專利名稱：一種抑制免疫及治療移植物抗宿主病(gvhd)制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
早在19世紀(jì)，在創(chuàng)傷愈合的研究領(lǐng)域，就有觀點第一次提出了骨髄中可能存在著非造血功能的干細(xì)胞。但直到1976年，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSC)才首次被報導(dǎo)，并由此開始逐漸被人們重視。MSC是ー種存在于骨髓中的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，將同種異體甚至異種異體的間充質(zhì)干細(xì)胞移植入宿主體內(nèi)，在一定的誘導(dǎo)條件下可分化成具有中胚層、外胚層或內(nèi)胚層特點的細(xì)胞，并參與宿主的構(gòu)成。這使得人們一直以來對于異體移植的理解產(chǎn)生了巨大的沖擊，甚至在ー些研究中間充質(zhì)干細(xì)胞還可以用來治療由于器官移植造成的移植物抗宿主病，可見間充質(zhì)干細(xì)胞有著獨特的免疫調(diào)節(jié)功能使其在人和動物體內(nèi)可以避免異種移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，逐漸成為移植治療中的研究熱點。 近年來，MSC的免疫調(diào)節(jié)作用愈發(fā)引起了新的重視，MSC具有獨特的免疫學(xué)特性。首先，MSC沒有免疫原性，MSC僅低水平表達(dá)人類主要組織相容性I類分子，而不表達(dá)人類主要組織相容性II類分子，由于人類主要組織相容性II類分子是誘發(fā)異體免疫排斥的主要抗原，因而導(dǎo)致了間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性，不會刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這就可以使其逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)的殺傷作用；另ー個方面，MSC又顯示出一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可以降低機(jī)體的免疫反應(yīng)，具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞功能的作用。MSC表面不表達(dá)T細(xì)胞共刺激分子Β7-1、Β7-2，也不表達(dá)刺激細(xì)胞凋亡的分子如⑶40、⑶80、⑶86。有報道表明，用⑶80、⑶86基因轉(zhuǎn)染MSC，從而為T細(xì)胞增殖提供⑶28介導(dǎo)的共刺激信號，或是用Y-干擾素預(yù)處理MSC以上調(diào)人類主要組織相容性II類分子的表達(dá)，這些經(jīng)處理的MSC仍不能有效提呈抗原和刺激T細(xì)胞的増殖，進(jìn)ー步證實了間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性。正因為MSC具有重要的體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)作用，同時其取材方便，數(shù)量豐富，擴(kuò)增效率高，具有多向分化潛能，因而，MSC正成為最具臨床應(yīng)用潛能的干細(xì)胞，也展現(xiàn)了在器官移植后的免疫排斥抑制方面的廣泛應(yīng)用前景。移植物抗宿主病(GVHD)是由于供受體間次要組織相容性抗原的差異，即便在MHC配型極大的提高了骨髄移植的成功性的今天，GVHD仍然是骨髄移植患者所面臨的重要問題，是導(dǎo)致骨髄移植患者死亡的重要因素，而MSC的免疫調(diào)節(jié)功能，為臨床上治療GVHD提供了一種全新的思路。目前，對MSC的臨床應(yīng)用嘗試主要集中與直接進(jìn)行自體或異體的細(xì)胞移植，有報道顯示MSC對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用具有劑量依賴性，尤其是對T細(xì)胞增殖的抑制作用，隨著MSC劑量增加，抑制作用加強(qiáng)。盡管在細(xì)胞移植的角度，MSC應(yīng)用取得了一定程度的進(jìn)展，但細(xì)胞移植本身的局限性，例如活細(xì)胞的保存困難、移植的操作難度等極大的限制了 MSC的更為廣泛的應(yīng)用，針對這ー問題，本發(fā)明人通過相關(guān)研究，證實移植的MSC在參與免疫調(diào)節(jié)抑制的過程中所分泌出的生長因子和細(xì)胞活素，可借由MSC在體外特定環(huán)境中所分泌的條件培養(yǎng)基中獲得，并完全可能將其應(yīng)用于臨床上的器官移植或組織工程后的免疫抑制方面的應(yīng)用，從而提升器官移植或者組織工程(例如人工骨移植)后的愈后效果。因此，MSC在體外人工環(huán)境中分泌的促血管及周邊組織修復(fù)或再生的生長因子和細(xì)胞活素在臨床上有巨大的潛力，可以作為干細(xì)胞療法的有效替代品或輔助藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑，應(yīng)用于抑制臨床由于器官移植、骨組織工程手術(shù)等因素引起的自體免疫排斥反應(yīng)。本發(fā)明的目的還在于提供一種制備免疫抑制及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的方法，該方法步驟為
I)從健康人血液中通過白細(xì)胞置換(Ieukapheresis)獲取外周血單核細(xì)胞,或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細(xì)胞，或從人脂肪吸取物(Iipoaspirate)中直接提取 MSC;2)篩選及培養(yǎng)外周血或骨髓單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞；3)在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞使其分泌促組織修復(fù)和再生的生長因子和細(xì)胞活素，分離MSC細(xì)胞和培養(yǎng)基，獲得富含促血管生成因子和細(xì)胞活素的無細(xì)胞培養(yǎng)基；4)對步驟3)中所獲得的無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行后處理，該后處理步驟包括過濾細(xì)胞碎片、純化該無細(xì)胞培養(yǎng)基、檢測各有效生長因子的成分及含量、對該培養(yǎng)基進(jìn)行凍干處理或冷凍保存，即獲得抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑。