專利名稱：：免疫富集絲檢測細(xì)菌的方法及免疫富集刷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，具體的說是免疫富集絲檢測細(xì)菌的方法及免疫富集刷。技術(shù)背景在我國加入WTO的今天，各種商品的流通范圍越來越大，速度加快，各種食品、畜產(chǎn)品、衛(wèi)生用品等商品的檢驗(yàn)，尤其是關(guān)系到人類到生命健康及動(dòng)物安全的致病性細(xì)菌的檢驗(yàn)，如沙門氏菌、志賀氏菌、出血性大腸桿菌0-157、李斯特氏菌、空腸彎曲菌等的檢驗(yàn)要求也進(jìn)一步提高；這些項(xiàng)目的檢測是我們檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)的主要工作內(nèi)容，是國內(nèi)市場及進(jìn)出境把關(guān)的主要任務(wù)和目的，因其關(guān)系到人類及動(dòng)物的衛(wèi)生健康安全，成為食品檢疫的必檢項(xiàng)目。用于從食品中分離致病性細(xì)菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是不相同的。至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，致病性細(xì)菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾致病性細(xì)菌的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的致病細(xì)菌受到了尚不致命的損傷或稱"致傷"。這就形成了一個(gè)具有不同生長特性的細(xì)菌群。這種現(xiàn)象對那些希望從食物樣品中分離出致病性細(xì)菌的食品分析來說有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)"致傷，，的致病性細(xì)菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。這些方法本身證明是可靠的，基于上述原因，我國的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，無論是GB標(biāo)準(zhǔn)還是SN標(biāo)準(zhǔn)，都采用比較傳統(tǒng)的做法，每個(gè)項(xiàng)目總體可分4個(gè)不同階段或步驟1、都要將樣品加到一種高營養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中，前增菌(4-6小時(shí))；2、選擇適合檢測目的菌生長，又能使樣品中其他微生數(shù)量減少的培養(yǎng)基，進(jìn)行選擇性增菌(24-48小時(shí))；3、選擇性培養(yǎng)物在瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)，然后對平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)(24-48小時(shí))——挑選特征菌落進(jìn)行純培養(yǎng)(24小時(shí))，4、生化培養(yǎng)鑒定(24小時(shí))和血清鑒定。做出以陽性或未檢出報(bào)告結(jié)果。整個(gè)過程大約七天。這種方法經(jīng)過幾十年的應(yīng)用，證明比較可靠，但檢驗(yàn)操作繁瑣、檢驗(yàn)周期長。選擇性增菌的時(shí)間大約24小時(shí)——48小時(shí)，占到檢驗(yàn)流程的三分之一時(shí)段，不但費(fèi)時(shí)而且浪費(fèi)人力物力，不適應(yīng)現(xiàn)在檢樣數(shù)量大，檢驗(yàn)出具報(bào)告快速、樣品結(jié)果重復(fù)性高的要求。