專利名稱：白介素i天然拮抗劑的仿生親和純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的方法，具體地說，是一種白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法。
背景技術：
白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)可有效地阻斷IL-1的活性，使機體過高的TNF、IL-6水平趨于正常，而不干擾內環(huán)境平衡，治療某些與細胞因子失調有關的炎癥性疾病。目前，重組人IL-1ra已在臨床上試用于治療敗血癥、類風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、哮喘、髓源性白血病，以及移植物抗宿主反應等疾病。我國哮喘病患者約有2500萬，已成為第二大呼吸道疾病，患過敏性鼻炎到病人約2000萬人。因此，急需白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)生產用的規(guī)?；兓夹g。人白介素I天然拮抗劑可用離子交換層析，疏水層析等方法多步連用進行純化。但工藝復雜，操作耗時、耗力、回收率低、成本高。
經(jīng)對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Takemasa Takii等在《干擾素和細胞因子研究雜志》上發(fā)表的《利用短桿菌大規(guī)模表達人白介素I天然拮抗劑》(HumanInterleukin-1 Receptor AntagonistLarge-Scale Expression in Bacillusbrevis 47-5Q，Journal of Interferon & Cytokine Research，Nov 1999，Vol.19，No.111325-1331)。該論文將抗人白介素I天然拮抗劑的單克隆抗體固定制作免疫親和層析介質后，再用免疫親和層析一步純化人白介素I天然拮抗劑。該方法利用親和分離技術的優(yōu)點，使純化步驟少，操作簡單。由于該方法中使用的單克隆抗體制備成本高，性質不穩(wěn)定，使用壽命短，因此不適合大規(guī)模生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，使其純化步驟少，分離材料壽命長，生產成本低。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明在基礎層析介質上合成親和配體，制備仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化人白介素I天然拮抗劑。
本發(fā)明包括以下步驟(1)基礎層析介質與三氯三氮嗪反應活化后，分別與酪氨酸和4-氨基苯甲脒反應，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的仿生親和分離材料制備親和層析柱，將含人白介素I天然拮抗劑蛋白的樣品流過該親和層析柱，人白介素I天然拮抗劑蛋白吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再沖洗親和層析柱，將結合的人白介素I天然拮抗劑蛋白洗脫下來，得到純化的人白介素I天然拮抗劑蛋白。
所述的步驟(1)，具體是指以帶氨基的基礎層析介質，與三氯三氮嗪反應活化；或者用常規(guī)化學方法對不帶氨基的基礎層析介質進行活化，與氨水或氨基化合物反應后生成氨基后，再與三氯三氮嗪反應活化。
所述的不帶氨基的基礎層析介質包括葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠、多孔玻璃與陶瓷。
所述的常規(guī)化學方法，是指C.R.Lowe在《親和色譜導論》(洛(C.R.Lowe)著；劉毓秀譯.科學出版社，1983以“年5月第1版，第61-84頁)中提到的基質活化與功能化方法，如多糖基及含羥基的其它基質，可用鹵化氰、三嗪(均二氯三嗪或三氯三嗪)、高碘酸氧化，環(huán)氧乙烷(1，4-二羥基正丁烷雙縮水甘油醚)，環(huán)氧氯丙醇，環(huán)氧溴丙醇，雙氮丙啶，二乙烯砜，苯醌類化合物如醌，溴乙酰溴進行活化和功能化；聚丙烯酰胺基質可用無水乙二胺，酰肼化后水解，直接堿水解進行活化和功能化；硅膠、多孔玻璃與陶瓷可用硅烷化試劑進行活化和功能化；從而在基礎層析介質上介紹需要的基團。
所述的親和配體中含有色氨酸的結構，或者含有4-氨基苯甲脒的結構。
所述的步驟(2)中，親和材料吸附人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)的緩沖液pH為5-9，電導率為0.1-9.0mS/cm；洗脫吸附人白介素I天然拮抗劑緩沖液的pH為5-9，電導率為20-50mS/cm。
本發(fā)明既克服了免疫親和分離材料制備困難，成本昂貴、性質不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模生產使用的缺點。又能減少了人白介素I天然拮抗劑大規(guī)模純化的步驟，降低了生產成本，可快速、簡便、低成本、大批量純化人白介素I天然拮抗劑。人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率達到50％以上，純度90％以上(SDS-PAGE分析)。
具體實施例方式
實施例1一、制備分離材料取NH2-Sepharose(100ml)，與100ml去離子水混合，冰浴條件下攪拌，當溫度降至5℃后，緩慢加入三氮嗪(4.9g 100ml預冷丙酮溶解)，用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應2h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌以除去未反應的三氮嗪，得到雙氯三氮嗪Sepharose(90ml)。
取雙氯三氮嗪Sepharose(49ml)，稱取色氨酸(5g)用二甲基亞砜(30ml)和去離子水(20ml)溶解，與雙氯三氮嗪Sepharose混勻，50℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)。
