專利名稱：：抗淀粉樣β蛋白的單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可例如用于阿爾茲海默病或其它神經(jīng)變性性疾病的預(yù)防、治療和診斷的單克隆抗體(例如8F5和8C5)。
背景技術(shù)：
：阿爾茲海默病(AD)是一種認(rèn)知能力進(jìn)行性喪失以及特有的神經(jīng)病理學(xué)特征包括大腦若干區(qū)域的淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失為特征的神經(jīng)變性的疾病，參見Hardy和Selkoe(Science297,353(2002);Mattson(Nature431、7004(2004)。淀粉樣蛋白沉積的主要成分是淀粉樣蛋白卩肽(A(3),其中以長42個(gè)氨基酸的類型(A|31-42)最為顯著。具體的說，淀粉樣P(l-42)蛋白質(zhì)是具有42個(gè)氨基酸的多肽，其通過蛋白水解處理淀粉樣前體蛋白(APP)衍生得到。除了淀粉樣|3(l-42)蛋白質(zhì)的人變體外，這還包括存在于人以外的生物體、尤其是其它哺乳動物、又特別是大鼠中的淀粉樣P(l-42)蛋白質(zhì)的亞型。在含水環(huán)境中趨向于發(fā)生聚合的這種蛋白質(zhì)可以迥然不同的分子形式存在。不溶性蛋白的沉積與癡呆病癥如阿爾茲海默病的發(fā)生或發(fā)展的簡單相關(guān)被證實(shí)不可信(Terryetal.,Ann.Neurol.30.572-580(1991);Dicksonetal.,Neurobiol.Aging16,285-298(1995))。相反，突觸和認(rèn)知性感覺的喪失似乎與可溶性形式的A卩(l-42)更有關(guān)聯(lián)(Lueetal.,Am.J.Pathol.155,853-862(1999);McLeanetal.,Ann.Neurol.46,860-866(1999》。雖然過去已經(jīng)產(chǎn)生出抗AP(l-42)的多克隆和單克隆抗體，但無一被證實(shí)能在動物和/或人中產(chǎn)生所需的療效而又不產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。例如，對高齡APP23小鼠接受的持續(xù)5個(gè)月每周一次的N末端定向性抗A(3(l-42)抗體的臨床前研究所得的被動免疫結(jié)果顯示治療相關(guān)性副作用。特別是這些小鼠比用鹽水處理的小鼠顯示出微出血量和嚴(yán)重程度加劇(Pfeiferetal.,Science2002298:1379)。最近也有描述高齡(>24個(gè)月)Tg2576和PDAPP小鼠有類似的出血增加情況(Wilcocketal.,JNeuroscience2003,23:3745-51;Rackeetal"JNeuroscience2005,25:629-636)。在這兩種小鼠品系中，注射抗Aj3(l-42)都導(dǎo)致微出血的顯著增加。因此，存在開發(fā)預(yù)防或減慢疾病發(fā)展又不會誘發(fā)人體負(fù)面的和潛在的致命影響的生物制品的巨大的治療需求。鑒于大眾壽命的日益延長,由于這種延長，每年診斷出的阿爾茲海默病患者的數(shù)量增加,因此這種需求尤其明顯。此外，這種抗體將允許對有阿爾茲海默病癥狀的患者進(jìn)行正確的診斷，而目前的診斷只能在尸體解剖時(shí)才能得到確證。另外，所述抗體將允許對造成這種衰竭性疾病的蛋白質(zhì)和其它生物因子的生物特性進(jìn)行闡釋。本文提到的所有專利和出版物通過引用整體結(jié)合到本文中。發(fā)明概述本發(fā)明包括這樣的分離抗體，其對淀粉樣P(AP)蛋白球聚體(globulomer)的結(jié)合特異性大于對淀粉樣|3蛋白單體的結(jié)合特異性。因此，觀察到優(yōu)先結(jié)合現(xiàn)象?？贵w可以是例如單克隆抗體如8F5或8C5。對球聚體的結(jié)合特異性與對單體的結(jié)合特異性的比例為至少1.4。具體的說，該比例優(yōu)選為至少約1.4到至少約16.9。(1.0-17.5的比例，包括端點(diǎn)在內(nèi)，及其小數(shù)部分，也^l認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。例如，1.1、1.2、1.3.....2.0、2.1、2.2...、17.1、17.2、17,3、17.4、17.5以及其間的全部整數(shù)及其百分?jǐn)?shù)被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。)淀粉樣P蛋白單體可以是例如A卩(l-42)單體或AI3(l-40)單體。此外，本發(fā)明還涵括由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)保藏號為PTA-7238的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體(本文稱為"8F5")以及產(chǎn)生這種單克隆抗體(即8F5)的雜交瘤。同樣，本發(fā)明包括由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為PTA-7407的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體(本文稱為"8C5")以及產(chǎn)生這種單克隆抗體(即8C5)的雜交瘤。另外，本發(fā)明包括包含有由SEQIDNO:1編碼的可變重鏈的單克隆抗體。這個(gè)抗體可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。此外，本發(fā)明包括包含有由SEQIDNO:2編碼的可變輕鏈的單克隆抗體。這個(gè)抗體同樣可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。該抗體還可包含有由SEQIDNO:1編碼的可變輕重鏈，且可以是人抗體或人源化抗體。而且，本發(fā)明包括包含有SEQIDNO:3的單克隆抗體。該抗體可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。此外，本發(fā)明涵括包含有SEQIDNO:4的單克隆抗體。這個(gè)抗體可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。這個(gè)抗體還可包含有SEQIDNO:3,且可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。另外，本發(fā)明包括包含有由SEQIDNO:11編碼的可變重鏈的單克隆抗體。這個(gè)抗體可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。此外，本發(fā)明包括包含有由SEQIDNO:12編碼的可變輕鏈的單克隆抗體。這個(gè)抗體同樣可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。該抗體還可包含有由SEQIDNO:11編碼的可變重鏈，且可以是人抗體或人源化抗體。而且，本發(fā)明包括包含有SEQIDNO:19的單克隆抗體。該抗體可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。此外，本發(fā)明涵括包含有SEQIDNO:20的單克隆抗體。這個(gè)抗體可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。這個(gè)抗體還可包含有SEQIDNO:19，且可以是鼠抗體、人抗體或人源化抗體。本發(fā)明還包括這樣的分離抗體，其對淀粉樣卩蛋白球聚體(globulomer)的結(jié)合特異性大于對淀粉樣(3蛋白原纖維的結(jié)合特異性。這個(gè)抗體可以是例如單克隆的，可以是由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為PTA-7243的雜交瘤或保藏號為PTA-7407的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。產(chǎn)生這些單克隆抗體的雜交瘤也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明包括這樣的抗體，其中可變重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中至少有一個(gè)選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。而且，本發(fā)明還包括這樣的抗體，其中可變輕鏈的CDR中至少有一個(gè)選自SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。這個(gè)抗體還可包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的可變重鏈CDR。本發(fā)明還包括這樣的抗體，其中可變重鏈的CDR中至少有一個(gè)選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15。此外，本發(fā)明還涵括這樣的抗體，其中可變輕鏈的CDR中至少有一個(gè)選自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。這個(gè)抗體還可包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15的可變重鏈CDR。另外，本發(fā)明涵括對阿爾茲海默病需要患者治療或預(yù)防的方法。這個(gè)方法包括將上述分離抗體中的任何一種或多種以足以實(shí)現(xiàn)治療或預(yù)防的量給予該患者。本發(fā)明分離抗體可例如通過選自肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥和皮下給藥的途徑來給予。本發(fā)明還包括對懷疑患有阿爾茲海默病的患者進(jìn)行診斷的方法。這個(gè)方法包括以下步驟l)從該患者分離生物樣品；2)使該生物樣品與至少一種上述抗體進(jìn)行接觸，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗原/抗體復(fù)合物得以形成；和3)檢測所述樣品中抗原/抗體復(fù)合物的存在，復(fù)合物的存在表明該患者患有阿爾茲海默病。該抗原可以是例如^^聚體或者ii其部分或片段，該部分或片段具有與完全球聚體相同的功能特性(例如結(jié)合活性)。此外，本發(fā)明包括另一種對懷疑患有阿爾茲海默病的患者進(jìn)行診斷的方法。這個(gè)方法包括以下步驟l)從該患者分離生物樣品；2)使該生物樣品與抗原進(jìn)行接觸，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗原/抗體復(fù)合物得以形成；3)向所得的抗體/抗原復(fù)合物加入綴合物，加入的時(shí)間和條件足夠使該綴合物與結(jié)合抗體發(fā)生結(jié)合，其中該綴合物包含上述抗體中的一種，這個(gè)抗體與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物連接；和4)通過檢測信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的信號檢測在該生物樣品中可能存在的抗體的存在，該信號表明該患者患有阿爾茲海默病。該抗原可以是球聚體或者其部分或片段，該部分或片段具有與完全球聚體相同的功能特性(例如"結(jié)合活性")。本發(fā)明包括又一種對懷疑患有阿爾茲海默病的患者進(jìn)行診斷的方法。這個(gè)方法包括以下步驟l)從該患者分離生物樣品；2)使該生物樣品與抗抗體進(jìn)行接觸，其中該抗抗體對上述抗體中的一種具有特異性，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗抗體/抗體復(fù)合物得以形成，該復(fù)合物含有該生物樣品中存在的抗體；3)向所得的抗抗體/抗體復(fù)合物加入綴合物，加入的時(shí)間和條件足夠使該綴合物與結(jié)合抗體發(fā)生結(jié)合，其中該綴合物包含抗原，這個(gè)抗原與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物結(jié)合；和4)檢測信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的信號，該信號表明該患者患有阿爾茲海默病。此外，本發(fā)明包括包含有上述抗體中的任何一種或多種(例如8F5和8C5)的組合物。本發(fā)明包括另一種對阿爾茲海默病需要患者預(yù)防或治療的方法?；颊叩倪@個(gè)步驟。另外，本發(fā)明涵括包含有上述抗體中的至少一種和藥學(xué)上可接受的佐劑的疫苗。而且，本發(fā)明包括又一種對阿爾茲海默病需要患者預(yù)防或治療的方法。這個(gè)方法包括將上述疫苗以足以實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療的量給予該患者的這個(gè)步驟。此外，本發(fā)明涵括鑒定適用于對預(yù)測會發(fā)生阿爾茲海默病的患者進(jìn)行自動免疫接種的化合物的方法。這個(gè)方法包括l)使一種或多種目的化合物暴露于上述抗體中的一種或多種，暴露的時(shí)間和條件足以使該一種或多種化合物與該一種或多種抗體發(fā)生結(jié)合；2)鑒定與該一種或多種抗體發(fā)生結(jié)合的那些化合物，所鑒定出的化合物用于對預(yù)測會發(fā)展阿爾茲海默病的患者進(jìn)行主動免疫。還有，本發(fā)明包括這樣的試劑盒，其包括a)上述分離抗體中的至少一種，和b)包含有與信號產(chǎn)生化合物連接的抗體的綴合物，其中該綴合物的該抗體不同于該分離抗體。該試劑盒還可包括包裝插頁，上有關(guān)于試劑盒的各成分如何進(jìn)行使用的說明。本發(fā)明還涵括這樣的試劑盒，其包括a)抗上述抗體中的一種的抗抗體，和b)包含有與信號產(chǎn)生化合物連接的抗原的綴合物。該抗原可以是球聚體或者其片段或部分，該片段或部分具有與球聚體相同的功能特性(例如結(jié)合活性)。而且，該試劑盒還可包括包裝插頁，上有關(guān)于試劑盒的各成分如何進(jìn)行使用的說明。附圖簡述圖1圖解比較了8F5對球聚體相對于A卩(l-42)單體、A卩(l-40)和sAPP的的選擇性。8F5的選擇性系數(shù)可以計(jì)算為各EC50值之間的比例(與HFIP中的A(3(l-42)單體之比555.8/90.74=6.1;與NH4OH中的A(3(l-42)單體之比1007/90.74=11.1;與A卩(l-40)單體之比667.8/90.74=7.4;與sAPP之比>100)。圖2圖解說明結(jié)合原纖維的重鏈和輕鏈抗體(泳道4、6、8)和上清液中相應(yīng)的非結(jié)合游離部分(泳道3、5、7)的SDS-PAGE分析。圖3圖解說明來自患輕度認(rèn)知損害(MCI，左)或阿爾茲海默病(AD,右)患者的CSF樣品中的A042和A|340含量。在兩組中，可以析相比，8F5結(jié)合較高比例的A卩(l-42)和較少或相等數(shù)量的A|3(l-40)。圖4圖解說明三組APP轉(zhuǎn)基因小鼠(即6G1、8F5、PBS)和一組非轉(zhuǎn)基因同胎仔鼠(野生型)中的新物體認(rèn)知指數(shù)，該指數(shù)是對未知物體與對熟知物體所花的時(shí)間。各小鼠(數(shù)字在柱條下方給出)用單克隆抗體6G1或8F5進(jìn)行免疫或者用介質(zhì)(即磷酸緩沖鹽水PBS和野生型)進(jìn)行處理，做法是連續(xù)三周每周一次腹膜內(nèi)注射。最后一次注射的當(dāng)天，進(jìn)行新物體認(rèn)知試驗(yàn)。PBS組和野生型組之間的差異表明這個(gè)實(shí)驗(yàn)示例(paradigm)中的APP轉(zhuǎn)基因小鼠有認(rèn)知缺損。注射PBS的小鼠以機(jī)會水平認(rèn)知(即不顯著偏離50)，而所有其它小鼠顯示物體識別力(t-檢驗(yàn)；星號)。