目前國內(nèi)外應(yīng)用免疫學(xué)方法的實(shí)驗(yàn)所用固相載體多為各種材質(zhì)的微珠，比如金膠體、乳膠體、磁性珠等，還有常用的綿羊紅血球等微顆粒固相載體，抗體所反應(yīng)的目的抗原也多為病毒或其他小分子可溶性抗原及半抗原(如藥物、激素等)，出現(xiàn)沉淀凝集反應(yīng)，微載體需要反應(yīng)后，通過磁場或離心沉淀，再從樣品中分離出來，進(jìn)行示蹤檢查或微流控儀器檢查，這些方法不適用于要培養(yǎng)微生物活菌，進(jìn)行分離鑒定無菌操作的要求；微顆粒固相載體越來越小有的甚至達(dá)到納米級，成本也隨之增高，并且需要特別的造價(jià)昂貴儀器設(shè)備。用免疫學(xué)技術(shù)對很多病毒的檢測，或各種可溶性抗原進(jìn)行檢測，在酶標(biāo)ELISA試劑盒的研制與開發(fā),在國際有許多大公司開發(fā)了大量產(chǎn)品，技術(shù)成熟、得到了廣泛的應(yīng)用,不但快速敏感,而且價(jià)廉，容易操作，機(jī)器數(shù)據(jù)讀取,結(jié)果客觀重復(fù)性高，適應(yīng)大批量快速檢測的需求,而對微生物的免疫學(xué)方法檢測現(xiàn)在所研究的多是針對其核酸檢測,因?yàn)槲⑸镌诩庸ぶ袦鐨r(shí)，其基因仍殘存，而我們要求看有無具繁殖能力的活菌存在，活菌和死菌難以區(qū)分，影響報(bào)告結(jié)果。因此核酸檢測要靠核酸量大祛除非特異性，量大只能是在菌分離培養(yǎng)之后，所以免疫學(xué)方法的應(yīng)用，基本局限在最后的鑒定時(shí)用，及部分代替生化實(shí)驗(yàn)，往往還需要價(jià)格昂貴的儀器，不適合在食品衛(wèi)生檢測中大規(guī)模推廣和應(yīng)用。另外，用單一免疫方法檢測致病細(xì)菌，由于細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其抗原較多，同屬細(xì)菌中有致病菌也有非致病菌，如A族鏈球菌為致病菌，而糞鏈球菌一般不致病，此外，不同細(xì)菌之間，細(xì)菌與宿主之間也可能存在共同抗原，故實(shí)際所開展的研究方面很少根據(jù)抗原檢測判斷致病細(xì)菌。現(xiàn)在有免疫磁珠法包現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)雖然比較可靠，但是樣品前增菌過程，細(xì)菌只是恢復(fù)或修復(fù)損傷，也有細(xì)菌數(shù)不增或者下降的。選擇增菌時(shí)以雞肉檢驗(yàn)沙門氏菌為例是取十倍稀釋液前增菌再十倍稀釋選擇性增菌，也就是說25克樣品要有25個(gè)細(xì)菌以上才有可能檢出，從另一方面講細(xì)菌經(jīng)選擇性增菌會(huì)繁殖大約N/100x220-Nx24G，相當(dāng)于Nxl()5—1012，而這些菌分布在100ML或250ML之內(nèi)，即Nxl03—101()/ML分離培養(yǎng)量沙門氏菌是用10uL,相當(dāng)于1ML的1(T2，目的菌大約NxlO—108,而這些菌數(shù)是理論上的數(shù)字，由于微生物繁殖到一定數(shù)量，其代謝產(chǎn)物就會(huì)阻止繁殖，營養(yǎng)消耗殆盡引起細(xì)菌死亡，而使菌數(shù)繁殖進(jìn)入平臺期，尤其是在樣品為多相菌液時(shí)，會(huì)各種菌爭奪營養(yǎng)，或代謝產(chǎn)物拮抗作用，目的菌繁殖代數(shù)會(huì)更少一些。3M試劑3MPetrifilmTMPlates微生物快速檢測法，通過了許多國際相關(guān)組織和機(jī)構(gòu)的認(rèn)證認(rèn)可，比如AFNOR-France、AOAC、Canada,是直接對樣品進(jìn)行呈色計(jì)數(shù)培養(yǎng)，也可以進(jìn)行進(jìn)一步的分離鑒定，是目前檢測培養(yǎng)微生物最快捷的方法，比較常見的致病微生物項(xiàng)目基本都有培養(yǎng)基試紙片，這種方法對固體樣品的檢出線在10個(gè)菌以上/克，而現(xiàn)在國標(biāo)行標(biāo)MPN法的檢出線是30個(gè)/每100克，這種檢出差距在