專利名稱：移植物抗宿主疾病的檢查及治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求基于日本專利申請2007-165547(2007年6月22日申請)的優(yōu)先權(quán)， 將其內(nèi)容作為參照引入本說明書。 本發(fā)明涉及用于檢查移植物抗宿主疾病的方法及試劑、以及治療方法及治療用藥 物組合物。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation :HSCT)是將他人 的造血干細(xì)胞移植給患者使其造血功能及免疫功能再構(gòu)筑的治療方法，作為廣泛種類的血 液、腫瘤、代謝及免疫疾病的治療方法已經(jīng)確立。最近20年內(nèi)移植后免疫抑制療法顯著進 步，但是移植物抗宿主疾病(Graft Versus Host Disease ;GVHD)依然是性命攸關(guān)的嚴(yán)重的 移植后并發(fā)癥。HSCT的受血者(患者)的30-80%，盡管采用利用免疫抑制劑的預(yù)防方法， 卻仍然患上GVHD。因此，人們期望早期診斷GVHD并早期開始治療，客觀地監(jiān)控治療效果。另 外，采用目前的治療方法有時不能痊愈，因此人們期望開發(fā)新的治療方法。關(guān)于GVHD的發(fā) 病率、診斷和治療可以參照Sullivan等(Sullivan KM. Graft vs. host disease. In :Blume KG， FormanSJ， Appelbaum FR， eds. Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden， MA :Blackwell Publishing ;2004 :635—664)。 但是，目前GVHD的診斷主要是基于皮疹、高膽紅素血癥、腹瀉等的臨床癥狀進行 的，不存在能夠?qū)VHD與其他類似的并發(fā)癥(靜脈阻塞疾病、病毒復(fù)活、與毒性相關(guān)的治療 方案等)相區(qū)別的決定性生物標(biāo)志物(biomarker)。因此，GVHD的鑒別診斷需要臟器活檢 等侵入性方法。但是活檢是具有侵入性且主觀性的診斷方法。因此需要開發(fā)一種新方法， 不依賴于活檢并且能夠在初期進行準(zhǔn)確、客觀且定量的診斷，從而對GVHD進行適當(dāng)?shù)闹委?及改善HSCT的危象。 最近蛋白質(zhì)組學(xué)的進步提供了幾種方法用于研究生物學(xué)液體中蛋白質(zhì)的廣泛表 達(dá)，鑒定疾病或病理狀態(tài)中的新型生物標(biāo)志物。上述方法之一為表面加強激光解析/電離 飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOFMS)，這是一種高通量且高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，用于從血 漿等復(fù)雜組成的體液中分離蛋白質(zhì)，生成比較蛋白質(zhì)譜。Petricoin等(Petricoin EF， Ardekani AM，Hitt BA，et al. Use of proteomic patternsin serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002 ;359 :572-577)報道了一種利用使用SELDI的蛋白質(zhì)組學(xué)解析的卵巢 癌生物標(biāo)志物。在SELDI中將從生物學(xué)樣品中得到的蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合于蛋白質(zhì)芯片 (Ciphergen Biosystems， Fremont CA)上的經(jīng)化學(xué)修飾的親和表面，沖洗非特異結(jié)合的雜 質(zhì)。然后，利用TOF-MS分析捕捉的蛋白質(zhì)，得到各蛋白質(zhì)的分子量(m/z)及相對濃度(強 度)的光譜。最近的研究成功地將該技術(shù)適用于癌癥及其他疾病的診斷。
對于GVHD中人體液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，也有相關(guān)報道。但是，在使用人的臨床試 樣的實驗中，不能避免受遺傳背景及環(huán)境影響的假象，這使新型生物標(biāo)志物難以表達(dá)。特 別是對于HSCT后的患者由于存在多種已有疾病、調(diào)整的養(yǎng)生方案以及GVHD預(yù)防方法等，所以目前為止還沒有基于包括蛋白質(zhì)組學(xué)分析的生化方法發(fā)現(xiàn)有用標(biāo)記的報道。例如， Kaiser等(Kaiser T， Kamal H， Rank A， et al. Proteomics applied to the clinical follow—up of patients after allogeneichematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004 ;104 :340-349)報道了以尿作為材料利用蛋白質(zhì)組學(xué)解析的GVHD標(biāo)記的研究。 鑒定了兩種蛋白質(zhì)(白三烯；炎癥介質(zhì)，血清白蛋白；血清中最多的蛋白質(zhì))，但沒有發(fā)現(xiàn) GVHD特異蛋白質(zhì)。 在本說明書中引用的參考文獻(xiàn)如下所述。所述文獻(xiàn)中記載的內(nèi)容均作為參照援引 在本說明書中。申請人認(rèn)為這些文獻(xiàn)中的任意一篇都不構(gòu)成影響本發(fā)明專利性的現(xiàn)有技 術(shù)。 非專利文獻(xiàn)1 :Sullivan KM. Graft vs. host disease. In :B1聽KG， Forman SJ， Appelbaum FR， eds. Thomas'Hematopoietic CellTransplantation. 3rd ed. Malden， MA : Blackwell Publishing;2004 :635-664 非專禾U文獻(xiàn)2 :Petricoin EF， Ardekani AM， Hitt BA， et al. Use ofproteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002 ;359 :572_577
非專禾U文獻(xiàn)3 :Kaiser T， Kamal H， Rank A， et al. Proteomicsapplied to the clinicalfollow_up of patients after allogeneichematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004 ;104 :340-349