當(dāng)將抗體處理過的APP轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知水平與對照組進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，與PBS處理的小鼠有顯著差異，但與野生型小鼠沒有顯著差異(ANOVA加post-hoct-檢驗(yàn)；圓圈)，表明用抗體處理逆轉(zhuǎn)了這些APP轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知缺損。圖5(A)圖解說明編碼本文稱為"8F5"的單克隆抗體的可變重鏈的DNA序列(SEQIDNO:l)，圖5(B)說明編碼單克隆抗體8F5的可變輕鏈的DNA序列(SEQIDNO:2)。(互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)在每個(gè)序列中加下劃線表示；另參見圖6。)圖6(A)圖解說明單克隆抗體8F5的可變重鏈的氨基酸序列(SEQIDNO:3)，圖6(B)圖解說明單克隆抗體8F5的可變輕鏈的氨基酸序列(SEQIDNO:4)?？勺冎劓湹囊粋€(gè)CDR由氨基酸序列SYGMS(SEQIDNO:5)表示。可變重鏈的另一個(gè)CDR由氨基酸序列ASINSNGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:6)表示，可變重鏈的又一個(gè)CDR由氨基酸序列SGDY(SEQIDNO:7)表示?？勺冚p鏈的一個(gè)CDR由氨基酸序列RSSQSLVYSNGDTYLH(SEQIDNO:8)表示。可變輕鏈的另一個(gè)CDR由氨基酸序列KVSNRFS(SEQIDNO:9)表示，可變輕鏈的又一個(gè)CDR由氨基酸序列SQSTHVPWT(SEQIDNO:IO)表示。所有上述CDR在圖6(A)和6(B)中以下劃線表示。圖7顯示不同濃度的抗體與阿爾茲海默病(AD)患者或老齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠的新皮層的橫切片的結(jié)合。具體的說，圖7(A)圖解確認(rèn)在APP轉(zhuǎn)基因小鼠系Tg2576和在AD患者(RZ55)中用剛果紅染色淀粉樣沉積物為大腦組織中的斑塊和大腦血管中的大腦淀粉樣血管病(CAA)。圖7(B)圖解說明對AD患者(RZ16)中的A(3(淀粉樣斑塊)腦實(shí)質(zhì)沉積物的染色只在6G1和市售可得抗體6E10出現(xiàn)，而8F5和8C5顯示相當(dāng)弱的染色。圖7(C)圖解說明對TG2576小鼠中的Ap(淀粉樣斑塊)腦實(shí)質(zhì)沉積物的強(qiáng)染色只在6G1和市售可得抗體6E10出現(xiàn)，而8F5和8C5顯示相當(dāng)弱的染色。圖7(D)-(G)圖解說明用圖像分析對組織學(xué)圖像中的A卩斑塊染色進(jìn)行的分析定量。光密度值(0%=無染色)由斑塊的灰度值減去背景組織的灰度值計(jì)算得出。((D)=Tg2576小鼠中結(jié)合0.7嗎/ml抗體；@(E)=APP/L小鼠中結(jié)合0.07-0.7pg/ml抗體；圖(F^AD患者(RZ55)中結(jié)合0.7嗎/ml抗體；圖(G^AD患者(RZ16)中結(jié)合0.0;0.7pg/ml抗體)對市售可得抗體6E10(星號)和4G8(圓圈)與抗體6G1、8C5和8F5(—個(gè)星號/圓圈p<0.05，兩個(gè)星號/圓圈p<0.01，三個(gè)星號/圓圈pO.OOl，均相對于于對照比較；在ANOVA后，post-hocBonferroni的t檢驗(yàn)p〈0.001)之間的染色差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的評估(圖(D)和圖(E))。在圖(E)和(G)中，抗體8C5和8F5總是顯示出比市售可得抗體6E10和4G8顯著更低的染色(ANOVA檢驗(yàn)pO.OOl后，post-hoc的t檢驗(yàn)中，p<0.05。圖(H)圖解說明對A(3血管沉積物的強(qiáng)烈染色(箭頭)只在6G1和市售可得抗體6E10出現(xiàn)，而8F5或8C5的染色要弱得多。在Tg2576小鼠中發(fā)現(xiàn)定性類似情況(這里未顯示)。圖8圖解比較了8C5對球聚體相對于A卩(l-42)單體、A卩(l-40)和sAPP的選擇性。8C5的選擇性系數(shù)可計(jì)算為各EC50值之間的比值(對HFIP中的Ap(l-42)單體:2346/568.2=4.1;對NH4OH中的A卩(l-42)單體>100;對A卩(l-40)單體>100;對sAPP:〉100)圖9(A)圖解說明了編碼8C5的重鏈的核苷酸序列(SEQIDNO:ll)，圖9(B)圖解說明了編碼8C5的輕鏈的核苦酸序列(SEQIDNO:12)。編碼圖10(A)和10(B)中所述的相應(yīng)CDR的核苷酸序列以下劃線表示。圖10(A)說明單克隆抗體8C5的可變重鏈的氨基酸序列(SEQIDNO:19)，圖10(B)說明單克隆抗體8F5的可變輕鏈的氨基酸序列(SEQIDNO:20)。可變重鏈的一個(gè)CDR由氨基酸序列SYGMS(SEQIDNO:13)表示。可變重鏈的另一個(gè)CDR由氨基酸序列SIK麗GGSTYYPDSLKG(SEQIDNO:14)表示，可變重鏈的又一個(gè)CDR由氨基酸序列SGDY(SEQIDNO:15)表示?？勺冚p鏈的一個(gè)CDR由氨基酸序列RSSQSLVHSNGDTFLH(SEQIDNO:16)表示。可變輕鏈的另一個(gè)CDR由氨基酸序列KVSNRFS(SEQIDNO:17)表示，可變輕鏈的又一個(gè)CDR由氨基酸序列SQSIHVPWT(SEQIDNO:18)表示。所有上述CDR在圖10(A)和IO(B)中以下劃線表示。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及本文稱為"8F5"的單克隆抗體以及其它相關(guān)抗體(例如8C5)。這些抗體可例如用于阿爾茲海默病和其它神經(jīng)變性性疾病的診斷、預(yù)防和治療。單克隆抗體8F5及單克隆抗體8C5具有許多值得關(guān)注的特性，這些特性使得它們成為極其值得關(guān)注的治療用候選者及極其有用的診斷用候選者。例如，單克隆抗體8F5和8C5對A(3(l-42)球聚體的結(jié)合優(yōu)先于對單體或原纖維的結(jié)合。術(shù)語"A卩(X-Y)"在本文中指人淀粉樣(3蛋白質(zhì)中從氨基酸位置X到氨基酸位置Y、包括X和Y在內(nèi)的氨基酸序列，具體的說指氨基酸序歹'〗DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA或其任何天然變體中從氨基酸位置X到氨基酸位置Y、包括位置X和位置Y在內(nèi)的氨基酸序列，或者具有最多三個(gè)另外的氨基酸置換、而這些置換沒有一個(gè)會妨礙球聚體的形成的序列，所述變體具體的說是具有至少一個(gè)選自以下的突變的那些變體A2T、H6R、D7N、A21G("Flemish")、E22G("Arctic")、E22Q("Dutch")、E22K("Italian")、D23N("Iowa")、A42T和A42V，其中數(shù)字是相對于A卩肽的起始位置。"另外的"氨基酸置換在本文中定義為與自然界中所不存在的規(guī)范序列的任何偏差。更具體的說，術(shù)語"Ap(l-42)"在本文中指人淀粉樣P蛋白質(zhì)中從氨基酸位置1到氛基酸位置42、包括1和42在內(nèi)的氨基酸序列，具體的說指從氨基酸位置1到氨基酸位置42、包括1和42在內(nèi)的氨基酸序歹'JDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA(對應(yīng)于氨基酸位置1-42),或其任何天然變體，所述變體可以是例如具有至少一個(gè)選自以下的突變的那些變體A2T、H6R、D7N、A21G("Flemish")、E22G("Arctic")、E22Q("Dutch")、E22K("Italian")、D23N("Iowa")、A42T和A42V,其中數(shù)字是相對于A卩肽的起始位置，或者具有最多三個(gè)另外的氨基酸置換、而這些置換沒有一個(gè)會妨礙球聚體的形成的序列，。同樣，術(shù)語"AP(l-40)"在本文中指人淀粉樣|3蛋白質(zhì)中從氨基酸位置1到氨基酸位置40、包括1和40在內(nèi)的氨基酸序列，具體的說指從氨基酸位置1到氨基酸位置40、包括1和40在內(nèi)的氨基酸序列DAEFRHDSGY述變體包括例如具有至少一個(gè)選自以下的突變的那些變體A2T、H6R、D7N、A21G("Flemish")、E22G("Arctic")、E22Q("Dutch")、E22K("Italian")和D23N("Iowa")，其中數(shù)字是相對于A卩肽的起始位置，或者具有最多三個(gè)另外的氨基酸置換、而這些置換沒有一個(gè)會妨礙球聚體的形成的序列，。術(shù)語"A(3(X-Y)球聚體"(也稱"A(3(X-Y)球形寡聚體")在本文中指以上所定義的A卩(X-Y)肽的可溶性、球形、非共價(jià)的聯(lián)合體(association),該聯(lián)合體具有均勻性和獨(dú)特的物理特性。A卩(X-Y)球聚體是A卩(X-Y)肽的穩(wěn)定、非纖維狀、寡聚的集合體(assembly)，可通過將該肽與陰離子去污劑一起溫育來獲得。與單體和原纖維相比，這些球聚體的特征是具有確定的亞單位集合體數(shù)(例如PCT國際申請公開說明書WO04/067561中所描述，早期集合體形式，n=3-6，"寡聚體A"，和后期集合體形式，n=12-14，"寡聚體B")。球聚體具有3維球形結(jié)構(gòu)("熔融小球(moltenglobule)"，參見Barghornetal.,2005,JNeurochem,95,834-847)。它們還可通過一種或多種以下特征來表征-能用混雜蛋白酶(如嗜熱菌蛋白酶或內(nèi)切蛋白酶GluC)切割N末端氨基酸X-23，產(chǎn)生截短形式的A卩(X-Y)球聚體；-混雜蛋白酶和抗體不能接近C末端氨基酸24-Y;-截短形式的這些AP(X-Y)球聚體保持了球聚體的3維核心結(jié)構(gòu)，同時(shí)核心表位A|3(20-Y)在其球聚體構(gòu)象下具有更好的可接近性。根據(jù)本發(fā)明，具體的說出于評估本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力的目的，術(shù)語"A|3(X-Y)球聚體，，在本文中指可通過國際申請公開說明書WO04/067561(其通過引用整體結(jié)合到本文中)描述的方法獲得的產(chǎn)物。該方法包括使天然、重組或合成的Ap(X-Y)肽或其衍生物解折疊；使至少部分上解折疊的AP(X-Y)肽或其衍生物暴露于去污劑；減少去污作用和繼續(xù)進(jìn)行溫育。出于使肽解折疊的目的，可讓氫鍵破壞劑如六氟異丙醇(HFIP)作用于蛋白質(zhì)。當(dāng)作用溫度為約20-50°C、具體的說約35-40。C時(shí)，幾分鐘、例如約10-60分鐘的作用時(shí)間就足夠了。隨后將被蒸發(fā)至干的、劑如二甲亞砜(DMSO)，產(chǎn)生出至少部分上解折疊的肽或其衍生物的懸浮液，該懸浮液隨后可以進(jìn)行使用。如果需要，可將懸浮液原液在低溫下、例如在約-20。C下儲藏臨時(shí)的一段時(shí)間?；蛘?，可將肽或其衍生物吸收在輕微酸性的、優(yōu)選含水的溶液中，例如約10mMHCl水溶液。在大約幾分鐘的溫育時(shí)間后，將不溶性成分離心除去。以10,000g幾分鐘就適宜了。這些方法步驟優(yōu)選在室溫下、即20-30。C范圍內(nèi)進(jìn)行。離心后獲得的上清液含有A卩(X-Y)肽或其衍生物，可在低溫下、例如在約-20。C下儲藏臨時(shí)的一段時(shí)間。接下來暴露于去污劑涉及到肽或其衍生物發(fā)生寡聚化產(chǎn)生中間體型的寡聚體(在國際申請公開說明書WO04/067561中稱為寡聚體A)。出于這個(gè)目的，讓去污劑作用于任選至少部分解折疊的肽或其衍生物，直到產(chǎn)生了足夠的中間寡聚體。優(yōu)選的是使用離子型去污劑，特別是陰離子去污劑。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，使用下式(I)的去污劑R-X,其中基團(tuán)"R"是具有6-20個(gè)、優(yōu)選10-14個(gè)碳原子的無支鏈或有支鏈烷基或者具有6-20個(gè)、優(yōu)選10-14個(gè)碳原子的無支鏈或有支鏈烯基，基團(tuán)"x"是酸性基團(tuán)或其鹽，該x優(yōu)選選自-cocnvT、-so3—]vr，最優(yōu)選為-OS(VM"，M"為氫陽離子或者優(yōu)選選自堿金屬陽離子、堿土金屬陽離子和銨陽離子的無機(jī)或有機(jī)陽離子。最有利的是式(I)其中R為無支鏈烷基的去污劑，該烷基中特別值得一提的是烷-l-基基團(tuán)。特別優(yōu)選的是十二烷基硫酸鈉(SDS)。還可方便地使用月桂酸和油酸。十二烷酰肌氨酸這種去污劑的鈉鹽(也稱sarkosylNL-30或Gardof)也特別有利。去污劑作用的時(shí)間具體的說取決于寡聚化的肽或其衍生物是否已經(jīng)解折疊，且如果已經(jīng)解折疊，則取決于解折疊程度如何。如果根據(jù)解折疊步驟，肽或其衍生物已預(yù)先用氫鍵破壞劑(即具體的說用六氟異丙醇)進(jìn)行了處理，則當(dāng)作用溫度為約20-50。C、具體的說約35-40。C時(shí)，作用時(shí)間為若干小時(shí)、有利地約l-20小時(shí)、具體的說約2-10小時(shí)。如果是從解折疊較少或者幾乎沒有解折疊的肽或其衍生物出發(fā)，則宜相應(yīng)增加作用時(shí)間。如果肽或其衍生物已例如根據(jù)上述程序進(jìn)行了預(yù)處理作為HFIP處理的替代，或者所述肽或其衍生物直接經(jīng)過寡聚化，則當(dāng)作用溫度為約20-50。C、具體的說約35-40。C時(shí)，作用時(shí)間為約5-30小時(shí)、尤其是約10-20小時(shí)。溫育后，不溶性成分通過離心法方便地除去。以10,000g幾分鐘就適宜了。去污劑濃度的選定取決于所用的去污劑。如果是使用SDS，則適宜濃度為0.01-1%(重量)、優(yōu)選0.05-0.5%(重量)、例如約0.2%(重量)。如果是使用月桂酸或油酸，則適宜稍高的濃度，例如0.05-2%(重量)、優(yōu)選0.1-0.5%(重量)、例如約0.5%(重量)。去污作用發(fā)生于近似生理學(xué)含鹽濃度范圍內(nèi)。因此，具體的說，NaCl適宜濃度為50-500mM、優(yōu)選100-200mM、更優(yōu)選約140mM。隨后的去污劑作用的減少和溫育的繼續(xù)涉及到進(jìn)一步寡聚化產(chǎn)生本發(fā)明的A|3(X-Y)球聚體(在國際申請公開說明書WO04/067561中稱為寡聚體B)。由于從前面步驟獲得的組合物常常含有去污劑和處于生理范圍的鹽濃度，因此宜減少去污劑作用并優(yōu)選還減少鹽濃度。這可以這樣來進(jìn)行將去污劑和鹽例如適宜地用水或較低鹽濃度的緩沖液(例如Tris-HCl,pH7.3)進(jìn)行稀釋，從而減少去污劑和鹽的濃度。稀釋系數(shù)是約2-10、有利地是約3-8、特別合適的是約4。去污劑作用的減少也可通過加入能中和這個(gè)去污劑作用的物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。這些物質(zhì)的實(shí)例包括能夠?qū)⑷ノ蹌┙j(luò)合的物質(zhì)，如能夠在純化和提取措施中使細(xì)胞穩(wěn)定化的物質(zhì)，例如特別是EO/PO嵌段共聚物，具體的說商標(biāo)為PluronicF68的嵌段共聚物。同樣可以使用的是烷氧基化的、特別是乙氧基化的烷基酚，如TritonX系列的乙氧基化叔辛基酚，具體的說是TritonX100、3-(3-膽酰胺丙基二甲氨基)丙磺酸鹽(3-(3-cholamidopropyldimethylammonio)-1-propanesulfonate，CHAPS)，或者烷氧基化的、具體的說乙氧基化的脫水山梨糖醇脂肪酯，如Tween系列的乙氧基化脫水山梨糖醇脂肪酯，具體的說是Tween20，所用濃度范圍在特定臨界膠束濃度附近或以上。隨后將溶液溫育至產(chǎn)生出足夠的A(3(X-Y)球聚體。當(dāng)作用溫度為約20-50。C、具體的說約35-40。C時(shí)，作用時(shí)間是若干小時(shí)、優(yōu)選約10-30小時(shí)、具體的說約15-25小時(shí)。然后可將溶液濃縮，可能出現(xiàn)的殘余物可通過離心除去。同樣，以10,000g幾分鐘就適宜了。離心后獲得的上清液含有本文所述的A|3(X-Y)球聚體。