30多倍，而且這種3M試劑的菌檢有苛刻的菌量限量要求，在雜菌多或菌量大時(shí)，培養(yǎng)的菌落容易融合一片，看不出結(jié)果，對下一步的分離鑒定都有影響，其檢測成本也較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，引進(jìn)免疫學(xué)方法來代替標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的選擇性增菌的過程，減少檢驗(yàn)環(huán)節(jié)，縮短現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的流程，而提供免疫富集絲^f企測細(xì)菌的方法。具體操作步驟如下A、按現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)采樣，需要前增菌的進(jìn)行前增菌；B、將富集絲直接或間接包被針對要檢測的特定細(xì)菌的單克隆或多克隆抗體，制成免疫富集絲，免疫富集絲放入待檢樣品中0.5-1小時(shí)富集^r測目的細(xì)菌，將免疫富集絲取出后，用滅菌生理鹽水進(jìn)行洗滌，機(jī)械卸載細(xì)菌到適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基平板上，分離培養(yǎng)24士3小時(shí)，或直接放到適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基平板上分離培養(yǎng)24士3小時(shí)，其間培養(yǎng)到4-6小時(shí)時(shí)，棄掉免疫富集絲；所述的富集絲選自聚乙烯絲、尼龍絲、錦綸絲中的一種；C、挑選典型菌落，以下按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)繼續(xù)操作，報(bào)告檢出或未檢出。在做組織樣品檢測時(shí)，采用三層拍打袋，中間有一層濾網(wǎng)，組織放在濾網(wǎng)一側(cè)，免疫富集絲放在另一側(cè)富集細(xì)菌。本發(fā)明又一目的是提供免疫富集刷，它包括刷柄和刷頭，刷頭是由刷板和刷毛組成，刷毛植在刷板上，刷柄和刷板可拆裝，與富集絲同樣材料制成，刷毛是所述的免疫富集絲。所述的免疫富刷的刷板長為15mm，刷毛為單排。所述的刷毛在包被抗體前，為0.1-0.2毫米直徑的白色透明原絲，刷毛端部經(jīng)過磨細(xì)打毛。所述的免疫富集刷的刷板或刷毛帶有代表包被不同抗體的標(biāo)記。所述的免疫富集刷，還包括一個(gè)刷架，刷架中間有一刷架孔，刷架柄通過刷架孔與刷架連接，刷架上帶有2-6個(gè)刷頭，刷架柄、刷架、刷頭三部件，可以自由組裝和拆卸。本發(fā)明又一目的是提供免疫富集網(wǎng)，它是由所述的免疫富集絲制成的網(wǎng)。所述免疫富集網(wǎng)為圓形，網(wǎng)隔為3-5mm,直徑小于所使用平皿直徑6-10mm,有彈性框架。聚乙烯、聚丙稀和尼龍材料，有著良好的吸附抗體IgG的作用，使用時(shí)，先將刷頭包被抗體，刷板插入刷架槽內(nèi)，把刷架放入樣品中富集細(xì)菌，然后刷柄插入刷架孔與刷架固定，拿出后，用生理鹽水洗滌，去掉非特異性吸咐，手握刷柄，刷毛在選擇平板上劃線；長1.5厘米的單排聚乙烯或尼龍材料的刷毛，可以方便的進(jìn)行活化和抗體包被處理，刷架、刷柄為聚丙稀材料，有與刷架連接的刷柄，這兩種部件無生物活性作用，可以方便的進(jìn)行煮沸消毒，組裝成方便適用的免疫富集刷，免疫富集刷有毛針結(jié)構(gòu)，毛端經(jīng)過磨細(xì)打毛，纖維的表面有些細(xì)微的粗糙，有利于吸附作用，也使毛在瓊脂上的硬度和接觸角度更為適宜；免疫富集刷的作用和操作如同細(xì)菌分離常規(guī)使用的白金爾，使目的菌在培養(yǎng)基上分離和增殖形成典型菌落；視情況菌量少劃全板；菌量多時(shí)劃部分板，再用白金爾從富集刷劃過的區(qū)域打到清凈區(qū)域，以獲得好的單個(gè)菌落；免疫富集刷的刷板或刷毛帶有代表包被不同抗體的標(biāo)記，可以同時(shí)檢測不同細(xì)菌。