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供檢查移植物抗宿主疾病的方法、所述方法中使用的診斷試 劑、和治療方法及治療用藥物組合物。 本發(fā)明人等廣泛研究了在移植物抗宿主疾病發(fā)病的模型動物和對照動物之間不
同地表達(dá)的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在移植物抗宿主疾病中CCL8的表達(dá)量明顯上升，進而發(fā)現(xiàn)移
植物抗宿主疾病的臨床癥狀發(fā)病及過程與CCL8表達(dá)量相關(guān)，從而完成了本發(fā)明。 S卩，本發(fā)明提供一種用于檢查移植物抗宿主疾病的方法，其特征在于，測定取自受
試者或受試動物的試樣中CCL8蛋白質(zhì)的量，并將得到的測定值作為移植物抗宿主疾病的
診斷或過程的指標(biāo)。優(yōu)選移植物抗宿主疾病的診斷在移植物抗宿主疾病的臨床癥狀發(fā)病前進行。 在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用抗CCL8抗體測定CCL8蛋白質(zhì)的量。另外優(yōu)選使用 選自質(zhì)譜法(MS)、高效液相色譜法(HPLC)及雙向電泳中的方法測定CCL8蛋白質(zhì)的量。
另外，本發(fā)明提供一種含有抗CCL8抗體的移植物抗宿主疾病的診斷試劑。
進而，本發(fā)明提供一種選擇移植物抗宿主疾病治療藥的候選物質(zhì)(candidate substance)的方法。所述方法包括下述各步驟向移植物抗宿主疾病的模型動物給與試驗 物質(zhì)，測定取自上述模型動物的試樣中CCL8蛋白質(zhì)的量，然后比較給與試驗物質(zhì)時與未給 與試驗物質(zhì)時的CCL8蛋白質(zhì)的量，在給與試驗物質(zhì)時的CCL8蛋白質(zhì)的量低于未給與試驗 物質(zhì)時的CCL8蛋白質(zhì)的量的情況下，選擇所述試驗物質(zhì)作為移植物抗宿主疾病治療藥的 候選物質(zhì)。 本發(fā)明還提供含有抗CCL8抗體作為有效成分的用于治療移植物抗宿主疾病的藥 物組合物。并且，本發(fā)明提供一種治療移植物抗宿主疾病的治療方法，所述方法包括向患有移植物抗宿主疾病的受試者給與抗CCL8抗體。 根據(jù)本發(fā)明可以以高可靠性診斷移植物抗宿主疾病的發(fā)病及過程，通過本發(fā)明的 方法可以使現(xiàn)有主觀的診斷變成客觀且定量的更準(zhǔn)確的診斷。進而，根據(jù)本發(fā)明可以治療 移植物抗宿主疾病，特別是治療對現(xiàn)有治療方法具有抗性的患者的移植物抗宿主疾病。


[圖1]圖1表示小鼠GVHD模型的臨床癥狀和病理學(xué)評分的經(jīng)時變化。[圖2]圖2表示由GVHD小鼠模型得到的樣品的代表性的SELDI光譜，及各時間點
的樣品中8972Da峰的平均歸一化強度(average normalized intensity)。[圖3]圖3表示由給與CsA的小鼠模型得到的樣品的代表性的SELDI光譜，及各
時間點的樣品中S972Da峰的平均歸一化強度。[圖4]圖4表示由同種移植小鼠模型得到的樣品的代表性的SELDI光譜，及各時 間點的樣品中S972Da峰的平均歸一化強度。[圖5]圖5表示含有8972Da蛋白質(zhì)的HPLC餾分的SELDI光譜及2D電泳的結(jié)果。
[圖6]圖6表示從S972Da蛋白質(zhì)中分離的肽的代表性的MS/MS光譜及鑒定的氨 基酸序列。[圖7]圖7表示利用免疫測定的CCL8蛋白質(zhì)的檢測。[圖8]圖8表示人臨床樣品中CCL8蛋白質(zhì)水平的經(jīng)時變化。[圖9]圖9表示人臨床樣品中CCL8蛋白質(zhì)水平的經(jīng)時變化。[圖10]圖10表示人臨床樣品中CCL8蛋白質(zhì)的檢測。[圖11]圖11表示多個人臨床樣品中CCL8蛋白質(zhì)的檢測。[圖12]圖12表示人臨床樣品中CCL8蛋白質(zhì)水平的經(jīng)時變化。[圖13]圖13表示人臨床樣品中CCL8蛋白質(zhì)水平的經(jīng)時變化。[圖14]圖14表示給與TLR配體的小鼠和GVHD小鼠中CCL8的蛋白質(zhì)水平。[圖15]圖15表示小鼠GVHD模型的臨床癥狀和CCL8蛋白質(zhì)水平的經(jīng)時變化。[圖16]圖16表示給與了抗CCL8抗體的小鼠GVHD模型的組織染色。[圖17]圖17表示小鼠GVHD模型中抗CCL8抗體的治療效果的病理學(xué)評價。
具體實施例方式
本發(fā)明的特征在于通過測定受試者血液等受試試樣中CCL8的表達(dá)量，診斷移植 物抗宿主疾病并監(jiān)控過程的方法。具體內(nèi)容如下述實施例所示，可確認(rèn)在接受了骨髓移植 或臍帶血移植的患者中，移植物抗宿主疾病發(fā)病患者的CCL8的表達(dá)量明顯較高、以及移植 物抗宿主疾病的臨床癥狀的發(fā)病與CCL8的表達(dá)之間存在相關(guān)性。 所謂CCL8為屬于趨化因子家族的堿性肝素結(jié)合性分泌蛋白，也稱為 MCP-2 (GenBank Accession No. NP 005614)。已知此蛋白質(zhì)在單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮 細(xì)胞等中產(chǎn)生，與作為受體的CCR2， CCR3， CCR5及CCR11結(jié)合。已知CCL8以CD4陽性T細(xì) 胞、CD8陽性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞等作為靶細(xì)胞。 一般認(rèn) 為移植物抗宿主疾病在造血干細(xì)胞移植后經(jīng)三個階段發(fā)病。第一階段為預(yù)處理，包括對準(zhǔn) 備進行造血干細(xì)胞移植的宿主(患者)進行放射線照射；第二階段為移植T細(xì)胞的活化、
5增殖、分化；第三階段為細(xì)胞性或炎癥性效應(yīng)物的出現(xiàn)(關(guān)于該機理，參照以下兩篇綜述； Reddy P. Pathophysiology of acute graft—versus—host disease. Hematol Oncol. 2003 ; 21 :149—161. ， Ferrara幾，Reddy P. Pathophysiology of graft_versus_host disease. SeminHematol. 2006 ;43 :3-10)。在第二階段中，為了移植T細(xì)胞的活化，必須進行樹狀細(xì) 胞的抗原呈遞。在該樹狀細(xì)胞的分化、增殖、活化中包括CCL8的趨化因子發(fā)揮重要作用 (關(guān)于第二階段中趨化因子的重要性參照以下文獻(xiàn)Wysocki CA， Panoskaltsis-Mortari A， BlazarBR， Serody JS.Leukocyte migration and graft—versus—host disease. Blood. 2005 ;105 :4191-4199)。但是，機體內(nèi)CCL8的作用及其在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中的意義尚 不完全清楚。因此，本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的CCL8的表達(dá)與移植物抗宿主疾病的相關(guān)性的機理目前 為止尚不明確。 作為需要測定CCL8蛋白質(zhì)量的受試試樣，可以使用從受試者或受試動物中獲取