A(3(X-Y)球聚體可例如通過超濾、透析、沉淀或離心進(jìn)行最終回收。進(jìn)一步優(yōu)選的是，A|3(X-Y)球聚體在變性條件下例如通過SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離能產(chǎn)生雙條帶(例如對于A(3(l-42)來說表觀分子量為38/48kDa),特別優(yōu)選的是，在分離前對寡聚體進(jìn)行戊二醛處理時(shí)，這些雙條帶合并成一個(gè)條帶。還優(yōu)選的是，對球聚體進(jìn)行尺寸排阻色譜法產(chǎn)生單一峰(例如對于A卩(l-42)來說對應(yīng)于大約60kDa體。優(yōu)選地，球聚體顯示出對神經(jīng)元細(xì)胞的親和力，同時(shí)還顯示神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。"神經(jīng)調(diào)節(jié)作用"定義為神經(jīng)元的長期抑制作用，該抑制作用導(dǎo)致神經(jīng)元在可塑性方面出現(xiàn)功能異常。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，術(shù)語"AP(X-Y)球聚體"在本文中指本質(zhì)上由AP(X-Y)亞單位組成的球聚體，其中優(yōu)選的是平均來說12個(gè)亞單位中至少有11個(gè)是Aj3(X-Y)類型，更優(yōu)選的是，小于10%的球聚體包含任何非A卩(X-Y)肽，最優(yōu)選的是，制品中的非A卩(X-Y)肽的含量低于檢測閾。更具體的說，術(shù)語"A(3(l-42)球聚體"在本文中指包含如上定義的A卩(l-42)單位的球聚體；術(shù)語"AI3(12-42)球聚體"在本文中指包含如上定義的A|3(12-42)單位的球聚體；術(shù)語"A卩(20-42)球聚體"在本文中指包含如上定義的Ap(20-42)單位的球聚體。術(shù)語"交聯(lián)A|3(X-Y)球聚體"在本文中指可通過對如上定義的A|3(X-Y)球聚體的組成單位進(jìn)行交聯(lián)、優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)、更優(yōu)選醛交聯(lián)、最優(yōu)選戊二醛交聯(lián)而從該球聚體獲得的分子。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，交聯(lián)球聚體基本上是這樣的球聚體其中的各單位至少部分上通過共價(jià)鍵連接，而不是只通過非共價(jià)相互作用保持在一起。術(shù)語"A|3(X-Y)球聚體衍生物"在本文中具體是指通過與有助于檢測的基團(tuán)發(fā)生共價(jià)連接而被標(biāo)記的球聚體，所述基團(tuán)優(yōu)選為熒光團(tuán)，例如異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、維多利亞水母(Aequoreavictoria)熒光蛋白、線躕科(Dictyosoma)熒光蛋白或者它們的任何組合或熒光活性衍生物；發(fā)色團(tuán)；化學(xué)發(fā)光團(tuán)(chemoluminophore)，例如螢光素酶，優(yōu)選北美螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶、費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)營光素酶或者它們的任何組合或化學(xué)發(fā)光活性衍生物；酶促活性基團(tuán)，例如過氧化物酶如辣根過氧化物酶或者其酶促活性衍生物；電子致密基團(tuán)(electron-densegroup)，例如含重金屬基團(tuán)如含金基團(tuán)；半抗原，例如酚衍化半抗原；強(qiáng)抗原性結(jié)構(gòu)，例如如通過Kolaskar和Tongaonkar的算法預(yù)測具有抗原性的肽序列；另一分子的適體(aptamer);螯合基團(tuán)，例如六聚組氨酸基團(tuán)；能介導(dǎo)進(jìn)一步的特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的天然的或天然衍生的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，例如fos/jun對中的成員；磁性基團(tuán)，例如鐵磁性基團(tuán)；或者放射性基團(tuán)如包含&、14C、32P、3、或1251或它們的任何組合的基團(tuán)；或者是指這樣的球聚體其通過高親和力相互作用共價(jià)或非共價(jià)地、優(yōu)選共價(jià)地與能促進(jìn)失活、螯合、降解和/或沉淀的基團(tuán)連接而附加標(biāo)識，優(yōu)選標(biāo)識能促進(jìn)體內(nèi)降解的基團(tuán)，更優(yōu)選標(biāo)識遍在蛋白，在這種情況下特別優(yōu)選的是這一被標(biāo)識寡聚體是在體內(nèi)集合裝配；或者是指通過上述基團(tuán)的任何組合進(jìn)行修飾的球聚體。這種標(biāo)記的和附加標(biāo)識的基團(tuán)和將它們與蛋白質(zhì)連接的方法是本領(lǐng)域公知的。標(biāo)記和/或附加標(biāo)識可在進(jìn)行球聚體化(globulomerization)之前、過程中或之后進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，球聚體衍生物是可通過標(biāo)記和/或附加標(biāo)識反應(yīng)從球聚體獲得的分子。相應(yīng)地，術(shù)語"A(3(X-Y)單體衍生物"在本文中具體是指如對球聚體所述進(jìn)行標(biāo)記或附加標(biāo)識的AP單體。術(shù)語"較大親和力"在本文中指這樣的相互作用的程度，其中未結(jié)合抗體和未結(jié)合球聚體與抗體-球聚體復(fù)合物之間的平衡更有利于抗體-球聚體復(fù)合物。同樣，術(shù)語"較小親和力"在本文中指這樣的相互作用的程度，其中未結(jié)合抗體和未結(jié)合球聚體與抗體-球聚體復(fù)合物之間的平衡更有利于未結(jié)合抗體和未結(jié)合球聚體。術(shù)語"AP(X-Y)單體"在本文中指A(3(X-Y)肽的分離形式，優(yōu)選沒有參與到與其它A卩肽的實(shí)質(zhì)上非共價(jià)相互作用的A(3(X-Y)肽形式。實(shí)際上，A(3(X-Y)單體常常是以水溶液的形式提供。優(yōu)選地，單體水溶液當(dāng)用于例如測定本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力時(shí)，含有0.05%-0.2%、更優(yōu)選約0.P/o的NaOH。在另一個(gè)優(yōu)選的情況中，單體水溶液含有0.05%-0.2%、更優(yōu)選約0.1%的NaOH。當(dāng)使用時(shí)，宜以適當(dāng)?shù)姆绞綄⑷芤哼M(jìn)行稀釋。此外，溶液通常宜在其制備后2小時(shí)內(nèi)、具體的說l小時(shí)內(nèi)、特別是30分鐘內(nèi)使用。術(shù)語"原纖維"在本文中指由非共價(jià)締合的單個(gè)AJ3(X-Y)肽的集合體構(gòu)成的分子結(jié)構(gòu)，該集合體在電子顯微鏡下顯示纖維狀結(jié)構(gòu)，能結(jié)合剛果紅，在偏振光下顯示雙折射現(xiàn)象，其X-射線衍射圖樣是交叉|3折疊結(jié)構(gòu)。原纖維還可定義為可通過這樣的方法獲得的分子結(jié)構(gòu)，該方法包括使合適的A(3肽在例如0.1MHC1中，在去污劑不存在下，發(fā)生自身引發(fā)的聚合聚集(polymericaggregation),導(dǎo)致形成超過24個(gè)單位、優(yōu)選超過100個(gè)單位的聚集體(aggregate)。這個(gè)方法是本領(lǐng)域公知的。AP(X-Y)原纖維適宜以水溶液形式使用。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣來制備原纖維水溶液將A卩肽溶于0.1。/。NH4OH中，將它用20mMNaH2P04,140mMNaCl,pH7.4進(jìn)行1:4稀釋，然后重調(diào)pH至7.4，所得溶液在37°C下溫育20小時(shí)，然后以10000g離心10分鐘，重懸浮于20mMNaH2P04,140mMNaCl,pH7.4中。術(shù)語"AP(X-Y)原纖維，，在本文中指包含A(3(X-Y)亞單位的原纖維，其中優(yōu)選的是平均來說至少90。/。的亞單位是AI3(X-Y)類型，更優(yōu)選的是至少98%的亞單位是八|3(X-Y)類型，最優(yōu)選的是非AJ3(X-Y)肽的含量低于檢測閾?，F(xiàn)回到8F5(圖1所示)及8C5(圖8),相比于非特異性抗體6G1和6E10,Ap(l-42)球聚體特異性抗體即單克隆抗體8F5和8C5主要識別Ap(l-42)球聚體形式而不是A(3(l-40)或A卩(l-42)單體的標(biāo)準(zhǔn)制品，包括聚集的A|3(l-42)。具體的說，8F5只通過無變性PAGE-蛋白質(zhì)印跡而不是通過SDS-PAGEA蛋白質(zhì)印跡分析檢測A卩(l-42)球聚體，這表明是與核心A|3(1-42)球聚體結(jié)構(gòu)中的更為復(fù)雜的去污劑可解離亞基間表位發(fā)生結(jié)合。亞基間表位定義為位于至少兩個(gè)亞單位上的復(fù)雜非線型跨空間表位。更具體的說，對各種AJ3(l-42)和A卩(卜40)標(biāo)準(zhǔn)制品的斑點(diǎn)印跡分析顯示，特異性8F5和8C5在對A(3(l-42)球聚體的識別與對非球聚體A(3形式(標(biāo)準(zhǔn)的A|3(l-40)/(l-42)單體制品、聚集的Af3(l-42》的識別上存在顯著差異，而同種型非特異性抗體6G1和6E10卻不是這樣。通過在夾心ELISA中對A卩(l-42)球聚體、A卩(l-42)單體、A(3(l-40)單體和可溶性淀粉樣前體蛋白a結(jié)合進(jìn)行定量，證實(shí)了8F5和8C5對球聚體有特異性，而6G1和6E10沒有特異性。此外，由于這些抗體在無變性的蛋白質(zhì)印跡后而不是在SDS蛋白質(zhì)印跡后接近球聚體，很可能每個(gè)抗體識別的是在A(3(l-42)的氨基酸20-30區(qū)域中亞單位之間的結(jié)構(gòu)非線型表位。對球聚體的這種特異性是重要的，因?yàn)橛们蚓垠w優(yōu)先抗體如8F5或8C5特異性靶向球聚體形式的A|3,將能是用不溶性AJ3進(jìn)行免疫過程中所觀察到的炎性副作用的原因)；2)避開據(jù)報(bào)道具有預(yù)識別(precognitive)生理功能(Planetal.,J.ofNeuroscience23:5531-5535(2003)的A|3單體和APP;和3)提高抗體的接近。本發(fā)明還包括編碼單克隆抗體8F5和8CD的可變輕鏈和重鏈的分離核苷酸序列(或其片段)，以及具有包含、對應(yīng)于、相同于、可雜交于或可互補(bǔ)于與這些編碼核苷酸序列的至少約70%(例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%)、優(yōu)選至少約80%(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%)、更優(yōu)選至少約90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)同一性的序列的那些核苷酸序列(或其片段)。(關(guān)于百分比同一性，70%-100%之間(包括70%和100%)的所有整數(shù)(及其小數(shù))均被認(rèn)為都屬于本發(fā)明的百分比同一性范圍之內(nèi)。)這種序列可衍自任何來源(例如從天然來源分離，通過半合成途徑產(chǎn)生，或者從頭合成)。具體的說，這種序列可分離自或衍自實(shí)施例中所述的來源之外的來源(例如細(xì)菌、真菌、藻類、小鼠或人)。除了上述核苷酸序列外，本發(fā)明還包括單克隆抗體8F5和單克隆抗體8C5的可變輕鏈和重鏈的氨基酸序列(或者這些氨基酸序列的片段)。此外，本發(fā)明還包括包含、對應(yīng)于、相同于或可互補(bǔ)于與本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的至少約70%、優(yōu)選至少約80%、更優(yōu)選至少約90%同一性的氨基酸序列(或其片段)。(同樣，70%-100%之間(包括70%和100%)的所有整數(shù)(及其小數(shù))(如同以上有關(guān)核苷酸序列同一性所述)也被認(rèn)為屬于本發(fā)明的核苷酸序列同一性范圍之內(nèi)。)出于本發(fā)明的目的，核苷酸序列的"片l殳"定義為對應(yīng)于指定核苷酸序列的某個(gè)區(qū)域的、由大約至少6個(gè)、優(yōu)選至少約8個(gè)、更優(yōu)選至少約10個(gè)核香酸、甚至更優(yōu)選至少約15個(gè)核苷酸組成的連續(xù)序列。術(shù)語"同一性，，指兩個(gè)序列在特定的比較窗或區(qū)段范圍內(nèi)基于核苦酸對核苦酸比較的相關(guān)性。因此，同一性定義為兩個(gè)DNA區(qū)段(或者兩個(gè)氨基酸序列)的相同鏈(正義鏈或反義鏈)之間的相同性、對應(yīng)性或等同性的程度。"序列同一性百分?jǐn)?shù)"是這樣計(jì)算的將兩個(gè)進(jìn)行最佳比對的序列在特定區(qū)域范圍內(nèi)進(jìn)行比較；確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同石威基或氨基酸的位置的數(shù)量，以得到相匹配位置的數(shù)量；將這種位置的數(shù)量除以被比較區(qū)段中的位置總數(shù)，所得的商再乘以100。序列的最佳比對可以通過Smith&Waterman,Appl.Math.2:482(1981)的算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的算法、Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988)的方法和執(zhí)行相關(guān)算法的計(jì)算機(jī)程序(例如ClustalMacawPileup0ltta〃cmgm.Stanford.edu/biochem218/11Multiple,pdf;Higginsetal.,CABIOS.5L151-153(1989》、FASTDB(Intelligenetics)、BLAST(NationalCenterforBiomedicalInformation;Altschuletal.,NucleicAcidsResearch25:3389-3402(1997》、PILEUP(GeneticsComputerGroup,Madison,WI)或GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,Madison,WI)來進(jìn)行。(參見美國專利5,912,120。)出于本發(fā)明目的，"互補(bǔ)性"定義為兩個(gè)DNA區(qū)段之間的相關(guān)性程度。它是通過測量一個(gè)DNA區(qū)段的正義鏈在適當(dāng)條件下與另一DNA區(qū)段的反義鏈發(fā)生雜交形成雙螺旋的能力來確定的。"互補(bǔ)序列"定義為基于典范的堿基配對規(guī)則與給定序列配對的序列。例如，一個(gè)核苷酸鏈中的序列A-G-T與另一個(gè)核苷酸鏈中的序列T-C-A是"互補(bǔ)的"。在雙螺旋中，腺噪呤在一條鏈中出現(xiàn)，胸腺嘧啶則在另一條鏈中出現(xiàn)。同樣，如鳥嘌呤存在于一條鏈中，則胞嘧啶會存在于另一條鏈中。兩個(gè)DNA區(qū)段的核苷酸序列之間的相關(guān)性越大，該兩個(gè)DNA區(qū)段的兩條鏈之間形成雜合雙鏈體的能力越大。兩個(gè)氨基酸序列之間的"相似性"定義為在兩個(gè)序列中有一系列的相同和保守的氨基酸殘基存在。兩個(gè)氨基酸序列之間的相似性程度越高，該兩個(gè)序列的對應(yīng)性、相同性或等同性越高。(兩個(gè)氨基酸序列之間的"同一性"定義為在兩個(gè)序列中有一系列的完全同樣或不變的氨基酸殘基存在。)"