在做組織樣品檢測時(shí)，采用三層拍打袋，中間有一層濾網(wǎng)，組織放在濾網(wǎng)一側(cè)，富集絲放在另一側(cè)富集細(xì)菌，防止肌肉組織纖維纏繞在免疫富集絲上。免疫富集網(wǎng)也是由聚乙烯或尼龍材料絲做成的孔徑適宜的方格網(wǎng)，由彈性良好的框架固定，在前期的準(zhǔn)備和操作中免疫富集網(wǎng)可以折疊，體積減小，方便包被抗體清洗等各項(xiàng)操作，對樣品細(xì)菌富集反應(yīng)清洗后，直接放分離瓊脂上，打開折疊，框架支撐使每個(gè)網(wǎng)線均勻分布和緊貼在分離瓊脂上，富集的菌在接觸培養(yǎng)基后，繁殖定植后(4-6小時(shí))，取下免疫富集網(wǎng)，菌落的培養(yǎng)形態(tài)和特征不會(huì)受到影響，達(dá)到分離目的菌的目的。本發(fā)明免疫富集絲檢測細(xì)菌的方法，適用于所有要求檢測沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特氏菌、大腸桿菌0-157等各種致病微生物檢驗(yàn)的樣品，其原理是采用抗原抗體在電解質(zhì)溶液中能夠特異性結(jié)合的性質(zhì)，用聚苯乙烯絲或其他不帶表面電荷的有相對彈性的固相載體(免疫分離介質(zhì))分別包被需檢測的項(xiàng)目高效價(jià)抗體，制成免疫富集絲，直接放入到檢驗(yàn)制備的樣品中或經(jīng)復(fù)蘇的樣液中，經(jīng)過短時(shí)間的醉育，捕捉相對應(yīng)的病原微生物(靶抗原)，經(jīng)過生理鹽水洗去非特異性吸附，然后機(jī)械卸載或直接進(jìn)行分離培養(yǎng)，抗原抗體復(fù)合物對微生物的正常生長沒有影響，免疫富集絲富集目的菌，代替了部分前增菌和選擇性增菌，省去選擇增菌，縮短了檢測時(shí)間，達(dá)到了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的效果，對于某些種細(xì)菌來說優(yōu)于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)；是對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的改良；使用免疫富集刷、免疫富集網(wǎng)操作更方便、效果更佳。圖1為本發(fā)明免疫富集刷刷頭的結(jié)構(gòu)示意圖圖2為本發(fā)明免疫富集刷各組件的裝配圖圖3為本發(fā)明免疫富集刷的結(jié)構(gòu)示意4為本發(fā)明免疫富集刷法和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測沙門氏菌的流程5為本發(fā)明免疫富集網(wǎng)放在平皿上的結(jié)構(gòu)示意圖其中1、為免疫富集絲2、為彈性框架3、平皿具體實(shí)施方式實(shí)施例l免疫富集刷請參見圖1、圖2、圖3，免疫富集刷包括刷柄4、刷架3、刷毛l和刷板2組成的刷頭，刷架上帶有刷架孔31和3個(gè)刷架槽32，刷板2插入刷架槽32中，刷柄4的一端41插入刷架孔31中。使用時(shí)，先將刷頭包被抗體，刷板2插入刷架槽32內(nèi)，把刷架3放入樣品中富集細(xì)菌，然后刷柄4插入刷架孔31與刷架3固定，用生理鹽水洗滌刷架3、刷板2及刷毛1，手握刷柄4，刷毛l在選擇平板上劃線。實(shí)施例2免疫富集刷和免疫富集網(wǎng)抗體包被將免疫富集刷和免疫富集網(wǎng)，用100ml0.04mol/LpH8.6的巴比妥緩沖液內(nèi)加0.2%雞蛋清，浸泡，4。C過夜，倒去液體PBS清洗3次,控干；或用用O.lmol/LPH9.6碳酸鹽緩沖液配置濃度為2Q/。的戊二醛,加入戊二醛浸泡4。C過夜，倒去液體PBS清洗3次，控干；取預(yù)處理后的富集刷和富集網(wǎng)，浸泡于提純的免疫球蛋白IgG溶液中，該溶液用0.05mol/LpH4.8檸檬酸緩沖液稀釋成需要的2mg/ml濃度，4"C冰箱過夜,第二天甩去液體，PBS清洗3次，然后加2%甘油作為保護(hù)劑浸泡，控干，自然干燥。