的體液、血液、血清及血漿等。另外，還可以使用取自受試者的組織和細(xì)胞。 取自受試者的試樣中CCL8蛋白質(zhì)的量，可以使用抗CCL8抗體，采用本技術(shù)領(lǐng)域中
熟知的免疫學(xué)測定法進行測定?？笴CL8抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體。市場上銷
售有多種抗CCL8多克隆抗體及單克隆抗體，上述抗體均可用于本發(fā)明。 或者，抗體也可以采用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法進行制備。與CCL8結(jié)合的多克隆抗
體可以如下得到使用CCL8或其肽片段作為致敏抗原將動物免疫，從免疫后的動物中分離
含有抗體的抗血清，使用ELISA分析、蛋白質(zhì)印跡分析或放射免疫測定等本技術(shù)領(lǐng)域熟知
的方法，確認(rèn)具有所希望特異性的抗體的存在。 與CCL8結(jié)合的單克隆抗體可以如下得到根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法使用CCL8 或其肽片段作為致敏抗原將動物免疫，取出所得的免疫細(xì)胞使其與骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇 產(chǎn)生抗體的雜交瘤并進行克隆，培養(yǎng)該雜交瘤，由此得到。 本發(fā)明使用的抗CCL8單克隆抗體中，除了由雜交瘤產(chǎn)生的抗體之外，還包括由用 含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的基因重組抗體。基因重組抗體可以如下制 備由生產(chǎn)與CCL8結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤克隆編碼抗體的cDNA，將該cDNA插入表達(dá) 載體中，使用該載體對動物細(xì)胞，植物細(xì)胞等進行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體而制備。另外，可以將 編碼抗CCL8抗體的基因?qū)朕D(zhuǎn)基因動物，在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生抗CCL8抗體。
為了治療人類患者進行使用時，根據(jù)本發(fā)明的抗CCL8抗體優(yōu)選為人型嵌合抗體 (human chimeric antibody)或人源化抗體。人型嵌合抗體是由人之外的動物抗體的重鏈 可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)、和人抗體的重鏈恒定區(qū)及輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成的抗體。人源化抗體由來 自人之外的動物的抗體的互補決定區(qū)(CDR)、和來自人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)及C區(qū)域構(gòu)成。 由于人型嵌合抗體及人源化抗體由于在人體內(nèi)的抗原性降低，所以作為本發(fā)明藥物組合物 的有效成分有用。用于得到人型嵌合抗體及人源化抗體的一般的基因重組方法以及評價上 述抗體的結(jié)合活性的方法在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的?；蛘撸部梢酝ㄟ^向具有人抗體基因的 全部的全套抗體庫的轉(zhuǎn)基因動物給與CCL8得到抗CCL8人抗體。 并且，在本發(fā)明中也可以使用抗體片段。所謂抗體片段是指雖然缺失抗CCL8抗體 全長的一部分但仍具有對CCL8的結(jié)合能力的肽。作為抗體片段的例子，例如可以舉出Fab、 Fab'、F(ab' )2，F(xiàn)v等。抗體片段可以通過用酶處理抗體生成抗體片段而得到。進而，本發(fā) 明的抗體片段還包括通過用連接體等連接抗CCL8抗體的VL鏈和VH鏈而構(gòu)筑的抗體片段及其二聚物，例如scFv、雙鏈抗體(diabody) 、 sc(Fv)2等。 使用由此得到的抗體利用免疫學(xué)方法測定從受試者或受試動物獲取的試樣中的 CCL8蛋白質(zhì)。測定可以為定性測定也可以為定量測定。取自受試者的CCL8表達(dá)的免疫學(xué) 測定例如可以使用放射免疫測定、ELISA、免疫沉淀法、免疫凝集法、蛋白質(zhì)印跡法等進行。
例如，作為典型例子可以如下進行夾心ELISA。采集受試者的外周血調(diào)制血槳，將 其加入固定有抗CCL8抗體的平板或芯片上培養(yǎng)適當(dāng)時間。清洗平板或芯片除去未結(jié)合成 分后，加入其它抗CCL8抗體。所述抗體可以通過酶、熒光色素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素、放射 性化合物等進行標(biāo)記使其可以進行檢測。培養(yǎng)適當(dāng)時間后清洗平板或芯片，通過測定熒光、 發(fā)光、放射活性等，檢測標(biāo)記?；蛘?，也可以使抗CCL8抗體結(jié)合后加入二次抗體(例如羊抗 小鼠抗體)增強信號。二次抗體用酶、熒光色素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素、放射性化合物等標(biāo) 記使其可以進行檢測。如上所述，可以測定取自受試者的血漿中CCL8蛋白質(zhì)的量。