取1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)，稱取4-氨基苯甲脒(6g)用二甲基亞砜(10ml)和去離子水(40ml)溶解，與1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose混勻，90℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(35ml)待用。
二、人白介素I天然拮抗劑的純化將1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(20ml)裝填到層析柱(1×40cm)中。用磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH6.0，3.0mS/cm)平衡層析柱(10倍體積)，流速1ml/min。取含IL-1RA的樣品，調pH與電導率分別至pH6.0，3.0mS/cm后上50ml至用上述緩沖液平衡的層析柱中，樣品全部進入層析柱后，再用上述緩沖液(5倍體積)洗滌未結合的蛋白質，直流出液280nm的光吸收值(A280)降低至水平，不再變化為止。然后用含NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH6.0，電導率36mS/cm)洗脫層析柱，收集洗脫峰組分，用進行15％還原性SDS-PAGE分析純度，Lowry法定量分析蛋白含量。結果顯示，人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率可以達到62.8％，純度99％(SDS-PAGE分析)。
實施例2一、制備分離材料取NH2-Sepharose(100ml)，與100ml去離子水混合，冰浴條件下攪拌，當溫度降至5℃后，緩慢加入三氮嗪(4.9g 100ml預冷丙酮溶解)，用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應2h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌以除去未反應的三氮嗪，得到雙氯三氮嗪Sepharose(90ml)。
取雙氯三氮嗪Sepharose(49ml)，稱取色氨酸(5g)用二甲基亞砜(30ml)和去離子水(20ml)溶解，與雙氯三氮嗪Sepharose混勻，50℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)。
取1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)，稱取4-氨基苯甲脒(6g)用二甲基亞砜(10ml)和去離子水(40ml)溶解，與1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose混勻，90℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(35ml)待用。
二、人白介素I天然拮抗劑的純化將1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(20ml)裝填到層析柱(1×40cm)中。用磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH5.0，0.1mS/cm)平衡層析柱(10倍體積)，流速1ml/min。取含IL-1RA的樣品，調pH與電導率分別至pH5.0，0.1mS/cm后上50ml至用上述緩沖液平衡的層析柱中，樣品全部進入層析柱后，再用上述緩沖液(5倍體積)洗滌未結合的蛋白質，直流出液280nm的光吸收值(A280)降低至水平，不再變化為止。然后用含NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH5.0，電導率50mS/cm)洗脫層析柱，收集洗脫峰組分，用進行15％還原性SDS-PAGE分析純度，Lowry法定量分析蛋白含量。結果顯示，人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率可以達到60％，純度92％(SDS-PAGE分析)。
實施例3一、制備分離材料取NH2-Sepharose(100ml)，與100ml去離子水混合，冰浴條件下攪拌，當溫度降至5℃后，緩慢加入三氮嗪(4.9g 100ml預冷丙酮溶解)，用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應2h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌以除去未反應的三氮嗪，得到雙氯三氮嗪Sepharose(90ml)。
取雙氯三氮嗪Sepharose(49ml)，稱取色氨酸(5g)用二甲基亞砜(30ml)和去離子水(20ml)溶解，與雙氯三氮嗪Sepharose混勻，50℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)。
取1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)，稱取4-氨基苯甲脒(6g)用二甲基亞砜(10ml)和去離子水(40ml)溶解，與1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose混勻，90℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(35ml)待用。