實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)方法和免疫富集刷法及免疫富集網(wǎng)檢測沙門氏菌的對比試驗(yàn)，請參見附圖5。實(shí)驗(yàn)室收到具有代表性的，而且運(yùn)輸或儲存過程中沒有損壞或改變的凍雞肉，同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)方法和免疫富集刷法及免疫富集網(wǎng)法進(jìn)行沙門氏菌^r測1、國標(biāo)檢測肉食品中樣品的檢測標(biāo)準(zhǔn)方法A、制備測試樣品進(jìn)行非選擇增菌將用無菌的剪子、鑷子，以無菌方法取多點(diǎn)交叉位的瘦肉25g(確保樣品的代表性)十225mlBPW，拍打袋進(jìn)行拍打30秒，置37。C水浴中將原始懸浮液于37士rC培養(yǎng)18士2h。進(jìn)行前增菌，確保瀕于死亡的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)活；B、選擇增菌將上述的非選擇增菌培養(yǎng)物0.1ml接種到10mlRVS肉湯的試管中；另取lml接種到10mlMKTTn肉湯試管中。接種到RVS肉湯的試管于41.5士1。C培養(yǎng)24土3h;接種到MKTTn肉湯試管于37士rC培養(yǎng)24士3h。進(jìn)行選擇性增菌，使目的菌優(yōu)勝出來；C、劃線與鑒定將培養(yǎng)后的增菌培養(yǎng)物搖勻，在超凈工作臺中，以無菌方法分別取3mm接種環(huán)一環(huán)，分別劃線于表面無凝結(jié)水的第一種選擇性平板XLD和第二種選擇性平板DHL平板，以獲得好的單個(gè)菌落。倒置平板，使底部位于上面，于37。C培養(yǎng)24土3h進(jìn)行分離培養(yǎng)，用選擇性的平板，使目的菌分離出來，(如果沒有可疑菌，可繼續(xù)培養(yǎng)24士2h)確定平板上典型的沙門氏菌菌落或可能的非典型沙門氏菌菌落，在平板的底部標(biāo)示它們的位置；D、確認(rèn)實(shí)驗(yàn)在每種選擇性平板中各選取2-3個(gè)典型菌落，如果選擇性平板中為陰性，則要選擇4個(gè)以上的菌落來進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，接種于TSI、賴氨酸脫羧酶瓊脂或尿素酶瓊脂上，于37士rC培養(yǎng)24士3h，記錄高層和斜面的顏色、培養(yǎng)基變黑、有氣泡或培養(yǎng)基開裂顯示產(chǎn)氣以及斜面上劃線處的菌落生長；檢查直立培養(yǎng)的TSI和U瓊脂；丟棄或重新劃線分離任何最初培養(yǎng)時(shí)生長過于密集的試管，丟棄所有在U瓊脂斜面上顯紅色的試管，分離顯示典型沙門氏菌反應(yīng)的菌林，分離沙門氏菌反應(yīng)不典型的菌林，需要結(jié)合生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。2、免疫富集刷法A、將用無菌的剪子、鑷子，以無菌方法取多點(diǎn)交叉位的瘦肉25g(確保樣品的代表性)+225r^BPW，放中間帶濾網(wǎng)的三層拍打袋進(jìn)行拍打30秒，置37。C水浴中將原始懸浮液于37士rC培養(yǎng)4h，進(jìn)行前增菌；然后將免疫富集刷放到三層拍打袋樣品的另一邊，感做45分鐘；B、將免疫富集刷取出用滅菌生理鹽水進(jìn)行洗滌，富集刷分別劃線于表面無凝結(jié)水的第一種選擇性平板XLD和第二種選擇性平板DHL平板，視情況劃全板(菌量少)或部分板(菌量多時(shí)用白金爾從富集刷劃過的區(qū)域打到清凈區(qū)域，以獲得好的單個(gè)菌落)，于37。C培養(yǎng)24士3h;確定平板上典型的沙門氏菌菌落或可能的非典型沙門氏菌菌落，在平板的底部標(biāo)示它們的位置C、和標(biāo)準(zhǔn)方法相同方法做確認(rèn)性試驗(yàn)。