專利名稱：：應(yīng)用生物傳感器檢測(cè)與固定化靶標(biāo)分子直接結(jié)合的小分子的方法應(yīng)用生物傳感器檢測(cè)與固定化靶標(biāo)分子直接結(jié)合的小分子的方法優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求2007年4月19日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/912，725的權(quán)益，該申請(qǐng)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
：鑒定針對(duì)藥物性蛋白質(zhì)靶的高品質(zhì)的先導(dǎo)化合物是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)。產(chǎn)生新的可優(yōu)化的先導(dǎo)化合物是十分困難的。最近，人們探索出基于碎片的篩選法(fragment-basedscreening)作為產(chǎn)生高品質(zhì)先導(dǎo)化合物的方法。分子量約為lOODa至約300Da的化合物(即"碎片")似乎比分子量約為300Da至約600Da的化合物可提供更好的先導(dǎo)化合物，這種觀點(diǎn)一直用來(lái)制備先導(dǎo)化合物。雖然碎片常常是弱結(jié)合分子，但是篩選與治療靶蛋白結(jié)合的低分子量弱結(jié)合分子可用于確定小的構(gòu)建模塊，它們可用來(lái)通過(guò)化學(xué)結(jié)合提供略高分子量的緊密結(jié)合的化合物。這些分子可具有針對(duì)靶蛋白的治療作用。盡管低分子量化合物可引導(dǎo)開發(fā)出有效的藥物，鑒定弱結(jié)合但是極低分子量化合物的進(jìn)展極緩并困難重重。尋找與蛋白質(zhì)或靶分子結(jié)合的各種大小的化合物的現(xiàn)有方法均涉及需要化合物以一定能量進(jìn)行結(jié)合，這種能量通常不能通過(guò)碎片化合物獲得。用于鑒定與蛋白質(zhì)結(jié)合的碎片化合物的現(xiàn)有鑒定方法需要大量蛋白質(zhì)，耗費(fèi)勞力，還需要非常熟練的人員來(lái)操作的昂貴儀器，而且篩選很少幾種化合物要花上許多天或者許多周的時(shí)間。典型的方法應(yīng)用經(jīng)典生物物理學(xué)技術(shù)，例如多維核磁共振波譜法(NMR)、x-射線晶體學(xué)檢測(cè)法或等溫滴定量熱法(isothermaltitrationcalorimetry)。本領(lǐng)域需要使用少量試驗(yàn)化合物以高通量方式篩選基于碎片的約lOODa至約300Da的化合物文庫(kù)的方法。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測(cè)定小分子對(duì)靶分子的親和力的方法。該方法包括使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器(colorimetricresonantreflectancebiosensor)表面上并測(cè)定第一峰波長(zhǎng)值；將小分子按3種以上不同濃度加到比色共振反射生物傳感器表面并測(cè)定3種以上不同濃度的峰波長(zhǎng)值，對(duì)峰值波長(zhǎng)進(jìn)行比較以確定小分子對(duì)于靶分子的親和力。小分子可大約為300Da以下?？梢詼y(cè)定小分子的解離常數(shù)(Kd)。小分子的解離常數(shù)可約為2，000iiM至約750iiM。小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測(cè)定小分子樣品的等級(jí)親和力(rankaffinity)的方法，該方法包括檢測(cè)比色共振反射生物傳感器表面的第一峰波長(zhǎng)值；使已知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第二峰波長(zhǎng)值；使用第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值確定與比色共振反射生物傳感器結(jié)合的靶分子的摩爾量；將特定濃度的已知分子量的小分子樣品加到比色共振反射生物傳感器上并測(cè)定第三峰波長(zhǎng)值；第二峰波長(zhǎng)值和第三峰波長(zhǎng)值之間的差值給出了與比色共振反射生物傳感器表面結(jié)合的小分子的量；使用第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值之間的差值與第二峰波長(zhǎng)值和第三峰波長(zhǎng)值之間的差值的比率，確定小分子樣品的等級(jí)親和力。小分子樣品可包含大約300Da以下的小分子。小分子樣品中小分子的解離常數(shù)可約為2，000M至約750M。小分子樣品中小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供測(cè)定小分子是否與靶分子的特定位點(diǎn)結(jié)合或者與已知的靶位點(diǎn)封阻劑竟?fàn)幮越Y(jié)合靶分子的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括使靶分子固定在第一比色共振反射生物傳感器上；使靶分子固定在第二比色共振反射生物傳感器上，其中靶分子的靶位點(diǎn)用已知的靶位點(diǎn)封阻劑封閉；將小分子加到第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器上并測(cè)定第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值，如果第一比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值與第二比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值相比發(fā)生位移，則小分子與已知封阻劑竟?fàn)幮越Y(jié)合靶分子的靶位點(diǎn)或與靶分子的特定位點(diǎn)結(jié)合。小分子可約為300Da以下。小分子的解離常數(shù)可約為2，000iiM至約750iiM。小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案提供測(cè)定300Da以下的小分子是否與靶分子結(jié)合的方法，該方法包括使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第一峰波長(zhǎng)值；將小分子加到比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第二峰波長(zhǎng)值；對(duì)第一峰波長(zhǎng)和第二峰波長(zhǎng)進(jìn)行比較，如果第二峰波長(zhǎng)值與第一峰波長(zhǎng)值相比發(fā)生位移，則小分子與靶分子結(jié)合?？蓽y(cè)出小分子的解離常數(shù)(Kd)。小分子的解離常數(shù)可約為2，000iiM至約750iiM。小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。因此，本發(fā)明可以測(cè)定與靶生物分子結(jié)合的、本領(lǐng)域技術(shù)人員稱之為碎片的極低分子量化合物。本發(fā)明方法較之用于定量測(cè)定和定性測(cè)定碎片分子與靶生物分子相互作用以及用于測(cè)定碎片分子其它性質(zhì)的典型生物化學(xué)試驗(yàn)法的精確性更高。比起通常相同應(yīng)用的傳統(tǒng)方法(例如NMR波譜法、x-射線晶體學(xué)檢測(cè)法或熱量法)，本發(fā)明方法更經(jīng)濟(jì)，耗時(shí)更少，需要的試劑更少。附圖詳述圖1顯示用于靈敏檢測(cè)小分子與靶表面弱締合的生物傳感器的再現(xiàn)性。