專利名稱：促進創(chuàng)傷愈合的制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以促進創(chuàng)傷愈合的制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷愈合是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中古老而重要的課題之一。皮膚作為ー種特殊的器官，是人類與外界接觸的第一道屏障，在創(chuàng)傷愈合中起著不容忽視的作用。創(chuàng)傷愈合包括毛細血管再生、纖維蛋白充填、細胞増殖和組織塑形3個基本過程，進而由增生的細胞和細胞間質(zhì)，充填、連接或代替缺損的組織。血液中的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞受創(chuàng)傷區(qū)趨化因子趨化和細胞因子、生長因子、缺氧環(huán)境等刺激，穿過血管壁到達創(chuàng)面，再生血運途徑，促進創(chuàng)面愈合，而參與創(chuàng)面愈合的成纖維細胞則是由創(chuàng)面底部或邊緣的間充質(zhì)細胞或成纖維細 胞演化而來的。隨著組織工程的拓展，應(yīng)用干細胞技術(shù)可望為創(chuàng)傷修復(fù)提供新的手段。從理論上講，干細胞可以用于各種疾病的治療，尤其是其具有的促進血管再生和器官功能恢復(fù)的特殊功效，在涉及血管疾病，血運重建及創(chuàng)傷愈合的治療中有著巨大潛力。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是來源于早期中胚層的ー種具有多向分化潛能的成體干細胞。MSC廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，易于從骨髄中分離獲得。近年來，盡管人們已成功地應(yīng)用自體成熟細胞，如成纖維細胞來修復(fù)皮膚缺損，但MSC與成熟細胞相比具有更大的優(yōu)勢，因在體外培養(yǎng)過程中，MSC可以保持未分化表型不斷増殖，達到所需數(shù)目，然后經(jīng)誘導(dǎo)可分化為所需表型，這些表型包括脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、成纖維細胞、肌腱、韌帶等多種間充質(zhì)來源的細胞。從骨髓中分離MSC，還能避免通過手術(shù)從病人自身獲取自體成熟細胞所造成的二次損傷?；谏鲜鍪聦崳瑢SC應(yīng)用于各種程度的創(chuàng)傷愈合治療中，正越來越成為相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注重點，事實上，移植的MSC在參與受損皮膚組織修復(fù)中分泌出的生長因子和細胞活素，可借由MSC在體外特定環(huán)境中所分泌的條件培養(yǎng)基中獲得，并完全可能將其應(yīng)用于受損皮膚及周邊組織的修復(fù)和再生，從而起到促進創(chuàng)傷愈合的相應(yīng)功能。因此，MSC在體外人工環(huán)境中分泌的促血管及周邊組織修復(fù)或再生的生長因子和細胞活素在臨床上有巨大的潛力，可以作為干細胞療法的有效替代品或輔助藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑，用于克服現(xiàn)有藥物的不足，為臨床促進創(chuàng)傷愈合的治療提供一種新的治療藥物。本發(fā)明的目的還在于提供一種制備能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑的方法，該方法步驟為I)從健康人血液中通過白細胞置換(Ieukapheresis)獲取外周血單核細胞,或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細胞，或從人脂肪吸取物(lipoaspirate)中直接提取 MSC;2)篩選及培養(yǎng)外周血或骨髓單核細胞以獲得MSC細胞；3)在特定條件下培養(yǎng)MSC細胞使其分泌促組織修復(fù)和再生的生長因子和細胞活素，分離MSC細胞和培養(yǎng)基，獲得富含促血管生成因子和細胞活素的無細胞培養(yǎng)基；4)對步驟3)中所獲得的無細胞培養(yǎng)基進行后處理，該后處理步驟包括過濾細胞碎片、純化該無細胞培養(yǎng)基、檢測各有效生長因子的成分及含量、對該培養(yǎng)基進行凍干處理或冷凍保存，即獲得促進創(chuàng)傷愈合的制劑。
本發(fā)明所述制備能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑的方法中，步驟I)所述的健康人血液或骨髄的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血庫直接購買的健康人外周血白細胞懸液樣本，或通過臨床白細胞置換?？蛇x步驟中所述的梯度離心以獲取單核細胞的步驟為將所獲得的骨髄或外周血液在密度梯度劑中梯度離心，所用的梯度劑可為Ficoll-Paque (GEhealthcare)、Histopaque-1077 (Sigma),或其他公司同類產(chǎn)品，優(yōu)選為Histopaque-1077 ;適用溫度范圍為15到25°C，優(yōu)選為25°C。具體操作為將含有骨髄或外周血及梯度劑的容器在200g-500g下離心20-40分鐘，分層后，用無菌一次性針管吸取當中不透明層，即為富含單核細胞的懸浮液，經(jīng)鑒定，此單核細胞群體來源于骨髓髓系干細胞其內(nèi)所含多種細胞亞群，呈多形性。本發(fā)明所述制備能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑的方法中，步驟2)中的培養(yǎng)單核細胞以獲得MSC細胞時，所用的培養(yǎng)基可為M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー種，并可添加有h印arin (0-100U/ml)。培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。在預(yù)設(shè)條件為培養(yǎng)溫度37°C，ニ氧化碳濃度為5-7%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明所述制備能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑的方法中，步驟2)中的培養(yǎng)單核細胞以獲得MSC細胞的步驟為以下所述方法①至④中的ー種方法 :將單核細胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養(yǎng)1_2天，去除懸浮細胞，將貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達細胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。方法②將單核細胞與fibrin微球(直徑50-250微米，可由商業(yè)途徑獲得，如Forticell Bioscience)共同培養(yǎng) 1-2 天，姆 IOO-IOOOmg fibrin 微球可吸附 I X IO6 至