本發(fā)明所述制備免疫抑制及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的方法中，步驟I)所述的健康人血液或骨髄的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血庫直接購買的健康人外周血白細(xì)胞懸液樣本，或通過臨床白細(xì)胞置換?？蛇x步驟中所述的梯度離心以獲取單核細(xì)胞的步驟為將所獲得的骨髄或外周血液在密度梯度劑中梯度離心，所用的梯度劑可為Ficoll-Paque (GE healthcare)、Histopaque-1077 (Sigma),或其他公司同類產(chǎn)品，優(yōu)選為Histopaque-1077 ;適用溫度范圍為15到25°C，優(yōu)選為25°C。具體操作為將含有骨髄或外周血及梯度劑的容器在200g-500g下離心20-40分鐘，分層后，用無菌一次性針管吸取當(dāng)中不透明層，即為富含單核細(xì)胞的懸浮液，經(jīng)鑒定，此單核細(xì)胞群體來源于骨髓髓系干細(xì)胞其內(nèi)所含多種細(xì)胞亞群，呈多形性。本發(fā)明所述制備抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的方法中，步驟2)中的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞時，所用的培養(yǎng)基可為Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー種，并可添加有h印arin(0-100U/ml)。培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。在預(yù)設(shè)條件為培養(yǎng)溫度37°C，ニ氧化碳濃度為5-7%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明所述制備抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的方法中，步驟2)中的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞的步驟為以下所述方法①至④中的ー種方法①將單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)1_2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。方法②將單核細(xì)胞與fibrin微球(直徑50-250微米，可由商業(yè)途徑獲得，如Forticell Bioscience)共同培養(yǎng) 1-2 天，姆 IOO-IOOOmg fibrin 微球可吸附 I X IO6 至I X IO8個細(xì)胞的密度，去除懸浮細(xì)胞，將附著于fibrin微球的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。方法③將單核細(xì)胞通過⑶14，或⑶45特異性抗體進(jìn)行磁珠分選(MACS ,由德國Miltenyi Biotec公司生產(chǎn))，篩選出不含⑶14或⑶45的單核細(xì)胞亞群，將此⑶14—或⑶45_單核細(xì)胞亞群以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)1_2天(或用方法②培養(yǎng))，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲II 型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。方法④將人脂肪吸取物(lipoaspirate,約50_100ml)在pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄，用I型和II型膠原酶(collagenase type I，ILSigma-Aldrich)消化(酶的濃度范圍O. 05% -O. 1% )，消化步驟為置于37°C條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，將貼壁(或附著于fibrin微球)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲III型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。本發(fā)明所述制備抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的方法中，步驟3)中所述的在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞的方法為以下所述方法①或②中的ー種方法①將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC置于不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為O. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。方法②將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC先置于促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，此培養(yǎng)基可為M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー種，并可添加有O. 5-1 %的生長因子添加劑EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的ー種(由瑞士 Lonza公司購買，其中含血管內(nèi)皮生長因子VEGF-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子FGF-2、表皮生長因子EGF，和胰島素樣生長因子IGF-1);或添加有內(nèi)皮細(xì)胞生長因子ECGF(IO-IOOygAil);并可添加有h印arin(0-100U/ml);培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。1-2天后將MSC轉(zhuǎn)入不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為