互補(bǔ)性"、"同一性"和"相似性"的定義是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。"(由)......編碼的，，是指編碼多肽序列的核酸序列，其中該多肽序列或其部分含有這樣的氨基酸序列，其由該核酸序列編碼的多肽的至少3個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少8個(gè)氣基酸、甚至更優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸組成。另外，當(dāng)單鏈形式的核酸分子在適當(dāng)?shù)臏囟群碗x子強(qiáng)度條件下能與另一核酸分子退火時(shí)，則該核酸分子與該另一核酸分子"可雜交"(參見Sambrooketal.,"MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor:26NewYork))。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的"嚴(yán)格性"。本文所用的術(shù)語"雜交"一般用來指核酸在適當(dāng)?shù)膰?yán)格性條件下件是容易明了的。雜交和洗滌的條件是本領(lǐng)域公知的，根據(jù)所需的嚴(yán)格性通過改變溫育時(shí)間、溫度和/或溶液的離子強(qiáng)度來對條件作出調(diào)整也是容易實(shí)現(xiàn)的。參見例如Sambrook,J.etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition,ColdspringharborPress,ColdSpringharbor，N.Y.,1989,這個(gè)文獻(xiàn)在上文也提到過，它通過引用結(jié)合到本文中。(另參見ShortProtocolsinMolecularBiology,ed.Ausubeletal.和Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993),這兩個(gè)文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。)具體的說，條件的選擇決定于被雜交序列的長度(特別是探針序列的長度)、核酸的相對G-C含量和允許的錯配數(shù)量。如需要的是互補(bǔ)性程度較低的鏈之間的部分雜交，則優(yōu)選低嚴(yán)格條件。當(dāng)需要的是完美或近乎完美的互補(bǔ)性時(shí)，則優(yōu)選高嚴(yán)檔_條件。對于典型的高嚴(yán)格條件，雜交溶液含有6XS.S.C、0.01MEDTA、lxDenhardt氏溶液和0.5%SDS。雜交是在約68攝氏度下進(jìn)行，對于克隆的DNA的片段進(jìn)行約3-4小時(shí)，對于總真核DNA進(jìn)行約12-約16小時(shí)。對于中等嚴(yán)格性，可以采取用3X氯化鈉、檸檬酸鈉(SSC)的溶液、50。/。甲酰胺(0.1M的此緩沖劑，pH7.5)和5XDenhardt氏溶液進(jìn)行的濾膜預(yù)雜交和雜交。那么就可以在37攝氏度下預(yù)雜交4小時(shí)，接著在37攝氏度下與總量等于3,000,000cpm的標(biāo)記探針雜交16小時(shí)，再接著在2XSSC和0.1。/。SDS溶液中進(jìn)行洗滌，即在室溫下洗滌4次，每次1分鐘，然后在60攝氏度下洗滌4次，每次30分鐘。干燥后，暴露于膜。對于低嚴(yán)格性，將雜交的溫度降到低于雙鏈體的解鏈溫度(Tm)約12攝氏度。已知Tm是G-C含量和雙鏈體長度以及溶液的離子強(qiáng)度的函數(shù)。"雜交"要求兩個(gè)核酸含有互補(bǔ)的序列。但是，視雜交的嚴(yán)格性而定，石tt之間可能會出現(xiàn)錯配。如上所述，使核酸雜交的適當(dāng)嚴(yán)才各性取決于核酸的長度和互補(bǔ)的程度。這些變量是本領(lǐng)域公知的。更具體的說，兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，具有這些序列的核酸的雜交體的Tm值越大。對于長度大于100個(gè)核苷酸的雜交體，已有計(jì)算Tm的方程式(參見Sambrooketal.,出處同上)。對于與較短核酸的雜交，錯配的位置變得更為重要，寡核苷酸的長度決定其特異性(參見Sambrooketal.,出處同上)。本文所用的"分離核酸片段或序列"是單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變了的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離核酸片段可以由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段組成。(指定多核苷酸的"片段"指這樣的多核苷酸序列其包含由與指定核苷酸序列的某個(gè)區(qū)域有同一性或互補(bǔ)性的大約至少6個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少約8個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少約10個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選至少約15個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少約25個(gè)核苷酸組成的不間斷序列。)核香酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)用以下單字母符號指代"A"指代腺芬酸或脫氧腺苷酸(分別對RNA或DNA)，"C"指代胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"指代鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，"U"指代尿普酸，"UT"指代脫氧胸苷酸，"R"指代嘌呤(A或G)，"Y"指代嘧啶(C或T)，"K"指代G或T，"H"指代A或C或T，"I"指代肌苷，"N"指代任何核苷酸。術(shù)語"功能上等同的片段或亞片段，，與"功能等同片段或亞片段"在本文中可互用。這些術(shù)語指分離核酸片段中的這樣的部分或亞序列其中無論該片段或亞片段是否編碼活性酶，其改變基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力都得到保持。例如，該片段或亞片段可用于設(shè)計(jì)嵌合構(gòu)建物以在被轉(zhuǎn)化植物中產(chǎn)生所需的表型?？蛇@樣設(shè)計(jì)作共抑制或反義之用的嵌合構(gòu)建物將無論是否編碼活性酶的核酸片段或其亞片段，以相對于植物啟動子序列的適當(dāng)方向進(jìn)行連接。術(shù)語"同源性"、"同源的"、"基本上相似"、"基本上對應(yīng)"在本文中可互用。它們指這樣的核酸片段其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸石咸基的變化不會影響核酸介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。這些術(shù)語還指對本發(fā)明核酸片段的修飾如缺失或插入，相對于初始的未修飾片段，該修飾基本上沒有改變所產(chǎn)生的核苷酸片段的功能性特性。因此應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明所涵括的不只是特定的示例性序列，這一點(diǎn)本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到。"基因"指能表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括該編碼序列前面和后面的調(diào)節(jié)序列(分別為5'非編碼序列和3'非編碼序列)。"天然基因"指自然界中所存在的帶有其自身的調(diào)節(jié)序列的基因。相反，"嵌合序列"指在自然界中通常不一起存在的核酸片段的組合。因此，嵌合構(gòu)建物可包含衍自不同的來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者衍自相同的來源、但排列方式不同于自然界中通常存在的方式的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。(術(shù)語"分離(的)"是指序列被脫離其自然環(huán)境。)"外來"基因指在宿主生物中通常不存在、而是通過基因轉(zhuǎn)移引入到該宿主生物中的基因。外來基因可包括插入到非天然生物中的天然基因或者嵌合構(gòu)建物。"轉(zhuǎn)基因"是通過轉(zhuǎn)化程序被引入到基因組中的基因。"編碼序列"指編碼特定氛基酸序列的DNA序列。"調(diào)節(jié)序列"指位于編碼序列上游、當(dāng)中或下游的核苷酸序列(位于上游或下游的分為叫5'非編碼序列和3'非編碼序列)，它們能影響相關(guān)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。調(diào)節(jié)序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識別序列。"啟動子"或"調(diào)節(jié)基因序列"指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。該序列由近端的和較為遠(yuǎn)端的上游元件組成，后種元件往往被稱為增強(qiáng)子。因此，"增強(qiáng)子"是能刺激啟動子或調(diào)節(jié)基因序列活性的DNA序列，它可以是啟動子的固有元件或者是被插入以增強(qiáng)啟動子的水平或組織特異性的異源元件。啟動子序列也可位于基因的被轉(zhuǎn)錄部分當(dāng)中、和/或被轉(zhuǎn)錄序列的下游。啟動子可以全部衍自天然基因，或者可以由衍自自然界中存在的不同啟動子的不同元件組成，乃至可以包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，不同的啟動子可指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)，或者在不同發(fā)育階段的表達(dá)，或者響應(yīng)不同環(huán)境條件的表達(dá)。能引起基因在大多數(shù)宿主細(xì)胞類型中最多次數(shù)的表達(dá)的啟動子，通常被稱為"組成型啟動子"。各種類型的可用于植物細(xì)胞的新啟動子不斷得到發(fā)現(xiàn)；在Okamuro和Goldberg,BiochemistryofPlants15:1-82(1989)的匯編資料中可以找到很多例子。還要認(rèn)識到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切界限未曾得到完全定義，稍有差異的DNA片段可能也有相同的啟動子活性。"內(nèi)含子"M因中的不編碼蛋白質(zhì)序列的一部分的間插序列。因此，這種序列^皮轉(zhuǎn)錄成RNA后就被切除而不^皮翻譯。該術(shù)語還用于被切除的RNA序列。"外顯子"是基因序列中的這樣一個(gè)部分它被轉(zhuǎn)錄和存在于衍自該基因的成熟信使RNA中，但不一定是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的一部分。"翻譯前導(dǎo)序列"指位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導(dǎo)序列在完全加工的mRNA中在翻譯起始序列的上游存在。翻譯前導(dǎo)序列可影響初級轉(zhuǎn)錄物向mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例已有描述(Turner,R.和Foster,G.D.(1995)Mo/簡/w飾to:/wo/ogy3:225)。"3'非編碼序列"指位于編碼序列的下游的DNA序列，包括聚腺普酸化識別序列和其它編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號的序列。聚腺苷酸化信號通常以影響聚腺苷酸束(tract)向mRNA前體的3'末端的加入為特征。Ingelbrechtetal.,PlantCell1:671-680(1989)舉例說明了不同的3'非編碼序列的使用。"RNA轉(zhuǎn)錄物"指RNA聚合酶催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生200680051985.4的產(chǎn)物。RNA轉(zhuǎn)錄物如果是DNA序列的完美互補(bǔ)拷貝，則稱它為初級轉(zhuǎn)錄物，或者它可以是衍自初級轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，稱為成熟RNA。"信使RNA(mRNA)"指沒有內(nèi)含子的、能被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。"cDNA，，指用反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的、與該才莫板互補(bǔ)的DNA。cDNA可以是單鏈的，或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。"正義"RNA指包括mRNA的、能在細(xì)胞當(dāng)中或在體外^f皮翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。"反義RNA"指與耙標(biāo)初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)的、能阻斷靶標(biāo)基因的表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利5,107,065)。反義RNA的互補(bǔ)性可以涉及特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即在5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。"功能RNA"指可能不被翻譯、但仍對細(xì)胞過程具有作用的反義RNA、核酶RNA或其它RNA。術(shù)語"互補(bǔ)序列(complement)"和"反向互補(bǔ)序列(reversecomplement)"在本文中在mRNA轉(zhuǎn)錄物上可互用，意在定義信息鏈的反義RNA。術(shù)語"內(nèi)源RNA"指在用本發(fā)明的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化前在宿主的基因組中存在的任何核酸序列所編碼的任何RNA，既可以是天然的，也可以是非天然的，即通過重組手段、誘變等引入的。術(shù)語"非天然的"是指人工的，與自然界中通常存在的不一致。術(shù)語"有效連接"指將各核酸序列締合在單一核酸片段上，使得一個(gè)序列的功能受到另一個(gè)序列的調(diào)節(jié)。例如，某啟動子如果能夠調(diào)節(jié)某編碼序列的表達(dá)，則它就與該編碼序列有效連接(即該編碼序列處于該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)。編碼序列可以以正義或反義方向與調(diào)節(jié)序列有效連接。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的互補(bǔ)RNA區(qū)域能直接或間接地在耙標(biāo)mRNA上游(5')有效連接，或者在靶標(biāo)mRNA下游(3')有效連接，或者在靶標(biāo)mRNA當(dāng)中有效連接，或者第一互補(bǔ)區(qū)域在靶標(biāo)mRNA上游(5'),其互補(bǔ)序列在耙標(biāo)mRNA下游(3')。本文所用的術(shù)語"表達(dá)"指功能性最終產(chǎn)物的產(chǎn)生?；虻谋磉_(dá)涉及到該基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯為前體或成熟蛋白質(zhì)。"