專利名稱：羊草Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運蛋白基因序列及其克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羊草(v4"ewra/epWMm c/ /脫rae)中Na"7H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因爿dVHA7的 克隆、重組及耐鹽性功能的分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。(二) 背景技術(shù)高濃度的鹽引起植物體內(nèi)的離子失衡和高滲脅迫，導(dǎo)致植物發(fā)育不良，生長緩慢特別 是降低農(nóng)作物產(chǎn)量。嚴(yán)重的鹽脅迫或滲透脅迫會引起植物體內(nèi)的第二脅迫——氧化脅迫的 發(fā)生，甚至導(dǎo)致植物死亡。因此，鹽脅迫受到人們的廣泛關(guān)注，提高作物的耐鹽性亦愈來 愈受到人們的重視。在高鹽下，植物通過產(chǎn)生脅迫蛋白和可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來減輕鹽脅 迫造成的毒害。早期的耐鹽基因工程主要集中在清除自由基和增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)兩個方 面，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力有所提高，但效果不太明顯。最近，定位在質(zhì)膜和液泡膜上的 Na+ZH+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因從許多植物中分離出來。研究結(jié)果表明質(zhì)膜上的Na+ZH+反向轉(zhuǎn)運 蛋白負(fù)責(zé)Na+的外排，從而保持植物細(xì)胞內(nèi)低Na+水平。而液泡膜上的Na+ZH+反向轉(zhuǎn)運蛋 白則負(fù)責(zé)Na"的液泡區(qū)域化，維持細(xì)胞內(nèi)的離子均衡。這大大促進了耐鹽基因工程方面的 研究工作并取得突破性進展。Blumwald等利用基因工程手段在番茄和油菜中過量表達Na+ 反向轉(zhuǎn)運蛋白基因，得到了世界上第一批真正意義上的耐鹽植株，參見于張虹霞等人于 2001年《自然生物技術(shù)》中的轉(zhuǎn)基因抗鹽番茄植株葉中積累鹽而果實中不積累鹽，19: 765-768 (Hong-Xia Zhang， Eduardo Blumwald， 2001, Nature biotechnology, 19:765-768)。(三) 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供羊草編碼液泡型Na7H+反向轉(zhuǎn)運蛋白的全長cDNA，并提供將該 基因?qū)胧荏w植物，獲得具有高耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植物。 技術(shù)方案1.從羊草中分離出編碼液泡型Na+AT反向轉(zhuǎn)運蛋白的全長cDNA: 從羊草葉片中提取總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)其它植物中的Na7H+反 向轉(zhuǎn)運蛋白中保守的氨基酸序列，設(shè)計兩條上游一條下游兼并引物正向引物l: 5'-tt(tc) aa(tc) gc(tc) gg(gt) U(tc) ca (ag) gt-3' 正向弓l物2: 5'-aca ga(tc) tc(tg) gt(tc) tgc ac (ct) tt-3' 反向弓l物5'-ga(tc) aa(ca) ggg aa(gt) ac(ga) aat gc-3'結(jié)果擴增到一個617bp的DNA片段。經(jīng)過3'和5'末端快速擴增獲得全長的cDNA 為2022bp，包括起始密碼子前的上游序列和多聚A尾巴。開放閱讀框部分為1611bp，由 此推得具537個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行比較，表明與 已發(fā)表的大麥(〃oi^/ei/z 7 raJgare)、長禾惠偃麥草(7Xi/ (9AK^〃/H e2o/ ga t〃/n)禾口小麥(7>i^'c"/z 的Na+Ai+反向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸同源性都為94%,表明經(jīng)過上述克隆步驟得到 了編碼^+/11+反向轉(zhuǎn)運蛋白的基因，該基因序列及其編碼的氨基酸序列如下 序列表(l)SEQ ID NO 1的信息(a) 序列特征*長度2022堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分乎類型cDNA(c) 