3、免疫富集網(wǎng)法A、將用無菌的剪子、鑷子，以無菌方法取多點(diǎn)交叉位的瘦肉25g(確保樣品的代表性)十225m舊PW,放中間帶濾網(wǎng)的三層拍打袋進(jìn)行拍打30秒，置37。C水浴中將原始懸浮液于37士l。C培養(yǎng)4h;進(jìn)行前增菌；然后將富集網(wǎng)放到三層拍打袋樣品的另一邊，感做45分鐘；B、將免疫富集網(wǎng)取出用滅菌生理鹽水進(jìn)行洗滌，免疫富集網(wǎng)分別放置于表面無凝結(jié)水的第一種選擇性平板XLD和第二種選擇性平板DHL平板，使底部位于上面，于37。C培養(yǎng)4士2h進(jìn)行分離培養(yǎng)，棄取免疫富集網(wǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至24士3h，使目的菌分離出來，確定平板上典型的沙門氏菌菌落或可能的非典型沙門氏菌菌落，在平板的底部標(biāo)示它們的位置；C、和標(biāo)準(zhǔn)方法相同方法做確認(rèn)性試驗(yàn)共檢測200例，檢出陽性5例，三種方法結(jié)果相同。免疫富集刷法及免疫富集網(wǎng);f企測沙門氏菌比標(biāo)準(zhǔn)方法節(jié)省時(shí)間40小時(shí)。實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)方法、3M試劑3MPetrifilmTMPlates微生物快速檢測法、和富集法進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定實(shí)驗(yàn)比較。結(jié)果如下表對食品肉制品等固體樣品金黃色葡萄球菌檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例5:對檢測添加菌的最低檢出線敏感性實(shí)驗(yàn)將埃希氏大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌抹放到生理鹽水中，250毫升加一白金爾，菌量計(jì)數(shù)后稀釋到10tfU/m1,菌液作10倍遞減稀釋至1(T5,每個(gè)稀釋度用免疫富集刷和富集網(wǎng)進(jìn)行捕獲，分離培養(yǎng)，計(jì)算檢出率，并與標(biāo)準(zhǔn)方法和3MpetrifilmTMpiates微生物快速檢測法分離作比較，大腸菌群行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)MPN方法的檢出線為固體樣品100gZ30CfU，液體樣品100mlZ3Cfb,富集刷和富集網(wǎng)檢出無顯著差異，均在10Cfb/ml以上時(shí)能100%檢出，菌液檢出的狀況詳見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3MpetrifilmTMPlates微生物快速檢測法、富集法與標(biāo)準(zhǔn)方法檢出的差別很大，在用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測時(shí)，由于有雙料培養(yǎng)基，可以取10倍量樣品，所以檢出差別如此，這是由于單純標(biāo)準(zhǔn)菌液無干擾，無瀕死或損傷菌，檢測液稀釋和取樣不均衡造成的差別，富集刷和富集網(wǎng)無明顯差別，略優(yōu)于3MpetrifilmTMpiates微生物快速檢測法。我們在做檢樣標(biāo)陽對照時(shí)，用225毫升稀釋液加入一白金爾標(biāo)陽菌抹相當(dāng)于5微升，100%可檢出，我們用富集刷法100%可檢出，在225毫升加入1微升添加時(shí)亦可100%檢出。標(biāo)準(zhǔn)方法的前增菌時(shí)間為幾小時(shí)到拾幾小時(shí)，然后是選擇性增菌24-48小時(shí)，而用富集刷法，刷在多相襝，樣液體內(nèi)孵育和富集，可以相應(yīng)縮短部分前增菌時(shí)間，富集刷在分離平板上進(jìn)行涂抹，視樣品狀況涂抹平板的面積l/2—全部，比如如果樣品潛在目的菌少-全涂，目的菌多則少面積涂，然后用白金爾劃線平板的其余部分，比標(biāo)準(zhǔn)方法的節(jié)省30-50多個(gè)小時(shí)。