圖2顯示當(dāng)以相同濃度加到對(duì)照表面或封閉表面(x軸)和靶表面(y軸)上時(shí)，與靶表面(y軸)相比，聚集化合物和miso錯(cuò)配化合物在兩種表面上提供顯著不同的信號(hào)。圖3顯示可應(yīng)用本發(fā)明的方法進(jìn)行滴定獲得已知結(jié)合化合物的理想的親和力結(jié)合曲線，該結(jié)合化合物通過(guò)其它生物物理方法獲得。圖4表明本發(fā)明的方法能夠測(cè)定弱締合碎片與不同結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。圖5顯示用于確定特異性的結(jié)合時(shí)程實(shí)驗(yàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案可供在不需要摻入放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記或熒光標(biāo)記的情況下，甚至在結(jié)合性相互作用非常弱的情況下，應(yīng)用生物傳感器(例如比色共振反射生物傳感器)直接測(cè)定小分子(亦稱碎片)與靶分子的結(jié)合?？刹捎酶咚俑叻直鎯x器，例如BINDScanner(即比色共振反射生物傳感器系統(tǒng))，并應(yīng)用量化數(shù)據(jù)的相應(yīng)算法，對(duì)結(jié)合進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?，951，715和美國(guó)專利公開文本2004/0151626。將這樣的方法、儀器和計(jì)算分析結(jié)合起來(lái)，可以無(wú)標(biāo)記的方式、甚至在結(jié)合非常弱情況下，方便地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小分子與靶分子的結(jié)合。生物傳感器本發(fā)明的生物傳感器可以是比色共振反射生物傳感器。參見例如Cu皿ingham等，"Colorimetricresonantreflectionasadirectbiochemicalassaytechnique(用作直接生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)的比色共振反射)"，SensorsandActuatorsB，第81巻，第316-328頁(yè)，2002年1月5日；美國(guó)專利公開號(hào)2004/0091397。比色共振生物傳感器并非表面等離振子共振(SPR)生物傳感器。SPR生物傳感器有一層薄的金屬層，例如銀、金、銅、鋁、鈉和銦。金屬必須具有能夠與合適波長(zhǎng)的光共振的導(dǎo)帶電子。暴露于光的SPR生物傳感器表面必須為純金屬。氧化物、硫化物和其它薄膜干擾SPR。比色共振生物傳感器不必有金屬層，相反它們具有高折射率材料(例如Ti0》的介電涂層。基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器可參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?，738，825?；诠鈻诺牟▽?dǎo)生物傳感器包括波導(dǎo)膜(waveguidingfilm)和衍射光柵，衍射光柵將入射光場(chǎng)投射(incouple)到波導(dǎo)膜上產(chǎn)生衍射光場(chǎng)，檢測(cè)出波導(dǎo)膜有效折射率的變化。光必須在其中傳播相當(dāng)距離的裝置，例如基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器，缺乏本發(fā)明的空間分辨率。在不需使用熒光標(biāo)簽、比色標(biāo)記或任何其它類型的檢測(cè)標(biāo)簽或檢測(cè)標(biāo)記的情況下，比色共振反射生物傳感器允許在生物傳感器的表面測(cè)定生化相互作用。生物傳感器表面含有光學(xué)結(jié)構(gòu)，該光學(xué)結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)成當(dāng)用平行光和/或白光照射時(shí)，只反射波長(zhǎng)窄帶("共振光柵效應(yīng)(resonantgratingeffect)")。波長(zhǎng)窄帶被稱為波長(zhǎng)"峰"。當(dāng)材料(例如生物材料)沉積到生物傳感器表面或從生物傳感器表面去除時(shí)，"峰波長(zhǎng)值"(peakwavelengthvalue,PWV)發(fā)生改變。使用讀出儀器用平行光和/或白光照射生物傳感器表面特定位置，收集反射光。使采集到的光聚集到波長(zhǎng)分光計(jì)以測(cè)定PWV?？梢酝ㄟ^(guò)將該生物傳感器面結(jié)構(gòu)(生物傳感器面向上)結(jié)合到無(wú)底微量滴定板柱體底部，將生物傳感器整合成標(biāo)準(zhǔn)的一次性實(shí)驗(yàn)器材，例如微量滴定板。最好將生物傳感器與常用實(shí)驗(yàn)室形式柱體整合，因?yàn)檫@樣的常用實(shí)驗(yàn)室形式柱體與現(xiàn)有的微量滴定板處理設(shè)備(例如混合器、培養(yǎng)箱和液體分配裝置)相兼容。比色共振反射生物傳感器還可被整合到例如微型流體設(shè)備、大型流體設(shè)備或微陣列設(shè)備中(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?，033，819、美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?，033，821)。比色共振反射生物傳感器可與本領(lǐng)域眾所周知的方法(參見例如MethodsofMolecularBiology,Jun_LinGuan主編，第294巻，HumanaPress,Totowa，NewJersey)—起使用以監(jiān)測(cè)分子與生物傳感器表面的共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合。比色共振反射生物傳感器包括各種分波長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)表面(subwave1engthstructuredsurfaces,SWS)，并且是可模擬薄膜涂層作用的非傳統(tǒng)型的衍射鏡片(Peng禾口Morris,"Resonantscatteringfromtwo-dimensionalgratings(二維光柵的共振散射)"，J.Opt.Soc.Am.A，第13巻，第5期，第993頁(yè)，1996年5月；Mag皿sson和Wang，"Newprincipleforopticalfilters(濾光片的新原理)"，Appl.Phys丄ett.，61，第9期，第1022頁(yè)，1992年8月；Peng禾口Morris,"Experimentaldemonstrationofresonantanomaliesindiffractionfromtwo-dimensionalgratings(二維光柵衍身寸中共振異常的實(shí)驗(yàn)證明)"，OpticsLetters，第21巻，第8期，第549頁(yè)，1996年4月)。SWS結(jié)構(gòu)含有一維光柵、二維光柵或三維光柵，其中與入射光波長(zhǎng)相比，光柵周期較短，致使不是衍射級(jí)次而是反射或透射零級(jí)次得到傳播。不支持導(dǎo)模橫向傳播。相反，導(dǎo)模共振效應(yīng)發(fā)生在距任何光子進(jìn)入生物傳感器結(jié)構(gòu)某點(diǎn)約3微米的非常有限的區(qū)域內(nèi)。將分子例如特異性結(jié)合物質(zhì)、耙分子或小分子或其組合加到生物傳感器的上表面，可調(diào)節(jié)比色共振反射生物傳感器的反射光或透射光。所加入的分子增加通過(guò)該結(jié)構(gòu)的6在一個(gè)實(shí)施方案中，比色共振反射生物傳感器被設(shè)計(jì)成用白光和/或平行光照射時(shí)，反射出單波長(zhǎng)或窄帶波長(zhǎng)("共振光柵效應(yīng)")。