O.5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加I %的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。在按照上述方法①或②培養(yǎng)完成后，收集富含細(xì)胞生長因子的條件培養(yǎng)基，棄去MSC細(xì)胞。本發(fā)明所述制備抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的方法中，步驟4)所述的后處理步驟包括①對步驟3)中所收集的無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行過濾，可通過高速離心或過濾器將細(xì)胞雜質(zhì)及碎片去除。②對過濾后的無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行成分鑒定，并對其中所含的代表性促血管及周邊組織生長因子及細(xì) 胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, MMP-2, PDGF, SDF-I，F(xiàn)GF, VEGF的含量進(jìn)行鑒定，鑒定方法可為蛋白組學(xué)(proteomics),細(xì)胞活素陣列(cytokine array),酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，或Bio-Plex 細(xì)胞因子測試。③對過濾后的無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行凍干或分裝冷凍保存，以便長期保存其中的生長因子及細(xì)胞活素成分的活性。


圖I :本發(fā)明所述抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑對對外周血單核細(xì)胞(PBMC)中淋巴細(xì)胞群増殖活性的抑制作用。圖2 :動物實驗檢測抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑對GVHD模型小鼠的存活率影響。
具體實施例方式以下通過具體的實例對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)ー步的闡述說明，本發(fā)明包括但不限于下述步驟和內(nèi)容。實施例I.單核細(xì)胞的制備。將抽取出的骨髓或者由血庫直接購買的健康人外周血白細(xì)胞懸液加入密度梯度劑Histopaque-1077 (Sigma),姆15mL Histopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白細(xì)胞懸液。將骨髓提取液或外周血白細(xì)胞懸液在梯度劑的存在下于400G的速度下常溫離心30分鐘。分層后，用無菌一次性針管吸取當(dāng)中不透明層，即為富含骨髄系單核細(xì)胞的懸浮液。實施例2. MSC細(xì)胞的獲取。針對I類MSC細(xì)胞的獲取方法將骨髓或外周血單核細(xì)胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米IX IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。針對II類MSC細(xì)胞的獲取方法將骨髓或外周血單核細(xì)胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，通過⑶14，或⑶45特異性抗體進(jìn)行磁珠分選(MACS ,由德國Miltenyi Biotec公司生產(chǎn))，篩選出不含⑶14或⑶45的單核細(xì)胞亞群，將此⑶14_或⑶45_單核細(xì)胞亞群在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲II型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。
針對III類MSC細(xì)胞的獲取方法將人脂肪吸取物(lipoaspirate，約50_100ml)在pH = 7. 4,0. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄,用II型膠原酶(collagenase type II)消化(質(zhì)量濃度O. 075% ),消化條件為于37°C下震蕩30分鐘。將消化并過濾出的單核細(xì)胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲III型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。實施例3.抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑的獲取。將實施例2所獲得的各型MSC置于不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為 O.5%的環(huán)境中在O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中培養(yǎng)2天(每平方厘米2 X IO5個細(xì)胞)，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。培養(yǎng)完成后收集富含細(xì)胞生長因子的無細(xì)胞培養(yǎng)基，棄去貼壁的MSC細(xì)胞。將收集的無細(xì)胞培養(yǎng)基通過孔徑為O. 2微米的過濾器將細(xì)胞雜質(zhì)及碎片去除井分裝于_80°C冷庫冷藏備用。視具體情況，每IxlO6個MSC細(xì)胞可以制備2-5ml所述抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑。實施例4.抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑中的生長因子及細(xì)胞活素的鑒定。實施例3所制得的抗移植排斥制劑中含有的生長因子及細(xì)胞活素成分通過細(xì)胞活素陣列(cytokinearray)鑒定(由R&D Systems購買)，此抗移植排斥制劑的有效成分包含并不局限于以下生長因子MCP-1、EGF、IL-6、IL_8、MMP-9、SDF-1、HGF、VEGF 以及 PDGF。通過酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)，其中有效成分的含量為，MCP-I 5-50ng/ml ;IL_8
1-5 μ g/ml ；SDF-1 :0.5_5ng/ml ;IL_6 5-20ng/ml ；PDGF-BB :0.l-10ng/ml ；VEGF l-20ng/mlo其他成分組成見表I。表I.本發(fā)明所述抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)制劑中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
權(quán)利要求
