移植物抗宿主疾病的治療或預(yù)防方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防接受了移植(包括造血細(xì)胞移植)的主體出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法。該方法包含在體外令移植物接觸有效數(shù)量的粘膜瘤病毒，以抑制移植物內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖或預(yù)防受試體移植該移植物后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)。在移植物接觸粘液瘤病毒后，該方法包含將經(jīng)過病毒處理的移植物植入到受試體內(nèi)。
【專利說明】移植物抗宿主疾病的治療或預(yù)防方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月9日提交的美國專利申請第61 / 495，342號的優(yōu)先權(quán)。該美國專利申請在這里被全文引用。
[0003]有關(guān)聯(lián)邦贊助開發(fā)的聲明
[0004]本發(fā)明是在美國國家衛(wèi)生研究所(合同號R01CA138541)和美國國家癌癥研究所(合同號R21CA149869)的支持下開發(fā)完成的。因此，美國政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明與移植物抗宿主疾病(GVHD)的治療或預(yù)防方法及生物試樣內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制方法有關(guān)，例如同種異體細(xì)胞的移植。
【背景技術(shù)】
[0006]移植物抗宿主疾病(GVHD)是將同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞移植至免疫功能不健全的患者體內(nèi)時，可能發(fā)生的一種潛在的可致死性臨床并發(fā)癥。具體來說，移植物抗宿主疾病(GVHD)的一個重要組成包括移植物中的成熟供體⑶3+T淋巴細(xì)胞被移植到免疫功能不健全的受體體內(nèi)。供體T細(xì)胞一經(jīng)被輸注至受體體內(nèi)，就會識別宿主細(xì)胞抗原，導(dǎo)致影響肝臟、胃腸道和皮膚(1、 2)的免疫級聯(lián)反應(yīng)。
[0007]目前，移植物抗宿主疾病(GVHD)的治療和預(yù)防方法包括移植后進(jìn)行常規(guī)免疫抑制、低強度預(yù)處理及在輸注前耗竭或抑制同種反應(yīng)性供體的T淋巴細(xì)胞(2、3)。不過，這些方法的臨床效果受多種副作用的限制。例如，常規(guī)免疫抑制與增加再次感染病毒及機會性病毒感染的風(fēng)險有關(guān)聯(lián)，而低強度預(yù)處理方案則與復(fù)發(fā)率增加有關(guān)聯(lián)(3)。目前，耗竭或抑制供體T淋巴細(xì)胞是最具前景的移植物抗宿主疾病(GVHD)預(yù)防性治療方法。通過淋巴細(xì)胞毒性劑、專用的T淋巴抑制劑及專門針對CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)選擇的T細(xì)胞耗竭劑等多種方法，可實現(xiàn)該目的。盡管人們已經(jīng)證實，這些方法可有效地降低移植物抗宿主疾病(GVHD)發(fā)病率，但是，它們會降低受體重構(gòu)免疫系統(tǒng)的速度，增加患者出現(xiàn)致命感染的危險并可能具有限制移植物抗白血病的效果(4、5)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1:粘液瘤病毒(MYXV)治療可防止致死性移植物抗宿主疾病(GVHD)。對NSG小鼠進(jìn)行亞致死量照射，然后移植PBS (陰性對照組，n=5) UxlO7的人體原體骨髓(BM) (n=36)或使用粘液瘤病毒(MYXV)預(yù)處理過的IxlO7人體原代骨髓(n=36)。小鼠每兩周稱重一次，以監(jiān)測小鼠身體狀況(A)，并在移植六周后或小鼠身體狀況評分達(dá)到2時，將小鼠處死(B)。然后，采用對數(shù)秩檢驗(P〈0.05)法，判斷存活率是否存在顯著差異。N.S.=不顯著。小鼠尸體解剖后，將各器官取出并使用福爾馬林固化，然后切片和標(biāo)記，以確定是否存在人體CD3+淋巴細(xì)胞(C)。所示的免疫組織化學(xué)圖片為在五只小鼠中觀測到的具有代表性的結(jié)果。
[0009]圖2:粘液瘤病毒(MYXV)處理可防止供體T淋巴細(xì)胞在移植后出現(xiàn)體內(nèi)擴(kuò)張，同時使得正常造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)能夠成功移植。首先對NSG小鼠進(jìn)行亞致死量照射，然后移植IxlO7的全骨髓細(xì)胞。移植六周后，取出小鼠骨髓，并通過流式細(xì)胞儀分析人體造血細(xì)胞植入情況(人體⑶45+ / HLA-A, B、C+雙陽性細(xì)胞)。采用粘液瘤病毒(MYXV)處理后，人體造血細(xì)胞的成功植入(A)并未改變動物細(xì)胞的比例或是此類植入物在小鼠骨髓
(B)中的水平。試驗顯示，經(jīng)過照射的小鼠在移植了 IxlO7的⑶34耗竭了的骨髓細(xì)胞后，可降低整體植入水平，體外粘液瘤病毒(MYXV)處理可顯著降低此植入水平(C)。試驗顯示，經(jīng)過照射的小鼠在移植1x105CD34+選定細(xì)胞后，人體細(xì)胞植入水平與移植了全骨髓細(xì)胞的小鼠中的水平類似。體外粘液瘤病毒(MYXV)處理對植入水平無影響。試驗中采用了 StudentT檢驗法對顯著性進(jìn)行了判斷(P〈0.05)。N.S.=不顯著。首先對NSG小鼠進(jìn)行亞致死量照射，然后移植5xl06的聚蔗糖濃縮外圍血單核細(xì)胞(PBMC)。小鼠每兩周稱重一次，以監(jiān)測小鼠身體狀況(E)，并在移植六周后或小鼠身體狀況評分達(dá)到2后，將小鼠處死(F)。然后，采用對數(shù)秩檢驗(P〈0.05)法，判斷存活率是否存在顯著差異。
[0010]圖3:粘液瘤病毒(MYXV)感染了一部分人體原代⑶3+T淋巴細(xì)胞。為了測定粘液瘤病毒(MYXV)是否會感染骨髓細(xì)胞中存在的CD3+T淋巴細(xì)胞，采用了 vMYX-GFP對IxlO6的全骨髓細(xì)胞進(jìn)行了處理，感染復(fù)數(shù)(M0I)=10。細(xì)胞接觸MYXV24小時后，采用了⑶3或⑶34抗原對細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，然后采用了流式細(xì)胞儀測定了各族群中GFP+細(xì)胞的水平(A)。為了測定不同骨髓細(xì)胞供體之間CD3+淋巴細(xì)胞感染的不同，共對21份不同的骨髓試樣進(jìn)行了感染處理和分析。GFP+呈顯性的⑶3+細(xì)胞所占比例在I %-47% (B)之間。為了測定粘液瘤病毒(MYXV)能否在同種刺激后抑制T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)張，采用了經(jīng)過照射的人體白細(xì)胞抗原(HLA)不匹配的飼養(yǎng)層細(xì)胞，將通過粘液瘤病毒(MYXV)處理過的骨髓細(xì)胞的陰性對照處理細(xì)胞培養(yǎng)了 10天。經(jīng)對照組處理過的骨髓細(xì)胞在經(jīng)照射過的飼養(yǎng)層細(xì)胞刺激后，顯示出活細(xì)胞數(shù)量顯著增加 ，而經(jīng)粘液瘤病毒(MYXV)處理過的骨髓細(xì)胞未見該顯著增加(C)。所示數(shù)據(jù)為三次獨立試驗的平均值。