反義抑31制"指能夠抑制靶標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。"共抑制"指能夠抑制相同的或本質(zhì)上類似的外來或內(nèi)源基因的表達(dá)的正義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(美國專利5,231,020)。"成熟"蛋白質(zhì)指經(jīng)過翻譯后加工的多肽，即已除去了初級翻譯產(chǎn)物中存在的任何前肽(prepeptide或propeptide)的多肽。"前體"蛋白質(zhì)指mRNA翻譯的初級產(chǎn)物，即其中仍存在有前肽。前肽可以是但不限于胞內(nèi)定位信號。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指核酸片段向宿主生物的基因組中轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生遺傳上穩(wěn)定的遺傳特征。相反，"短暫轉(zhuǎn)化"指核酸片段向宿主生物的細(xì)胞核或含DNA細(xì)胞器轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致基因表達(dá)，但不發(fā)生整合和穩(wěn)定的遺傳特征。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物稱為"轉(zhuǎn)基因"生物。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"既指穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化也指短暫的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,1989(下文稱"Sambrook")中有更詳細(xì)的描述。術(shù)語"重組(的)"指將序列的兩個(gè)不同的分開區(qū)段進(jìn)行人工組合，例如通過化學(xué)合成或者通過用遺傳工程技術(shù)對核酸的分離區(qū)段進(jìn)行操縱。"PCR"或"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"是一種用以合成大量的特定DNA區(qū)段的技術(shù)，由一系列的重復(fù)循環(huán)組成(PerkinElmerCetusInstruments,Norwalk,CT)。通常，將雙鏈DNA熱變性，使與靶標(biāo)區(qū)段的3'邊界互補(bǔ)的兩個(gè)引物在低溫下退火，然后在中溫下延伸。這三個(gè)連續(xù)步驟構(gòu)成一組稱為一個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)("PCR")是一種通過才莫板的反復(fù)復(fù)制在短時(shí)間里將DNA擴(kuò)增幾百萬倍的強(qiáng)大技術(shù)。(Mullisetal.,ColdSpringHarborSvmp.Ouant.Biol.51:263-273(1986);Erlichetal.,歐洲專利申請第50，424號；歐洲專利申請第84,796號；歐洲專利申請第258,017號；歐洲專利申請第237,362號；Mullis,歐洲專利申請第201,184號；Mullisetal.,美國專利第4,683,202號；Erlich,美國專利第4,582,788號；和Saikietal.,美國專利第4,683,194號)。該過程采用幾組特異性的體外合成寡核苷酸來引發(fā)DNA合成。引物的設(shè)計(jì)取決于待分析的DNA的序列。該技術(shù)是通過許多個(gè)以下循環(huán)(通常20-50個(gè))步驟來進(jìn)行高溫使模板解鏈、讓引物與模板當(dāng)中的互補(bǔ)序列退火、然后用DNA聚合酶使模板復(fù)制。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是這樣進(jìn)行分析進(jìn)行瓊脂糖凝膠分離，然后進(jìn)行溴化乙錠染色，再用紫外透照法進(jìn)行顯現(xiàn)?；蛘?，可將放射性dNTP加到PCR中以向產(chǎn)物中摻入標(biāo)記。在這種情況下，PCR的產(chǎn)物通過將凝膠暴露于X射線片來顯現(xiàn)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行放射標(biāo)記的額外好處是能對單個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的水平進(jìn)行定量。術(shù)語"重組構(gòu)建物"、"表達(dá)構(gòu)建物"和"重組表達(dá)構(gòu)建物"在本文中可互用。這些術(shù)語指可用本領(lǐng)域技術(shù)人員^^知的標(biāo)準(zhǔn)方法插入到細(xì)胞基因組中的遺傳材料功能單位。這種構(gòu)建物可以單獨(dú)使用，或者可以與栽體一起使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于要用來轉(zhuǎn)化宿主植物的方法，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可以使用質(zhì)粒。為了成功轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含本發(fā)明的任何分離核酸片段的宿主細(xì)胞而必須在載體上存在的遺傳元件，是技術(shù)人員所熟知的。技術(shù)人員還會認(rèn)識到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件會導(dǎo)致不同的表達(dá)水平和才莫式(Jonesetal.，(1985)EMBOJ.4:2411-2418;DeAlmeidaetal"(1989)Mol.Gen.Genetics218:78-86),因此必須對多個(gè)事件進(jìn)行篩選以獲得顯示所需的表達(dá)水平和模式的細(xì)胞系。這種篩選可通過DNA的Southern分析、mRNA表達(dá)的Northern分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的Western分析或者表型分析來實(shí)現(xiàn)。本文所用的"單克隆抗體"意指含有共同的重鏈和共同的輕鏈氨基酸序列的抗體的一種抗體分子制品，與之相對的是來自含有不同抗體的混合物的"多克隆"抗體制品。單克隆抗體可通過幾種新型技術(shù)33如噬菌體、細(xì)菌、酵母或核糖體展示來產(chǎn)生，也可通過以雜交瘤衍生抗體為例證的經(jīng)典方法來產(chǎn)生(例如由通過雜交瘤技術(shù)如標(biāo)準(zhǔn)的Kohler和Milstein雜交瘤方法((1975)Nature256:495-497)制備的雜交瘤分泌的抗體)。因此，本發(fā)明的非雜交瘤衍生的激動性抗體盡管可能是通過非經(jīng)典方法衍生得到，但仍稱為單克隆抗體。本文所用的"分離抗體"意指基本上與具有不同抗原特異性的其它抗體分開的抗體(例如，特異性結(jié)合球聚體的分離抗體基本上與特異性結(jié)合球聚體之外的抗原的抗體分開)。但是，特異性結(jié)合球聚體的分離抗體可能對其它抗原具有交叉反應(yīng)性。此外，分離抗體可以大體上與其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)藥品分開。本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱"抗體部分")指抗體的一個(gè)或多個(gè)保持特異性結(jié)合抗原的能力的片段。已證實(shí)抗體的抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的各片段來執(zhí)行。這種抗體實(shí)施方案還可以是特異性結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)不同抗原的雙特異性、二重特異性或多特異性形式。涵括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"當(dāng)中的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，為由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，為包含兩個(gè)通過鉸鏈區(qū)中的二硫化物橋接的Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，其由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；(v)dAb片段(Wardetal.,(1989)A^wreMi:544-546)，其包含單一可變結(jié)構(gòu)域；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的VL和VH兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由分別的基因所編碼，但可用重組方法通過合成的接頭將它們連接起來，合成的接頭使它們能夠構(gòu)成單一的蛋白質(zhì)鏈，在該蛋白質(zhì)鏈中VL區(qū)和VH區(qū)能配對形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Birdetal.(1988)Sc!e"ce242:423-426;和Hustonetal.(1988)尸rac.Ato/./4cfldOS^M:5879-5883)。這種單鏈抗體也意在涵括在抗體的"抗原結(jié)合部分"這個(gè)術(shù)語當(dāng)中。還涵括的有其它形式的單鏈抗體如雙功能抗體。雙功能抗體是二價(jià)雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)在單一多肽鏈上，但所用的接頭太短，而不能使同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對，從而迫使這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如Holliger,P.,etal.(1993)My".爿o^.[/&4巡6444-6448;Poljak,R丄，etal.(1994)S"Wi^e2:1121-1123)。這種抗體結(jié)合部分是本領(lǐng)域公知的(Kontermann和Dubeleds.,AntibodyEngineering(2001)Springer-Verlag.NewYork.790pp.(ISBN3-540-41354-5)。還有，抗體或其抗原結(jié)合部分還可以是較大的免疫黏附分子的一部分，該免疫黏附分子是由該抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)其它蛋白質(zhì)或肽發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)締合而形成。這種免疫黏附分子的實(shí)例包括使用鏈霉親和素核心區(qū)來制作四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.,etal.(1995)//ww朋爿"/,力c^/m朋dT/少Z)nfitom^6:93-101)和使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端聚組氨酸標(biāo)簽來制作二價(jià)和生物素酰化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.,etal.(1994)Mo/,/wmw"o/.H=1047-1058)。抗體部分如Fab和F(ab')2片段可用常規(guī)技術(shù)從完整抗體制備，如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶對完整抗體進(jìn)行消化來制備。此外，抗體、抗體部分和免疫黏附分子可用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得。本文所用的術(shù)語"重組人抗體"意在包括所有通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體，如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體、從重組、組合人抗體庫分離的抗體(HoogenboomH.R.,(1997)7TOrec/.15:62-70;AzzazyH.,和Highsm池W.E.,(2002)C//".說oc/ew.35:425-445;Gavilondo丄V.，和LarrickJ.W.(2002)5,orecAm々1^5129:128-145;HoogenboomH.,和ChamesP.(2000)/mww朋/ogvTo^y21:371-378)、從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor,L.D.,etal.(1992)A^c/.yk/血尺e義20:6287-6295;KellermannS-A.,和GreenL.L.(2002)Cw/remQ/^mow胸ec/wo/ogy13:593-597;LittleM.etal(2000)/顯畫/ogy7b勿21:364-370)或者通過任何其它涉及到將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這種重組人抗體具有衍自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是，在某些實(shí)施方案中，這種重組人抗體經(jīng)歷體外誘變(或者如果使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物的話，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列它們雖然衍自和關(guān)聯(lián)于人種系VH序列和VL序列，但可能并不在體內(nèi)人抗體種系庫當(dāng)中天然存在。(另參見Kabatetal.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242，1991)。但是，本發(fā)明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1990)。術(shù)語"嵌合抗體"指包含來自一種物種的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列和來自另一種物種的恒定區(qū)序列的抗體，如其中鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)與人恒定區(qū)連接在一起的抗體。術(shù)語"CDR移植抗體"指包含來自一種物種的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列、但其中VH和/或VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的序列用另一種物種的CDR序列取代的抗體，如具有鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)、其中一個(gè)或多個(gè)鼠CDR(例如CDR3)已用人CDR序列取代的抗體。本發(fā)明的重組人抗體具有衍自人種系免疫球蛋白序列可變區(qū)，且還可包括衍自人種系免疫球蛋白序列的恒定區(qū)。(參見Kabatetal.(1991)，出處同上。)但是，在某些實(shí)施方案中，這種重組人抗體經(jīng)歷體外誘變(或者如果使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物的話，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列它們雖然衍自和關(guān)聯(lián)于人種系VH序列和VL序列，但可能并不在體內(nèi)人抗體種系庫當(dāng)中天然存在。