其它方案中可以使用利用了凝集反應(yīng)的檢測方法檢測CCL8蛋白質(zhì)。在該方法中 可以使用結(jié)合有抗CCL8抗體的載體例如膠乳粒子檢測CCL8。如果將結(jié)合有抗CCL8抗體的 膠乳粒子與試樣混合培養(yǎng)一定時間，若試樣中含有CCL8則粒子發(fā)生凝集。肉眼觀察該凝集 的程度或者使用分光光度計進行定量，由此可以檢測試樣中的CCL8。 在其他方案中可以使用利用了表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振現(xiàn)象的生物傳感器檢測 CCL8蛋白質(zhì)。利用了表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振現(xiàn)象的生物傳感器以表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振信 號的形式對蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)間的相互作用進行監(jiān)控。例如，通過使用BIAcore (Pharmacia 制)等生物傳感器，可以檢測CCL8蛋白質(zhì)與抗CCL8抗體的結(jié)合。具體而言，使受試試樣與 固定有抗CCL8抗體的傳感器芯片接觸，能夠以共振信號變化的方式檢測與抗CCL8抗體結(jié) 合的CCL8蛋白質(zhì)。 或者，CCL8蛋白質(zhì)也可以如實施例2所示使用金屬螯合劑和肝素等親和載體將受
試試樣進行粗精制(濃縮)后通過MS進行檢測及定量。另外，也可以如實施例3所示通過
HPLC進行檢測及定量，也可以通過進行雙向電泳后進行銀染色來檢測及定量。 另外，本發(fā)明提供含有抗CCL8抗體的移植物抗宿主疾病診斷試劑。本發(fā)明的移植
物抗宿主疾病診斷試劑以診斷試劑盒的形式提供。診斷試劑盒含有用于檢測CCL8的試劑
例如抗CCL8抗體作為有效成分。另外，該試劑盒還可以進一步含有測定所需的適當(dāng)試劑
類，例如緩沖液、稀釋液、反應(yīng)終止液、清洗液和對照樣品等。 在本發(fā)明中可以以如上所述測定的CCL8蛋白質(zhì)的量作為指標(biāo)進行移植物抗宿主 疾病的檢查。如果按照本發(fā)明的方法，無需目測檢查或觀察腹瀉量，可以以CCL8蛋白質(zhì)作 為標(biāo)記，客觀地診斷移植物抗宿主疾病，可以監(jiān)控移植物抗宿主疾病的發(fā)病及過程。本發(fā) 明的檢查方法對于例如移植物抗宿主疾病發(fā)病前的診斷(早期診斷)、發(fā)病的確診、嚴(yán)重程 度的判定、疾病過程的監(jiān)控、治療效果的判定及預(yù)后的預(yù)測有用。特別是如圖14所示由于 CCL8蛋白質(zhì)的表達(dá)量經(jīng)過由TLR(Toll樣受體)介導(dǎo)的途徑?jīng)]有升高，所以通過使用CCL8 蛋白質(zhì)作為標(biāo)記可以對移植物抗宿主疾病和細(xì)菌或病毒感染進行鑒別診斷。
如下述實施例所示，移植物抗宿主疾病發(fā)病的患者中CCL8的表達(dá)量與發(fā)病前相 比顯著升高。實施例8中，骨髓移植模型小鼠呈現(xiàn)出CCL8的表達(dá)量自確認(rèn)移植物抗宿主疾 病臨床表現(xiàn)兩天前開始上升。進而，如圖8及9所示，即使在人類患者中CCL8的表達(dá)量也 自觀察到移植物抗宿主疾病臨床表現(xiàn)之前開始上升，這表明根據(jù)本發(fā)明的方法可以進行移
7植物抗宿主疾病的早期診斷。另外，本發(fā)明的方法對治療效果的判定也有用。如圖8及9 所示，通過治療移植物抗宿主疾病臨床表現(xiàn)得到改善，同時觀察到CCL8的表達(dá)量下降。在 治療抗性GVHD中通常的甲基潑尼松龍(methylprednisolone)治療無效，需要進行更加嚴(yán) 格的治療，由于這種治療副作用強，所以根據(jù)本發(fā)明的方法邊適當(dāng)?shù)乇O(jiān)控治療效果邊調(diào)節(jié) 給藥量進行處置是有益的。 另外，如圖11所示由于CCL8的表達(dá)量與移植物抗宿主疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后相 關(guān)，所以根據(jù)本發(fā)明的方法可以早期發(fā)現(xiàn)重癥患者并進行適當(dāng)治療。 并且，本發(fā)明的方法對移植物抗宿主疾病的治療方法的開發(fā)及改良也有用。如圖 11所示，通過檢查CCL8的表達(dá)量可以明確具有治療抗性GVHD病例的患者。對這種患者還 沒有確立治療方法。因此，通過對上述病例邊進行上述監(jiān)控邊研究同時使用多種制劑等的 效果，可以期待開發(fā)適合的治療方法。 進而，由于對于移植物抗宿主疾病通常沒有特效藥，所以根據(jù)本發(fā)明以CCL8的表 達(dá)量作為指標(biāo)，可以篩選移植物抗宿主疾病治療藥的有力的候選物質(zhì)?？梢酝ㄟ^向移植物
抗宿主疾病的模型動物給與試驗物質(zhì)，測定取自模型動物的試樣中CCL8蛋白質(zhì)的量，進行 篩選。作為試驗物質(zhì)例如可以使用抗CCL8抗體。或者，試驗物質(zhì)也可以由各種合成或天然 的化合物文庫、組合文庫、寡核苷酸文庫、肽文庫等文庫中取得。另外，還可以使用由細(xì)菌、 真菌類、藻類、植物、動物等天然物得到的提取物或其部分精制物作為試驗物質(zhì)。在給與試 驗物質(zhì)時與未給與試驗物質(zhì)時相比，在CCL8蛋白質(zhì)的量低的情況下，可以選擇上述試驗物 質(zhì)作為移植物抗宿主疾病治療藥的候選物質(zhì)。即，本發(fā)明的檢查方法提供開發(fā)移植物抗宿 主疾病的新型治療方法的平臺。 另外，本發(fā)明提供含有抗CCL8抗體作為有效成分的、用于治療移植物抗宿主疾病 的藥物組合物，以及通過給與抗CCL8抗體治療移植物抗宿主疾病的方法。如下述實施例9 所示，對移植物抗宿主疾病模型動物給與抗CCL8抗體進行病理學(xué)評價，結(jié)果確認(rèn)了炎癥細(xì) 胞對皮膚的表皮真皮接合部的浸潤減少，毛囊及皮脂腺的障礙減輕，表明給與抗CCL8抗體 對GVHD的治療有效。 本發(fā)明的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行制劑化。例如可以 通過適當(dāng)組合藥學(xué)上允許的載體或介質(zhì)，具體而言為滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、 混懸劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、粘合劑等，以通常認(rèn)可的進 行制藥所要求的單位用量形態(tài)混合，進行制劑化。 用于口服給藥時，可以通過將本發(fā)明的提取物或化合物或其鹽與本技術(shù)領(lǐng)域中公 知的藥學(xué)上允許的載體進行混合，制成片劑、丸藥、糖衣劑、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿 劑、漿液、懸浮液等。 用于非口服給藥時，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的藥學(xué)上允許的媒介物，將本發(fā)明 的提取物或化合物或其鹽制成注射用制劑、噴霧給與用制劑、透皮給與用制劑等形態(tài)。