[0011]圖4:在骨髓贈體之間，對移植物抗宿主疾病(GVHD)的形成情況進(jìn)行了統(tǒng)一的觀察。首先對NSG小鼠進(jìn)行亞致死量照射，然后移植IxlO7的來自三個不同供體的骨髓細(xì)胞(A)。小鼠每兩周稱重一次，以監(jiān)測小鼠身體狀況，并在注入六周后或小鼠身體狀況評分達(dá)到2時，將小鼠處死(B)。然后，采用對數(shù)秩檢驗(P〈0.05)法，判斷存活率是否存在顯著差異小鼠尸體解剖后，將各器官取出并使用福爾馬林固定，然后切片和標(biāo)記，以確定是否存在人體CD3+淋巴細(xì)胞(B)。所示的免疫組織化學(xué)圖片為在五只小鼠中觀測到的具有代表性的結(jié)果。
[0012]圖5:注入了⑶34+細(xì)胞或⑶34+耗竭的骨髓細(xì)胞的小鼠出現(xiàn)了不同淋巴細(xì)胞譜系的植入。首先對NSG小鼠進(jìn)行亞致死量照射，然后植入IxlO7的CD34+耗竭骨髓細(xì)胞或IxlO5的⑶34+選定的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)。注入六周后將小鼠處死，并通過對提取出的鼠科骨髓細(xì)胞和HLA-APC、⑶3-PE、⑶19_FitC和⑶15-PERCP抗原進(jìn)行共同標(biāo)記，測定骨髓中是否存在人體細(xì)胞譜系。在注入了 CD34+耗竭骨髓細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，人體細(xì)胞主要是HLA+ /⑶3+ /⑶15_ /⑶19_細(xì)胞(A)，而在注入了⑶34+選定細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，人體細(xì)胞主要是 HLA+ / CD3- / CD15- / CD19.細(xì)胞(B)。
[0013]圖6:粘液瘤病毒(MYXV)處理可抑制T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)張。為了測定粘液瘤病毒(MYXV)能否在同種刺激后抑制T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)張，采用經(jīng)過照射的人體白細(xì)胞抗原(HLA)不匹配的飼養(yǎng)層細(xì)胞，將通過粘液瘤病毒(MYXV)處理過的骨髓細(xì)胞的陰性對照處理細(xì)胞培養(yǎng)了 10天。采用對照組處理方法處理過的骨髓細(xì)胞在經(jīng)照射過的飼養(yǎng)層細(xì)胞刺激后，顯示出活細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而經(jīng)粘液瘤病毒(MYXV)處理過的骨髓細(xì)胞未見該顯著增加
(C)。三組獨立的骨髓供體均見此效果。
[0014]圖7 =GFP表達(dá)粘液瘤病毒選擇性地感染正常骨髓細(xì)胞中的一部分原代T細(xì)胞，但不會感染⑶19+B細(xì)胞或⑶34+干細(xì)胞。
[0015]具體描述
[0016]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可通過粘液瘤病清除生物試樣(如同種異體細(xì)胞)中的T淋巴細(xì)胞或抑制其擴(kuò)張，對生物試樣進(jìn)行處理。以這種方式經(jīng)過粘液瘤病毒處理過的同種異體移植物可有效防止移植物抗宿主疾病(GVHD)。若不采用本發(fā)明中所述的粘液瘤病毒處理，移植體內(nèi)的同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可導(dǎo)致受體肝臟、皮膚和肺部等幾種重要器官損傷。這種損傷可表現(xiàn)為輕度發(fā)炎、腸道粘膜破壞及靶細(xì)胞死亡脫落不等。發(fā)炎一般會表現(xiàn)為發(fā)熱、腹部疼痛、惡心、嘔吐、腹瀉、腸出血和黃疸等癥狀。
[0017]在本發(fā)明中，“生物試樣”或“試樣”是指與其自然環(huán)境相分離的生物材料。試樣可包含組織試樣、生物體液試樣(如血液、血漿)或細(xì)胞試樣,如造血細(xì)胞試樣。試樣可采用當(dāng)前適用的技術(shù)，通過供體、組織庫或其他來源獲取，然后會被移植到受體宿主中。
[0018]在本發(fā)明中，“接觸”包含令生物試樣與粘液瘤病毒相接觸的任何方法。
[0019]在本發(fā)明中，“有效量”是指要達(dá)到所需結(jié)果，所需的有效劑量或時間。 [0020]在本發(fā)明中，“移植物抗宿主疾病”或“GVHD”是指移植組織與宿主受體之間發(fā)生的病理反應(yīng)。移植物抗宿主疾病(GVHD)常見于造血干細(xì)胞和實體器官移植后。發(fā)生移植物抗宿主疾病時，同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞會將受體組織視為異物。因此，會攻擊受體，導(dǎo)致受體發(fā)炎或發(fā)生有害反應(yīng)。移植物抗宿主疾病(GVHD)易于攻擊上皮組織，尤其是皮膚、肝臟和胃腸道黏膜。鑒于免疫系統(tǒng)參與了大規(guī)模的同種免疫反應(yīng)，因此，移植物抗宿主疾病(GVHD)屬于一種深度的免疫系統(tǒng)受損狀態(tài)。此外，出現(xiàn)移植物抗宿主疾病的患者一般要服用強性免疫抑制劑，使得此類主體更易于受到機會性感染源的侵害。
[0021]在本發(fā)明中，“移植物”是指按照本發(fā)明中所述方法，被移植到受試體中的試樣，如造血細(xì)胞試樣。移植物可為同種異體移植物或自體移植物。
[0022]在本發(fā)明中，“造血細(xì)胞”是指造血系統(tǒng)中各種類型的細(xì)胞，其中包括但不僅限于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)等未分化細(xì)胞及巨核細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞等分化細(xì)胞。
[0023]在本發(fā)明中，“造血細(xì)胞移植”包含和指代血液和骨髓移植、外周血液干細(xì)胞移植、供體細(xì)胞輸注、臍帶血移植或多能造血干細(xì)胞的其他任何來源途徑。
[0024]在本發(fā)明中，“宿主受試體”或“受試體”是指動物世界中包括人在內(nèi)的各種受試體。在其中一種實施方案中，受試體指按照本發(fā)明中所述方法，正在接受、將要接受或已經(jīng)接受了移植物的任何哺乳動物。哺乳動物受試體可能包含但不僅限于人類、猴類、馬、豬、牛、狗、貓、大鼠及小鼠等。在某一具體實施方法中，采用了本發(fā)明中所述的方法，對人類受試者進(jìn)行了治療。
[0025]在本發(fā)明中，“免疫受損”、“免疫受損的受試體”或“免疫受損的個體”是指由于免疫系統(tǒng)無法在最佳狀態(tài)下工作，而存在罹患感染性疾病風(fēng)險的個體。在其中一種實施方案中，受試體由于接受了用于治療其潛在疾病及(或)用于防止移植物排異現(xiàn)象的治療方案，而出現(xiàn)免疫系統(tǒng)受損。
[0026]在本發(fā)明中，“抑制T淋巴細(xì)胞增殖”是指清除或耗竭受試體生物試樣中的T淋巴細(xì)胞或抑制生物試樣中T淋巴細(xì)胞的增殖。
[0027]在本發(fā)明中，“非致病性病毒”是指對所關(guān)注的受試體而言不具致病性的病毒，如粘液瘤病毒。換言之，粘液瘤病毒不會導(dǎo)致受試體患病。
[0028]在本發(fā)明中，“預(yù)防”是指阻止和推遲與移植物抗宿主疾病(GVHD)相關(guān)的癥狀或是降低此類癥狀的嚴(yán)重性。
[0029]在本發(fā)明中，“治療”或“處理”是指為達(dá)到有益或期望的結(jié)果，包括臨床效果，而采取的方法。所謂有益或期望的結(jié)果可包含但不僅限于減輕或改善一種或多種癥狀或狀況；縮小疾病(如移植物抗宿主疾病(GVHD))的發(fā)病范圍、穩(wěn)定病況、防止疾病發(fā)生、防止疾病擴(kuò)散、延緩或減慢疾病發(fā)展速度、延緩或減慢疾病發(fā)作速度、改善或減輕病況及可見或不可見地減慢擴(kuò)散速度(無論是局部還是整體)，“治療”還可能指延長患者的壽命，以超出放棄治療時的預(yù)期壽命。此外，“治療”還指抑制疾病的發(fā)展，暫時性地減緩疾病的發(fā)病速度，在更理想的情況下，治療還包含永久地阻止疾病的發(fā)展。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，若在改善特定病況的同時，治療方法在被治療主體上產(chǎn)生的有害效果超過了治療產(chǎn)生的有益效果，可能會產(chǎn)生有害效果或非理想效果。