當(dāng)物質(zhì)沉積在生物傳感器表面上時(shí)，由于在生物傳感器上出現(xiàn)的光的光程發(fā)生改變，使得反射波長(zhǎng)發(fā)生位移。檢測(cè)系統(tǒng)例如由光源和分光計(jì)組成，光源通過(guò)例如光纖探頭以正入射照射到生物傳感器小點(diǎn)上，分光計(jì)則通過(guò)例如第二光纖探頭同樣以正入射采集反射光。由于在激發(fā)/檢測(cè)系統(tǒng)和生物傳感器表面之間沒(méi)有發(fā)生實(shí)物接觸，所以不需要特定的耦合棱鏡，可輕易地將生物傳感器裝配到包括例如微量滴定板在內(nèi)的任何常用實(shí)驗(yàn)平臺(tái)中?？稍跀?shù)毫秒內(nèi)進(jìn)行一次分光計(jì)讀數(shù)，因此很可能快速測(cè)定平行發(fā)生在生物傳感器表面的大量分子間的相互作用并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。選擇層厚度(即覆蓋層、生物材料或光柵)以實(shí)現(xiàn)對(duì)最上面所加入分子的共振波長(zhǎng)靈敏度。選擇光柵周期以在所需波長(zhǎng)下達(dá)到共振。比色共振反射生物傳感器包括例如光柵、基底層和任選一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)或接頭，光柵由高折射率材料組成，基底層支撐著光柵，特異性結(jié)合物質(zhì)或接頭則固定在基底層對(duì)側(cè)的光柵表面上。高折射率材料具有比基底層高的折射率。參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?，094，595、美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?，070，987?；讓涌蔀榫酆衔?、塑料、玻璃或納米多孔材料。參見美國(guó)專利公開文本2007/0009380。任選覆蓋層覆蓋了光柵表面。光柵涂有高折射率介電薄膜，該薄膜可由例如以下材料組成硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭、四氮化三硅和二氧化硅。具有光學(xué)特性的光柵的截面可包括任何周期性重復(fù)函數(shù)，例如"方波"。光柵還可包括選自以下形狀的重復(fù)形式線形(一維)、正方形、圓形、橢圓形、三角形、梯形、正弦波、卵形、矩形和六角形。本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器還可包括由涂有高折射率材料的例如塑料或環(huán)氧樹脂組成的光柵。線形光柵(即一維光柵)具有共振性質(zhì)，其中照射光偏振化的方向垂直于光柵周期。比色共振反射生物傳感器還可包括例如二維光柵，例如圓孔或正方形的六角陣列。也可以使用其它的形狀。線形光柵具有與六角陣列光柵相同的間距(即高折射率和低折射率區(qū)間的距離)、周期、層厚度和材料性質(zhì)。然而，為了共振偶聯(lián)到光學(xué)結(jié)構(gòu)上，必須使光垂直于光柵線偏振。因此，照射源和生物傳感器表面之間必須插入其偏振軸垂直于線形光柵方向的偏振片。因?yàn)檎丈涔庠粗兄簧俨糠直徽_偏振，所以與六角形光柵相比，需要較長(zhǎng)的積分時(shí)間(integrationtime)以收集等量的共振反射光。光柵還可包括例如"階形(st印ped)"剖面，其中單一固定高度的高折射率區(qū)被嵌入較低折射率的覆蓋層內(nèi)。高折射率和低折射率區(qū)的交替提供平行于生物傳感器頂面的光波導(dǎo)。本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器可進(jìn)一步包括在基底層對(duì)側(cè)的光柵表面上的覆蓋層。如果存在覆蓋層，則將一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)固定在光柵另一側(cè)的覆蓋層表面上。優(yōu)選覆蓋層包含的材料具有比構(gòu)成光柵的材料低的折射率。覆蓋層可由例如玻璃(包括旋壓玻璃(S0G))、環(huán)氧樹脂或塑料組成。例如，符合生物傳感器折射率要求的各種聚合物可用于覆蓋層。由于SOG的折射率適當(dāng)，易于處理，并且采用多種玻璃表面活化技術(shù)時(shí)易于被特異性結(jié)合物質(zhì)激活，所以可以使用S0G。當(dāng)生物傳感器表面的平直度對(duì)于具體系統(tǒng)設(shè)置不成問(wèn)題時(shí)，SiN/玻璃的光柵7結(jié)構(gòu)可被直接用作傳感表面，傳感表面的活化可以采用與玻璃表面相同的方法進(jìn)行。無(wú)需使光柵上面的覆蓋層偏振同樣可獲得共振反射。例如，生物傳感器可僅含有涂有高折射率材料的結(jié)構(gòu)化薄膜層的基底。無(wú)需使用平坦化覆蓋層，周圍的介質(zhì)(例如空氣或水)便充滿了光柵。因此，將特異性結(jié)合物質(zhì)固定在暴露于特異性結(jié)合物質(zhì)的所有光柵表面的生物傳感器上，而不是僅固定于上表面?！愣?，本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器使用可包括每個(gè)偏振角的光線的白光和/或平行光照射。生物傳感器光柵重復(fù)特征的偏振角方向?qū)Q定共振波長(zhǎng)。例如，由一套重復(fù)的直線和間隔組成的"線形光柵"(即一維光柵)生物傳感器將具有可產(chǎn)生各自共振反射的兩種光偏振。垂直于直線偏振的光稱為"s偏振"，而平行于直線偏振的光稱為"p偏振"。入射光的這兩個(gè)s和P組成在未過(guò)濾的照射光束中同時(shí)存在，各自產(chǎn)生獨(dú)立的共振信號(hào)。生物傳感器一般可設(shè)計(jì)成只使一種偏振(s偏振)的性質(zhì)最優(yōu)化，非優(yōu)化偏振易用偏振片消除。為了消除偏振依賴，以使得每個(gè)偏振角都產(chǎn)生相同的共振反射譜，可以使用由一套同心環(huán)組成的替代生物傳感器結(jié)構(gòu)。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，各同心環(huán)內(nèi)徑與外徑之間的差值大致相當(dāng)于光柵周期的1/2。各鄰接環(huán)的內(nèi)徑比前一環(huán)的內(nèi)徑大約l光柵周期。同心環(huán)模式延伸以覆蓋單個(gè)傳感器位置一例如一個(gè)陣列點(diǎn)(arrayspot)或一個(gè)微量滴定板孔。每個(gè)單獨(dú)的微陣列點(diǎn)或微量滴定板孔在其中心都具有單獨(dú)的同心環(huán)。這類結(jié)構(gòu)的所有偏振方向都具有相同的截面。同心環(huán)結(jié)構(gòu)必須精確地照射到中心以保持偏振獨(dú)立。同心環(huán)結(jié)構(gòu)的光柵周期不超過(guò)共振反射光波長(zhǎng)。光柵周期約為0.01微米至約1微米。光柵深約為0.01微米至約1微米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，孔或柱的陣列被排列得十分接近上述同心圓結(jié)構(gòu)，無(wú)需將照射光束集中在格柵的任何特定位置上。通過(guò)3條激光束以相同角度從三個(gè)方向入射到表面上的光波干涉，自動(dòng)生成這類陣列模式。在該模式中，孔(或柱)集中在一批緊密堆積的六角形的邊角處?？谆蛑渤霈F(xiàn)在各六角形中心。這類六角形格柵的孔或柱具有3個(gè)"看見"同一截面的偏振方向。因此，該六角形格柵結(jié)構(gòu)使用任何偏振角的光都提供等同的共振反射譜。因此，不需要偏振片以消除不需要的反射信號(hào)組成?？谆蛑闹芷诳杉s為0.01微米至約1微米，深或高可約為0.01微米至約1微米。