IX IO8個細胞的密度，去除懸浮細胞，將附著于fibrin微球的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達細胞表面受體⑶90，CD105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。方法③將單核細胞通過⑶14，或⑶45特異性抗體進行磁珠分選(MACS ,由德國Miltenyi Biotec公司生產(chǎn))，篩選出不含⑶14或⑶45的單核細胞亞群，將此⑶14—或⑶45_單核細胞亞群以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6個細胞的密度培養(yǎng)1_2天(或用方法②培養(yǎng))，去除懸浮細胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲II型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達細胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。
方法④將人脂肪吸取物(lipoaspirate,約50_100ml)在pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄，用I型和II型膠原酶(collagenase type I，
II,Sigma-Aldrich)消化(酶的濃度范圍O. 05% -O. 1% )，消化步驟為置于37°C條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，將貼壁(或附著于fibrin微球)細胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲III型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達細胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。本發(fā)明所述制備能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑的方法中，步驟3)中的在特定條件下培養(yǎng)MSC細胞的方法為以下所述方法①或②中的ー種方法①將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC置于不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)， 在氧濃度為O. 5%至2%的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、RPMI-1640、F12、、pH= 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加I %的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。方法②將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC先置于促血管內(nèi)皮細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，此培養(yǎng)基可為M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー種，并可添加有O. 5-1 %的生長因子添加劑EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的ー種(由瑞士 Lonza公司購買，其中含血管內(nèi)皮生長因子VEGF-1、堿性成纖維細胞生長因子FGF-2、表皮生長因子EGF，和胰島素樣生長因子IGF-1);或添加有內(nèi)皮細胞生長因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0-100U/ml);培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。1-2天后將MSC轉(zhuǎn)入不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為0. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4)或0.9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加I %的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。在按照上述方法①或②培養(yǎng)完成后，收集富含細胞生長因子的條件培養(yǎng)基，棄去MSC細胞。本發(fā)明所述制備能夠有效的促進創(chuàng)傷愈合的制劑的方法中，步驟4)所述的后處理步驟包括①對步驟3)中所收集的無細胞培養(yǎng)基進行過濾，可通過高速離心或過濾器將細胞雜質(zhì)及碎片去除。②對過濾后的無細胞培養(yǎng)基進行成分鑒定，并對其中所含的代表性促血管及周邊組織生長因子及細胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, MMP-2, PDGF, SDF-I，F(xiàn)GF, VEGF的含量進行鑒定，鑒定方法可為蛋白組學(xué)(proteomics),細胞活素陣列(cytokine array),酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，或Bio-Plex 細胞因子測試。③對過濾后的無細胞培養(yǎng)基進行凍干或分裝冷凍保存，以便長期保存其中的生長因子及細胞活素成分的活性。