[0030]在本發(fā)明中，“移植體/移植”是指從源體部位移植至受體部位的各種器官或器官組織，或是代指該移植過程?！耙浦病卑ǖ粌H限于通過輸液、局部應(yīng)用及(或)充填方式，而進(jìn)行的移植。
[0031]在本發(fā)明中，提供了一種移植物抗宿主疾病(GVHD)治療或預(yù)防方法，以防止移植了含造血細(xì)胞移植物的受試體，出現(xiàn)該疾病或?qū)ζ溥M(jìn)行治療。該方法包含在體外令移植物接觸有效數(shù)量的粘液瘤病毒，以抑制移植物內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖或預(yù)防受試體移植該移植物后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)。此外，該方法還包含在移植物接觸粘液瘤病毒后，將該經(jīng)過病毒處理的移植物移植到受試體中。移植可包含本領(lǐng)域內(nèi)的各種適用技術(shù)，如同種異體造血細(xì)胞移植、供體細(xì)胞輸液和支持性血液產(chǎn)品輸液等。在其中一種實施方案中，采用了輸注法作為單倍體相合移植方法。
[0032]在本發(fā)明中，提供了一種用于抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣內(nèi)增殖的方法。該方法包含令生物試樣接觸有效數(shù)量的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣中的增殖。在其中一種實施方案中，粘液瘤病毒被用于抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣或移植物中的增殖。
[0033]含有造血細(xì)胞的生物試樣可通過行業(yè)內(nèi)已知的各種標(biāo)準(zhǔn)方法，從受試體中提取，其中包括但不僅限于活組織檢查法和穿刺法。例如，我們可通過穿刺患者(進(jìn)行或不進(jìn)行細(xì)胞因子動員)，收集造血細(xì)胞。通常，該生物試樣需在大約35°C至38°C溫度下保持30-120分鐘，最佳宜保持60分鐘，以在確保試樣達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，再將痘病毒引入試樣。待造血細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明中所述的非致病性痘病毒處理后，可采用行內(nèi)已知技術(shù)，將處理好的造血細(xì)胞重復(fù)輸回或注入到患者體內(nèi)。例如，我們可通過血管內(nèi)輸入的方法重新輸入這些細(xì)胞，或是直接將其輸回患者的系統(tǒng)循環(huán)中。
[0034] 在本發(fā)明中，提供了一種細(xì)胞族群，該族群由多種經(jīng)過一定數(shù)量的粘液瘤病毒處理過的造血細(xì)胞組成。[0035]本發(fā)明所使用的粘液瘤病毒可能為任何屬于兔痘病毒屬的病毒。這些粘液瘤病毒可為野生菌株的粘液瘤病毒，或是經(jīng)過基因改良的粘液瘤病毒。此類粘液瘤病毒可采用行業(yè)內(nèi)已知的任何方法和配方制備和配制,其中包括已公布的編號為2006 / 026333的美國專利中所述的方法，本發(fā)明通過引用，將該專利納為本發(fā)明申請的整體組成部分。例如，我們可能如下方法制備粘液瘤病毒:首先令培養(yǎng)好的兔子細(xì)胞感染所要使用的粘液瘤細(xì)胞菌株，直至該病毒開始在所培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制及可通過行內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法釋放該病毒，以破壞細(xì)胞表面，釋放和收集病毒顆粒。待病毒收集后，可通過令該病毒感染兔子細(xì)胞試樣及執(zhí)行菌班計數(shù)試驗的方法，確定病毒的滴定量(見Mossman等人于1996年在《病毒學(xué)》上發(fā)表的論文215:17-30)。值得一提的是，粘液瘤病毒的宿主嗜性高度地限于歐洲兔種，試驗顯示，該病毒對包括人在內(nèi)的其他各種脊椎動物均不具有致病性(麥克法登(McFadden)，2005)。該病毒的基因組不具分段性，含有一個單獨的線性雙鏈DNA分子，其長度上包含16萬個核苷酸。該基因組的G-C含量約為40%，兩端具有重復(fù)排列的末端冗余序列。
[0036]當(dāng)生物試樣與粘液瘤病毒接觸時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松確定要達(dá)到期望結(jié)果，所需的處理劑量和時間。在其中一種實施方案中，生物試樣為同種異體移植物，該試樣采用粘液瘤病毒處理了至少一個小時(例如可為三個小時)。此外，還可采用有效數(shù)量的粘液瘤病毒處理生物試樣，該數(shù)量可通過測量試樣中的感染復(fù)數(shù)確定。感染復(fù)數(shù)是指傳染性病原體(如噬菌體或病毒)與感染目標(biāo)(如細(xì)胞)的比例。例如，對于接種了感染性病毒顆粒的一組細(xì)胞而言，感染復(fù)數(shù)(MOI)是指孔內(nèi)沉積的感染性病毒顆粒的數(shù)量除以孔內(nèi)靶細(xì)胞數(shù)量，得到的比值。在其中一種實施方案中，在令試樣(如同種異體移植物)與粘液瘤病毒相接觸時，所采用的感染復(fù)數(shù)(MOI)值為10。
[0037]在其中一種實施方案中，要采用粘液瘤病毒處理的移植物中，可能包含含有多種造血細(xì)胞的骨髓細(xì) 胞或人體外周血液細(xì)胞。在其中一種具體實施方案中，該移植物為同種異體移植物。
[0038]作為進(jìn)一步的理解，可結(jié)合化療、放療或其他抗病毒療法等治療方法，對要引入到患者體內(nèi)的移植物進(jìn)行體外處理。在其中一種實施方案中，經(jīng)過粘液瘤病毒處理過年移植物可同其他溶瘤病毒(對于不同腫瘤細(xì)胞類型，可能會表現(xiàn)出不同的特異性)一起或先后移植到受試體內(nèi)。
[0039]在本發(fā)明中，提供了一種用于治療受試體癌癥的方法。該方法包括令含有多種造血細(xì)胞的移植體在體外接觸數(shù)量有效的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣內(nèi)的增殖。此外，該方法包含在化療、生物治療、基因抑制和放療中至少選擇一種方法，對宿主個體進(jìn)行治療。然后，按照該方法將經(jīng)過病毒處理過的移植體植入到受試體內(nèi)。在其中一種實施方案中，該移植物由骨髓細(xì)胞或人體外周血液細(xì)胞組成。
[0040]可通過本發(fā)明中所述方法進(jìn)行治療的癌癥及(或)癌癥細(xì)胞的典例包括但不僅限于從患有造血系統(tǒng)惡性腫瘤的患者體中提取出的細(xì)胞,例如患有淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、骨髓增長異常綜合癥、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、肉瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、細(xì)胞癌、大腸癌、胰腺癌、腦癌、卵巢癌或胃癌的患者。在其中一種實施方案中，本發(fā)明中所述的方法被用于患有惡性血液腫瘤的受試體中。此類惡性血液腫瘤可為白血病、骨髓增生異常綜合癥、淋巴瘤或骨髓瘤。在一種具體實施方案中，所針對的癌癥是一種急性骨髓性白血病(AML)或多發(fā)性骨髓瘤(MM)。在其中一種實施方案中，所針對的癌癥為難治性疾病，如對治療無反應(yīng)或產(chǎn)生耐藥性的癌癥。