檢測(cè)系統(tǒng)可包括比色共振反射生物傳感器、將光直射到比色共振反射生物傳感器的光源和從生物傳感器檢測(cè)光反射的檢測(cè)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，可應(yīng)用濾波器來(lái)簡(jiǎn)化讀出儀器，以便只有超過(guò)測(cè)定閾值的陽(yáng)性結(jié)果才引起檢測(cè)。通過(guò)測(cè)量共振波長(zhǎng)在本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器的各個(gè)不同位置上的位移，便可確定在哪一個(gè)獨(dú)特位置上有例如生物材料沉積。位移程度可用來(lái)測(cè)定例如試驗(yàn)樣品中結(jié)合配偶體(bindingpartner)的量，以及一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)和試驗(yàn)樣品中的結(jié)合配偶體之間的化學(xué)親和力。比色共振反射生物傳感器可被照射兩次。第一次測(cè)量測(cè)定生物傳感器(例如生物傳感器上無(wú)靶分子)一個(gè)或多個(gè)特定位置的反射光譜。第二次測(cè)量測(cè)定在例如一種或多種分子應(yīng)用到生物傳感器上后的反射光譜。這兩次測(cè)量間峰值波長(zhǎng)的差異是生物傳感器上分子存在或含量的量度。這種照射方法可以控制生物傳感器表面的小缺點(diǎn)，該缺點(diǎn)可導(dǎo)致具有峰共振波長(zhǎng)微小變化的區(qū)域。該方法還可控制生物傳感器上分子的濃度或密度變化。生物傳感器表面通過(guò)例如物理吸附或化學(xué)結(jié)合，可將一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)或靶分子固定在生物傳感器上。靶分子可以通過(guò)特異性結(jié)合物質(zhì)與生物傳感器表面特異性結(jié)合，特異性結(jié)合物質(zhì)例如核酸、肽、蛋白質(zhì)溶液、肽溶液、得自以下化合物的溶液組合化學(xué)品文庫(kù)(combinatorialchemicallibrary)、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab')2片段、Fv片段、有機(jī)小分子、病毒、聚合物或生物樣品，其中靶分子被固定在生物傳感器表面上。靶分子可與生物傳感器非共價(jià)或共價(jià)地連接。靶分子可被排列在生物傳感器表面的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特位置的陣列上，所述表面可位于多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔內(nèi)，并包括多孔板或微陣列的一個(gè)或多個(gè)表面。靶分子陣列在微孔板內(nèi)的生物傳感器表面上包含一種或多種靶分子，使得表面含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特位置，各具有不同的靶分子或不同量的靶分子。例如，陣列可包括1、10、100、1，000、10，000或100，000個(gè)以上的獨(dú)特位置。因此，多孔板或微陣列的每孔內(nèi)可具有與多孔板其它孔分隔開的一個(gè)或多個(gè)特定位置的陣列，這可供在一塊多孔板上對(duì)多種不同的樣品進(jìn)行處理。任一孔內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)陣列可與存在于同一微量滴定板的任何其它微量滴定板孔的一個(gè)或多個(gè)陣列相同或不同。還可通過(guò)與例如下列官能接頭(functionallinker)結(jié)合實(shí)現(xiàn)將靶分子固定到生物傳感器表面上鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、巰基、有機(jī)磷酸酯基、脂質(zhì)基(lipidgroup)、磷脂基或類固醇基。此外，還可通過(guò)物理吸附、化學(xué)結(jié)合、電化學(xué)結(jié)合、靜電結(jié)合、疏水結(jié)合或親水結(jié)合及免疫捕捉方法，使靶分子固定在生物傳感器表面上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生物傳感器可用例如以下接頭涂敷例如鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、巰基、有機(jī)磷酸酯基、脂質(zhì)基、磷脂基或類固醇基。例如，胺表面可用來(lái)連接若干類型的接頭分子，而醛表面可用來(lái)直接結(jié)合蛋白質(zhì)而無(wú)需額外的接頭。鎳表面與具有摻入了組氨酸("his")標(biāo)簽的分子結(jié)合。用鎳活化表面檢測(cè)"his標(biāo)簽"化分子是本領(lǐng)域眾所周知的(Whitesides，Anal.Chem.68,490，(1996))。接頭和特異性結(jié)合物質(zhì)可被固定在生物傳感器表面，使得每孔都有相同的固定于此的接頭和/或特異性結(jié)合物質(zhì)?；蛘撸靠卓珊薪宇^和/或特異性結(jié)合物質(zhì)的不同組合。靶分子可與固定在生物傳感器表面的接頭或特異性結(jié)合物質(zhì)特異性或非特異性結(jié)合。或者，生物傳感器表面可能沒(méi)有接頭或特異性結(jié)合物質(zhì)，靶分子可與生物傳感器表面非特異性結(jié)合。使一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)或接頭固定在生物傳感器上，使得特異性結(jié)合物質(zhì)或接頭不會(huì)在漂洗過(guò)程沖被沖洗掉，并使得其與試驗(yàn)樣品中的靶分子的結(jié)合不受生物傳感器表面阻礙。已實(shí)施了若干類型的表面化學(xué)策略用于特異性結(jié)合物質(zhì)與例如用于不同類型微陣列和生物傳感器的玻璃、塑料或納米多孔材料的共價(jià)連接。使生物傳感器表面含有結(jié)合一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的適當(dāng)官能團(tuán)的生物傳感器的表面制備，這是生物傳感器制造方法的有機(jī)組成部分之一。通過(guò)物理吸附(即無(wú)需使用化學(xué)接頭)或通過(guò)化學(xué)結(jié)合(即需要使用化學(xué)接頭)以及電化學(xué)結(jié)合、靜電結(jié)合、疏水結(jié)合和親水結(jié)合，可將一種或多種特異性靶分子與生物傳感器表面連接?；瘜W(xué)結(jié)合可使特異性結(jié)合物質(zhì)較強(qiáng)地連接在生物傳感器表面上，并提供規(guī)定方向和構(gòu)象的表面結(jié)合分子。基本上按照固定到玻璃上的方法，可以將特異性結(jié)合物質(zhì)固定在塑料、環(huán)氧樹脂或高折射率材料上。然而，可以取消酸洗滌步驟，此處理可能損害特異性結(jié)合物質(zhì)所固定的材料。使用生物傳感器的方法本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供鑒定結(jié)合靶分子的一種或多種"小分子"(即低于約300Da的分子)的方法。靶分子可以是例如核酸分子、多肽、蛋白質(zhì)、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab')2片段、Fv片段、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)小分子、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌或生物樣品。小分子可以是例如核酸分子、多肽、抗原、抗體碎片、有機(jī)小分子或無(wú)機(jī)小分子。小分子可以小于約1Da、5Da、10Da、50Da、75Da、100Da、125Da、150Da、175Da、200Da、225Da、250Da、275Da或300Da。