不過在某些實(shí)施方案中，這種重組抗體是選擇性誘變或回復(fù)突變或這兩種情況的結(jié)果。36術(shù)語"回復(fù)突變"指這樣的過程其中人抗體的一些或全部的體細(xì)胞性突變的氨基酸被來自同源種系抗體序列的相應(yīng)種系殘基替代。將本發(fā)明人抗體的重鏈和輕鏈序列分別與VBASE數(shù)據(jù)庫中的種系序列進(jìn)行比對，以鑒定出具有最高同源性的序列。VBASE是所有的人種系可變區(qū)序列的綜合目錄，是將包括GenBank和EMBL數(shù)據(jù)文庫的最新發(fā)布序列在內(nèi)的公布序列匯編而成。該數(shù)據(jù)庫是在MRCCentreforProteinEngineering(Cambridge,UK)開發(fā)，作為已測序的人抗體基因的收藏庫(網(wǎng)址http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-intro.phpmenu=901)。本發(fā)明的人抗體中的差異，通過將編碼這種差異性氨基酸的明確核苷酸位置進(jìn)行突變來回傳到種系序列。對于每種氨基酸這樣被鑒定為回復(fù)突變的候選者的角色，都應(yīng)研究其在抗原結(jié)合中的直接或間接角色，任何在突變后被發(fā)現(xiàn)會影響人抗體的任何合宜特性的氛基酸，都不應(yīng)包括在最終人抗體中。為使要經(jīng)歷回復(fù)突變的氨基酸的數(shù)量減到最少，可保留那些被發(fā)現(xiàn)與最近的種系序列不同、但與第二種系序列中的相應(yīng)氨基酸相同的氨基酸位置，條件是第二種系序列與本發(fā)明的人抗體的序列在所指涉氨基酸的兩側(cè)相同和共線性(co-linear)達(dá)至少10個(gè)、優(yōu)選12個(gè)氨基酸?；貜?fù)突變可在抗體最優(yōu)化的任何階段出現(xiàn)。"標(biāo)記結(jié)合蛋白"是其中本發(fā)明抗體或抗體部分衍生或連接到另一功能分子(例如另一肽或蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明的標(biāo)記結(jié)合蛋白可通過將本發(fā)明抗體或抗體部分(通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)締合或其它方式)與一個(gè)或多個(gè)其它分子實(shí)體發(fā)生功能連接來衍生，所述分子實(shí)體如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可檢測物劑、細(xì)胞毒性劑、藥劑和/或能介導(dǎo)該抗體或抗體部分與另一分子的締合的蛋白質(zhì)或肽(如鏈霉親和素核心區(qū)或聚組氨酸標(biāo)簽)。出于本發(fā)明目的，"糖基化結(jié)合蛋白"是這樣的蛋白質(zhì)其中抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)或多個(gè)碳水化合物殘基。體內(nèi)新生的蛋白質(zhì)可進(jìn)行進(jìn)一步的加工，此稱翻譯后修飾。具體的說，可酶促加入糖(糖基)殘基，這個(gè)過程稱為糖基化。所得的帶有共價(jià)連接的寡糖側(cè)鏈的蛋白質(zhì)稱為糖基化蛋白質(zhì)或糖蛋白?？贵w就是在Fc結(jié)構(gòu)域以及可變結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)或多個(gè)碳水化合物殘基的糖蛋白。FC結(jié)構(gòu)域中的碳水化合物殘基對Fc結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能具有重要的影響，而對抗體的抗原結(jié)合或半衰期的影響最小(R.Jefferis,說o&c/wo/.21(2005)，pp.11-6)。與此對比，可變結(jié)構(gòu)域的糖基化可能對抗體的抗原結(jié)合活性有影響?？勺兘Y(jié)構(gòu)域中的糖基化可能會對抗體結(jié)合親和力有負(fù)面影響(這可能是因?yàn)槲蛔杷?(Co,M.S.,etal.,Mol.Immunol.(1993)30:1361-1367)，或者可能會導(dǎo)致對抗原的親和力增加(Wallick,S.C.,etal.,Exp.Med.(1988)168:1099-1109;Wright,A.,etal.,EMBO丄(1991)10:27172723)。此外，可以產(chǎn)生出其中結(jié)合蛋白的O-或N-連接糖基化位點(diǎn)已被突變的糖基化位點(diǎn)突變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用標(biāo)準(zhǔn)的公知技術(shù)產(chǎn)生出這樣的突變體。還設(shè)想到了保持有生物活性、但結(jié)合活性得到提高或降低的糖基化位點(diǎn)突變體。此外，可對本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分的糖基化加以修飾。例如，可產(chǎn)生出無糖基化抗體(即缺乏糖基化的抗體)。可對糖基化加以改變，以例如提高抗體對抗原的親和力。這種碳水化合物修飾可通過例如改變抗體序列當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。例如，可作出一個(gè)或多個(gè)會導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)糖基化位點(diǎn)被消除的氨基酸置換，從而消除該位點(diǎn)處的糖基化。這種糖基化會提高抗體對抗原的親和力。這種方法在國際申請公開說明書WO03/016466A2及美國專利5,714,350和6,350,861中有更詳細(xì)的描述，這三個(gè)專利每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。另外，可產(chǎn)生出糖基化類型發(fā)生改變的修飾抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)量減少的低巖藻糖基化抗體或分叉(bisecting)GlcNAc結(jié)構(gòu)增加的抗體。這種改變了的糖基化模式已證實(shí)能提高抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可通過例如在糖基化體系(machinery)發(fā)生了改變的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實(shí)現(xiàn)。糖基化體系發(fā)生了改變的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，可用作宿主細(xì)胞來表達(dá)本發(fā)明的重組抗體從而產(chǎn)生糖基化改變了的抗體。(參見例如Shields,R.L.etal.(2002)J,Biol.Chem.277:26733-26740;Umanaetal.(1999)NatBiotech.17:176-1，以及歐洲專利EP1,176，195;國際申請公開號WO03/035835和WO99/5434280,這些文獻(xiàn)和專利的每一個(gè)通過引用整體結(jié)合到本文中。)蛋白質(zhì)糖基化取決于目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以及表達(dá)該蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。不同的生物可產(chǎn)生不同的糖基化酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶)，可有不同的底物(核苷酸糖)可供利用。由于這些因素，蛋白質(zhì)糖基化模式和糖基殘基的組成可隨表達(dá)特定蛋白質(zhì)的宿主系統(tǒng)而異。可用于本發(fā)明的糖基殘基包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸。優(yōu)選地，糖基化結(jié)合蛋白所包含的糖基殘基使得糖基化模式是人糖基化模式。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，不同的蛋白質(zhì)糖基化會導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)特性。例如，在微生物宿主如酵母中產(chǎn)生并用酵母內(nèi)源途徑糖基化的治療性蛋白質(zhì)，與在哺乳動物細(xì)胞如CHO細(xì)胞系中表達(dá)的相同蛋白質(zhì)相比，其功效會降低。這種糖蛋白還可能在人體中具有免疫原性，并顯示給藥后體內(nèi)半衰期減少。人和其它動物中的特異性受體可識別特定的糖基殘基，促進(jìn)蛋白質(zhì)從血流中的快速清除。其它不良反應(yīng)可包括蛋白質(zhì)折疊、溶解度、對蛋白酶的易感性、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)、區(qū)室化、分泌、-波其它蛋白質(zhì)或因子的識別、抗原性或變應(yīng)原性方面的變化。因此，業(yè)內(nèi)人士可能偏好具有特定的糖基化組成和模式的治療性蛋白質(zhì)，所述特定的糖基化組成和^^式例如相同于或至少類似于在人細(xì)胞中或在預(yù)期動物對象的物種特異性細(xì)胞中產(chǎn)生的糖基化組成和模式。要表達(dá)不同于宿主細(xì)胞的糖基化蛋白質(zhì)的糖基化蛋白質(zhì)，這可通過將宿主細(xì)胞遺傳修飾成能表達(dá)異源糖基化酶來實(shí)現(xiàn)。業(yè)內(nèi)人士使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可產(chǎn)生出顯示人蛋白質(zhì)糖基化的抗體或其抗原結(jié)合部分。例如，已將酵母菌株遺傳修飾成能表達(dá)非天然糖基化酶，使得在這些酵母菌林中產(chǎn)生的糖基化蛋白質(zhì)(糖蛋白)顯示的蛋白質(zhì)糖基化與動物細(xì)胞特別是人細(xì)胞的相同(美國專利申請公開說明書20040018590和20020137134及國際申請公開說明書WO05/100584A2)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，可用文庫的遺傳設(shè)計(jì)的表達(dá)各種糖基化酶的宿主細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)，使得該庫中的成員宿主細(xì)胞產(chǎn)生出具有不同的糖基化模式的目的蛋白質(zhì)。業(yè)內(nèi)人士然后可選擇和分離出具有特定的新型糖基化模式的目的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，具有特別選定的新型糖基化模式的蛋白質(zhì)顯示出改進(jìn)的或改變的生物特性。本發(fā)明還提供通過對包含人免疫球蛋白基因座的非人轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行免疫，從非人、非小鼠動物產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的方法。這種動物可用本領(lǐng)域公知的方法來產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非人動物可以是大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R。能產(chǎn)生抗體的無限增殖化雜交瘤可從被免疫動物制備得到。免疫后，將動物處死，將脾B細(xì)胞與無限增殖化骨髓瘤細(xì)胞融合，這是本領(lǐng)域公知的。參見例如Harlow和Lane，出處同上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，骨髓瘤細(xì)胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細(xì)胞系)。在融合和進(jìn)行抗生素選擇后，用抗原(例如球聚體)或其部分或者表達(dá)目的抗原的細(xì)胞篩選雜交瘤。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)或放射免疫測定(RIA)、優(yōu)選ELISA進(jìn)行初始篩選。國際申請公開說明書WO00/37504(其通過引用結(jié)合到本文中)提供了ELISA篩選的一個(gè)實(shí)例。對能產(chǎn)生抗體的雜交瘤進(jìn)行選擇、克隆并就合宜特性進(jìn)行進(jìn)一步篩選，所述合宜特性包括充沛的雜交瘤生長(robusthybridomagrowth)、高抗體生產(chǎn)和適需的抗體特性，這在下文進(jìn)一步論述。雜交瘤可在同種同基因(syngeneic)型動物中、在缺乏免疫系統(tǒng)的動物例如棵鼠中體內(nèi)培養(yǎng)和擴(kuò)展，或者在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)和擴(kuò)展。選擇、克隆和擴(kuò)展雜交瘤的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。優(yōu)選地，被免疫動物是能表達(dá)人免疫球蛋白基因的非人動物，脾B細(xì)胞與衍自該非人動物的相同物種的骨髓瘤融合。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供能產(chǎn)生旨在用于阿爾茲海默病的治療、診斷和預(yù)防的單克隆抗體的雜交瘤。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交瘤是小鼠雜交瘤。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交瘤在非人、非小鼠物種如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬中產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交瘤是人雜交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤與表達(dá)抗球聚體的抗體的人細(xì)胞發(fā)生融合。如在美國專利5,627,052、國際申請公開說明書WO92/02551和Babcock,J.S.etal.(1996)尸rac.Wa".(7&421:7843-7848中所述，可用本領(lǐng)i或稱為選定'淋巴細(xì)月包抗體方法(selectedlymphocyteantibodymethod(SLAM)的程序從單個(gè)分離的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生重組抗體。在這個(gè)方法中，用抗原特異性溶血斑塊測定法篩選能分泌目的抗體的單細(xì)胞(例如衍自被免疫動物的淋巴細(xì)胞)，在該測定中抗原(例如球聚體)或其片段是用接頭如生物素與綿羊紅細(xì)胞偶聯(lián)，并用來鑒定能分泌對該抗原有特異性的抗體的單細(xì)胞。鑒定出能分泌抗體的目的細(xì)胞后，通過反轉(zhuǎn)錄酶-PCR從細(xì)胞拯救出重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA,然后可將這些可變區(qū)在哺乳動物宿主細(xì)胞如COS或CHO細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍缀愣▍^(qū)(例如人恒定區(qū))情況下進(jìn)行表達(dá)。用衍自體內(nèi)選定淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增免疫球蛋白序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，然后就可進(jìn)行進(jìn)一步的體外分析和選擇，例如通過對被轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行淘選以分離出能表達(dá)抗IL-18抗體的細(xì)胞。