[0041]在本文所述的方法中，可能會用到任何適用的放療、生物治療、免疫抑制和化療方法。例如，化療劑可為任何對癌癥細(xì)胞或受試者的腫瘤細(xì)胞具有溶瘤作用的任何試劑。例如，化療劑可為但不僅限于蒽環(huán)類化合物、烷化劑、烷基磺酸酯、氮丙啶、氮丙啶、甲基三聚氰胺、氮芥、亞硝基脲、抗生素、抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、嘧啶類似物、酶、鬼臼毒素、含鉬類試劑或細(xì)胞因子。此類化療劑宜為已知的能夠有效對抗特定類型的癌癥或腫瘤細(xì)胞的試劑。在其中一種實施方案中，化療劑可有效治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤，例如此類化療劑可為塞替派、順鉬系化合物和環(huán)磷酰胺。細(xì)胞因子包括干擾素、G-CSF、紅細(xì)胞生成素、GM-CSF,白細(xì)胞介素、甲狀旁腺激素等類似因子。生物療法包括利妥昔單抗、貝伐單抗、血管破壞劑、來那度胺及類似物。放射增敏劑包括煙酰胺等類似物
[0042]盡管本發(fā)明包含對移植物等生物試樣進(jìn)行體外處理，不過，該發(fā)明還可被理解為按照申請編號為20090317362的美國公開專利(麥克法登(McFadden)等人申請)中所述方法，在受試體的體內(nèi)進(jìn)行粘液瘤病毒治療，同時，本文通過引用的方法，已將該專利納為本文的整體組成部分。在體內(nèi)使用時，可將粘液瘤病毒作為一種成份，配制在藥品之中。根據(jù)理解，該藥品一般可含有濃度為藥品可接受水平的鹽、緩沖劑、防腐劑及各種相容載體。對于各種輸送形式而言，我們還可將粘液瘤病毒配制到生理鹽溶液中。該藥液還可包含抗癌劑等其他治療劑。在各種實施方案中，此類藥液可包含化療劑、細(xì)胞因子、生物治療劑和放療劑。
[0043]作為進(jìn)一步理解，本發(fā)明中所述的方法還可用于治療以致病性及(或)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞為特征的非惡性疾病，例如自身免疫失調(diào)癥。因此，從本發(fā)明的另一個層面上說，本發(fā)明還提供了一種用于 治療T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫失調(diào)癥的方法。該方法包括令含有多種造血細(xì)胞的移植體在體外接觸數(shù)量有效的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣內(nèi)的增殖。此外，該方法還包含將經(jīng)過病毒處理過的移植體植入到受試體內(nèi)。在此方面，本方法還有可能用于清除及(或)抑制可導(dǎo)致自身免疫失調(diào)癥的致病性、自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，如多發(fā)性硬化癥。
[0044]以下各例僅用于描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明的范圍應(yīng)為下面所附權(quán)利聲明中所定義的范圍，以下各例不應(yīng)被理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0045]實施例1
[0046]下面實施例中采用了以下材料和方法。
[0047]正常人體細(xì)胞:由Lonza公司提供的新鮮人體骨髓穿刺細(xì)胞及外周血液單核細(xì)胞。試驗時，會按照廠家建議的方式，采用臨床Sepax裝置(B1safe公司生產(chǎn))在Ficoll梯度內(nèi)對骨髓單核細(xì)胞進(jìn)行富集化處理。
[0048]粘液瘤病毒和病毒感染物:通過使用vMyx-GFP培養(yǎng)細(xì)胞，完成各種病毒感染處理。vMyx-GFP是具有粘液瘤病毒(MYXV)結(jié)構(gòu)，可從合成病毒早期/后期啟動子(21)處，在病毒基因中的基因間位置表達(dá)eGFP。通過這種結(jié)構(gòu)，可根據(jù)試驗細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)情況，監(jiān)測病毒復(fù)制的早期階段。在感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的條件下，在溫度為37°C及CO2濃度為5%的加濕艙內(nèi)，在PBS+10% FBS溶液中，令人體骨髓細(xì)胞接觸vMyx-GFP3小時。陰性對照組細(xì)胞則在PBS+10% FBS的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，該環(huán)境中不含病毒，其他條件與上面所述相同。[0049]干細(xì)胞移植瘤:在移植物抗宿主疾病(GVHD)研究中，采用了 Cs137作為輻射源，按照200cGy的亞致死性總輻射劑量，對NOD / Scid / IL2Ry^^(NSG)小鼠進(jìn)行了照射處理。照射后24小時內(nèi)，通過尾巴靜脈為小鼠注入了 1χ106-10χ106的細(xì)胞，此類細(xì)胞已按照對照組進(jìn)行了處理或者采用了 vMyx-GFP進(jìn)行了處理或接觸了 vMyx-GFP。為防止機會性細(xì)胞感染，注射后兩周內(nèi)，小鼠通過飲用水?dāng)z入了預(yù)防性抗生素。移植后周后，小鼠被處以安樂死，并提取了小鼠的骨髓。然后采用流式細(xì)胞液(BD FACSCaliber公司生產(chǎn))，針對人體⑶45+和HLA-A、B、C+細(xì)胞，定量測定了人體干細(xì)胞植入量。若流式細(xì)胞儀確證，骨髓細(xì)胞群體中人體⑶45+ / HLA-A、B、C+細(xì)胞呈雙陽性，則將小鼠評定為成功植入。同時，將各骨髓細(xì)胞中⑶45+ / HLA-A、B、C+細(xì)胞的數(shù)量，均采用了植入水平予以表示。通過采用HLA-APC、⑶3-PE、CD 19-Fi tC、CD 15-PERCP抗體對提取的小鼠骨髓進(jìn)行共同標(biāo)記，測定了植入細(xì)胞的譜系分析值。
[0050]免疫組織化學(xué)分析:組織驗尸后，手術(shù)摘取肺、肝、腎、胰腺、皮膚和腸道六種組織，對人體細(xì)胞在小鼠外周組織中的滲透情況進(jìn)行分析。組織被放入10 %的福爾馬林緩沖液中固化24小時，然后采用了 70%的EtOH溶液沖洗24小時。組織處理后，按照5微米的大小，切取了被福爾馬林固化且浸有石蠟的組織塊，然后將切片置于了帶電載片上(FisherScientific公司產(chǎn)品)。通過一系列二甲苯和分級酒精對載片進(jìn)行了脫石蠟和再水化處理，然后在濃度為3%的過氧化氫/甲醇溶液中，室溫下阻斷10分鐘。此后，在PH6.0的斯特拉緩沖液中，進(jìn)行25分鐘的熱介導(dǎo)抗原修復(fù)處理。緊接著使用市面上有售的試劑盒(VectorLabs公司產(chǎn)品)，采用普通山羊血清和抗生物素蛋白/生物素阻斷。在4°C的溫度下，按照1: 100的比例，在切片上涂敷兔子的抗⑶3。接著，采用ABC-Elite試劑組(VectorLaboratories公司產(chǎn)品)完成標(biāo)記。最后,可通過與DAB (Vector Labs公司產(chǎn)品)反應(yīng),觀測抗原-抗體復(fù)合物；并在蓋片前，采用蘇木素對載片進(jìn)行復(fù)染標(biāo)記。
[0051]磁場激活細(xì)胞分選法:采用Miltenyi B1tec公司生產(chǎn)的CD3+(產(chǎn)品目錄號130-050-101)和CD3 4+(產(chǎn)品目錄號130-046-702)微珠分離試劑盒，按照廠家建議從SEPAX純化正常骨髓細(xì)胞穿刺提取物中，分離出⑶3+和⑶34+細(xì)胞。然后采用Miltenyi B1tec公司生產(chǎn)的autoMACS專業(yè)分離器，按照廠家建議，對細(xì)胞進(jìn)行分離。分離完成后，采用流式細(xì)胞儀測定各種分離族群的相對純度。分離后，采用血球計測定各種細(xì)胞的總數(shù)目。