可以通過口服給藥或非口服給藥將本發(fā)明的藥物組合物給與患者。優(yōu)選為非口 服給藥。作為給藥途徑，例如可以舉出靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、直 腸內(nèi)給與、經(jīng)鼻給與、經(jīng)肺給與、透皮給與等。作為給藥量例如可以在每lkg體重每次給與 0. 0001mg至1000mg的范圍內(nèi)進行選擇。主治醫(yī)生可以根據(jù)患者的年齡、癥狀的嚴(yán)重程度、 給藥中的其他藥物等適當(dāng)選擇給藥途徑及給藥量。
本說明書中明確引用的全部專利及參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均作為參照引入本說明書中。
以下通過實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于這些實施例。
實施例1
骨髓移植(BMT) 通過對小鼠進行異種骨髓移植誘導(dǎo)急性GVHD。作為受體小鼠使用BALB/c (H_2d); 作為供體小鼠，用于異種BMT時使用C57BL/6 (H_2b)，用于同種BMT時使用BALB/c (H_2d)。 小鼠均為7-12周齡(Sankyo Labo Service Corporation)。 在BMT當(dāng)日通過頸椎脫臼處死供體小鼠。沖洗股骨及脛骨的骨體，收集供體的骨 髓細(xì)胞，放入含有2X胎牛血清/1X青霉素-鏈霉素的DME培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)中調(diào)制單細(xì)胞懸浮液。用RPMI1640培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，再懸浮于相同培 養(yǎng)基中。調(diào)制骨髓細(xì)胞接種物，使其在用于異種BMT時200 L中含2X 107個骨髓細(xì)胞，用 于同種BMT時100 ii L中含1 X 106個骨髓細(xì)胞。 受體BALB/c小鼠在BMT前用酸性水飼養(yǎng)至少7日，防止致死量放射線照射后的敗 血癥。以0. 34Gy/分鐘的比例對受體小鼠進行共計8. 5Gy的全身照射，在3小時以內(nèi)經(jīng)尾 靜脈靜脈內(nèi)注射供體小鼠骨髓細(xì)胞。
GVHD的監(jiān)控 每日觀察受體小鼠的GVHD臨床表現(xiàn)，即體重減少、弓背姿勢、皮膚紅斑、脫毛及腹 瀉。在異種BMT小鼠中在移植后7日以內(nèi)出現(xiàn)急性GVHD的臨床癥狀，例如腹瀉及褶皺狀白 苔(ruffled fur) ，21日以內(nèi)確認(rèn)到皮膚紅斑及脫毛。在第14日與第21日之間出現(xiàn)死亡 例。 組織病理學(xué)分析 在移植后第7日、第14日、第21日及第28日處死受體小鼠。取出皮膚、肝臟及小 腸，在10%福爾馬林緩沖液中固定。將固定后的組織包埋在石蠟中制備切片，用蘇木精及曙 紅染色，在顯微鏡下觀察。代表臟器中的認(rèn)為與GVHD相對應(yīng)的組織學(xué)變化如下所述皮膚 (單核細(xì)胞向表皮真皮接合部的浸潤及毛囊或皮脂腺的損傷)；肝臟(單核細(xì)胞向門靜脈的 浸潤及肝細(xì)胞壞死)；及小腸(隱窩細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡及絨毛擴張或變平)。評分系統(tǒng)是 分別將上臟器的陰性結(jié)果作為0，陽性對照作為1 ( 一只小鼠的最大分?jǐn)?shù)為6)。圖1表示各 時間點平均病理學(xué)評分和臨床癥狀。該結(jié)果為5次獨立實驗的代表例。受體小鼠在移植后 的全部時間點均有GVHD的病理學(xué)征兆，第14日的病理學(xué)評分最大。另外，各時間點的病理 學(xué)評分與GVHD的臨床表現(xiàn)一致。
血漿樣品 在BMT前及BMT后第7日、第14日、第21日及第28日采集血液樣品。使用涂布 了肝素的毛細(xì)管從活小鼠的尾靜脈采集血液樣品，在30分鐘以內(nèi)在10，000rpm下離心分離 5分鐘調(diào)制血漿。用于分析之前將其于-8(TC下保存。
實施例2 SELDI蛋白質(zhì)芯片陣列分析 向10iiL各血漿樣品中加入于Tris-HCL(pH7. 4)中含有9mol/L尿素及10g/L CHAPS的20 ii L溶液。將混合物于4"下渦旋15分鐘，用Tris-HCl將其稀釋為1 : 40。用 50mmol/L CuS04活化8斑點固定金屬親和捕獲陣列(IMAC-30)。將稀釋后的樣品(50 y L)
9加入蛋白質(zhì)芯片陣列的各斑點中，在振蕩器中培養(yǎng)l小時。用相同的Tris-HCL清洗后用 水輕輕洗滌，在各斑點中加入0. 5iU的飽和芥子酸(sin即inic acid ;SPA)加2次，進行 風(fēng)干。使用Ciphergen ProteinBiology System II飛行時間質(zhì)譜儀(PBS II， Ciphergen Biosystems，Inc)測定與螯合后的金屬結(jié)合的蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z)光譜。通過將在激光 強度200及檢測器靈敏度8的條件下得到的65個激光脈沖(laser shots)進行平均，求出 數(shù)據(jù)。 SELDI-TOF質(zhì)譜的統(tǒng)計學(xué)分析 編譯全部的光譜，使用Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0.進行數(shù)據(jù)初步 分析。作為血漿樣品使用GVHD組(移植后第7日、第14日、第21日及第28日)50個樣品 及對照組(BMT前)28個樣品共計78個樣品。結(jié)果在m/z = 2k 200k的范圍內(nèi)檢測到表 達(dá)不同的共169個峰。對于這些峰通過使用Biomarker Pattern' s Software對2組間進 行比較，提取峰強度變化為5倍以上且p < 0. 05的峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GVHD組中有10個峰上 升、9個峰下降。 利用SELDI-T0F MS得到的蛋白質(zhì)譜 對上述2. 0-200kDa質(zhì)量范圍的169個峰進一步使用峰強度值進行分析。使用 Biomarker Pattern' s Software (BPS， CiphergenBiosystems， Inc)，禾U用交叉驗證法使用 全部169個峰制備分類樹。簡單而言，在分類樹中一次使用一個規(guī)則以問題的形式將數(shù)據(jù) 分割為兩個節(jié)點。在該實驗中基于由SELDI蛋白表達(dá)譜鑒定的峰或簇的歸一化強度水平來 確定分割。即，由SELDI譜鑒定的各峰或簇是分類過程中的變量。繼續(xù)進行分割過程直至 達(dá)到末端節(jié)點且不能由數(shù)據(jù)分類進一步分割。 使用該方法制備多個分類樹，基于分類樹分析選擇最優(yōu)秀的分類樹。結(jié)果，作為在 GVHD組中與對照組相比明顯上升的峰之一，選擇8972Da的峰。通過使用8972Da的峰可以 對GVHD組和對照組進行分類使靈敏度及特異度均為100%。 8972Da峰的表達(dá)例如圖2所示。圖2A表示在6000-lOOOODa范圍內(nèi)由相同個體的 小鼠得到的正常對照樣品(preBMT ;移植前)及GVHD樣品(移植后第7日、第14日、第21 日及第28日)的代表性SELDI光譜。線包圍的部分表示平均質(zhì)量S972Da的峰。確認(rèn)到所 述峰與正常血槳相比GVHD過量表達(dá)，第7日以后峰強度明顯上升。組織評分和峰強度均在 第28日下降。圖2B表示各時間點樣品中8972Da峰的平均歸一化強度(在各個點n = 9)。 GVHD樣品峰的平均表達(dá)明顯高于對照樣品(preBMT;移植前)的平均表達(dá)。