假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源羊草(f) 序列描述SEQ IN NO. 1ATGGGGTTCGAAATAGTGACGGCGCAGCTGGCGCGGCTGAGCGGCGCGCTGGGCACCTCG——60 GGGCTGTGCACGGGCGTGGTGATCCTGCTGACCACCAAGGGGAAGAGCTCGCACGTGCTC---240 GTTGGGACGATGATTTCGTTTTTCACAATATCTCTTGCTGCCATTGCGATATTCAGCAAG—-420—600 —660 :---720 —780 —840 --900 :—-960 -1020GGCAAATCCATTGGAATAAGCTCAATTTTGCTAGGGTTGGTTCTGGTGGGAAGAGCTGCT--1080AGCTGGAGGCAGCAAGTCGTAATATGGTGGGCCGGGCTGATGAGAGGAGCTGTGTCGATT--1200 GCTCTTGCTTACAATAAGTTTACAAGATCTGGTCACACGCAGCTGCACGGCAACGCGATA--1260-1320 -1380 -1440 -1500CACTAC亇ACTGGCGCAAGTTTGACGACGCGCTGATGCGCCCGATGTTCGGTGGGCGCGGG--1560CGAAGAAACAACGCAGAAGCCATTACGGCTTCAGAAGGCACTTGAACCGTGACATGMGA--1680:--1740 -1800AACAGGAAGATGAACCCTAGTAACGGTGATGCGAGTATCATCGCCTTATAGGTTACGACG--1860-1920「--1980ATCCTGCCAAAAMAAAAMAAAAAAAAAMAMAAAAMAA--------------------2022(2) SEQINN0.2的信息 (a)序列特征*長度537氨基酸 *類型氨基酸 *鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型蛋白質(zhì) (C)序列描述FLGVFSGLLSAYIIKKLYIGRHSTDREVAL麗LMAYLSYMLAELLDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTVSSRVTTNVHVG-5372. 構(gòu)建具有上述基因序列的表達載體根據(jù)上述序列，設(shè)計構(gòu)建表達載體的引物正向引物5'—CGGTCTAGAATGGGGTTCGAAATAGTGAC—3' 反向引物5'-TATGAGCTCTCATCCCACGTGTACATTCG-3'以葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄的.cDNA為模板，進行PCR擴增出含全長編碼框的序列，先連 接到pMD18-T載體上，進行測序鑒定。然后用Zfel和5"a/1切下該片段，插入到表達載 體PBI121的35S啟動子的下游。3. 將構(gòu)建好的表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105.4轉(zhuǎn)化煙草NC89，在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選，將篩選出的抗性苗在100mM、 200mM和300mM氯化鈉的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明，與野生型'相比，含有本發(fā)明編碼 *+川+反向轉(zhuǎn)運蛋白的基因轉(zhuǎn)基因植株仍能正常生長，耐鹽性高達200mM，具較高的耐鹽 能力。5.轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感突變株RIOO(由Dr. Rajini Rao, Johns, Hopkins University, U.S.A.提供)在選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子在含400慮氯化鈉的選擇培養(yǎng)基上培 養(yǎng)。實驗結(jié)果表明」cAm7對酵母鹽敏感突變株有補償作用，轉(zhuǎn)力cAKW的酵母鹽敏感突變株的耐鹽能力大大增強。根據(jù)上述技術(shù)，從羊草中分離出編碼液泡型Na7H+反向轉(zhuǎn)運蛋白的基因」cyV"n，該基因過量表達能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草具較高的耐鹽性。將該基因與特異啟動子連接，對其表達 進行時空和脅迫誘導(dǎo)進行調(diào)控，將更具有針對性，具有非常重要的經(jīng)濟效益和社會效益.

