用于檢測萊姆病螺旋體的rpa引物和探針及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測萊姆病螺旋體的 RPA引物和探針及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Bolrelia burgdorferi)引起的一種 慢性自然疫源性疾病。該病主要是通過節(jié)肢動物蜱的叮咬在宿主動物與宿主動物及人之間 傳播。萊姆病臨床表現(xiàn)初期多有典型皮膚損害一慢性游走性紅斑(ECM)，同時伴有頭痛、發(fā) 熱、寒戰(zhàn)、疲乏不適.局部淋巴結(jié)腫大等癥狀，后期表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、運動系統(tǒng)等 呈間歇性、交替性出現(xiàn)的各種損害。具有分布廣、病程長、病死率較高等特點。如能早期診 斷、早期治療?？扇?，否則會出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。因此開發(fā)萊姆病螺旋體的早期快速檢測技 術(shù)，對萊姆病早期診斷、早期治療具有重要的意義。
[0003] 目前萊姆病的主要診斷方法包括病原學(xué)檢測和特異性抗體檢測。病原學(xué)檢測包括 直接鏡檢法、病原分離培養(yǎng)、多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和熒光定量PCR(real-time PCR);常用的 特異性抗體檢測包括間接免疫熒光抗體法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和蛋白免疫印 跡法(WB)。
[0004] 直接鏡檢法需要操作者具備豐富的檢驗經(jīng)驗，然而對于混合感染的情況，則無法 檢測到，而且該法容易漏檢，與其他診斷方法相比，直接檢查的檢出率相對較低。病原分離 培養(yǎng)法的分離率低，耗時較長，敏感性差。IFA只能檢測到菌體表面的抗原，靈敏度和特異性 都比較低，且IFA受實驗因素影響大，易造成假陽性或假陰性。ELISA主要對萊姆病特異抗體 IgG進行檢測，傳統(tǒng)ELISA檢測方法，存在非特異反應(yīng)，雖然靈敏度高，但缺乏特異性，易誤 診。WB可以判斷和驗證IFA和ELISA的真假陽性，但由于萊姆病螺旋體有不同的致病基因型， 而這幾種基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各國應(yīng)根據(jù)實際情況，制定出針對本 國流行的基因型的WB陽性診斷標準，而且WB的操作比較復(fù)雜，不利于推廣。PCR技術(shù)的不足 之處在于：（1)靶基因易被污染；（2)易出現(xiàn)非特異性擴增；（3)擴增反應(yīng)易受多種因素的影 響；（4)需要投入比較昂貴的精密儀器(如PCR儀、凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)）；（5)耗時長， 需要2~3h的反應(yīng)時間和1~2h的電泳時間。這些均不利于現(xiàn)場的快速檢測，給技術(shù)的基層 推廣造成了極大障礙。
[0005] 重組酶聚合酶擴增法（Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是2014年 興起的一種新的恒溫擴增方法，其特點是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地 擴增靶基因序列。目前RPA技術(shù)主要應(yīng)用于病原微生物的快速檢測，包括病毒、細菌、真菌、 支原體、寄生蟲等，在臨床疾病診斷、食品衛(wèi)生檢驗及環(huán)境監(jiān)測方面應(yīng)用廣泛，然而目前未 見利用RPA技術(shù)進行萊姆病螺旋體檢測的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測萊姆病螺旋體的RPA引物和探針以及含有所述 引物和探針的檢測試劑盒。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測萊姆病螺旋體的RPA法。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測萊姆病螺旋體的RPA引物和探針，所 述RPA引物基于萊姆病螺旋體recA基因設(shè)計，引物序列如下：
[0009] LF-F:5 '-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 '
[0010] LF-R:5 '-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 '
[0011]所述探針根據(jù)RPA引物設(shè)計，大小為46-52bp，探針的5'端用FAM標記，3'端進行 C3Spacer修飾，且在探針中間距5'端30bp處進行dSpacer或THF修飾。
[0012] 引物和探針序列分別如下：
[0013] LF-F:5 '-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 '
[0014] LF-R:5 '-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 '
[0015] LF-P:5,-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT (C3Spacer)-3，