1.ー種抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑的制備方法，其特征在于，該制劑的制備方法包括如下步驟 1)從健康人血液中通過白細(xì)胞置換獲取外周血單核細(xì)胞，或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細(xì)胞，或從人脂肪吸取物中直接提取MSC ； 2)篩選及培養(yǎng)外周血或骨髄單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞； 3)在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞使其分泌促組織修復(fù)和再生的生長因子和細(xì)胞活素，分離MSC細(xì)胞和培養(yǎng)基，獲得富含促血管生成因子和細(xì)胞活素的無細(xì)胞培養(yǎng)基； 4)對步驟3)中所獲得的無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行后處理，該后處理步驟包括過濾細(xì)胞碎片、純化該無細(xì)胞培養(yǎng)基、檢測各有效生長因子的成分及含量、對該培養(yǎng)基進(jìn)行凍干處理或冷凍保存，即獲得抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述的健康人血液或骨髄的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血庫直接購買的健康人外周血白細(xì)胞懸液樣本，或通過臨床白細(xì)胞置換。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述的從血液中或骨髓中通過密度梯度離心獲取外周血單細(xì)胞的方法為使用梯度劑為Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同類產(chǎn)品，溫度為15 25°C，離心カ為200g_500g，時間20-40分鐘，離心完成后，吸取當(dāng)中不透明層，即為單核細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞時，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー種，并添加有h印arin(0-100U/ml)，培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清，在預(yù)設(shè)條件為培養(yǎng)溫度37°C，ニ氧化碳濃度為5-7%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞的方法為以下所述方法①、②、③或④中的ー種 方法①將單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲I型MSC。
方法②將單核細(xì)胞與fibrin微球共同培養(yǎng)1_2天，每IOO-IOOOmg fibrin微球可吸附IX IO6至IX IO8個細(xì)胞的密度，去除懸浮細(xì)胞，將附著于fibrin微球的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21 天，獲 I MMSC0 方法③將單核細(xì)胞通過CD14，或CD45特異性抗體進(jìn)行磁珠分選，篩選出不含CD14或⑶45的單核細(xì)胞亞群，將此⑶14-或⑶45-單核細(xì)胞亞群以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲II型MSC。
方法④將人脂肪吸取物50-100ml在pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄，用I型和II型膠原酶消化(酶的濃度范圍O. 05% -O. 1% )，消化步驟為置于37°C條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，將貼壁(或附著于fibrin微球)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲III型MSC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞的方法為以下所述方法①或②中的ー種方法①將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC置于不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為O. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
方法②將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC先置于促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，此培養(yǎng) 基可為Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー種，并添加有O. 5-1%的生長因子添加劑EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的ー種；或添加有內(nèi)皮細(xì)胞生長因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0-100U/ml);培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。1-2天后將MSC轉(zhuǎn)入不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為0.5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的制備方法，其特征在于，不添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的制備方法，其特征在于，所述MSC細(xì)胞為I型MSC細(xì)胞。
9.一種由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備獲得的制劑。
10.權(quán)利要求9所述的制劑在制備抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑及其制備方法，該制劑的制備方法是通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，進(jìn)而在低血清條件培養(yǎng)上述MSC細(xì)胞，最后分離MSC細(xì)胞獲得無細(xì)胞培養(yǎng)基，并對該無細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)后處理，即可獲得所述制劑。體外和體內(nèi)實驗表明，本發(fā)明所述的抑制免疫及治療移植物抗宿主病(GVHD)的制劑能夠顯著的抑制受體的免疫反應(yīng)從而有效的改善GVHD癥狀。
文檔編號A61K35/12GK102641296SQ20111004192
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者楊子江, 顧麗婭, 顧茂健 申請人:楊子江