二、人白介素I天然拮抗劑的純化將1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(20ml)裝填到層析柱(1×40cm)中。用磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH9.0，9.0mS/cm)平衡層析柱(10倍體積)，流速1ml/min。取含IL-1RA的樣品，調pH與電導率分別至pH9.0，9.0mS/cm后上50ml至用上述緩沖液平衡的層析柱中，樣品全部進入層析柱后，再用上述緩沖液(5倍體積)洗滌未結合的蛋白質，直流出液280nm的光吸收值(A280)降低至水平，不再變化為止。然后用含NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH9.0，電導率25mS/cm)洗脫層析柱，收集洗脫峰組分，用進行15％還原性SDS-PAGE分析純度，Lowry法定量分析蛋白含量。結果顯示，人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率可以達到52％以上，純度95％(SDS-PAGE分析)。
實施例4一、制備分離材料取NH2-Sepharose(100ml)，與100ml去離子水混合，冰浴條件下攪拌，當溫度降至5℃后，緩慢加入三氮嗪(4.9g 100ml預冷丙酮溶解)，用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應2h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌以除去未反應的三氮嗪，得到雙氯三氮嗪Sepharose(90ml)。
取雙氯三氮嗪Sepharose(49ml)，稱取色氨酸(5g)用二甲基亞砜(30ml)和去離子水(20ml)溶解，與雙氯三氮嗪Sepharose混勻，50℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)。
取1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)，稱取4-氨基苯甲脒(6g)用二甲基亞砜(10ml)和去離子水(40ml)溶解，與1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose混勻，90℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(35ml)待用。
二、人白介素I天然拮抗劑的純化將1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(20ml)裝填到層析柱(1×40cm)中。用磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH7.0，9.0mS/cm)平衡層析柱(10倍體積)，流速1ml/min。取含IL-1RA的樣品，調pH與電導率分別至pH7.0，9.0mS/cm后上50ml至用上述緩沖液平衡的層析柱中，樣品全部進入層析柱后，再用上述緩沖液(5倍體積)洗滌未結合的蛋白質，直流出液280nm的光吸收值(A280)降低至水平，不再變化為止。然后用含NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH6.0，電導率36mS/cm)洗脫層析柱，收集洗脫峰組分，用進行15％還原性SDS-PAGE分析純度，Lowry法定量分析蛋白含量。結果顯示，人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率可以達到75％，純度94％(SDS-PAGE分析)。
實施例5一、制備分離材料取NH2-Sepharose(100ml)，與100ml去離子水混合，冰浴條件下攪拌，當溫度降至5℃后，緩慢加入三氮嗪(4.9g 100ml預冷丙酮溶解)，用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應2h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌以除去未反應的三氮嗪，得到雙氯三氮嗪Sepharose(90ml)。
取雙氯三氮嗪Sepharose(49ml)，稱取色氨酸(5g)用二甲基亞砜(30ml)和去離子水(20ml)溶解，與雙氯三氮嗪Sepharose混勻，50℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)。
取1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)，稱取4-氨基苯甲脒(6g)用二甲基亞砜(10ml)和去離子水(40ml)溶解，與1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose混勻，90℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(35ml)待用。
二、人白介素I天然拮抗劑的純化將1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(20ml)裝填到層析柱(1×40cm)中。用磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH7.5，2mS/cm)平衡層析柱(10倍體積)，流速1ml/min。取含IL-1RA的樣品，調pH與電導率分別至pH7.5，2mS/cm后上50ml至用上述緩沖液平衡的層析柱中，樣品全部進入層析柱后，再用上述緩沖液(5倍體積)洗滌未結合的蛋白質，直流出液280nm的光吸收值(A280)降低至水平，不再變化為止。然后用含NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH7.0，電導率35mS/cm)洗脫層析柱，收集洗脫峰組分，用進行15％還原性SDS-PAGE分析純度，Lowry法定量分析蛋白含量。結果顯示，人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率可以達到80％，純度90％(SDS-PAGE分析)。