實(shí)施例6:從混合菌液中分離細(xì)菌利用沙門氏菌培養(yǎng)基分離培養(yǎng)沙門氏菌，利用PB瓊脂平板分離培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，從制備的分別含有104CFU/ML沙門氏菌和金黃色葡萄球菌混合菌液，菌液作IO倍遞減稀釋至10"，每個(gè)稀釋度用免疫富集刷進(jìn)行捕獲，分離培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算檢出率。項(xiàng)|^\_10JCfu/ml10'Cfu/ml10'Cfu/ml10"Cfu/ml10-lCfu/ml金黃色葡萄球*集刷7/77/77/73/70/7沙門氏菌富集刷7/77/72/70/70/7致病性金黃色葡萄球菌含有葡萄球菌A蛋白，葡萄球菌A蛋白具有與哺乳動(dòng)物抗體IgG的結(jié)合作用，所以在我們用免疫學(xué)方法固化抗體去特異性捕獲目的抗原時(shí)，如杲在多相檢樣中同時(shí)存在致病性金黃色葡萄球菌時(shí)，會(huì)有干擾，好在選擇培養(yǎng)基會(huì)對這種干擾的抑制效果理想，但對除金黃色葡萄球菌以外的其他致病性的^^r出有一定影響。實(shí)施例7:從組織模擬樣本中分離菌在出口肉雞企業(yè)目的菌陰性樣本，在無菌操作下取25克樣品，IO倍稀釋，拍打袋拍打30秒，加入標(biāo)準(zhǔn)埃希氏大腸桿菌液5微升，輕輕震蕩混勻，做不同稀釋度，利用相應(yīng)的免疫富集刷(網(wǎng))進(jìn)行樸獲，分離培養(yǎng)，并與直接分離培養(yǎng)做檢驗(yàn)分析，在做組織樣品檢測時(shí)，由于組織樣品中的肌肉組織纖維，容易纏繞在刷上，因此我們這里用三層拍打袋，中間有一層濾網(wǎng)，組織在一邊免疫富集刷(網(wǎng))在另一邊；特異性鑒定利用鑒定培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)，菌落形態(tài)，血清凝集實(shí)驗(yàn)及純培養(yǎng)的生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定和數(shù)據(jù)計(jì)算。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例8富集時(shí)間對吸附的影響。樸獲細(xì)菌的靈敏度利用已經(jīng)確定的免疫富集刷的最佳樸獲條件，檢測免疫富集刷樸獲特異性細(xì)菌的靈敏度，將含有104CFU/ML菌液，將免疫富集刷放入，在室溫下輕輕震蕩攪拌感做不同時(shí)間5分鐘、IO分鐘、20分鐘、30分鐘，然后洗滌3次，每個(gè)樣本分別接種選擇平板，觀察記錄分離結(jié)果如下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1、免疫富集絲檢測細(xì)菌的方法，具體操作步驟如下A、按現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)采樣，需要前增菌的進(jìn)行前增菌；B、將富集絲直接或間接包被針對要檢測的特定細(xì)菌的單克隆或多克隆抗體，制成免疫富集絲，免疫富集絲放入待檢樣品中0.5-1小時(shí)富集檢測目的細(xì)菌，將免疫富集絲取出后，用滅菌生理鹽水進(jìn)行洗滌，機(jī)械卸載細(xì)菌到適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基平板上，分離培養(yǎng)24±3小時(shí)，或直接放到適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基平板上分離培養(yǎng)24±3小時(shí)，其間培養(yǎng)到4-6小時(shí)時(shí)，棄掉免疫富集絲；所述的富集絲選自聚乙烯絲、尼龍絲、錦綸絲中的一種；C、挑選典型菌落，以下按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)繼續(xù)操作，報(bào)告檢出或未檢出。