[0016] 本發(fā)明還提供含有所述引物LF-F、LF-R和探針LF-P的用于RPA法檢測萊姆病螺旋 體的試劑盒。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括RPA反應(yīng)管、反應(yīng)緩沖液、標準陽性模板等中的至少一 種(RPA反應(yīng)管以及反應(yīng)緩沖液購自英國TwistDX公司，商品編號TANF002KIT;其中，Bsu DNA 聚合酶和重組酶uvaX以干粉狀態(tài)存在于RPA反應(yīng)管中，使用時，用1 X反應(yīng)緩沖液溶解，整個 RPA反應(yīng)在RPA反應(yīng)管中進行）。
[0018] 本發(fā)明還提供所述RPA引物和探針及其檢測試劑盒在鑒定萊姆病螺旋體中的應(yīng) 用。
[0019] 本發(fā)明進一步提供一種用于檢測萊姆病螺旋體的RPA法，包括以下步驟：
[0020] 1)提取樣品中的DNA;
[0021] 2)以步驟1)中提取的DNA為模板，使用所述引物LF-F、LF-R和探針LF-P，在RPA反應(yīng) 管中進行RPA擴增反應(yīng)；
[0022] 3)分析RPA擴增產(chǎn)物。
[0023] 其中，RPA反應(yīng)體系以50μ1計為： 模板ΟΝΑ ΙμL ΙΟμηιοΙ/L引物 LF-F 2 ΙμL ΙΟμηιοΙ/Ι 引物 LF-R 2.1μ1
[0024] ΙΟμηιοΙ/Ι...探針 LF-P 0.6μ1 lx反應(yīng)緩沖液 29.5μ1 280mmol/L TVlg2 緩沖液 2.5μΙ ddH.O 補足至50μ1
[0025] RPA反應(yīng)條件為:30-45°C (優(yōu)選37°C)，20分鐘，冰上終止反應(yīng)。
[0026] 步驟3)中采用Hybridetect 2T試劑盒（含側(cè)流層析試紙條，購自德國Milenia Biotec公司，商品編號MILENIA01)檢測RPA擴增產(chǎn)物。檢測方法如下：將擴增產(chǎn)物與 Hybridetect 2T試劑盒中的緩沖液按1: 20的體積比混合，然后將Hybridetect 2T試紙條置 于上述混合液中，5分鐘后判讀結(jié)果;如果試紙條的檢測線上出現(xiàn)條帶，而且質(zhì)控線正常，則 表明該樣品中含有萊姆病螺旋體，如果僅是質(zhì)控線上出現(xiàn)條帶，則表明該樣品中不含萊姆 病螺旋體。
[0027]本發(fā)明將RPA引物恒溫擴增技術(shù)與側(cè)流層析試紙聯(lián)用，可從疑似病人血清中快速 準確地檢測出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR更高，可對不同致病基 因型的萊姆病螺旋體進行檢測，對萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時 可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明實施例2中利用RPA引物恒溫擴增不同基因型的萊姆病螺旋體、非萊 姆病螺旋體的Hybridetect 2T試紙條檢測結(jié)果;其中，A圖為擴增36株萊姆病螺旋體的結(jié) 果，對應(yīng)于表1中各菌株，N為陰性對照;B圖為擴增非萊姆病螺旋體的結(jié)果，B31為陽性對照， 1為埃立克體，2為橫賽巴爾通體，3為無形體，4為貝氏柯克斯氏體，5為鉤端螺旋體，6為大腸 埃希菌，7為陰性對照。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例3中RPA引物恒溫擴增反應(yīng)體系的靈敏度檢測結(jié)果;其中，N為 陰性對照，模板濃度梯度依次為l〇pg，lpg，l〇〇f g，50f g，10f g。。
[0030] 圖3為本發(fā)明實施例3中普通PCR擴增反應(yīng)體系的靈敏度檢測結(jié)果;其中，M為lOObp Ladder，1-5分別代表模板濃度為60ng/yl、lOng/μΙ、lng/μL、lOOpg/μΙ、lOpg/μΙ，6為陰性對 照。
【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0032] 以下實施例中使用的RPA反應(yīng)管以及反應(yīng)緩沖液購自英國TwistDX公司，商品編號 TANF002KIT;其中，Bsu DNA聚合酶和重組酶uvaX以干粉狀態(tài)存在于RPA反應(yīng)管中，使用時， 用1 X反應(yīng)緩沖液溶解，整個RPA反應(yīng)在RPA反應(yīng)管中進行。
[0033]實施例1用于檢測萊姆病螺旋體的RPA引物和探針的合成
[0034]將萊姆病螺旋體菌株B31用于檢測萊姆病螺旋體的RPA引物和探針的篩選。以recA 基因為革El基因，根據(jù)TwistDX操作手冊要求，利用Primer 5設(shè)計5對可用于Basic RPA試劑盒 的引物。利用Basic RPA試劑盒對這5對引物進行篩選，得到可穩(wěn)定擴增目的產(chǎn)物，且靈敏度 和特異性最好的一對引物。篩選得到的最佳引物序列見Seq ID No: 1和2。然后在此引物的 基礎(chǔ)上根據(jù)Twist DX公司RPA nfo試劑盒操作手冊要求對上述引物進行改造，在反向引物 5'端加入一個生物素標記位點，另外，根據(jù)RPA引物序列設(shè)計一條大小為46-52bp的探針，探 針的5 '端用FAM標記，3 '端進行C3Spacer(C3間臂）修飾，且在探針中間距5 '端30bp處進行 d