CsA給藥模型 將作為GVHD治療藥的環(huán)孢菌素A(CsA) (Novartis Pharma)用0. 9% NaCl稀釋至 1.67mg/mL。從移植后第8日至第13日對異種移植小鼠以每日20mg/kg的用量腹腔內(nèi)給與 CsA。圖3表示CsA給與例的同一個體中8972Da峰的推移、以及各時間點樣品中8972Da峰 的平均歸一化強度(在各個點n = 4)。在CsA處置GVHD小鼠中8972Da的峰強度在第7日 上升，給與CsA后下降。
同種移植模型 在使用具有從BALB/c小鼠移植的骨髓移植的BALB/c小鼠的同種移植模型中沒有 誘發(fā)GVHD，并且在移植前樣品和移植后樣品中峰的平均表達(dá)沒有顯著性差異(圖4A， B)。
實施例3
舶薩,分m 禾U用免疫耗竭色譜法(Multiple Affinity Removal Column MS_3，4. 6mm IDX50mm ;Agilent)從匯集后的血漿樣品中除去量最多的三種血漿蛋白質(zhì)(白蛋白、IgG、 運鐵蛋白)。用緩沖液A(Agilent)將50iiL血漿稀釋至5倍，注入免疫耗竭色譜柱?；厥?流過的餾分(flow-through fractions)，用高效液相色譜法(HPLC)進一步分離。HPLC中 使用的分離柱為Inertsil(注冊商標(biāo))Ph柱(5iim，4.6mmlDX150mm;GL Sciences)。洗脫 梯度分布情況如下所述(1)洗脫溶劑A 2% ACN/0. 1% TFA， B 80% ACN/0. 1% TFA ; (2) 線性梯度:0-100% B/50分鐘；流速1. Oml/分鐘。 每30秒收集餾分，將2 ii L餾分置于Au芯片(Ciphergen)上，用SPA基質(zhì)處理，用 SELDI-TOF MS監(jiān)控各餾分的組成。根據(jù)SELDI-TOF MS監(jiān)控回收洗脫時間為31. 0_31. 5分 鐘(約38%乙腈)的HPLC餾分。在GVHD樣品中含有大量8972Da蛋白質(zhì)，但在對照樣品中 卻基本沒有(圖5A)。冷凍干燥該餾分并溶解于200yL溶解緩沖液中(7M尿素、2M硫脲、 50m MDTT、2% Ampholine、3% CHAPS、1% TritonX-100)。 然后，將如上所述濃縮后的樣品用2D電泳進行分離。超聲波處理后，將樣品溶 液置于IPG膠條(pH3-ll， NL，長度llcm， AmershamBioscience)中，將該膠條在30V下再 水化10小時。作為第一維分離的等電聚焦電泳法(IEF)使用IPGphor系統(tǒng)(Amersham Bioscience)在20。C下共進行12kVhr。 IEF后將IPG膠條在含有6M尿素、2% SDS、30X丙 三醇、0. 002%溴酚藍(lán)及1%二硫蘇糖醇的50慮Tris-HCL(pH8. 8)中平衡化15分鐘，然后在 含有2. 5%碘乙酰胺代替二硫蘇糖醇的相同緩沖液中再平衡15分鐘。使用8-20%梯度聚 丙烯酰胺凝膠進行作為第二維分離的SDS-PAGE，在40mA/凝膠的恒電流下進行電泳。2D電 泳后通過硝酸銀染色使蛋白質(zhì)可見。通過比較GVHD及對照樣品的兩個凝膠的圖像，鑒定出 位于6， 500Da-12， 300Da、在GVHD樣品中高度表達(dá)的斑點(spot)(圖5B， C)。
g白質(zhì)的鑒定 將作為候補蛋白質(zhì)的8972Da的斑點在凝膠內(nèi)消化。簡單而言，用100% ACN及 100mM NH4HC03清洗切下的凝膠斑點，然后真空干燥，在5 y L胰蛋白酶溶液(50mMNH4HC03 及5mMCaCl2中12. 5ng/ ii L)中于37。C下培養(yǎng)16小時。將得到的肽用20 ii L 20mMNH4HC03 提取一次，用20ii L的在50% ACN中為5%甲酸提取三次。將回收的提取物真空干燥至約 40 ii L，然后用NanoFlowHPLC-ESI-MS/MS進行分析。使用DiNa系統(tǒng)(KYA)進行HPLC，用Hi Qsil(注冊商標(biāo))C18色譜柱(75iimlDX50mm ;KYA)分離胰蛋白酶消化后的樣品。分離條件 如下所述。洗脫溶劑A :0. 1X甲酸，溶劑B :0. 1%甲酸中70% ACN，梯度0-100% B/40分 鐘，流速200nL/分鐘。使用QSTAR XL Q-TOF質(zhì)譜儀(A卯lied Biosystems)確定分離得 到的肽的特性。使用所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MASCOT軟件(Matrix Science Inc.)檢索NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。 結(jié)果，8972Da蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列與CCL8前體序列一致。從8972Da蛋白質(zhì)
分離得到的肽的代表MS/MS光譜示于圖6。所述肽通過Nano LC-MS/MS被鑒定為CCL8肽
68-79 (QGMSLCVDPTQK)。同樣操作鑒定與理論質(zhì)量相匹配的ll種肽。如果將上述肽的序列
組合，則CCL8前體的氨基酸序列的52%被覆蓋(下劃線部分)。 1MKIYAVLLCL LLIAVPVSPE KLTGPDKAPV TCCFHVLKLKIPLRVLKSYE 51 RINNIQCPME AVVFQTKQGM SLCVDPTQKWVSE預(yù)EILDQ KSQILQP (序列號1)
11
CCL8前體的推定質(zhì)量為11，017Da，推定pl為8.64。 CCL8前體含有19個氨基酸的 信號肽及與其相連的78個氨基酸殘基的成熟CCL8序列。成熟CCL8的推定質(zhì)量為8972Da， 推定pl為8. 45，這與由SELDI-TOF MS及2D-PAGE得到的數(shù)據(jù)一致。