[0052]淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)分析:將IxlO6的SEPAX純化nBM細(xì)胞分成三份，分別加入到96孔的孔板中。然后，采用Cs137作為輻射源，按照100cGy的劑量對細(xì)胞進(jìn)行輻照，以形成無法進(jìn)行復(fù)制的飼養(yǎng)層細(xì)胞。然后，對從第二個HLA-不合供體中取出的SEPAX純化nBM細(xì)胞進(jìn)行陰性對照組處理或使用粘液瘤病毒(MYXV)予以處理，并將IxlO6個細(xì)胞分三份置入空孔或含有經(jīng)過照射處理的飼養(yǎng)層細(xì)胞的孔中。在指定的時間點，采用市面上有售的MTT分析儀器(Pierce公司產(chǎn)品)，按照廠家建議方式，測定各孔內(nèi)活細(xì)胞的總數(shù)量。
[0053]統(tǒng)計分析:采用對數(shù)秩禾Student T檢驗法，測定各試驗組之間的統(tǒng)計差異。報告值為中數(shù)值加上或減去中數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)誤差后，得到的值。若P值小于0.05，則認(rèn)為存在統(tǒng)計顯著性。
[0054]如上文所述，移植物抗宿主疾病(GVHD)是將同種T淋巴細(xì)胞移植至免疫功能不健全的患者體內(nèi)時，可能發(fā)生的一種潛在的可致死性臨床并發(fā)癥。盡管有一些傳統(tǒng)的T細(xì)胞耗竭方法，不過，移植物抗宿主疾病(GVHD)仍是同種異體造血細(xì)胞移植中遇到的重大難題之一。在下面幾個例子中，發(fā)明人會展示幾種通過在體外采用粘液瘤病毒(MYXV)處理原代人體造血細(xì)胞，來預(yù)防移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法。眾所周知，粘液瘤病毒(MYXV)的宿主特異性較窄，僅對歐洲兔種具有該特異性，對小鼠和人類等其他物種不具特異性。本發(fā)明的
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)，采用粘液瘤病毒(MYXV)處理人體骨髓和外周血液單核細(xì)胞等，在免疫受損的小鼠體內(nèi)，不會抑制人體造血細(xì)胞的植入；同時，人體移植物通過體外接觸粘液瘤病毒,可通過根除移植物抗宿主疾病,提高人體造血細(xì)胞的移植成功率及移植后存活率。各大器官的檢查結(jié)果顯示，該方法能夠避免人體T淋巴細(xì)胞的增殖。粘液瘤病毒(MYXV)還可通過消除同種反應(yīng)性T細(xì)胞，平息淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)。此外值得一提的是，未見免疫系統(tǒng)深度受損的小鼠出現(xiàn)粘液瘤病毒(MYXV)感染現(xiàn)象。以下數(shù)據(jù)顯示，粘液瘤病毒(MYXV)體外病毒治療是一種簡單、有效的移植物抗宿主疾病(GVHD)預(yù)防方法，可有效地預(yù)防患者在輸注可能含有同種反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的造血產(chǎn)品(如同種異體造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞HSPC、供體白細(xì)胞注入物及輸血)后，出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)癥狀。
[0055]本發(fā)明的
【發(fā)明者】之前已經(jīng)證實，粘液瘤病毒(MYXV)這種新型病毒可作為溶瘤劑，在不損傷正常人體組織的同時，治療多種人體癌癥(6-8)。粘液瘤病毒(MYXV)在人體內(nèi)用作病毒治療時，具有多個優(yōu)點。首先，粘液瘤病毒(MYXV)的自然宿舍僅限為兔子。目前尚無任何非兔類物種感染粘液瘤病毒(MYXV)的實例記錄，即使是將活性病毒輸入人體受試者和免疫受損的小鼠體內(nèi)，也未見感染情況(9，10)。第二，粘液瘤病毒(MYXV)的溶瘤作用不依賴于特定的細(xì)胞表面受體，同時，而是依賴于獨特的細(xì)胞內(nèi)途徑，如用于允許進(jìn)入的蛋白激酶。這種特性使得粘液瘤病毒(MYXV)能夠有效地鍵合和清除多種人體癌癥。最后，粘液瘤病毒(MYXV)在治療中使用起來較為簡單和便捷，因此,可對于臨床用藥而言,具有很大的吸引力。
[0056]最近，本發(fā)明的發(fā)明人證實，通過體外處理被急性髓細(xì)胞性白細(xì)胞(AML)污染的原代人體造血細(xì)胞，可在保留正常人體造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)的同時，產(chǎn)生消除白血病克隆的效果(11)。這 種有選擇性的清除不依賴于任何轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和任何化療劑的添加，僅需要使用粘液瘤病毒(MYXV)在體外對移植物試樣進(jìn)行短時間培養(yǎng)，然后將其植入到免疫受損NOD / scid / IL2R(伽瑪)(NSG)小鼠體內(nèi)即可(11)。
[0057]在使用粘液瘤病毒(MYXV)作為臨床劑清除其他各種人體惡性血液腫瘤污染的HSPC移植物的跟進(jìn)試驗中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過亞致死量輻射的NSG小鼠在注入健康人體(BM)骨髓后，有50-70%小鼠在移植后4-6周內(nèi)地出現(xiàn)可致死消耗性疾病(圖1A和1B)。在經(jīng)過照射且注入陰性對照物的小鼠中及注入了已確定的癌癥細(xì)胞系的小鼠中均未見發(fā)生此病癥，但在注入取自三個獨立健康供體的骨髓后，均出現(xiàn)了該病癥。Barnes和Loutit在60年代[PMID13517181]最早將此類病癥稱為是“二次疾病”，此后又被稱為是移植物抗宿主疾病(GVHD)。與移植物抗宿主疾病(GVHD)相符，患病小鼠的組織學(xué)驗尸報告顯示，小鼠外周組織出現(xiàn)顯著水腫，同時人體⑶3+T淋巴細(xì)胞滲透至小鼠的肝臟、腸道、皮膚、肺、腎和胰腺等多個器官(圖1C)(圖4)。
[0058]但是，出乎意料的是，本發(fā)明的
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)輸注了經(jīng)過體外粘液瘤病毒(MYXV)處理的健康骨髓的小鼠，大多存活下來，未見患有消耗性疾病的跡象(圖1A和1B)。此外，組織學(xué)驗尸報告顯示，小鼠在輸注經(jīng)過粘液瘤病毒(MYXV)處理的骨髓后，幾乎未見人體CD3+T淋巴細(xì)胞滲透至小鼠任何重要器官，這其中包括肝臟、肺、腎和胰腺等器官(圖1C和圖4)。該數(shù)據(jù)支持了最新觀測結(jié)果，即使用粘液瘤病毒(MYXV)體外處理同種異體人體造血細(xì)胞移植物可預(yù)防移植物抗宿主疾病(GVHD)，并可實現(xiàn)正常人體造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)的有效移植。