圖1是野生型和轉(zhuǎn)JcMft7基因植株的光合速率的測定結(jié)果柱狀圖；橫坐標(biāo)表示NaCl濃度梯度，縱坐標(biāo)表示光合速率值；W代表野生型，T代表轉(zhuǎn)基因植株。圖2是野生型和轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量的測定結(jié)果柱狀圖；橫坐標(biāo)表示NaCl濃度梯度，縱坐標(biāo)表示葉綠素含量；W代表野生型，T代表轉(zhuǎn)基因植株。圖3是^^^7基因?qū)湍耕}敏感突變體的補償作用圖；橫坐標(biāo)表示NaCl濃度梯度，縱坐標(biāo)表示600nm處的光吸收值；control代表野生型酵母菌株K601 (由Dr. Rajini Rao,Johns Hopkins University, U.S.A.提供)，R100/pYES2代表轉(zhuǎn)pYES2 (空載體)的酵母菌株，R100/pYES2 AcNHXl代表轉(zhuǎn)^cMH7基因的酵母菌株。 具體實施方式
實施例l:羊草Na+ZH"反向轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆方法1. 總RNA的提取采用RNAeasy mini kit (promoga公司產(chǎn)品)提取總RNA。2. cDNA第一條鏈的合成取2微克總RNA,加入5x反應(yīng)緩沖液4 |il， 10mM脫氧核 糖核酸(dNTP) 2|_d，核糖核酸酶抑制劑(40-200u/nl) 0.5 |_U，引物T26(10 pmol/^l) 1 |_U，反轉(zhuǎn)錄酶(10u/|al) 2pl， 42。C反應(yīng)60分鐘，85°C IO分鐘終止反應(yīng)。3. PCR反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑與條件為首先將下列試劑混在一起10x反應(yīng)緩沖液 5lOmM脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1 ^正向引物(lOpM) 2 |al反向引物(10(M) 2|J模板cDNA 1 ^TaqDNA聚合酶 0.5^1總體積 50 ^PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，然后進入下列循環(huán)94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1.5分鐘，共30個循環(huán)，最后72。C延伸5分鐘。4.基因克隆取2|il PCR與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn) 品pMD18-T Vector system說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面 涂有5_溴—4—氯—3 —吲哚—(—d—半乳糖苷)和X—gal的含氨芐青霉素(100微克/毫 升)的lb平板上生長過夜。挑取白色菌落，在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。5. 質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。6. 序列測定本工作在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行。7.3'禾口5'序列的分離按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit說明書進行8.同源檢索禾i」用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進行比較。實施例2:.羊草Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因^4cA^X^^/if/定，本工作在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行。7. 3'禾口5'序列的分離按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit說明書進行羊草Na+7H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因JcAKX/及其編碼蛋白氨基酸序列如下 (l)SEQIDNOl的信息(a) 序列特征*長度2022堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型cDNA(c) 假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源:羊草(f) 序列描述SEQINNO.lATAATCAAGAAGTTATACATAGGAAGGCATTCTACTGACCGTGAGGTTGCACTTATGATG—-780 GTATTCTTCTGTGGTATTGTGATGTCACATTATACCTGGCATAACGTGACAGTGAGCTCA—-900GGCAAATCCATTGGAATAAGCTCAATTTTGCTAGGGTTGGTTCTGGTGGGAAGAGCTGCT—1080AGCTGGAGGCAGCAAGTCGTAATATGGTGGGCCGGGCTGATGAGAGGAGCTGTGTCGATT--1200 GCTCTTGCTTACAATAAGTTTACAAGATCTGGTCACACGCAGCTGCACGGCMCGCGATA--1260AAGCCTCTGATCCGGTTCCTGCTGCCCGCGTCGAGTGGCGCCACCTCGGAGCCCTCATCA--1380CTCCCCATCGTCAGGCCGTCCAGCCTCCGGATGCTCCTCACCAAGCCGACCCACACCGTC—1500 CACTACTACTGGCGCAAGTTTGACGACGCGCTGATGCGCCCGATGTTCGGTGGGCGCGGG—1560CGAAGAAACAACGCAGAAGCCATTACGGCTTCAGAAGGCACTTGAACCGTGACATGAAGA--1680'TAACTCAGAAGGCCGACGGCCCTCTGATGATGGTTCAGATGAACGGTTGGTTGCGGCACC—1800 AACAGGAAGATGMCCCTAGTAACGGTGATGCGAGTATCATCGCCTTATAGGTTACGACG--1860ATCCTGCCMAAAAAAAMAAAAAMAAAAAAAAMAAAAAA--------------------2022(2) SEQINN0.2的信息 (d)序列特征*長度537氨基酸 *類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(e) 分子類型蛋白質(zhì)(f) 序列描述FLGVFSGLLSAYIIKKLYIGRHSTDREVAL醒LMAYLSYMLAELLDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTVSSRVTTNVHVG—537實施例3:表達載體的構(gòu)建1.