAAGCGATAAATGAACTCATCAAAGTGATGAATGATCTCTCACCAAGATCTAACCTAAGGAAGCGGAAAAGGAGTCACAGTGTGTTTCCCGGCCGCAGAGCATCGAAATAAGGCCGCAGAGCATCGAAATAA
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的水貂IFN-Y基因的重組菌株，其特征 在于所述的序列是含有核苷酸序列的重組質(zhì)粒載體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水貂IFN-Y基因的重組菌株，其特征 所述的重組質(zhì)粒載體，是使用了質(zhì)粒載體pGM-T，是由一種克隆載體 在5boR V酶切為點處切開，再兩側(cè)的3'端加入"T"而成；所述從 水貂淋巴細胞中擴增的編碼Y-干擾素的核苷酸序列進行TA克隆， 構(gòu)建含水貂Y-干擾素的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水貂IFN-y基因的重組菌株，其特征 在于所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的水貂IFN-Y基因的重組菌株，其特征在于所述的大腸桿菌為大腸桿菌宿主。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水貂IFN-γ基因的重組菌株，其特征在于是從經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激的水貂外周血淋巴細胞(PMBC)中克隆的水貂IFN-γ基因序列，是一種含有核苷酸序列的重組質(zhì)粒載體；即使用了質(zhì)粒載體pGM-T，由一種克隆載體在EcoR V酶切為點處切開，再兩側(cè)的3’端加入“T”而成；所述從水貂淋巴細胞中擴增的編碼γ-干擾素的核苷酸序列進行TA克隆，構(gòu)建含水貂γ-干擾素的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。并將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，大腸桿菌宿主。是為研制和開發(fā)具有抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性的基因工程水貂重組干擾素類生物制品奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/21GK101531986SQ20081005101
公開日2009年9月16日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者張海玲, 立 易, 柴秀麗, 王鳳雪, 羅國良, 趙春霏, 閆喜軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所