[0059]原代人體骨髓含有⑶3+T淋巴細(xì)胞和⑶34+HSPC。為了測定粘液瘤病毒(MYXV)能否通過影響供體T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)張預(yù)防移植物抗宿主疾病(GVHD)病癥的發(fā)生或改變造血干細(xì)胞的長期移植成功率，我們對原代人體骨髓中的CD3+T淋巴細(xì)胞或CD34+HSPC進(jìn)行了免疫磁性富集或耗竭處理。與我們對移植物抗宿主疾病(GVHD)病癥的診斷結(jié)果一致，異體移植了主動選擇的CD3+淋巴細(xì)胞或CD34+耗竭骨髓的小鼠均死于移植物抗宿主疾病(GVHD)，其發(fā)病機制與移植了未分化骨髓的小鼠類似。與之相反，小鼠標(biāo)在移植CD3+淋巴細(xì)胞耗竭的骨髓或主動選擇的CD34+HSPC后，未見GVHD病癥(表1)。在所有同類試驗中，移植了經(jīng)過粘液瘤病毒(MYXV)預(yù)處理的人體造血細(xì)胞的NSG小鼠大多成活下來，未見移植物抗宿主疾病(GVHD)病癥跡象。
[0060]在有了粘液瘤病毒(MYXV)能夠預(yù)防供體T淋巴細(xì)胞同種異體反應(yīng)性的證據(jù)后，我們通過試驗檢測了體外粘液瘤病毒(MYXV)是否會影響造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)植入物。具體來說，我們 采用了異體移植模型，試驗中采用了全骨髓、主動選擇的CD34+HSPC和⑶34+耗竭的移植物。與之前的觀測結(jié)果一致(11)，通過使用粘液瘤病毒(MYXV)對人體造血移植物預(yù)處理，小鼠在移植六周后，人體造血移植物在小鼠體內(nèi)比例未見顯著變化。對于移植了經(jīng)過體外處理的全骨髓的小鼠，觀測結(jié)果顯示，人體造血移植物在小鼠骨髓內(nèi)所占比例有下降趨勢。不過，該趨勢未能達(dá)到統(tǒng)計顯著水平(圖2B)。對于移植了經(jīng)過體外處理的⑶34+HSPC的小鼠，人體造血移植物所占百分比無顯著差異(圖2D)，血統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)了存在B淋巴細(xì)胞扭曲的多向移植物，此為免疫系統(tǒng)受損的小鼠進(jìn)行異種移植后的常見現(xiàn)象(圖5)。移植了 CD34+耗竭骨髓的小鼠也顯示，小鼠在移植6周后，骨髓內(nèi)存在人體造血細(xì)胞移植物。不過，就像我們所預(yù)期的，與接受了全骨髓和⑶34+HSPC的試驗相比，⑶34+耗竭試驗組的植入水平要更低(圖2C)。血統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)了 T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)扭曲的多向移植(圖6)。這些數(shù)據(jù)表明，使用粘液瘤病毒(MYXV)體外處理人體造血移植物，不會在免疫受損的受體內(nèi)損害人類造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)植入物。
[0061]NSG小鼠在異種植入人體骨髓后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)的結(jié)果，進(jìn)一步證實了最近一份有關(guān)NSGi上鼠異植入人體外周血液單核細(xì)胞(PBMC)后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)的報告(15)。未動員的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)移植物含有高水平的CD3+T淋巴細(xì)胞，并在半合移植試驗和供體白細(xì)胞輸注中，用作T細(xì)胞反向添加物。在臨床上，輸注外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的目的是產(chǎn)生移植物抗白血病效應(yīng)(GVL)及提供有于防止感染的免疫能力，不過，同種異體外周血液單核細(xì)胞(PBMC)輸注可帶來高度的移植物抗宿主疾病(GVHD)風(fēng)險?？紤]到我們的試驗結(jié)果顯示，粘液瘤病毒可防止免疫受損的小鼠輸注人體骨髓后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)，因此，我們下一步試驗了粘液瘤病毒能否防止與外周血液單核細(xì)胞(PBMC)輸注相關(guān)的移植物抗宿主疾病(GVHD)。與之前有發(fā)表的研究結(jié)果一致(15)，移植了人體外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的NSG小鼠出現(xiàn)顯著體重下降(圖2E)，并在移植后40天左右，因移植物抗宿主疾病(GVHD)死亡。與之相反，移植了經(jīng)過粘液瘤病毒(MYXV)體外處理的人體外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的小鼠大多存活了下來。這些小鼠出現(xiàn)少量但仍具有統(tǒng)計意義的體重減輕，這表明這種病毒治療方法在此模型中，可能僅能部分減輕根除同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。
[0062]隨著體內(nèi)試驗顯示，粘液瘤病毒(MYXV)能夠防止骨髓移植后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)及減少外周血液單核細(xì)胞(PBMC)輸注后移植物抗宿主疾病(GVHD)的發(fā)病率，我們通過使用粘液瘤病毒(MYXV)處理人類骨髓或令人類骨髓接觸粘液瘤病毒(MYXV)(通過合成早期/晚期病毒啟動因子表達(dá)GFP)，探索了該機制的定義(21)。根據(jù)觀測，一小部分⑶3+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)GFP表達(dá)(即指示出現(xiàn)粘液瘤病毒(MYXV)感染)，但所有⑶19+B細(xì)胞或⑶34+HSPC均未見GFP表達(dá)(圖3A和圖7)。由于已經(jīng)證實，粘液瘤病毒(MYXV)治療效果與其能夠在體內(nèi)防止移植物抗宿主疾病(GVHD)的能力顯著一致(圖4)，我們很驚奇地發(fā)現(xiàn)，用于顯示粘液瘤病毒(MYXV)感染跡象的⑶3+淋巴細(xì)胞所占的比例，在不同患者骨髓試樣之間，存在顯著的差異性(圖3B)。為此，試驗了粘液瘤病毒(MYXV)治療能否以單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的方式，通過同種抗原刺激，對T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更加一致的效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若添加至經(jīng)過致死量照射的HLA不合人體飼養(yǎng)層細(xì)胞，按照陰性對照組處理過的人類骨髓的活細(xì)胞數(shù)量會出現(xiàn)顯著增加。與之相關(guān)，經(jīng)過粘液瘤病毒(MYXV)預(yù)處理過的骨髓細(xì)胞也可防止這種MLR增殖現(xiàn)象(圖3C)。三組獨立的患者骨髓試樣均見此觀測結(jié)果(圖6)。這些數(shù)據(jù)表明，對于來自多個原代供體的同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞而言，粘液瘤病毒(MYXV)都會抑制此類細(xì)胞的擴(kuò)張，即使在這些試樣中，CD3+淋巴細(xì)胞的粘液瘤病毒(MYXV)感染率看起來存在高度的可變性。