擴(kuò)增的免疫球蛋白序列還可例如通過體外親和力成熟方法進(jìn)行體外操作，所述方法例如國際申請公開說明書WO97/29131和國際申請公開說明書WO00/56772中所述的那些方法。術(shù)語"嵌合抗體"指包含來自一種物種的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列和來自另一種物種的恒定區(qū)序列的抗體，如其中鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)與人恒定區(qū)連接在一起的抗體。術(shù)語"CDR移植抗體"指包含來自一種物種的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列、但其中VH和/或VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的序列用另一種物種的CDR序列取代的抗體，如具有鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)、其中一個(gè)或多個(gè)鼠CDR(例如CDR3)已用人CDR序列取代的抗體。術(shù)語"人源化抗體"指包含來自非人物種(例如小鼠)的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列、但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改變成更加"人樣"即更類似于人種系可變序列的抗體。一種類型的人源化抗人CDR序列的CDR移植抗體。具體的說，術(shù)語"人源化抗體"是這樣的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段它們能免疫特異性地結(jié)合目的抗原，包含有基本上具有人抗體的氨基酸序列的構(gòu)架(FR)區(qū)和基本上具有非人抗體的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。本文在CDR情形中所用的術(shù)語"基本(本質(zhì))上"指其氨基酸序列與非人抗體CDR的氨基酸序列至少80%、優(yōu)選至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR。人源化抗體包含基本上所有的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白(即供體抗體)的CDR區(qū)，所有或基本上所有的構(gòu)架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的構(gòu)架區(qū)。優(yōu)選地，人源化抗體還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)、通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體既含輕鏈也含至少可變結(jié)構(gòu)域的重鏈。該抗體還可包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體只含人源化輕鏈。在其它實(shí)施方案中，人源化抗體只含人源化重鏈。在特定的實(shí)施方案中，人源化抗體只含人源化可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈和/或人源化重鏈。人源化抗體可選自免疫球蛋白的任何類別和任何同種型，前者包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，后者包括但不限于IgGl、IgG2、IgG3和lgG4。人源化抗體可包含來自超過一種類別或同種型的序列，且可用本領(lǐng)域公知的技術(shù)選擇特定的恒定結(jié)構(gòu)域以使所需的效應(yīng)子功能最優(yōu)化。人源化抗體的構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)不需要精確對應(yīng)于親本序列，例如供體抗體CDR或共有構(gòu)架可通過置換、插入和/或缺失至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行誘變，使得在該位點(diǎn)處的CDR或構(gòu)架殘基不對應(yīng)于供體抗體或共有構(gòu)架。但是在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種突變不會大量發(fā)生。通常，至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%的人源化抗體殘基會對應(yīng)于親本FR序列和CDR序列的殘基。本文所用的術(shù)語"共有構(gòu)架，，指共有免疫球蛋白序列中的構(gòu)架區(qū)。此外，本文所用的術(shù)語"共有免疫球蛋白序列"指由相關(guān)免疫球蛋白序列家族中的最常出現(xiàn)氨基酸(或核香酸)形成的序列(參見例如Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每個(gè)位置都被在該家族中該位置處最常出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。如果兩個(gè)氨基酸出現(xiàn)頻率相等，則任一個(gè)都可包括在共有序列中。術(shù)語"活性"包括諸如抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和力的活性。術(shù)語"表位"包括任何能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面纟且(chemicallyactivesurfacegrouping),長口氨基酸、津唐4貝寸鏈、石粦酰基或磺?；?，而在某些實(shí)施方案中則可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性和/或特定的電荷特性。表位是被抗體結(jié)合的抗原的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，抗體如果能在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)先識別其靶標(biāo)抗原，則稱之能特異性結(jié)合抗原。本文所用的術(shù)語"表面等離子共振"指可以實(shí)時(shí)生物特異性相互作用進(jìn)行分析的一種光學(xué)現(xiàn)象，該分析是通過例如用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,NJ)才企觀寸生物傳感器矩陣中的蛋白質(zhì)濃度變化來進(jìn)行。更多的描述參見J加sson,U.，etal.(1993)爿朋.歷o/.CV,w.^i:19-26;Jdnsson,U.,etal.(1991)wes11:620-627;Johnsson,B.，etal.(1995)</.M/.Aecog".&125-131;和Johnnson,B.,etal.(1991)/4"a/.說oc/^w.198:268-277。本文所用的術(shù)語"K。n"意指抗體與抗原締合形成抗體/抗原復(fù)合物的"締合速率(onrate)"常數(shù)，這是本領(lǐng)域7>知的。本文所用的術(shù)語"K。ff"意指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的"解離速率(offrate)"常數(shù)，這是本領(lǐng)域公知的。本文所用的術(shù)語"Kd"意指特定的抗體-抗原相互作用的"解離常數(shù)"，這是本領(lǐng)域公知的。本文所用的術(shù)語"標(biāo)記結(jié)合蛋白"指摻入了標(biāo)記的蛋白質(zhì)，該標(biāo)記使該結(jié)合蛋白可以被鑒定。優(yōu)選地，該標(biāo)記是可檢測標(biāo)志，例如放射標(biāo)記氨基酸的摻入或與可被標(biāo)記親和素檢測的生物素?；糠值亩嚯牡倪B接(例如含有能通過光學(xué)或比色方法檢測的熒光標(biāo)志或酶促活性的鏈霉親和素)。多肽用標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、35S、9。Y、"Tc、mIn、125I、131I、177Lu、I66Ho或53Sm);熒光標(biāo)記(例如FITC、羅丹明或鑭系磷(lanthanidephosphors);酶標(biāo)記(例如辣根過氧化物酶、螢光素酶或^咸性磷酸酶)；化學(xué)發(fā)光標(biāo)志；生物素?；鶊F(tuán)；被第二報(bào)道分子識別的預(yù)定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域或表位標(biāo)簽)；和磁性物質(zhì)如釓螯合物。術(shù)語"抗體綴合物"指與第二化學(xué)部分如治療性或細(xì)胞毒性劑發(fā)生化學(xué)連接的結(jié)合蛋白如抗體。這里使用的術(shù)語"(物)劑"表示化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物大分子或者從生物材料制備的提取物。優(yōu)選地，治療性或細(xì)胞毒性劑包括但不限于百日咳毒素、紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)類固醇、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及這些物劑的類似物和同系物。本文所用的術(shù)語"晶體"和"結(jié)晶的"指以晶體形式存在的抗體或其抗原結(jié)合部分。晶體是物質(zhì)固態(tài)的一種形式。術(shù)語"免疫"在本文中指將抗原呈遞到免疫系統(tǒng)(immunerepertoire)的過程，無論該免疫系統(tǒng)是在天然的遺傳上未改變的生物中存在，還是在被修飾成能顯示人工的人免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物中存在。類似地，"免疫原性制品"是含有會增強(qiáng)抗原的免疫原性的佐劑或其它添加劑的抗原制劑。這方面的一個(gè)實(shí)例是純化形式的GLP-1受體與弗氏完全佐劑共注射于小鼠。本文所用的"超免疫(法)"是將免疫原性制劑中的抗原連續(xù)、多次呈遞給宿主動物以旨在發(fā)展出強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的做法。測量抗體的結(jié)合動力學(xué)的一種方式是憑借表面等離子共振。本文所用的術(shù)語"表面等離子共振，，指一種以實(shí)時(shí)生物特異性相互作用進(jìn)行分析的光學(xué)現(xiàn)象，該分析是通過例如用Biacore系統(tǒng)(BiacoreInternational,Upsala,SwedenandPiscataway,NJ)檢測生物傳感器矩陣中的蛋白質(zhì)濃度變化來進(jìn)行。更多的描述參見J加ssonetal.(1993)AnnalesdeBiologieClinique(Paris)51:19-26;J6nssonetal.(1991)Bioteehniques11:620-627;Johnssonetal.(1995)JournalofMolecularRecognition8:125-131;和Johnnsonetal.(1991)AnalyticalBiochemistry198:268-277。"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一個(gè)或多個(gè)以及它們的組合。在許多情況下，優(yōu)選的是將等滲劑例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉包括在組合物中。藥學(xué)上可接受的載體還可包含少量的能提高抗體或抗體部分的貨架期或有效性的輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。本發(fā)明的藥物組合物可包括"治療有效量的"或"預(yù)防有效量的"本發(fā)明抗體或抗體部分。"治療有效量"指在必要的劑量下和時(shí)間里能有效實(shí)現(xiàn)所需的治療結(jié)果的量?？贵w或抗體部分的治療有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行確定，它可根據(jù)以下各種因素而異個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，抗體或抗體部分在個(gè)體中引起所需的應(yīng)答的能力。治療有效量還是這樣的量在該量下抗體或抗體部分的治療有效作用超出任何毒性或有害作用。"預(yù)防有效量"指在必要的劑量下和時(shí)間里能有效實(shí)現(xiàn)所需的預(yù)防結(jié)果的量。通常，由于預(yù)防劑量是在疾病早期階段之前或在疾病早期階段用于受試者，因此預(yù)防有效量會低于治療有效量?？蓪⒈景l(fā)明的抗體和抗體部分摻入到適合于例如腸胃外給藥的藥物組合物中。優(yōu)選地，可將抗體或抗體部分制備成含有0.1-250mg/ml抗體的可注射溶液?？勺⑸淙芤嚎梢允窃跓o色玻璃(flint)或琥珀色玻璃(amber)小瓶、安瓿或預(yù)充注射器中的液體劑型或凍千劑型。緩沖劑可以是L-組氨酸(l-50mM)，最好5-10mM，pH5.0-7.0(最好pH6.0)。其它合適的緩沖劑包括但不限于琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀?？墒褂脻舛?-300mM(對于液體劑型最好150mM)的氯化鈉來緩和溶液的毒性。對于凍干劑型，可包括抗凍劑，主要是0-10%蔗糖(最好0.5-1.0%)。其它合適的抗凍劑包括海藻糖和乳糖。對于凍干劑型，可包括增量劑(bulkingagent)，主要是1-10%甘露糖醇(最好2-4%)。在液體劑型和凍干劑型中都可使用穩(wěn)定劑，主要是1-50mML-曱硫氨酸(最好5-10mM)。其它合適的增量劑包括甘氨酸、精氨酸，可作為0-0.05%聚山梨醇酯-80(最好0.005-0.01%)力。入。另外的表面活性劑包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性劑。本發(fā)明的組合物可以為多種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液劑(例如可注射和可輸注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)定的給藥方式和治療應(yīng)用。典型的優(yōu)選組合物為可注射或可輸注溶液劑形式，如與用于和其它抗體一起對人進(jìn)行被動免疫的那些組合物相似的組合物。優(yōu)選的給藥方式是胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))給藥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體通過靜脈內(nèi)輸注或注射給予。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體通過肌肉內(nèi)或皮下注射給予。通常，治療用組合物在制造和儲藏條件下必須是無菌的和穩(wěn)定的。組合物可配制成溶液劑、微乳、分散劑、脂質(zhì)體或者其它與高藥物濃度相配的有序結(jié)構(gòu)。無菌可注射溶液劑可這樣制備將活性化合物(即抗體或抗體部分)以所需的量摻入到適當(dāng)?shù)娜軇┲校瑫r(shí)按需一起摻入以上列舉的一種成分或其組合，然后進(jìn)行過濾除菌。分散劑通常是這樣制備將活性化合物摻入到含有基本的分散介質(zhì)和所需的選自以上列舉成分的其它成分的無菌介質(zhì)中。在用于制備無菌可注射溶液劑的無菌凍干散劑的情況中，優(yōu)選的制備方法是進(jìn)行真空干燥和噴霧干燥，從之前進(jìn)行過無菌過濾的活性成分加上任何另外所需成分的溶液產(chǎn)生出這些成分的粉末。溶液的適當(dāng)流動性可例如這樣來保持使用包衣料如卵磷脂，在分散劑的情況中維持所需的顆粒大小，和使用表面活性劑。