實施例6一、制備分離材料取NH2-Sepharose(100ml)，與100ml去離子水混合，冰浴條件下攪拌，當溫度降至5℃后，緩慢加入三氮嗪(4.9g 100ml預冷丙酮溶解)，用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應2h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌以除去未反應的三氮嗪，得到雙氯三氮嗪Sepharose(90ml)。
取雙氯三氮嗪Sepharose(49ml)，稱取色氨酸(5g)用二甲基亞砜(30ml)和去離子水(20ml)溶解，與雙氯三氮嗪Sepharose混勻，50℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)。
取1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose(40ml)，稱取4-氨基苯甲脒(6g)用二甲基亞砜(10ml)和去離子水(40ml)溶解，與1-色氨酸-2-氯三氮嗪Sepharose混勻，90℃攪拌下反應24h。反應過程中，用飽和NaHCO3保持反應體系pH在7～7.5之間。反應結束后，用10×3倍體積的蒸餾水充分洗滌反應混合物，得到1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(35ml)待用。
二、人白介素I天然拮抗劑的純化將1-(4-氨基苯甲脒)-2-色氨酸三氮嗪Sepharose(20ml)裝填到層析柱(1×40cm)中。用磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH6.0，5.0mS/cm)平衡層析柱(10倍體積)，流速1ml/min。取含IL-1RA的樣品，調pH與電導率分別至pH6.0，5.0mS/cm后上50ml至用上述緩沖液平衡的層析柱中，樣品全部進入層析柱后，再用上述緩沖液(5倍體積)洗滌未結合的蛋白質，直流出液280nm的光吸收值(A280)降低至水平，不再變化為止。然后用含NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L，pH6.0，電導率25mS/cm)洗脫層析柱，收集洗脫峰組分，用進行15％還原性SDS-PAGE分析純度，Lowry法定量分析蛋白含量。結果顯示，人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)回收率可以達到66％，純度96％(SDS-PAGE分析)。
權利要求
1.一種白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征在于，在基礎層析介質上合成親和配體，制備仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化人白介素I天然拮抗劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，包括以下步驟(1)基礎層析介質與三氯三氮嗪反應活化后，分別與酪氨酸和4-氨基苯甲脒反應，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的仿生親和分離材料制備親和層析柱，將含人白介素I天然拮抗劑蛋白的樣品流過該親和層析柱，人白介素I天然拮抗劑蛋白吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再沖洗親和層析柱，將結合的人白介素I天然拮抗劑蛋白洗脫下來，得到純化的人白介素I天然拮抗劑蛋白。
3.根據(jù)權利要求2所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(1)中，以帶氨基的基礎層析介質，與三氯三氮嗪反應活化。
4.根據(jù)權利要求2所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(1)中，用常規(guī)化學方法對不帶氨基的基礎層析介質進行活化，與氨水或氨基化合物反應后生成氨基后，再與三氯三氮嗪反應活化；所述的不帶氨基的基礎層析介質包括葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠、多孔玻璃與陶瓷。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的親和配體中含有色氨酸的結構，
6.根據(jù)權利要求1或2所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，或者含有4-氨基苯甲脒的結構。
7.根據(jù)權利要求2所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(2)中，親和材料吸附人白介素I天然拮抗劑(IL-1RA)的緩沖液pH為5-9，電導率為0.1-9.0mS/cm。
8.根據(jù)權利要求2所述的白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(2)中，洗脫吸附人白介素I天然拮抗劑緩沖液的pH為5-9，電導率為20-50mS/cm。
全文摘要
一種白介素I天然拮抗劑的仿生親和純化方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明包括以下步驟(1)基礎層析介質與三氯三氮嗪反應活化后，分別與酪氨酸和4一氨基苯甲脒反應，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的仿生親和分離材料制備親和層析柱，將含人白介素I天然拮抗劑蛋白的樣品流過該親和層析柱，人白介素I天然拮抗劑蛋白吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再沖洗親和層析柱，將結合的人白介素I天然拮抗劑蛋白洗脫下來，得到純化的人白介素I天然拮抗劑蛋白。本發(fā)明純化步驟少，分離材料壽命長，生產成本低。
文檔編號A61P11/00GK1772765SQ20051003065
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權日2005年10月20日
發(fā)明者李榮秀, 貴艷麗, 程永剛 申請人:上海交通大學