[0063]此前，人們已經(jīng)驗證，粘液瘤病毒(MYXV)治療能夠在保留正常人體HSPC的同時，防止原代人體AML干細(xì)胞和祖細(xì)胞植入(11)。這些數(shù)據(jù)表明，粘液瘤病毒(MYXV)有一種全新的用途，具有在同種異體造血細(xì)胞輸注(如異基因造血干細(xì)胞移植)、外周血液單核細(xì)胞(PBMC)輸注和支持性血液產(chǎn)品輸入后，予以使用潛力。用于證實粘液瘤病毒治療能夠預(yù)防移植物抗宿主疾病 (GVHD)的這些數(shù)據(jù)是有關(guān)此類治療策略的首例報告，其利用了完整復(fù)制的溶瘤性病毒來防止一種自身性免疫疾病的發(fā)展。值得的一提的是，將同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞從異基因造血干細(xì)胞移植試樣中清除，這一過程與從自體造血細(xì)胞移植物中清除癌細(xì)胞大體類似。這兩種流程都是基于清除劑(粘液瘤病毒)能夠區(qū)分污染細(xì)胞(自體移植物中的癌細(xì)胞或同種異體移植物中的供體T淋巴細(xì)胞)和功能務(wù)必保留的干細(xì)胞(這里指造血干細(xì)胞)的能力。目前，人們正在對多種能夠用作溶瘤劑的病毒進(jìn)行研究，并開發(fā)了多種方法以區(qū)分不同的細(xì)胞類型。本文所示的數(shù)據(jù)表明，某些溶瘤性病毒(如粘液瘤病毒(MYXV))的潛在治療用途可擴(kuò)展至非惡性疾病的治療，例如T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫失調(diào)。為了改進(jìn)用于治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤的異基因造血干細(xì)胞移植(al1HCT)療法，此前已嘗試了多種淋巴細(xì)胞清除方法，其中包括陽性或陰性細(xì)胞分離及采用特定的溶瘤劑進(jìn)行處理的方法。不過，這些方法會延緩免疫系統(tǒng)恢復(fù)可為患者帶來高度的致命性感染的風(fēng)險及移植失敗風(fēng)險(4，5)。本文數(shù)據(jù)顯示，粘液瘤病毒(MYXV)治療看起來對正常HSPC移植無不良影響，由于部分同種反應(yīng)性CD3+淋巴細(xì)胞的感染，還可有選擇性地傳輸功能性淋巴細(xì)胞子集，以能夠在患者體內(nèi)立即實現(xiàn)抗感染和抗癌的效果。此外，粘液瘤病毒(MYXV)治療僅需在移植物輸注前，添加一個快速的病毒吸收步驟，該過程可在當(dāng)前已有的GTP(良好組織規(guī)范)臨床條件下完成(11)。因此，要將粘液瘤病毒(MYXV)的移植物抗宿主疾病(GVHD)預(yù)防和治療效果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，無需對現(xiàn)有的異基因造血干細(xì)胞移植、外周血液單核細(xì)胞(PBMC)輸注和輸注護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)做顯著調(diào)整。[0064]盡管我們不希望被理論所束縛，不過，我們認(rèn)為粘液瘤病毒(MYXV)能夠從其他T淋巴細(xì)胞子集和造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)中，區(qū)分同體反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的機制及粘液瘤病毒(MYXV)在人體造血細(xì)胞移植中所具有的安全性，可能是基于粘液瘤病毒(MYXV)無法與正常的人體CD34+HSPC相結(jié)合。由于痘細(xì)胞結(jié)合對于大部分的哺乳動物細(xì)胞而言具有極為廣泛的特性(18)，這表明粘液瘤病毒(MYXV)可能是一種有效的治療劑，能夠從功能上包括供體T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種非干細(xì)胞類細(xì)胞從造血移植物中清除，及清除多種造血系統(tǒng)惡性腫瘤中的污染性癌細(xì)胞。有趣的是，在當(dāng)前研究中，我們發(fā)現(xiàn)盡管僅少量CD3+T淋巴細(xì)胞被粘液瘤病毒(MYXV)感染，但這種病毒在每一例異體移植中，都能夠完全地根除移植物抗宿主疾病(GVHD)。通過這種具有選擇性的感染，粘液瘤病毒(MYXV)能夠在抑制移植物抗宿主疾病(GVHD)同時，有選擇性地將部分功能性T淋巴細(xì)胞傳輸給異基因造血干細(xì)胞移植受體(alloHCT)，因此，可提供有益的防菌和抗癌免疫(19)。考慮到粘液瘤病毒(MYXV)僅通過結(jié)合而不需要感染癌癥細(xì)胞來促發(fā)溶瘤活動(20)，因此，粘液瘤病毒(MYXV)還可通過簡單地抑制特定的CD3+淋巴細(xì)胞子集出現(xiàn)移植性擴(kuò)張來防止移植物抗宿主疾病(GVHD)，而不會出現(xiàn)全面產(chǎn)毒性病毒感染。在任何情況下，在輸注同種異體造血細(xì)胞前，使用粘液瘤病毒(MYXV)進(jìn)行體外病毒治療不僅具有防止移植物抗宿主疾病(GVHD)發(fā)病和降低出現(xiàn)重癥風(fēng)險的潛力，還為人體白細(xì)胞抗原(HLA)不合度更大的同種異體移植提供了空間，例如，來自不匹配的無關(guān)供體和單倍同一性供體的移植物，因此，可為更多患者提供接受異基因造血干細(xì)胞移植的機會。
[0065]盡管本文已經(jīng)介紹和描述了本發(fā)明的多種實施方案，不過，所述的這些實施方案僅用舉例說明。我們可對所述方案進(jìn)行多種變化、改變和替代，而均不會背離本申請所述的發(fā)明。相應(yīng)的，所述權(quán)利聲明項意圖是僅在精神和范圍上限制本發(fā)明的范圍。
[0066]參考資料
[0067]1.S.ff.Cho i, J.E.Levine, J.L.Ferrara, Tmmunol Allergy Clin North Am30,75 (Feb).[0068]2.B.R.Blazar, R.Korngold, D.A.Vallera, Tmmunol Revl57, 79 (Jun, 1997).[0069]3.S.Paczesny, S.ff.Choi, J.L.Ferrara, Curr Opin Hematol 16,427 (Nov, 2009).[0070]4.P.J.Martin et al., Bone Marrow Transplants, 445 (Sep, 1988).[0071 ] 5.M.Delain et al., Leuk Lymphomal 1, 359 (Nov, 1993).[0072]6.Μ.M.Stanford et al., Mol Therl6, 52 (Jan, 2008).[0073]7.Y.Woo et al.，Ann Surg Oncol 15，2329 (Aug, 2008).[0074]8.X.Q.Lun et al.，Cancer Res67,8818 (Sepl5, 2007).[0075]9.F.Fenner, F.N.Ratcliffe, Myxomatosis.(Cambridge University Press,Cambridge, UK,1965).[0076]10.Μ.M.Stanford, G.McFadden, Expert Opin B1l Ther7,1415 (Sep, 2007).[0077]11.M.Kim et al.，Leukemia23, 2313 (Dec, 2009).[0078]12.A.Gratwohl et al., Bone Marrow Transplant41,687 (Apr, 2008).[0079]13.D.Gallardo et al.，Haemato1gica94,1282 (Sep, 2009).[0080]14.J.Tanaka, Rinsho Ketsueki43,442 (Jun, 2002).[0081]15.R.1to et al.，Transplantat1n87,1654(Junl5,2009).[0082]16.R.K.Burt et al., J Autoimmun30,116 (May, 2008).[0083]17.C.Annaloro, F.0nida, G.Lambertenghi Deliliers, Expert Rev Hemato12,699 (Dec,2009).[0084]18.B.Moss, in Fields Virology, D.M.K.a.P.M.Howley, Ed.(Lippincott,ffilliams&ffilkins, New York2007)，vol.2，pp.p.2849-2855.[0085]19.J.ff.Hiemenz, Semin Hemato146, 289 (Jul, 2009).[0086]20.G.Madlambayan et al., Cancer Res Submitted, (2011).[0087]21.J.B.Johnston et al.，J Virol77, 5877 (May, 2003).[0088]應(yīng)當(dāng)理解的是，為了確保更加全面地描述與本發(fā)明相關(guān)的當(dāng)前發(fā)展水平，本申請所引用的各種專利、專利申請書、專利出版物、技術(shù)出版物、科學(xué)出版物及其他參考文件，均應(yīng)視為本文的組成部分。