小分子可約為0.1Da至約500Da、約1Da至約300Da、約1Da至約200Da、約1Da至約100Da、約1Da至約50Da、約1Da至約25Da或介于約0.1Da至約500Da之間的任何范圍。具有適當(dāng)靈敏度的基于平板的無(wú)標(biāo)記方法可供快速篩選在靶分子任何位置上進(jìn)行結(jié)合的非常小(小于約300Da)的化合物的整個(gè)文庫(kù)。小分子文庫(kù)可包括約5、10、25、50、100、500、1，000、5，000、10，000種以上不同的小分子?；蛘?，小分子文庫(kù)可只包括一種類型的小分子。可將靶分子涂在生物傳感器表面的第一位置。測(cè)定第一位置的比色共振反射光的第一峰波長(zhǎng)值(PWV)或折射率。將小分子樣品(例如小分子文庫(kù))應(yīng)用到第一位置上。必要時(shí)，可將靶分子和小分子樣品保溫一段時(shí)間。測(cè)定第一位置的第二PWV或折射率。計(jì)算出第一個(gè)數(shù)值，其中第一個(gè)數(shù)值是第一PWV和第二PWV(或第一折射率和第二折射率)之間的差值。如果第二PWV(或折射率)與第一PWV相比發(fā)生了位移，則小分子樣品與靶分子結(jié)合。任選將第一個(gè)數(shù)值與對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行比較。對(duì)照試驗(yàn)可包括將靶分子涂在生物傳感器表面的第二位置?？稍诘谝慌蟹肿討?yīng)用到第一位置的同時(shí)或在稍后時(shí)間將這些靶分子涂在第二位置。這些靶分子可以是與涂在第一位置的那批靶分子相同類型的靶分子或不同類型的靶分子。檢測(cè)第二位置的第三PWV(或折射率)。將已知的靶分子結(jié)合劑(targetmoleculebinder)涂在第二位置。必要時(shí)，可將靶分子保溫一段時(shí)間。檢測(cè)第二位置的第四PWV(或折射率)。確定第二個(gè)數(shù)值，其中第二個(gè)數(shù)值是第二位置的第三PWV(或折射率)和第四PWV(折射率)之間的差值。如果第一個(gè)數(shù)值和第二個(gè)數(shù)值相同或相似，則小分子樣品與靶分子結(jié)合。如果第一個(gè)數(shù)值和第二個(gè)數(shù)值彼此在約lnm范圍內(nèi)，則它們相同或相似。因?yàn)樘讲榘蟹肿拥臒o(wú)標(biāo)記生物傳感器方法不會(huì)破壞靶分子，所以可對(duì)靶分子處理一次以上以找出隨時(shí)間變化的差異。生物傳感器表面上的第一位置和第二位置可以是選自以下容器的內(nèi)表面微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養(yǎng)皿、微流體通道和微陣列。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，小分子樣品和試驗(yàn)分子不必包含檢測(cè)標(biāo)記；然而，必要時(shí)，它們可包含標(biāo)記?？蓪⒁环N或多種耙分子涂在某一位置，例如生物傳感器表面的微量滴定板孔上。容器是指一個(gè)容器，而不是指一批容器，例如多孔板。檢測(cè)該位置的比色共振反射光峰波長(zhǎng)10種或多種靶分子保溫一段時(shí)間(例如1秒鐘、30秒鐘、1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)以上)。在保溫之前，或在保溫之后，或在保溫之前以及在保溫之后，可將一種或多種小分子應(yīng)用于一種或多種靶分子上?？梢缘诙螜z測(cè)該位置的比色共振反射光PWV。如果一種或多種小分子與靶分子結(jié)合，則與未發(fā)生結(jié)合的情況相比，光的反射波長(zhǎng)發(fā)生位移?？蓪⒌谝籔WV與第二PWV進(jìn)行比較。PWV的變化表明發(fā)生了結(jié)合?？蓽y(cè)定若干時(shí)段的PWV并進(jìn)行比較。還可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合(參見例如圖5)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以測(cè)定與靶分子結(jié)合的小分子的數(shù)量或濃度。參見例如圖1。在生物傳感器位置上的結(jié)合可通過(guò)生物傳感器表面的PWV檢測(cè)，或者更常見的是使用顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)、傳統(tǒng)相機(jī)或其它可視化儀器，利用基于透鏡的光學(xué)裝置或基于電子的電荷耦合裝置(CCD)技術(shù)放大或不放大信號(hào)來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。優(yōu)選測(cè)定PWV的掃描儀的透鏡的分辨率約為2至約200、約2至約50或約2至約15微米像素大小。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)可以在約1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘以內(nèi)完成。也就是說(shuō)以省時(shí)的方式測(cè)定結(jié)合。在開發(fā)和設(shè)計(jì)藥物時(shí)，使第一分子與小分子連接可能是有利的，其中第一分子與靶分子的靶位點(diǎn)結(jié)合，小分子與靶分子的靶位點(diǎn)或相鄰位點(diǎn)結(jié)合。這樣可將特異性附加在與靶位點(diǎn)結(jié)合的第一分子上。例如，對(duì)于具有類似功能的靶分子來(lái)說(shuō)，許多靶標(biāo)活性位點(diǎn)十分相似。然而，耙分子很可能具有鄰近活性位點(diǎn)的獨(dú)特位點(diǎn)。通過(guò)一部分鄰接分子使靶位點(diǎn)封閉以及通過(guò)鄰接分子的結(jié)合部分對(duì)更為獨(dú)特的相鄰靶位點(diǎn)的特異性，來(lái)獲得鄰接分子的優(yōu)勢(shì)。因此，鑒定在特定靶位點(diǎn)以外與靶分子結(jié)合的小分子可能是有利的。另外，因?yàn)楸景l(fā)明提供能夠測(cè)定多個(gè)連續(xù)相互反應(yīng)的靜態(tài)系統(tǒng)，所以能用來(lái)測(cè)定多個(gè)小分子連接(在不同位點(diǎn)上，包括同一靶分子內(nèi)的不同位點(diǎn))事件。可以用例如在靶位點(diǎn)結(jié)合(共價(jià)或非共價(jià))靶分子的分子("封阻劑分子")"封閉"靶分子。靶位點(diǎn)可以是例如這樣一個(gè)位點(diǎn)如果其被封閉，則失活或激活靶分子。因此可用小分子文庫(kù)探測(cè)封閉和未封閉的靶分子傳感器表面，以便從在靶分子未封閉位點(diǎn)上與靶分子結(jié)合的文庫(kù)中找出小分子。本發(fā)明的方法還提供通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定在相同結(jié)合位點(diǎn)上或接近相同結(jié)合位點(diǎn)與靶分子相互作用/結(jié)合的分子。本發(fā)明的方法還提供通過(guò)滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)定親合力(avidity)及親和力(affinity)或平衡結(jié)合常數(shù)。親合力是多個(gè)鍵合作用的綜合強(qiáng)度。因此，親合力是化學(xué)鍵親和力的綜合協(xié)同強(qiáng)度而不是化學(xué)鍵的總和。親和力是指單鍵的強(qiáng)度。親和力指標(biāo)包括但不限于平衡結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)、結(jié)合速率和解離速率。解離常數(shù)(Kd)是小分子與靶分子之間的親和力，因此表明小分子如何緊密地與特定靶分子結(jié)合。親和力可受例如兩個(gè)小分子和靶分子之間的以下共價(jià)相互作用和非共價(jià)分子間相互作用的影響例如氫鍵結(jié)合、靜電相互作用、疏水力和范德華力。