專利名稱：一種聚己內(nèi)酯降解菌株及其選育方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物材料及其選育方法，具體涉及可降解PCL (聚己內(nèi)酯)的菌株以及該菌 株的選育方法。
背景技術：
PCL (聚己內(nèi)酯)作為一種新型的可生物降解高分子材料具有廣泛的應用前景。具有很 好的柔韌性和加工性，同時這種材料具有很好的生物相容性。這種特點， 一方面使其具有形 狀記憶性，具有初始形狀的制品，經(jīng)形變固定后，通過加熱等外部條件刺激手段的處理，又 可使其恢復初始形狀的現(xiàn)象。另一方面，該材料與淀粉等物質(zhì)共混，可制得完全生物降解材 料。目前，PCL作為一種新型的可生物降解高分子材料，在醫(yī)學、藥物、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領域 具有廣泛的應用前景。國外均已有工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，在許多國家都建立了 PCL的研發(fā)公司，如 美國的U.C.C、 Solvay公司，日本的夕^七^化學工業(yè)，意大利的Novamont公司等。而且近 年來已經(jīng)將許多的研究成果應用于實際中，如意大利Novamont公司研發(fā)的PCL生物降解塑料 (Mater-Bi) —次性餐飲具，曾成功用于2000年澳大利亞悉尼奧運會上，用后其廢棄物連同 生物垃圾進行堆肥化處理，較好地解決了一次性餐飲具廢棄物再資源化的問題，為實現(xiàn)綠色 奧運貢獻了力量；又如日本已在北海道、關東、九州等地區(qū)進行PCL生物降解地膜的覆蓋試 驗；北美、歐洲、日本均在積極進行研究開發(fā)PCL用于漁業(yè)材料?；赑CL本身諸多的優(yōu)點， 進入20世紀90年代以來我國加大了對PCL的研發(fā)，并將PCL (聚已內(nèi)酯)研究列入地方"九 五"重點科技攻關計劃。本項研究的目的是研究PCL降解菌株降解PCL的特性和降解規(guī)律， 探討PCL解聚酶的生化特性及其降解過程和酶作用的機理，為PCL的應用奠定理論和實踐基 礎，從自然界中篩選出可降解PCL的菌株。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可降解PCL(聚己內(nèi)酯)的菌株及其選育方法。 本發(fā)明從化工廠污水處理車間采集活性污泥，并以PCL作為唯一碳源篩選到具有PCL降 解菌株。對該菌株進行紫外誘變處理，獲得具有降解PCL能力的變異菌株YD0401-Ae。 PCL可被本發(fā)明的菌株產(chǎn)生的PCL解聚酶水解而發(fā)生降解，產(chǎn)物為e-羥基己酸。將從化工廠污水處理車間采集的活性污泥放入分離液體培養(yǎng)基(組分為PCL 0.15%， MgS047H20 0. 05%， NH4C12 0.1%， CaCl2.2H20 0.0005%， KH2P04 0.554%, Na2HP04.12H20 1.194%, pH6.8)中，置恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)，直至渾濁的培養(yǎng)液變得澄清為止。取一定量的培養(yǎng)液， 采用平板稀釋涂布法進行分離。選菌落周圍有明顯透明圈的菌落進一步純化。將選擇到的具有降解PCL能力的菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基(組分為PCL 0.15%， MgS04.7H20 0. 05%， NH4C12 0.1%， CaCl2'2H20 0.0005%， KH2P04 0 . 5 54%, Na2HP0412H20 1.194%， 瓊脂2%， pH 6.8，)上，培養(yǎng)至出現(xiàn)大量分生孢子。以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩使分生孢子分散。顯微 鏡檢査，使孢子濃度為1(Tl()7個/ml。滅菌平皿中裝入適量分生孢子懸液，在磁力攪拌下用紫外燈照射，處理后的懸液在無菌 室紅燈照射下適當稀釋。取上述懸液涂布于固體平板培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)，選取單菌落，點植法培養(yǎng)，觀察并定期 測量菌落周圍水解透明圈的大小。初步篩選水解透明圈較大的菌株。根據(jù)初篩結果，從固體平板培養(yǎng)基平皿中挑取需要的單菌落接入固體斜面培養(yǎng)基，待長 滿后接入液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，通過檢測發(fā)酵液中PCL解聚酶的活力進一步篩選獲得青 霉(尸e/H'c!77i"瓜 sp) 菌株。選育獲得的菌株的菌落培養(yǎng)初期顏色為灰白色，漸變灰綠色，最后為墨綠色，且中間夾 有橙色(或黃色)。其氣生菌絲為絮狀，營養(yǎng)菌絲為無色；菌絲有橫隔膜，分生孢子梗頂端有 不對稱帚狀分枝，帝狀枝結構由簡單到復雜，作兩次對稱二輪或不對稱(三次)分枝。分生 孢子為橢圓形。具體分生孢子梗的帚狀分枝和分生孢子形態(tài)見圖1。采用紫外誘變篩選到的青霉(尸e/7i'c^h'"瓜sp) YD0401-Ae具有很強的PCL降解能力。 菌株在液體培養(yǎng)基中，28。C搖瓶培養(yǎng)120 h，其PCL解聚酶的酶活力可達12~13 U/ml。對 YD0401-Ae菌株的PCL降解產(chǎn)物迸行質(zhì)譜分析，結果如圖2所示。在圖中出現(xiàn)的明顯的分子 量為133的質(zhì)譜峰，對應的是PCL單體，即羥基己酸。說明青霉(戶ew'w77i"瓜sp) YD0401-Ae對PCL的產(chǎn)物為羥基己酸，菌株可應用于PCL材質(zhì)的塑料制品的生物降解。