實施例4 利用免疫測I定確認(rèn)CCL8表汰 通過使用特異性的家兔抗小鼠CCL8抗體的SELDI免疫測定，進一步確認(rèn)8972Da 標(biāo)記為CCL8。在PS20(Preactivated Surface)蛋白質(zhì)芯片(Ciphergen)的各斑點加入 0. 1 y g抗小鼠CCL8抗體，在加濕室中室溫下培養(yǎng)2小時。用5 iil的1M乙醇胺(pH8. 0)將 殘留活性部位封閉30分鐘后，將斑點用PBS中的0. 5% TritonXlOO清洗三次，用PBS清洗兩 次。用PBS將血漿樣品稀釋至1 : 75，加入PS20芯片的抗體固定斑點中，邊使用生物芯片 處理器(bioprocessor)在室溫下柔和地混合邊培養(yǎng)2小時。將各斑點用PB S中的0. 5% TritonXlOO清洗兩次，用PBS清洗兩次。用5mM HEPES輕柔清洗后加入SPA基質(zhì)，使用PBS II蛋白芯片閱讀器進行MS分析。結(jié)果，從GVHD血槳樣品中檢測到CCL8，但在對照樣品中 基本沒有檢測到(圖7)。
實施例5 人類臨床樣品中的CCL8表汰 作為人臨床樣品，使用將從接受了骨髓移植的人類患者中得到的血漿在PBS中以 1 : 25稀釋得到的樣品。與實施例4同樣操作，使用PS20蛋白質(zhì)芯片，使用抗人CCL8抗 體，通過SELDI免疫測定調(diào)查人類患者中CCL8的表達(dá)。
患者1(圖8)
5歲男子 診斷范可尼貧血(Fanconi anemia)
處置非親緣者間臍血移植(CBSCT(UR))
預(yù)防藥CsA+匪F 過程移植后第13日皮膚GVHD發(fā)病，在該日開始甲基潑尼松龍治療(mPSL)。在臨 床GVHD發(fā)病前移植后10日出現(xiàn)CCL8。通過治療這種情況暫時下降。但是，之后在GVHD再 次發(fā)作的同時，CCL8的表達(dá)量也再次增加。患兒暫時對治療產(chǎn)生反應(yīng)但最終由于治療抗性 GVHD而死亡。CCL8的表達(dá)量與GVHD的發(fā)病及治療效果相關(guān)。另夕卜，陷入治療抗性后CCL8 不再下降。 患者2(圖9)
IO歲男子 診斷慢性骨髓性白血病(CML)
處置非親緣者間骨髓移植(BMT(UR))
預(yù)防藥FK+MTX 過程移植后第19日皮膚GVHD發(fā)病，從該日開始甲基潑尼松龍治療(mPSL)。該 日CCL8顯示出明顯的增加。GVHD—度由第二階段轉(zhuǎn)向第三階段，但通過之后的治療得到改 善，也未見CCL8再次高度表達(dá)。
患者3(圖10)
3歲女子
診斷急性淋巴性白血病(ALL) 處置適合同胞間骨髓移植(BMT (matched-sib.)) 預(yù)防藥MTX 過程沒有GVHD發(fā)病。過程中未見CCL8高度表達(dá)。
患者4(圖12)
11歲女子 診斷急性淋巴性白血病(ALL)
處置適合同胞間骨髓移植(MSD-BMT)
預(yù)防藥短期MTX 過程移植后第11日GVHD發(fā)病。顯示CCL8的表達(dá)增加。從該日開始CIV給與環(huán) 孢菌素A。在第14日GVHD的癥狀改善，CCL8的表達(dá)也下降。
患者5(圖13) 患有嚴(yán)重再生障礙性貧血的19歲女性接受了來自HLA 1抗原不匹配的父親的骨 髓干細(xì)胞移植?；颊呓邮芰擞?50mg/m2的氟達(dá)拉濱(Flu)及120mg/kg的環(huán)磷酰胺(CY)及 24mg/kg的抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)構(gòu)成的移植前調(diào)節(jié)，使用他克莫司預(yù)防GVHD。移植后 第IO日患者出現(xiàn)高燒，第16日在四肢及軀體出現(xiàn)非定型皮疹。未出現(xiàn)腹瀉。第20日CCL8 呈現(xiàn)明顯增加。第23日進行皮膚活檢，開始甲基潑尼松龍(mPSL)治療。在第31日GVHD 癥狀改善，CCL8的表達(dá)也下降。
實施例6 移禾宵物抗宿主疾病患者和iH常人中的CCL8的血漿濃度定量結(jié)果
對正常人的血漿、及接受了造血干細(xì)胞移植的患者中移植物抗宿主疾病發(fā)病的患 者及未發(fā)病的患者的血漿CCL8進行定量。結(jié)果示于圖11。數(shù)值的單位為Pg/mL。接受了造 血干細(xì)胞移植的患者中移植物抗宿主疾病未發(fā)病的患者的血漿CCL8濃度為6. 92-48. Opg/ mL平均23. 3pg/mL。但是，移植物抗宿主疾病發(fā)病的患者的血漿CCL8濃度為明顯高的濃度， 為52. 0-333. 6pg/mL平均133. 3pg/mL。進而，在治療抗性GVHD的2例中顯示出極高的濃度 333. 6pg/mL及290. 4pg/mL。這兩個病例對GVHD治療具有抗性，已經(jīng)死亡。正常人的血漿 CCL8濃度為極低值0-32. 6pg/mL，平均為18. 9pg/mL。由上述結(jié)果可知，在移植物抗宿主疾 病發(fā)病的患者中血漿CCL8量明顯高于正常人，而且在治療抗性GVHD的患者中血漿CCL8量 極高。 以上結(jié)果表明人類患者的GVHD的發(fā)病及過程與CCL8的表達(dá)量之間存在顯著的相 關(guān)性。 實施例7 與感染癥的鑒別診斷 測定對小鼠給與TLR配體時CCL8的表達(dá)水平。 雌性BALB/c (H_2d)小鼠購自Sankyo Labo Service Corporation (Tokyo, Japan)。小鼠在實驗開始時為8_10周齡。在無特別說明的情況下，試劑均購自SIGMA/ ALDRICH(Tokyo, J即an)。 向野生型BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)注射500ii1 PBS，在所述PB S中含有5iig的脂 多糖(LPS) (Eschrichia coli) 、5 li g的poly (I :C) (GE Health care BioScience， Tokyo,
13Japan)及20mg的D-GalN、 lOOmg的肽聚糖(PGN) (staphylococcus aureus) (Invitorogen， CA， USA) 、20mg的酵母聚糖_A (Invitorogen， CA， USA)或20nmol的CpG-ODN(Invitorogen， CA，USA)。向?qū)φ招∈蟾骨粌?nèi)注射500 L的PBS。注射4小時后回收血漿樣品。根據(jù)預(yù)實 驗確定LPS、 poly (I :C) 、 PGN、酵母聚糖_A或CpG-0DN的給藥量。 注射4小時后使用經(jīng)肝素處理的注射器采集小鼠血漿樣品，在30分鐘以內(nèi)在 5，000rpm下離心分離7分鐘。進行分析之前于-S(TC下保存分裝后的血漿。對志愿者及患 者進行采血調(diào)制血漿樣品，分裝，進行分析之前于-80°C下保存。 人CCL8使用酶免疫分析(ELISA)進行測定。人CCL8ELISA試劑盒購自 RayBiotech(Norcross， GA)，根據(jù)制造商的手冊進行使用。在450nm下使用平板閱讀器 (plate reader)讀取平板(MultiskanJX， Thermo Labsystems， Helsinki, Finland)。