本發(fā)明的方法可檢測(cè)用其它方法無(wú)法檢測(cè)到的小分子和靶分子之間的極弱結(jié)合。例如，可在下列Kd下，檢測(cè)到小分子和靶分子間的結(jié)合大于約2，000iiM、1，500iiM、1，000iiM、750iiM、500iiM、250iiM、100iiM、50iiM、25iiM、10iiM、5iiM、1iiM以上。可在下列Kd下檢測(cè)到小分子和耙分子間的結(jié)合約2，000iiM至約0.001yM、約2，000yM至約0.01iiM、約2，000iiM至約1，000iiM、約2，000iiM至約1，500iiM、約2，000iiM至約750iiM、11約1，500iiM至約0.01iiM、約1，000iiM至約0.01iiM、約750iiM至約0.01iiM、約500iiM至約0.01iiM、約250iiM至約0.01iiM或者約2，000yM至約0.001yM之間的任何范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于測(cè)定小分子對(duì)靶分子的親和力?？墒拱蟹肿庸潭ㄔ诒壬舱穹瓷渖飩鞲衅鞅砻嫔稀y(cè)定第一峰波長(zhǎng)值。可將小分子按例如3、5、10、12、15、24或36以上(2和1，000之間的任何范圍)的不同濃度，加到比色共振反射生物傳感器表面上。實(shí)質(zhì)上是為了繪出滴定曲線。檢測(cè)各個(gè)不同濃度的峰波長(zhǎng)值。對(duì)峰值波長(zhǎng)進(jìn)行比較，以確定小分子對(duì)于靶分子的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，耙分子或小分子或兩者的分子量是已知的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供測(cè)定小分子等級(jí)親和力值的方法。測(cè)定比色共振反射生物傳感器表面的第一峰波長(zhǎng)值。使已知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上。測(cè)定第二峰波長(zhǎng)值。使用第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值的差值確定與比色共振反射生物傳感器結(jié)合的靶分子的摩爾量。將特定濃度的已知分子量的小分子加到比色共振反射生物傳感器上。不需要確切的分子量。例如，可采用分子量近似值。例如使用450Da與30，OOODa耙標(biāo)結(jié)合，可估計(jì)小分子文庫(kù)的分子量范圍為300-600，對(duì)于耙標(biāo)300-600之間的差異在比值上可忽略不計(jì)。測(cè)定第三峰波長(zhǎng)值。第二峰波長(zhǎng)值和第三峰波長(zhǎng)值之間的差值提供了與比色共振反射生物傳感器表面結(jié)合的小分子的量。用第二峰波長(zhǎng)值和第三峰波長(zhǎng)值之間的差值與第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值之間差值的比率，確定小分子的等級(jí)親和力。本發(fā)明還提供用于測(cè)定小分子是否與靶分子的特定位點(diǎn)結(jié)合或者與已知靶位點(diǎn)封阻劑竟?fàn)幮越Y(jié)合靶分子的靶位點(diǎn)的方法?？墒拱蟹肿庸潭ㄔ诘谝槐壬舱穹瓷渖飩鞲衅魃稀Ｍ瑯邮拱蟹肿庸潭ㄔ诘诙壬舱穹瓷渖飩鞲衅魃?，其中靶分子的靶位點(diǎn)用已知的靶位點(diǎn)封阻劑封閉。將小分子加到第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器上并測(cè)定第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值。如果第一比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值與第二比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值相比發(fā)生位移，則小分子與已知封阻劑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶分子靶位點(diǎn)或與靶分子的特定位點(diǎn)結(jié)合。本發(fā)明還可測(cè)定固定化靶分子與所加入的小分子的化學(xué)計(jì)量比。此外，可用本發(fā)明方法測(cè)量的超化學(xué)計(jì)量相互作用(s卯erstoichiometricinteraction)，來(lái)測(cè)定小分子的相互作用或"粘性(stickiness)"的特異性。一般而言，在藥物設(shè)計(jì)中，理想的是避免超化學(xué)計(jì)量或"粘性"小分子，也就是說(shuō)與靶分子超過(guò)一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的小分子，因?yàn)樗鼈儗?duì)特定靶標(biāo)缺乏特異性，且最終導(dǎo)致不良毒性。在一個(gè)實(shí)施例中，隨時(shí)間變化定量測(cè)定固定在傳感器上的耙分子的量。例如于0.1分鐘至1小時(shí)(或之間的任何范圍)測(cè)定PWV。可采用2、5、10、20、30、50、100、200個(gè)以上(或之間的任何范圍)的時(shí)間點(diǎn)。如果利用本發(fā)明的一種形式提供PWV位移約為2ng/mm2，且具有固定化靶標(biāo)分子量值，則可計(jì)算出固定在傳感器上靶標(biāo)分子的摩爾數(shù)(2ng/m^乘以傳感器讀數(shù)面積大小(單位為mm2)乘以1摩爾/分子量靶標(biāo))。運(yùn)用下列等式，使用該值計(jì)算出可結(jié)合靶標(biāo)的小分子的相應(yīng)量靶標(biāo)固定PWV位移乘以(配體分子量/耙標(biāo)分子量)。應(yīng)用本發(fā)明，得到超過(guò)這個(gè)數(shù)值的PWV位移值表示超化學(xué)計(jì)量結(jié)合。如果數(shù)值是2-5倍的倍數(shù)，則該值很可能是與靶標(biāo)實(shí)際結(jié)合。如果該值大于此值數(shù)倍，則可表示聚集化合物。參見例如圖5。12通常當(dāng)測(cè)定分子和靶分子間的解離常數(shù)時(shí)，與靶分子結(jié)合的分子濃度適宜約為預(yù)期Kd的10倍以上。然而，由于分子在少量非水溶劑(例如可能與敏感生物系統(tǒng)一起使用)中的固有溶解度，因此可能難以在如此高的濃度下篩選出小分子。本發(fā)明提供測(cè)定在低濃度小分子下小分子和耙分子的親和力的方法(例如約2mM、約lmM、約0.5mM、約0.25mM或約2mM至約0.5mM、約2mM至約0.25mM、約0.5mM至約0.OlmM或者2mM和0.OlmM之間的任何范圍)。在小分子濃度低于Kd的情況下，如果確能檢測(cè)出，則大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)合信號(hào)顯著減弱。結(jié)合信號(hào)將隨濃度增加而升至濃度點(diǎn)等于Kd時(shí)的最大信號(hào)l/2的點(diǎn)上。由于本發(fā)明可供預(yù)測(cè)最大信號(hào)(見上文)，開始發(fā)出結(jié)合信號(hào)的任何較低濃度的小分子便從一條斜線開始，延伸到預(yù)期的平臺(tái)期。本領(lǐng)域從業(yè)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可由所述斜率和所述最大信號(hào)確定小分子對(duì)靶標(biāo)的親和力。本發(fā)明的方法還可通過(guò)在抑制型實(shí)驗(yàn)中置換已知的結(jié)合配偶體，從而用來(lái)測(cè)定生物活性的降低。將已知的結(jié)合配偶體和一種或多種小分子兩者同時(shí)加到已封閉或未封閉靶位點(diǎn)的生物傳感器表面上。