圖1為菌株的帚狀枝及分生孢子圖2應用菌株對PCL降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析圖本發(fā)明的可降解PCL微生物是屬于青霉屬(尸e/^'cj7力'i/瓜)的菌種，青霉(尸e/^'cWh'"瓜 sp) YD0401-Ae，已于2008年1月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地 址北京朝陽區(qū)大屯路)保藏，保藏號為CGMCC No. 2344。
具體實施方式
篩選和培養(yǎng)PCL降解菌株的液體培養(yǎng)基組分為PCL 0. 15%，MgS04 7H20 0. 05%，NH4C12 0. 1%， CaCl2.2H20 0 . 00 05%, KH2P04 0.554%， Na2HP04'12H20 1.194%， pH 6.8。固體培養(yǎng)基組分還需添 加2%的瓊脂。菌株的菌落培養(yǎng)初期顏色為灰白色，漸變灰綠色，最后為墨綠色，且中間夾有橙色(或 黃色)。其氣生菌絲為絮狀，營養(yǎng)菌絲為無色；菌絲有橫隔膜，分生孢子梗頂端有不對稱帚狀 分枝，帚狀枝結構由簡單到復雜，作兩次對稱二輪或不對稱(三次)分枝。分生孢子為橢圓 形。具體分生孢子梗的帚狀分枝和分生孢子形態(tài)見圖1。將從化工廠污水處理車間采集活性污泥放入上述分離液體培養(yǎng)基中，置恒溫搖床(28°C， 110r/min)中振蕩培養(yǎng)，直至渾濁的培養(yǎng)液變得澄清為止。取一定量的培養(yǎng)液，采用平板稀 釋涂布法進行分離。選菌落周圍有明顯透明圈的菌落進一步純化。將選擇到的具有降解PCL能力的菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)6天至出現(xiàn)大 量分生孢子。以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，28。C振蕩15min，使分生孢 子分散。顯微鏡檢査，使孢子濃度為1(Tl()7個/ml。滅菌平皿中裝有5ml分生孢子懸液，在磁力攪拌下用紫外燈(30W，照射距離10cm)照 射，照射時間為2(T80s，處理后的懸液在無菌室紅燈照射下適當稀釋。取上述懸液O. lml涂布于固體平板培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)3天，選取單菌落，點植法培養(yǎng)， 觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小。初步篩選合適菌株。根據(jù)初篩結果，從固體平板培養(yǎng)基平皿中挑取需要的單菌落接入固體斜面培養(yǎng)基，待長 滿后接入液體培養(yǎng)基中，28'C搖瓶培養(yǎng)120 h，檢測發(fā)酵液中PCL解聚酶的活力。PCL解聚酶酶活的測定(比濁法)將PCL粉末溶于氯仿中，所得溶液與十二烷基磺酸鈉溶液混合，混合液經(jīng)超聲波處理 5min，制得PCL乳化液，75。C加熱90min除去氯仿，得到PCL乳化液。以PCL懸浮液為底物用分光光度法測定PCL解聚酶的活力，取3ml PCL乳化液置于40°C 的恒溫水浴中，待平衡后加入粗酶液lml，反應30min后，于650nm波長下測其吸光值。l個 酶活單位定義為每分鐘引起光吸收率降低0.001 (A650nm)單位所需的酶量。
權利要求
1、一種聚己內(nèi)酯降解菌株的選育方法，其特征是將采集的活性污泥放入組分為PCL0.15％，MgSO4·7H2O 0.05％，NH4Cl2 0.1％，CaCl2·2H2O 0.0005％，KH2PO4 0.554％，Na2HPO4·12H2O1.194％，pH 6.8分離液體培養(yǎng)基中，置恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)，直至渾濁的培養(yǎng)液變得澄清為止，取一定量的培養(yǎng)液，采用平板稀釋涂布法進行分離，選菌落周圍有明顯透明圈的菌落進一步純化；將選擇到的具有降解聚己內(nèi)酯能力的菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，該固體斜面培養(yǎng)基組分為PCL 0.15％，MgSO4·7H2O 0.05％，NH4Cl2 0.1％，CaCl2·2H2O 0.0005％，KH2PO4 0.554％，Na2HPO4·12H2O 