圖I :本發(fā)明所述促進創(chuàng)傷愈合制劑對內(nèi)皮細胞，成纖維細胞及角質(zhì)形成細胞的刮傷愈合功效。
具體實施例方式以下通過具體的實例對本發(fā)明的內(nèi)容作進ー步的闡述說明，本發(fā)明包括但不限于下述步驟和內(nèi)容。實施例I.單核細胞的制備。將抽取出的骨髓或者由血庫直接購買的健康人外周血白細胞懸液加入密度梯度劑Histopaque-1077 (Sigma),姆15mL Histopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白細胞懸液。將骨髓提取液或外周血白細胞懸液在梯度劑的存在下于400G的速度下常溫離心30分鐘。分層后，用無菌一次性針管吸取當中不透明層，即為富含骨髄系單核細胞的懸浮液。
實施例2. MSC細胞的獲取。針對I類MSC細胞的獲取方法將骨髓單核細胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細胞的密度培養(yǎng)2天，去除懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達細胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。針對II類MSC細胞的獲取方法將骨髓單核細胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細胞的密度培養(yǎng)2天，通過⑶14，或⑶45特異性抗體進行磁珠分選(MACS ,由德國Miltenyi Biotec公司生產(chǎn))，篩選出不含CD14或⑶45的單核細胞亞群，將此⑶14_或⑶45_單核細胞亞群在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細胞的密度培養(yǎng)2天，去除懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲II型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達細胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。針對III類MSC細胞的獲取方法將人脂肪吸取物(lipoaspirate，約50_100ml)在pH = 7. 4,0. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄,用II型膠原酶(collagenase type II)消化(質(zhì)量濃度O. 075% ),消化條件為于37°C下震蕩30分鐘。將消化并過濾出的單核細胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個細胞的密度培養(yǎng)2天，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲III型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，大量表達細胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細胞及單核細胞受體。實施例3.促進創(chuàng)傷愈合制劑的獲取。將實施例2所獲得的各型MSC置于不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為
O.5%的環(huán)境中在O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中培養(yǎng)2天(每平方厘米2 X IO5個細胞)，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。培養(yǎng)完成后收集富含細胞生長因子的無細胞培養(yǎng)基，棄去貼壁的MSC細胞。將收集的無細胞培養(yǎng)基通過孔徑為O. 2微米的過濾器將細胞雜質(zhì)及碎片去除井分裝于_80°C冷庫冷藏備用。視具體情況，每IxlO6個MSC細胞可以制備2-5ml所述促進創(chuàng)傷愈合制劑。實施例4.促進創(chuàng)傷愈合制劑中的生長因子及細胞活素的鑒定。實施例3所制得的促進創(chuàng)傷愈合制劑中含有的生長因子及細胞活素成分通過細胞活素陣列(cytokinearray)鑒定(由R&D Systems購買)，此促進創(chuàng)傷愈合制劑的有效成分包含并不局限于以下生長因子MCP-1、EGF、IL-6、IL_8、MMP-9、SDF-U HGF, VEGF以及TOGF。通過酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)，其中有效成分的含量為，MCP-I 5-50ng/ml ；IL-8 1-5 μ g/ml ；SDF-1 :0.5_5ng/ml ;IL_6 5-20ng/ml ；PDGF-BB :0.l-10ng/ml ；VEGF l-20ng/mL·其他成分組成見表I。表I.本發(fā)明所述促進創(chuàng)傷愈合制劑中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
權(quán)利要求
1.一種促進創(chuàng)傷愈合的制劑的制備方法，其特征在干，該制劑的制備方法包括如下步驟 1)從健康人血液中通過白細胞置換獲取外周血單核細胞，或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細胞，或從人脂肪吸取物中直接提取MSC ； 2)篩選及培養(yǎng)外周血或骨髄單核細胞以獲得MSC細胞； 3)在特定條件下培養(yǎng)MSC細胞使其分泌促組織修復(fù)和再生的生長因子和細胞活素，分離MSC細胞和培養(yǎng)基，獲得富含促血管生成因子和細胞活素的無細胞培養(yǎng)基； 4)對步驟3)中所獲得的無細胞培養(yǎng)基進行后處理，該后處理步驟包括過濾細胞碎片、純化該無細胞培養(yǎng)基、檢測各有效生長因子的成分及含量、對該培養(yǎng)基進行凍干處理或冷凍保存，即獲得促進創(chuàng)傷愈合的制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述的健康人血液或骨髄的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血庫直接購買的健康人外周血白細胞懸液樣本，或通過臨床白細胞置換。