根據(jù)分離出的羊草Na+ZH+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因NHXl的核苷酸序列,設(shè)計引物 正向引物5'-CGGTCTAGMTGGGGTTCGMATAGTGAC-3' 反向引物5'陽TATGAGCTCTCATCCCACGTGTACATTCG-3' 以葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。2. 取2ialPCR與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pMD18-T Vector system說明書進行。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot菌株，在表面涂5-溴一4—氯一3 —吲 哚一p—D—半乳糖苷和X—gal的含氨芐青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生長過夜。 挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA,進行序列測定。3. 用^^I和& /I兩個限制性內(nèi)切酶將該基因從pMDl8-T載體上切下,與相同酶酶切的 PBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)胞，然后在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對 菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。4. 將構(gòu)建好的表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。 實施例4:基因耐鹽性分析1. 種植煙草NC89。2. 挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)。 '3. 3000rpm離心5分鐘，農(nóng)桿菌沉淀用10XMS培養(yǎng)基懸浮。4. 將煙草葉片切成小塊，放入上述懸浮液浸泡10分鐘。5. 侵染后的葉片切塊置于分化培養(yǎng)基(lxMS鹽，3。/。蔗糖，pH5.8,4.5g/L卡拉膠，)上共 培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(lxMS鹽，3。/。蔗糖，pH5.8,4.5g/L卡拉膠，卡那霉素100毫 克/升，頭孢青霉素250毫克/升)篩選，得到抗性植株。6. 將抗性植株移入花盆，每兩天澆含10mmolL"，100mmolL人200mmolL"和300 mmolL—i氯化鈉的l/2Hoagland營養(yǎng)液，20天后測定野生型和轉(zhuǎn)基因植株的光合速率和葉綠 素含量。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株具有較高的耐鹽性，耐鹽性可達200mM。該基 因可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化,提高植物的耐鹽能力。實施例5:羊草Na7H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因^cMZW對酵母鹽敏感突變株的補償作用1. 將克隆到的全長cDNA亞克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建成pMD18-T-AcNHXl 。2. 將pMD18-T-AcNHXl和酵母表達載體pYES2經(jīng)^a/z^/和歷'/2t////酶切，回收目的條 帶，在連接酶作用下，構(gòu)建成pYES2-GhNHXl表達載體。3. 挑取YPD平板上的酵母菌株K601(野生型)和R100(鹽敏感突變株)單菌落與5mlYPD 培養(yǎng)液中，30。C振蕩培養(yǎng)過夜，再稀釋10倍，振蕩培養(yǎng)6小時，3000rpm離心5分鐘收 集菌體，用1.5mlTE重懸菌體。4. 分別取O. lml上述菌液、3pig pYES2-AcNHXl質(zhì)粒和O. 6mlTE-liOAC-PEG溶液于一 L5ml離心管中，30。C振蕩培養(yǎng)30分鐘，42。C熱激15分鐘，3000rpm離心20秒收集菌體， 重懸于0.5ml重蒸水中，取200nl涂布于選擇培養(yǎng)基上，30。C培養(yǎng)2-4天。5. 轉(zhuǎn)化子接種到選擇培養(yǎng)液中，30。C振蕩培養(yǎng)48小時，測定600nm處的光吸收。 實驗結(jié)果表明將該基因轉(zhuǎn)入鹽敏感酵母突變株RIOO，能在一定程度上恢復(fù)其抗鹽能力。
權(quán)利要求
1. 一個克隆的羊草Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因，其特征在于它具有如下所示的核苷酸序列ATGGGGTTCGAAATAGTGACGGCGCAGCTGGCGCGGCTGAGCGGCGCGCTGGGCACCTCG----60GACCACGCGTCCGTGGTCTCCATCAACCTCTTCGTGGCGCTGCTCTGCGCCTGCATCGTC---120CTCGGCCACCTCCTCGAGGAGAACCGCTGGCTCAACGAGTCCATCACCGCCCTCATCATC---180GGGCTGTGCACGGGCGTGGTGATCCTGCTGACCACCAAGGGGAAGAGCTCGCACGTGCTC---240GTCTTCAGCGAGGACCTCTTCTTCATATACCTCCTCCCTCCCATCATCTTCAACGCCGGT---300TTCCAGGTGAAGAAGAAGCAGTTCTTCCGGAATTTCATGACAATCACACTATTTGGTGCT---360GTTGGGACGATGATTTCGTTTTTCACAATATCTCTTGCTGCCATTGCGATATTCAGCAAG---420ATGAACATTGGGACACTGGACGTATCAGATTTTCTTGCAATTGGAGCTATCTTTTCCGCG---480ACAGATTCCGTCTGCACTTTACAGGTTCTGAATCAGGATGAGACGCCCTTTTTGTACAGT---540CTAGTTTTCGGGGAAGGTGTTGTGAACGACGCCACATCAGTCGCGCTTTTCAACGCGCTC---600CAGAACCTTGATCCTAACCACATCGACGCAATCGTCATTCTCAAGTTCTTGGGGAATTTC---660TGCTACTTATTCGTGTCAAGCACCTTCCTTGGAGTGTTTTCTGGATTGCTCAGTGCATAC---720ATAATCAAGAAGTTATACATAGGAAGGCATTCTACTGACCGTGAGGTTGCACTTATGATG---780CTCATGGCCTACCTCTCATATATGCTAGCTGAGCTGCTTGATTTGAGTGGCATCCTCACT---840GTATTCTTCTGTGGTATTGTGATGTCACATTATACCTGGCATAACGTGACAGTGAGCTCA---900AGAGTTACAACAAAGCATGCGTTCGCAACCTTGTCCTTCATCGCTGAGACTTTTCTCTTC---960CTTTATGTTGGGATGGATGCACTGGATATTGAGAAATGGAAATTTGCTAGTGACAGCCCT--1020GGCAAATCCATTGGAATAAGCTCAATTTTGCTAGGGTTGGTTCTGGTGGGAAGAGCTGCT--1080TTTGTCTTCCCGCTCTCATTCTTGTCCAACTTAACAAAGAAGACGGCTCTCGAGAAAATA--1140AGCTGGAGGCAGCAAGTCGTAATATGGTGGGCCGGGCTGATGAGAGGAGCTGTGTCGATT--1200GCTCTTGCTTACAATAAGTTTACAAGATCTGGTCACACGCAGCTGCACGGCAACGCGATA--1260ATGATCACCAGCACCATCACTGTCGTTCTGTTTAGCACCATGCTGTTTGGCATATTGACA--1320AAGCCTCTGATCCGGTTCCTGCTGCCCGCGTCGAGTGGCGCCACCTCGGAGCCCTCATCA--1380CCGAAGTCCCTGCACTCTCCTCTCCTCACAAGCATGCTAGGCTCGGACCTGGAGCCGGCT--1440CTCCCCATCGTCAGGCCGTCCAGCCTCCGGATGCTCCTCACCAAGCCGACCCACACCGTC--1500CACTACTACTGGCGCAAGTTTGACGACGCGCTGATGCGCCCGATGTTCGGTGGGCGCGGG--1560TTCGTGCCCTACTCCCCAGGATCACCCACCGATCCGAATGTACACGTGGGATGAACGTCG--1620CGAAGAAACAACGCAGAAGCCATTACGGCTTCAGAAGGCACTTGAACCGTGACATGAAGA--1680GAAGGAATCACTACAGCTTCAGAAGAAGGCAAAGTTTCCGGTAATATTATAGTGTTTGGC--1740TAACTCAGAAGGCCGACGGCCCTCTGATGATGGTTCAGATGAACGGTTGGTTGCGGCACC--1800AACAGGAAGATGAACCCTAGTAACGGTGATGCGAGTATCATCGCCTTATAGGTTACGACG--1860AGCCTGTACATTTTTGTATGTAGATTAACAAGCCATTGTATCCTATGAGATCTCCGCTAG--1920CAGGCAGGTGTCTGACCTCCTGCGTCTACCCTTACTTAATCTCCTAATGGATTGGTGTGT--1980ATCCTGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------2022
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于該基因編碼如下所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì):SSLRMLLTKPTHTVHYYWRKFDMLMRPMFGGRGFVPYSPGSPTDPNVHVG-537
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因的應(yīng)用，其特征在于該基因在植物中表達，能有效地提高植物的 耐鹽性。4根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因的應(yīng)用，其特征在于該基因在煙草中表達，能有效地提高煙草的 耐鹽性。5根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因的應(yīng)用，其特征在于該基因在酵母菌鹽敏感突變株R100中表達， 能在一定程度上恢復(fù)其抗鹽能力。
全文摘要
本發(fā)明公開了羊草Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運蛋白的基因序列及其克隆和應(yīng)用。屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。根據(jù)其它植物中發(fā)表的Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列，設(shè)計引物，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從羊草中首次分離出編碼液泡型Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運蛋白的基因。將該基因轉(zhuǎn)入鹽敏感酵母突變體，能在一定程度上恢復(fù)其抗鹽能力。進一步構(gòu)建正義表達載體，轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株具有較高的耐鹽性，耐鹽性可達200mM。該基因可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物的耐鹽能力。
文檔編號C12N15/10GK101260404SQ200810050629
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者李校堃, 李海燕, 源 江, 鑫 王, 越 許, 嘉 郭, 峰 魏 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)