對(duì)照實(shí)驗(yàn)包括僅一種或多種小分子、僅已知的結(jié)合配偶體或者無(wú)分子被加到封閉和未封閉的表面上。本發(fā)明的方法還可鑒定和校正在測(cè)試封閉(用已知的靶分子結(jié)合劑)和未封閉的靶分子之間可能出現(xiàn)的差異。例如，如果將已知的緊密結(jié)合分子加到涂有靶分子的生物傳感器表面，然后將小分子文庫(kù)(溶于匿SO緩沖液或鹽緩沖液)加到表面上，則可檢測(cè)出信號(hào)。該信號(hào)可表示結(jié)合。或者，該信號(hào)可表示由鹽緩沖液或匿SO緩沖液所引起的假信號(hào)。例如，小分子文庫(kù)溶液中的匿S0可能引起的信號(hào)變化高達(dá)25%以上。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案通過(guò)對(duì)耙位點(diǎn)封閉和未封閉的生物傳感器表面上的匿SO進(jìn)行滴定以提供"錯(cuò)配"校正。靶位點(diǎn)封閉表面是這樣的表面其中靶分子被固定在生物傳感器表面上且將已知與靶分子靶位點(diǎn)結(jié)合的一種分子(即"封阻劑分子")加到生物傳感器表面上。未封閉表面是這樣的表面其中靶分子被固定在生物傳感器表面上。將一種或多種類型的小分子加到封閉的和未封閉的表面上。如果在封閉的生物傳感器表面上觀察到陰性PWV位移，則匿S0或鹽緩沖液引起變化。如果在封閉的表面上及在未封閉的表面均觀察到陽(yáng)性位移，則小分子在非已知的結(jié)合分子的位點(diǎn)上與靶標(biāo)分子結(jié)合。如果在未封閉的表面觀察到陽(yáng)性位移，且在封閉的表面上觀察到較弱的陽(yáng)性位移，則已知的結(jié)合分子和小分子在同一靶位點(diǎn)上結(jié)合。參見例如圖4。為了校正由匿SO或鹽緩沖液引起的變化，可將在參照表面或?qū)φ毡砻嫔蠝y(cè)量的PWV陰性位移加到靶表面的結(jié)合信號(hào)中。本發(fā)明方法可檢測(cè)的相互作用的類型的實(shí)例見表1。表l特異性相互作用其它相互作用化學(xué)計(jì)量i:i超化學(xué)計(jì)量劑量反應(yīng)曲線與結(jié)合等溫線匹配良好劑量反應(yīng)曲線與結(jié)合等溫線匹配差13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本文中任何部分提及的所有專利、專利申請(qǐng)和其它科技文獻(xiàn)通過(guò)引用將其整體結(jié)合到本文中。本文對(duì)本發(fā)明作了示例性描述，可在不存在本文未具體公開的任何要素或限制時(shí)，適當(dāng)?shù)貙?shí)施本發(fā)明。因此，例如，在本文任何情況下，術(shù)語(yǔ)"包含(含)"、"基本上由......組成"和"由......組成"中的任一個(gè)可被其它兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中的任一個(gè)替換，而又保持它們的通用含義。所使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)方式是描述性的而非限制性的，而且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)方式時(shí)，并不排除所寫明和記載的特征或特征部分的任何等同特征或特征部分，但是要了解的是，各種修改都可能落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)當(dāng)了解的是，雖然通過(guò)實(shí)施方案、任選特征具體地公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助本文所公開的構(gòu)思作出修改和變動(dòng)，這些修改和變動(dòng)也被認(rèn)為屬于本發(fā)明說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)。另外，在以馬庫(kù)什要素組或其它可選擇要素組描述了本發(fā)明的特征或方面的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明因此也已經(jīng)通過(guò)馬庫(kù)什要素組或其它要素組的各單一成員或成員亞組的形式得以說(shuō)明了。實(shí)施例使具有腺苷三磷酸酶結(jié)合域的靶分子即蛋白質(zhì)X(26kDa)固定在比色共振反射生物傳感器上。將文庫(kù)成員平均分子量〈300Da的化合物文庫(kù)加到生物傳感器上。檢測(cè)到文庫(kù)組分與生物傳感器直接結(jié)合。用生物物理學(xué)方法，包括NMR和X-射線晶體學(xué)檢測(cè)法，還獲得了化合物文庫(kù)的結(jié)合數(shù)據(jù)。對(duì)約500種分子的2%匿SO緩沖液進(jìn)行了篩選。讀數(shù)時(shí)間少于10分鐘。配體篩選濃度為250iiM和lmM。結(jié)果如下200Da配體的動(dòng)態(tài)量程為1:l化學(xué)計(jì)量，完全結(jié)合60pm，S/N=12;陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的正確鑒定；檢測(cè)/滴定的親和力范圍為lnM至約lmM;與較低通量的生物物理學(xué)方法呈強(qiáng)命中相關(guān)(stronghitcorrelation)。對(duì)下列化合物進(jìn)行了鑒定(參見圖2和圖3):碎片A(Mr=265Da，Kd--0.OluM)碎片B(Mr=263Da，Kd--luM)'碎片c(Mr=249Da，Kd--luM)碎片D(Mr=168Da，Kd--IOOuM)碎片E(Mr=215Da，Kd--IOuM)碎片F(xiàn)(Mr=265Da，Kd--0.luM)碎片G(Mr=283Da，Kd—-0.OOluM)圖1表示用于靈敏檢測(cè)與蛋白質(zhì)X弱締合的小分子的生物傳感器的再現(xiàn)性，蛋白質(zhì)X被固定在傳感器表面上。以lmM或0.25mM的濃度，將小分子加到傳感器板表面。結(jié)果證實(shí)是高度可再現(xiàn)的定量結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)96孔板和384孔板中進(jìn)行。圖2表示當(dāng)將聚集化合物和匿S0錯(cuò)配化合物以相同濃度加到對(duì)照表面或封閉表面(x軸)上時(shí)，與靶表面(y軸)相比，聚集化合物和匿SO錯(cuò)配化合物在對(duì)照表面或封閉表面(x軸)產(chǎn)生顯著不同的信號(hào)。該圖在圓圈區(qū)域內(nèi)突出顯示了用來(lái)獲得實(shí)驗(yàn)穩(wěn)健性統(tǒng)計(jì)評(píng)估的陽(yáng)性對(duì)照(已知結(jié)合)化合物。由于聚集分子所致，該實(shí)驗(yàn)鑒定出假陽(yáng)性(陰影框以外的分子)。本實(shí)驗(yàn)強(qiáng)相關(guān)性地證實(shí)了結(jié)合化合物，正如用以下其它生物物理實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的一樣核磁共振波譜法、x-射線晶體學(xué)檢測(cè)法和等溫滴定熱量法。圖2表示得自5塊96-孔傳感器板之一的代表性數(shù)據(jù)。圖3"標(biāo)準(zhǔn)"曲線圖顯示可應(yīng)用本發(fā)明的方法進(jìn)行滴定，獲得已知結(jié)合化合物的理想的親和力結(jié)合曲線，該結(jié)合化合物通過(guò)其它生物物理方法獲得。"BINDHits"曲線圖表示可以通過(guò)繪出擬合到用于親和力等級(jí)評(píng)定的平衡結(jié)合常數(shù)的滴定曲線，從而通過(guò)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的生物化學(xué)表征，以證實(shí)由本發(fā)明方法"發(fā)現(xiàn)的"化合物為結(jié)合化合物。