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述的從血液中或骨髓中通過密度梯度離心獲取外周血單細胞的方法為使用梯度劑為Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同類產(chǎn)品，溫度為15 25°C，離心カ為200g_500g，時間20-40分鐘，離心完成后，吸取當中不透明層，即為單核細胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中的培養(yǎng)單核細胞以獲得MSC細胞時，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー種，并添加有heparin (0-100U/ml)，培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清，在預(yù)設(shè)條件為培養(yǎng)溫度37°C，ニ氧化碳濃度為5-7%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的培養(yǎng)單核細胞以獲得MSC細胞的方法為以下所述方法①、②、③或④中的ー種 方法①將單核細胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養(yǎng)1-2天，去除懸浮細胞，將貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲I型MSC。
方法②將單核細胞與fibrin微球共同培養(yǎng)1_2天，每IOO-IOOOmg fibrin微球可吸附IX IO6至IX IO8個細胞的密度，去除懸浮細胞，將附著于fibrin微球的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21 天，獲 I MMSC0 方法③將單核細胞通過CD14，或CD45特異性抗體進行磁珠分選，篩選出不含CD14或⑶45的單核細胞亞群，將此⑶14-或⑶45-單核細胞亞群以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，去除懸浮細胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲II型MSC。
方法④將人脂肪吸取物50-100ml在pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄，用I型和II型膠原酶消化(酶的濃度范圍O. 05% -O. 1% )，消化步驟為置于37°C條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，將貼壁(或附著于fibrin微球)細胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲III型MSC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的在特定條件下培養(yǎng)MSC細胞的方法為以下所述方法①或②中的ー種方法①將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC置于不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為O. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
方法②將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC先置于促血管內(nèi)皮細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，此培養(yǎng)基可為Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー種，并添加有O. 5-1%的生長因子添加劑EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的ー種；或添加有內(nèi)皮細胞生長因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0-100U/ml);培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。1-2天后將MSC轉(zhuǎn)入不含任何生長因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為0.5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的制備方法，其特征在于，不添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的制備方法，其特征在于，所述MSC細胞為I型MSC細胞。
9.一種由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備獲得的制劑。
10.權(quán)利要求9所述的制劑在制備促進創(chuàng)傷愈合的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進創(chuàng)傷愈合的制劑及其制備方法，該制劑的制備方法是通過誘導(dǎo)單核細胞獲得間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，進而在低血清條件培養(yǎng)上述MSC細胞，最后分離MSC細胞獲得無細胞培養(yǎng)基，并對該無細胞培養(yǎng)基進行相應(yīng)后處理，即可獲得所述制劑。體外和體內(nèi)實驗表明，本發(fā)明所述的促進創(chuàng)傷愈合的制劑能夠顯著的促進受損皮膚及周邊組織的修復(fù)和再生，從而起到促進創(chuàng)傷愈合的相應(yīng)功能。
文檔編號A61K35/12GK102641295SQ20111004192
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者楊子江, 顧麗婭, 顧茂健 申請人:楊子江