[0089]本文中所指出的特定緩沖液、介質(zhì)、試劑、細(xì)胞、培養(yǎng)條件等等及其此類材料的細(xì)分材料，均非用于限制目的，在閱讀時，應(yīng)將其視為包含專業(yè)人員在特定討論環(huán)境中，能夠意識到的其他有興趣或重要的所有此類材料。例如，一般緩沖液系統(tǒng)或培養(yǎng)介質(zhì)都多種選擇，可以相互替代，因此，專業(yè)人員可通過其他已知方法，達(dá)到與本文所述方法、材料或成份所能達(dá)到的相同目標(biāo)。
[0090]對本發(fā)明的理解應(yīng)著重注意，本發(fā)明中所采用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，除非特別定義，其含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。除非特別說明，本發(fā)明中所使用的技術(shù)與本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的技術(shù)相同。同時為了更加清楚地幫助理解本發(fā)明揭示的內(nèi)容和權(quán)利要求而提供下列定義。
[0091] 雖然本
【發(fā)明內(nèi)容】
中顯示和描述了數(shù)個實施例，但該些實施例僅作為示范例，并不具有限制性。在不實質(zhì)性地偏離本發(fā)明為基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以進(jìn)行多種變異、變化和替代。例如，本發(fā)明無需局限于所揭示的最佳方式，因為其他申請可以從本發(fā)明所教授的內(nèi)容同等獲益。同樣，在權(quán)利要求中，“方法+功能”和“步驟+功能”的權(quán)利要求形式旨在于分別涵蓋為實施所述功能而在本發(fā)明中進(jìn)行描述的結(jié)構(gòu)和行為，并且不僅指結(jié)構(gòu)的等同物或行為的等同物，而且分別指等同的結(jié)構(gòu)或等同的行為。據(jù)此，根據(jù)對相關(guān)法律的理解，所有這樣的調(diào)整均應(yīng)包括在本發(fā)明在權(quán)利要求中所限定的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療或預(yù)防接受了移植(包括造血細(xì)胞移植)的主體出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，該方法包括: 在體外令移植物接觸有效數(shù)量的粘膜瘤病毒，以抑制移植物內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖或預(yù)防和治療受試體移植該移植物后出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD);及 待接觸后,將病毒處理過的移植體植入到受體內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述移植包含同種異體造血細(xì)胞移植、供體細(xì)胞輸液和支持性血液產(chǎn)品輸注方法中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中移植物包含同種異體移植物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中移植物包含骨髓細(xì)胞或人體外周血液細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中T淋巴細(xì)胞包含⑶3+T淋巴細(xì)胞。
6.一種用于抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣內(nèi)增殖的方法，包含令生物試樣接觸有效數(shù)量的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣中的增殖。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中生物試樣至少包含骨髓試樣和血液試樣中的一種。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中T淋巴細(xì)胞包含⑶3+T淋巴細(xì)胞。
9.一種用于治療受試體內(nèi)癌癥的方法，其組成包括: 令含有多種造血細(xì)胞的移植體在體外接觸數(shù)量有效的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣內(nèi)的增殖； 宿主主體至少接受化療、生物治療、免疫抑制及放療中的一種治療；及 將病毒處理過的移植體植入到受體內(nèi)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中移植物包含同種異體移植物。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中移植物至少包含骨髓試樣和人體外周血液細(xì)胞中的一種。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中癌癥是指造血系統(tǒng)惡性腫瘤。
13.一種用于治療T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫失調(diào)的方法，其組成包括: 令含有多種造血細(xì)胞的移植體在體外接觸數(shù)量有效的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴細(xì)胞在生物試樣內(nèi)的增殖；及 將病毒處理過的移植體植入到受體內(nèi)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中移植物包含同種異體移植物。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中移植物至少包含骨髓試樣和人體外周血液細(xì)胞中的一種。
16.一種由粘液瘤病毒處理過的造血細(xì)胞組成的細(xì)胞族群。
17.一種包含造血干細(xì)胞的移植物，所述移植物在體經(jīng)過了數(shù)量有效的粘液瘤病毒的處理，以抑制T淋巴細(xì)胞在移植物內(nèi)的增殖。
18.如權(quán)利要求17所述的移植物，其中所述移植物包含骨髓。
19.如權(quán)利要求17所述的移植物，其中所述移植物包含人體外周血液細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求17所述的移植物，其中所述移植物包含數(shù)量減少的T淋巴細(xì)胞。
【文檔編號】A61P35/00GK104039333SQ201280039201
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月9日
【發(fā)明者】道格拉斯·格蘭特·麥克法登, 埃里克·卡特·巴提, 克里斯多弗·R·考格 申請人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會有限公司