結(jié)果以平均+/-SE表示。通過雙側(cè)或單側(cè)t檢驗中的任一種進行統(tǒng)計學(xué)顯著性分 析。顯著性差異設(shè)定為P <0.05。多重比較中適用Bonferroni校正。結(jié)果為一系列實驗 的代表數(shù)據(jù)。 如圖14所示，表明通過給與TLR配體CCL8水平未上升。這表示細(xì)菌或病毒感染 未引起CCL8的表達(dá)水平上升，暗示以CCL8表達(dá)作為指標(biāo)可以鑒別診斷GVHD和感染癥。
實施例8
GVHD發(fā)病前診斷 與實施例1同樣操作進行小鼠同種BMT，在第1、3、5及7日采血，得到肝素血漿樣 品。使用Mouse CCL8 ELISA對其血漿中CCL8的濃度進行定量。 另一方面，對同種BMT后第O日至第7日的體重變化及第7日的體重減少、弓背姿 勢、毛皮(coat)、皮膚、腹瀉進行評分，進行0、l、2三階段評價。在體重減少方面，將減少不 足10%記為0，減少為10-小于25%記為1分，減少25%以上記為2分。在弓背姿勢方面， 將正常姿勢記為O，稍稍呈現(xiàn)弓背姿勢記為1分，基本是弓背姿勢時記為2分。在毛皮方面， 將正常情況記為O，毛稍稍豎起記作1分，將基本不梳理毛發(fā)、全身毛豎起的情況記為2分。 在皮膚方面，將正常情況記為O，尾及足呈現(xiàn)硬化記為1分，在有毛部位出現(xiàn)無毛部分時記 為2分。在腹瀉方面，將正常情況記為O，稍有腹瀉癥狀記為1分，全面爆發(fā)腹瀉記為2分。 臨床GVHD評價給出各評判標(biāo)準(zhǔn)的總分?jǐn)?shù)，最高分為10分。 血漿中CCL8濃度的經(jīng)時變化示于圖15。血漿中CCL8的濃度從骨髓移植后早期開 始上升，從第5日開始顯著增加。相對于此，至第6日仍未出現(xiàn)GVHD的臨床表現(xiàn)。在臨床 GVHD評價中第7日約為2.5分，是GVHD初期狀態(tài)。之后，所有小鼠在第7日以后GVHD癥狀 進展，第28日的分?jǐn)?shù)為6.3。 根據(jù)上述結(jié)果， 一般認(rèn)為血中CCL8蛋白質(zhì)的定量對小鼠GVHD發(fā)病前診斷或GVHD
早期診斷有用。 實施例9 使用抗CCL8抗體的GVHD的治療 抗小鼠CCL8家兔抗體如下配制向家兔給與合成CCL8肽，使用親和色譜柱從所得 的抗血清中精制抗CCL8IgG餾分，由此進行配制。作為對照的正常家兔抗體，使用正常家兔 血清的IgG餾分。 與實施例1同樣操作進行小鼠骨髓移植。從異種骨髓移植前一日開始連續(xù)3日，
14通過受體小鼠尾靜脈分別給與100iig抗小鼠CCL8家兔抗體或正常家兔抗體。對抗小鼠CCL8抗體(治療組)和正常家兔抗體(對照組)各三只分別進行治療。在骨髓移植14日后通過頸椎脫臼處死小鼠。取出皮膚、肝臟及小腸，在10%福爾馬林緩沖液中固定。將固定后的組織包埋于石蠟中制備切片，用蘇木精及曙紅染色，在顯微鏡下觀察認(rèn)為是GVHD的病理學(xué)癥狀。評價方法如下所述皮膚(單核細(xì)胞向表皮真皮接合部的浸潤及毛囊或皮脂腺的損傷)；肝臟(單核細(xì)胞向門靜脈的浸潤及肝細(xì)胞壞死)；及小腸(隱窩細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡及絨毛的擴張或變平)。以陽性(+)、陽性與陰性的中間態(tài)(+/_)、陰性(_)三階段進行評價。 圖16表示皮膚組織染色結(jié)果的代表例。(a)給與抗小鼠CCL8抗體，(b)給與正常家兔抗體(對照)。作為皮膚GVHD癥狀的皮脂腺損傷(箭頭)及淋巴細(xì)胞向表皮真皮接合部的浸潤(箭頭指示符號)，在正常家兔給藥組中出現(xiàn)，但在抗小鼠CCL8抗體給藥組中沒有確認(rèn)到。 圖17表示使用上述評分系統(tǒng)的結(jié)果。僅在抗CCL8抗體處理小鼠中確認(rèn)到炎癥細(xì)胞向皮膚的表皮真皮接合部的浸潤減少、毛囊及皮脂腺障礙減輕。這表明抗CCL8抗體處理對GVHD的治療有效。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性 本發(fā)明對移植物抗宿主疾病的診斷及過程的監(jiān)控、以及治療有用。
權(quán)利要求
一種用于檢查移植物抗宿主疾病的方法，其特征在于，測定取自受試者或受試動物的試樣中CCL8蛋白質(zhì)的量，并將得到的測定值作為移植物抗宿主疾病的診斷或過程的指標(biāo)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在移植物抗宿主疾病的臨床癥狀發(fā)病前進行移植 物抗宿主疾病的診斷。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，使用抗CCL8抗體測定CCL8蛋白質(zhì)的量。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，使用選自質(zhì)譜法、高效液相色譜法及雙向電泳 中的方法測定CCL8蛋白質(zhì)的量。
5. —種移植物抗宿主疾病的診斷試劑，含有抗CCL8抗體。
6. —種選擇移植物抗宿主疾病治療藥的候選物質(zhì)的方法，包括以下步驟， 向移植物抗宿主疾病的模型動物給與試驗物質(zhì)，測定取自所述模型動物的試樣中的CCL8蛋白質(zhì)的量，然后比較給與試驗物質(zhì)時與未給與試驗物質(zhì)時的CCL8蛋白質(zhì)的量，在給與試驗物質(zhì) 時的CCL8蛋白質(zhì)的量低于未給與試驗物質(zhì)時的CCL8蛋白質(zhì)的量的情況下，選擇所述試驗 物質(zhì)作為移植物抗宿主疾病治療藥的候選物質(zhì)。
7. —種用于治療移植物抗宿主疾病的藥物組合物，含有抗CCL8抗體作為有效成分。
8. —種治療移植物抗宿主疾病的方法，包括向患有移植物抗宿主疾病的受試者給與抗 CCL8抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢查移植物抗宿主疾病的方法，其特征在于測定取自受試者的試樣中CCL8蛋白質(zhì)的量，并將得到的測定值作為移植物抗宿主疾病的診斷或過程的指標(biāo)。另外，還公開了含有抗CCL8抗體的移植物抗宿主疾病的診斷試劑。通過本發(fā)明方法可以診斷移植物抗宿主疾病的發(fā)病及監(jiān)控其過程，特別是可以進行移植物抗宿主疾病和傳染病之間的鑒別診斷。進而還提供一種使用抗CCL8抗體的移植物抗宿主疾病的治療方法。
文檔編號G01N30/72GK101743473SQ20088002142
公開日2010年6月16日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者今井浩三, 堀司, 堤裕幸, 小?？捣? 苗代康可 申請人:北海道公立大學(xué)法人札幌醫(yī)科大學(xué);株式會社免疫生物研究所