1.194％，瓊脂2％，pH 6.8，培養(yǎng)至出現(xiàn)大量分生孢子；以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，使分生孢子分散，顯微鏡檢查，使孢子濃度為106~107個/ml；滅菌平皿中裝有分生孢子懸液，在磁力攪拌下用紫外燈照射，處理后的懸液在無菌室紅燈照射下適當稀釋；取上述懸液涂布于固體平板培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)，選取單菌落，點植法培養(yǎng)，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小，初步篩選水解透明圈較大的菌株；根據(jù)初篩結果，從固體平板培養(yǎng)基平皿中挑取需要的單菌落接入同上固體斜面培養(yǎng)基，待長滿后接入同上液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，通過檢測發(fā)酵液中PCL解聚酶的活力進一步篩選。
2.按照權利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯降解菌株的選育方法，其特征是將采集的活 性污泥放入組分為PCL 0.15%， MgS04 7H20 0. 05%， NH4C12 0.1%， CaCl2.2H20 0.0005%， KH2P04 0.554%， Na2HP0412H20 1.194%， pH 6.8的分離液體培養(yǎng)基中，置恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)，直 至渾濁的培養(yǎng)液變得澄清為止，取一定量的培養(yǎng)液，采用平板稀釋涂布法進行分離，選菌落 周圍有明顯透明圈的菌落進一步純化；將選擇到的具有降解PCL能力的菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，固體斜面培養(yǎng)基組分 為PCL 0. 15%, MgS047H20 0. 05%， NH4C12 0. 1%， CaCl2 2H20 0. 0005%， KH2P04 0, 554%， Na2HP04.12H20 1.194%， pH 6.8，另添加2%的瓊脂，28。C培養(yǎng)6天至出現(xiàn)大量分生孢子；以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，28。C振蕩15min，使分生孢 子分散，顯微鏡檢査，使孢子濃度為106 107個>1;滅菌平皿中裝有5ml分生孢子懸液，在磁力攪拌下用30W紫外燈，照射距離10cm照射， 照射時間為2(T80s，處理后的懸液在無菌室紅燈照射下適當稀釋；取上述懸液0. lml涂布于固體平板培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)3天，選取單菌落，點植法培養(yǎng)， 觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小，初步篩選合適菌株；根據(jù)初篩結果，從固體平板培養(yǎng)基平皿中挑取需要的單菌落接入同上固體斜面培養(yǎng)基， 待長滿后接入同上液體培養(yǎng)基中，28'C搖瓶培養(yǎng)120 h。
3、按權利要求1、 2所述的選育方法選育的聚己內(nèi)酯降解菌株，該菌株為青霉 (尸朋ici^力孤sp) YD0401-Ae，己于2008年1月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心保藏，地址北京朝陽區(qū)大屯路，保藏號為CGMCC No. 2344。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物材料及其選育方法，具體涉及可降解PCL(聚己內(nèi)酯)的菌株以及該株的選育方法本發(fā)明將從化工廠污水中采集的活性污泥放入分離液體培養(yǎng)基中，置恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)、采用平板稀釋涂布法進行分離、將選擇到的具有降解PCL能力的菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)、水沖洗、磁力攪拌下用紫外燈照射、懸液涂布于固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)等步驟，選育到的青霉(Penicillium.sp)YD0401-Ae具有很強的PCL降解能力，其PCL解聚酶的酶活力可達12~13U/ml。可應用于PCL材質(zhì)的塑料制品的生物降解。
文檔編號C12Q1/02GK101245364SQ200810050489
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月11日 優(yōu)先權日2008年3月11日
發(fā)明者丹 于, 巖 王, 王戰(zhàn)勇, 珊 陳 申請人:東北師范大學