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫富集絲檢測細(xì)菌的方法，在做組織樣品檢測時(shí)，采用三層拍打袋，中間有一層濾網(wǎng)，組織放在濾網(wǎng)一側(cè)，免疫富集絲放在另一側(cè)富集細(xì)菌。3、免疫富集刷，其特征在于它包括刷柄和刷頭，刷頭是由刷板和刷毛組成，刷毛植在刷板上，刷柄和刷板可拆裝，與富集絲同樣材料制成，刷毛是所述的免疫富集絲。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫富集刷，其特征在于所述的免疫富刷的刷板長為15mm,刷毛為單排。5、根椐權(quán)利要求4所述的免疫富集刷，其特征在于所述的刷毛在包被抗體前，為0.1-0.2毫米直徑的白色透明原絲，刷毛端部經(jīng)過磨細(xì)打毛。6、根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的免疫富集刷，其特征在于刷板或刷毛帶有代表包被不同抗體的標(biāo)記。7、根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的免疫富集刷，其特征在于還包括一個(gè)刷架，刷架中間有一刷架孔，刷架柄通過刷架孔與刷架連接，刷架上帶有2-6個(gè)刷頭，刷架柄、刷架、刷頭三部件，可以自由組裝和拆卸。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫富集刷，其特征在于還包括一個(gè)刷架，刷架中間有一刷架孔，刷架柄通過刷架孔與刷架連接，刷架上帶有2-6個(gè)刷頭，刷架柄、刷架、刷頭三部件，可以自由組裝和拆卸。9、免疫富集網(wǎng)，它是由所述的免疫富集絲制成的網(wǎng)。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫富集網(wǎng)，其特征在于為圓形網(wǎng)，網(wǎng)隔為3-5mm,直徑小于所使用平皿直徑6-10mm，有彈性框架。全文摘要本發(fā)明涉及食品檢疫檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體的說免疫富集絲檢測細(xì)菌的方法及免疫富集刷，是對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的改良，富集絲直接或間接包被針對要檢測的特定細(xì)菌的單克隆或多克隆抗體，制成免疫富集絲，直接放入到檢驗(yàn)制備的樣品中或經(jīng)復(fù)蘇的樣液中，富集相對應(yīng)的細(xì)菌，經(jīng)過生理鹽水洗去非特異性吸附，然后直接進(jìn)行分離培養(yǎng)，抗原抗體復(fù)合物對微生物的正常生長沒有影響，免疫富集絲富集目的菌，代替了部分前增菌和選擇性增菌，縮短了檢測時(shí)間，達(dá)到了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的效果，對于某些種細(xì)菌來說優(yōu)于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)；使用免疫富集刷或免疫富集網(wǎng)操作更方便、效果更佳。文檔編號C12Q1/04GK101215598SQ20081005024公開日2008年7月9日申請日期2008年1月11日優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日發(fā)明者于師宇,劉和平,李訓(xùn)德,肖成蕊,陽蔡申請人:中華人民共和國吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局