因此，本發(fā)明的方法可用來(lái)確定各結(jié)合化合物如何緊密地與靶分子結(jié)合，以確定化學(xué)計(jì)量，并采用例如競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)確定各個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。圖4表明本發(fā)明的方法能夠測(cè)定弱締合碎片與不同結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。給出大于零的信號(hào)以及當(dāng)在靶表面測(cè)試和在封閉靶表面測(cè)定時(shí)信號(hào)大致接近的化合物，對(duì)靶標(biāo)無(wú)特異性且不大可能與靶標(biāo)的單一位點(diǎn)實(shí)際結(jié)合。比起它們?cè)诜忾]靶表面顯示的信號(hào)，在突出顯示的圓形區(qū)域中的化合物在靶標(biāo)上顯示出顯著較強(qiáng)的信號(hào)，因此被確定為具有結(jié)合特異性且有適當(dāng)比率，與由PWV位移信號(hào)提供的摩爾計(jì)算值一樣。圖5表示用于特異性測(cè)定的結(jié)合時(shí)程實(shí)驗(yàn)。較慢的結(jié)合可表示較低的特異性，尤其當(dāng)PWV位移超過(guò)1:l化學(xué)計(jì)量時(shí)。化合物孔F11和孔F4表示"粘性"或超化學(xué)計(jì)量的化合物。正常的l:l結(jié)合表明發(fā)生在混合時(shí)間的穩(wěn)定平臺(tái)信號(hào)(化合物孔G7)。權(quán)利要求一種測(cè)定小分子對(duì)靶分子的親和力的方法，其中該方法包括(a)使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第一峰波長(zhǎng)值；(b)將小分子以3種以上不同的濃度加到比色共振反射生物傳感器表面并測(cè)定所述3種以上不同濃度的峰波長(zhǎng)值；對(duì)峰值波長(zhǎng)進(jìn)行比較以確定小分子對(duì)于靶分子的親和力。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述小分子小于約300Da。3.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)定所述小分子的解離常數(shù)(Kd)。4權(quán)利要求3的方法，其中所述小分子的解離常數(shù)約為2，000iiM至約750yM。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述小分子的濃度約為0.5mM至約0.OlmM。6.—種測(cè)定小分子樣品的等級(jí)親和力的方法，該方法包括(a)檢測(cè)比色共振反射生物傳感器表面的第一峰波長(zhǎng)值；(b)使已知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第二峰波長(zhǎng)值；(c)利用第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值確定與比色共振反射生物傳感器結(jié)合的靶分子的摩爾量；(d)將特定濃度的已知分子量的小分子樣品加到比色共振反射生物傳感器上并測(cè)定第三峰波長(zhǎng)值；其中第二峰波長(zhǎng)值和第三峰波長(zhǎng)值之間的差值給出了與比色共振反射生物傳感器表面結(jié)合的小分子的量；(e)利用第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值之間的差值與第二峰波長(zhǎng)值和第三峰波長(zhǎng)值之間的差值的比率確定小分子樣品的等級(jí)親和力。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述小分子樣品包含小于約300Da的小分子。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述小分子樣品中的小分子的解離常數(shù)約為2，000M至約750iiM。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述小分子樣品中的小分子濃度約為0.5mM至約0.OlmM。10.—種測(cè)定小分子是否與靶分子的特定位點(diǎn)結(jié)合或者是否與已知封阻劑競(jìng)爭(zhēng)性靶向結(jié)合靶分子的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括(a)使靶分子固定在第一比色共振反射生物傳感器上；(b)使靶分子固定在第二比色共振反射生物傳感器上，其中所述靶分子的靶位點(diǎn)用所述耙位點(diǎn)的已知封阻劑封閉；(c)將小分子加到第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器上并測(cè)定第一比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值和第二比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值；其中，如果對(duì)第一比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值與第二比色共振反射生物傳感器的峰波長(zhǎng)值相比發(fā)生位移，則小分子與已知封阻劑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶分子上的靶位點(diǎn)或者小分子與靶分子的特定位點(diǎn)結(jié)合。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述小分子小于約300Da。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述小分子的解離常數(shù)約為2，000iiM至約750yM。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述小分子的濃度約為0.5mM至約0.OlmM。14.一種測(cè)定300Da以下的小分子是否與靶分子結(jié)合的方法，其中該方法包括(a)使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第一峰波長(zhǎng)值；(b)將小分子加到比色共振反射生物傳感器表面上并測(cè)定第二峰波長(zhǎng)值；對(duì)第一峰波長(zhǎng)值和第二峰波長(zhǎng)值進(jìn)行比較，其中如果第二峰波長(zhǎng)值與第一峰波長(zhǎng)值相比發(fā)生位移，則小分子與靶分子結(jié)合。15.權(quán)利要求14的方法，其中測(cè)定所述小分子的解離常數(shù)(Kd)。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述小分子的解離常數(shù)約為2，000iiM至約750yM。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述小分子的濃度約為0.5mM至約0.OlmM。全文摘要本發(fā)明提供應(yīng)用生物傳感器檢測(cè)與固定化靶標(biāo)直接結(jié)合的小分子的方法。本發(fā)明提供檢測(cè)小分子與靶分子相互作用的方法。文檔編號(hào)G01N33/50GK101743465SQ200880021272公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年4月19日優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日發(fā)明者L·萊恩,R·沃納申請(qǐng)人:Sru生物系統(tǒng)公司