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包括能延遲吸收的物劑如單硬脂酸鹽和明膠來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的抗體和抗體部分可通過多種本領(lǐng)域公知的方法給予，不過對于許多治療應(yīng)用，優(yōu)選的給藥途徑/方式是皮下注射、靜脈內(nèi)注射或輸注。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，給藥途徑/方式要依所需的結(jié)果而變。在某些實(shí)施方案中，可將活性化合物與能保護(hù)該化合物免受快速釋放的載體一起進(jìn)行制備，所述載體如為控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。有許多制備這種制劑的方法已申請了專利或者為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公^口。參見例3口SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems:丄R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可進(jìn)行口服給藥，例如與惰性稀釋劑或可吸收可食用載體一起給予?；衔?如果需要，還有其它成分)還可包封在硬殼或軟殼明膠膠嚢中，壓制成片劑，或者直接摻入到受試者的膳食中。對于口服治療給藥，可將化合物與賦形劑一起摻合并以可攝取片劑、口含片劑、藥片劑(troche)、膠嚢劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙嚢劑(wafer)等的形式使用。為通過胃腸外給藥之外的方式給予本發(fā)明化合物，可能需要將該化合物用能防止其失活的材料包衣或者與該材料一起共給予。還可將輔助性活性化合物摻入到組合物中。在某些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種可用于治療阿爾茲海默病或相關(guān)疾病或病癥的另外治療藥劑一起共配制和/或共給予。例如，可將一種本發(fā)明抗體或其抗體部分與一種或多種能結(jié)合其它靶標(biāo)的另外抗體一起共配制和/或共給予。在某些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的單克隆抗體或其片段與本領(lǐng)域公知的半衰期延長介質(zhì)連接。這種介質(zhì)包括但不限于Fc結(jié)構(gòu)域、聚乙二醇和葡聚糖。這種介質(zhì)描述于例如美國申請系列號09/428,082和公布的PCT申請?zhí)朩O99/25044，出于任何目的這兩個(gè)專利通過引用結(jié)合到本文中。除了以上論述到的各程序外，從業(yè)人員也熟知這樣的標(biāo)準(zhǔn)資料這些資料描述用于大分子(例如DNA分子、質(zhì)粒等)的構(gòu)建、操作和分離，用于重組生物的產(chǎn)生和用于克隆的篩選和分離的特定條件和程序(參見侈'〗^口，Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1989);Maligaetal.,MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborPress(1995);Birrenetal.,GenomeAnalysis:DetectingGenes,1，ColdSpringHarbor,NewYork(1998》Birrenetal.,GenomeAnalysis:AnalyzingDNA,2,ColdSpringHarbor,NewYork(1998);PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,eds.Clark,Springer,NewYork(1997》。單克隆抗體的用途本發(fā)明的單克隆抗體(例如8F5和8CF)具有許多值得關(guān)注的用途。例如，單克隆抗體可如上所述用于阿爾茲海默病的預(yù)防、治療和診斷。此外，該抗體可用于抗抗體的開發(fā)。此外，產(chǎn)生相應(yīng)抗體的雜交瘤使得能夠穩(wěn)定提供相同單克隆抗體(即試劑)的連續(xù)來源，從而保證各種實(shí)驗(yàn)以及治療應(yīng)用中各抗體之間的同一性。還有，本發(fā)明的方法使得可以制備適量的用于制備其它原料的起始原料，而其它原料又可用來產(chǎn)生單克隆抗體(或其它抗體)供用于治療阿爾茲海默病。上文提到，所述抗體還可用來進(jìn)行被動免疫，以預(yù)防阿爾茲海默病或者以阿爾茲海默病的相同癥狀如認(rèn)知損傷為特征的其它相關(guān)神經(jīng)病癥。在本發(fā)明的一個(gè)診斷實(shí)施方案中，使本發(fā)明的抗體(例如8F5)或其部分包被在固體相上(或者存在于液體相中)。然后使試驗(yàn)樣品或者說生物樣品(例如全血、腦脊髓液、血清等)與固體相進(jìn)行接觸。如果樣品中存在抗原(例如球聚體)，這種抗原會結(jié)合固體相上的抗體，然后通過直接或間接方法檢測。直接方法涉及簡單地檢測到復(fù)合物本身的存在，從而檢測到抗原的存在。在間接方法中，將綴合物加到被結(jié)合抗原。綴合物包含與信號產(chǎn)生化合物或標(biāo)記相連接的、能與被結(jié)合抗原發(fā)生結(jié)合的第二抗體。要是該第二抗原與^f皮結(jié)合抗原發(fā)生結(jié)合，信號產(chǎn)生化合物就會產(chǎn)生可測量的信號。于是這種信號表明了抗原在試驗(yàn)樣品中的存在。用于診斷性免疫測定的固體相的實(shí)例有多孔材料和無孔材料、乳膠顆粒、磁性顆粒、微顆粒(參見例如美國專利5，705,330)、珠粒、膜、微量滴定孔和塑料管。固體相材料的選擇和對綴合物中存在的抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記的方法，如果需要的話根據(jù)所需的測定模式性能特性來確定。如上所述，綴合物(或指示試劑)會包含與信號產(chǎn)生化合物或標(biāo)記連接的抗體(或者也許是抗抗體，視測定法而定)。這一信號產(chǎn)生化合物或"標(biāo)記"本身是可檢測的，或者可與一種或多種另外的化合物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物。信號產(chǎn)生化合物的實(shí)例包括發(fā)色團(tuán)、放射性同位素(例如1251、1311、32P、3H、35S和14C)、化學(xué)發(fā)光化合物(例如吖咬f翁(acridinium))、顆粒(可見的或熒光的)、核酸、絡(luò)合劑或者催化劑如酶(例如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在使用酶的情況中(例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)，發(fā)色、發(fā)熒光或發(fā)光的基因底物的加入會導(dǎo)致可檢測信號的產(chǎn)生。也可使用其它檢測系統(tǒng)如時(shí)間分辨熒光、內(nèi)反射熒光、擴(kuò)增(例如聚合酶鏈反應(yīng))和拉曼光譜?？捎蒙鲜雒庖邷y定法測試的生物流體的實(shí)例包括血漿、全血、干全血、血清、腦脊髓液或者組織和細(xì)胞的水提取物或有機(jī)金屬的水提耳又物。本發(fā)明還涵括檢測抗體在試驗(yàn)樣品中的存在的方法。這個(gè)方法包括以下步驟(a)使懷疑含有抗體的試驗(yàn)樣品與對患者樣品中的該抗體有特異性的抗抗體接觸，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗抗體/抗體復(fù)合物得以形成，其中該抗抗體是能結(jié)合患者樣品中的抗體的本發(fā)明抗體；(b)向所得的抗抗體/抗體復(fù)合物加入綴合物，該綴合物包含與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物連接的抗原(其能結(jié)合該抗抗體)；和(d)通過檢測信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的信號，檢測在試驗(yàn)樣品中可能存在的抗體的存在?？墒褂冒乖摽箍贵w的抗體的對照品或校準(zhǔn)品。本發(fā)明還包括包含有一種或多種本文所述抗體或其部分及藥學(xué)上可接受的佐劑(例如弗氏佐劑或磷酸緩沖鹽水)的疫苗。試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。更具體的說，本發(fā)明包括用以測定懷疑患有阿爾茲海默病或者別的以認(rèn)識損害為特征的病癥的患者中抗原(例如球聚體)的存在的試劑盒。具體的說，用以測定抗原在試驗(yàn)樣品中的存在的試劑盒包含a)本文所定義的抗體或其片段；和b)包含與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物連接的第二抗體(對該抗原具有特異性)的綴合物。該試劑盒還可含有對照品或校準(zhǔn)品以及說明書，該對照品或校準(zhǔn)品包含能結(jié)合該抗原的試劑，該說明書詳述如何使用試劑盒和試劑盒各組分。本發(fā)明還包括用以檢測試驗(yàn)樣品中的抗體的試劑盒。該試劑盒可包含a)對目的抗體有特異性的抗抗體(例如本發(fā)明抗抗體之一)和b)前文所定義的抗原或其部分。也可包括包含有能結(jié)合該抗原的試劑的對照品或校準(zhǔn)品。更具體的說，該試劑盒可包含a)對該抗體有特異性的抗抗體(如本發(fā)明抗抗體之一)和b)包含有與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物連接的抗原(例如球聚體)的綴合物。此外，該試劑盒還可包含對照品或校準(zhǔn)品以及說明書或包裝插頁，該對照品或校準(zhǔn)品包含能結(jié)合該抗原的試劑，該說明書或包裝插頁描述應(yīng)如何使用試劑盒和試劑盒各組分。該試劑盒還可包含一個(gè)容器如小瓶、瓶子(bottle)或條，所述每種容器具有預(yù)定(pre-set)固體相，以及含有相應(yīng)綴合物的其它容器。這些試劑盒還可含有裝著為進(jìn)行測定所需的其它試劑(如洗滌、加工和指示試劑)的小瓶或容器。還應(yīng)指出的是，本發(fā)明不僅包括上述全長抗體，還包括其部分或片段，例如其Fab部分。另外，本發(fā)明涵括任何具有與本發(fā)明抗體相同的特性的抗體，所述相同的特性是例如結(jié)合特異性、結(jié)構(gòu)等方面的特性。保藏信息能產(chǎn)生單克隆抗體8F5的雜交瘤(ML5-8F5.1F2.2A2)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2005年12月1日寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110),分配的保藏號為ATCCNo.PTA-7238。能產(chǎn)生單克隆抗體8C5的雜交瘤(ML5-8C5.2C1.8E6.2D5)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2006年2月28日寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110),分配的保藏號為ATCCNo.PTA-7407。本發(fā)明可用以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行說明實(shí)施例Ua)單克隆抗體8F5和8C5的產(chǎn)生將Balb/c小鼠用如Barghoraetal.，2005,JNeurochem,95,834-847中所述的50微克A卩(l-42)球聚體(于CFA(Sigma)中)進(jìn)行sub-q免疫，并以一個(gè)月的時(shí)間間隔加強(qiáng)免疫兩次。收集脾臟，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞以5:1比例通過PEG程序進(jìn)行融合。將融合細(xì)胞以2xl()S個(gè)細(xì)胞/ml、200ml/孔接種在96孔平皿中的重氮絲氨酸/次黃噤呤選擇培養(yǎng)基中。讓細(xì)胞生長形成可見集落，通過直接ELISA測定法測定上清液的AP寡聚體反應(yīng)性。通過限制性稀釋對分泌抗AP寡聚體抗體的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，直到抗體表達(dá)呈現(xiàn)穩(wěn)定。實(shí)施例II8F5和8C5結(jié)合ABn-40〗和A(3(l-42)的球聚體優(yōu)先于結(jié)合它們的單體制品為測試8F5的選擇性，使用兩種進(jìn)行了不同的溶解的A(3(l-42)單體制品，并使用剛制備的AJ3(l-40)作為單體的替代物。進(jìn)行了兩個(gè)類型的實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過夾心ELISA法，以球聚體衍化但是構(gòu)象異構(gòu)的(globulomerderivedbutconformer)非特異性的MAb6G1(參見S.Barghornetal.J.Neurochemistry,95:834(2005))作為捕捉抗體，測試8F5對AP球聚體的特異性。用生物素?；?F5作為第二和構(gòu)象異構(gòu)(conformer)選擇性抗體。這個(gè)實(shí)驗(yàn)在以下實(shí)施例2.1中描述。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)(在以下實(shí)施例2.2中描述)中，通過斑點(diǎn)印跡免疫測定法分析寡聚體對A卩(l-42)單體和對A卩(l-40)單體的選擇性。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，8F5顯示出對A卩(l-42)球聚體(對比已知抗體4G8，其映射到的區(qū)域與8F5類似，但由用線型肽A|3(17-24)(AbeamLtd.,Cambridge,MA)進(jìn)行免疫衍生)的結(jié)合優(yōu)先于對A(3(l-42)單體的結(jié)合和對A卩(l-40)單體的結(jié)合。8C5的試驗(yàn)方案同8F5。實(shí)施例2.1:單克隆抗體8F5和8C5的寡聚體選擇性a)A(3(l-42)球聚體的制備將9mgA(3(l國42)Fa.Bachem溶于1.5mlHFIP(1丄1.3.3'3六氟-2國丙醇)中，在37。C下溫育1,5h。將所得溶液在SpeedVac中蒸發(fā)，懸浮于396plDMSO(5mMA|3儲備溶液)中。將樣品在超聲波水浴中超聲處理20秒鐘，振搖10分鐘，在-20。C下儲藏過夜。將樣品用4.5mlPBS(20mMNaH2P04;140mMNaCl;pH7,4)稀釋，加入0.5ml2%SDS水溶液(0.2%SDS含量)。將所得混合物在37。C下溫育7小時(shí)，用16mlH20稀釋，在37°C下再溫育16小時(shí)。然后，將A(3(l-42)球聚體溶液以3000g離心20分鐘。上清液用30KDacentriprep濃縮到0.5ml。將濃縮液在6°C下對5mMNaH2P04;35mMNaCl;pH7.4透析過夜。隨后，將Ap(l-42)球聚體濃縮液以10000g離心10分鐘。然后將上清液分成等分試樣，在-20。C下儲藏。b)HFIP預(yù)處理的單體A卩(l-42)的制備將3mg人A|3(l-42)(BachemInc，目錄號H-1368)溶于1.7mlEppendorff管中的0.5mlHFIP(6mg/ml懸浮液)中，在37°C下振搖1.5h(EppendorffThermo混合器，1400rpm)，直到獲得透明溶液。將樣品在speedvac濃縮器中干燥(1.5h),重懸于13.2^ilDMSO中，振搖10秒鐘，然后進(jìn)行超聲浴超聲處理(20秒鐘)，振搖(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)10分鐘。加入6ml20mMNaH2P04;140mMNaCl;0.1%嵌段式聚醚(Pluronic)F68;pH7.4,在室溫下攪拌1小時(shí)。將樣品在3000g下離心20分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于0.6ml20mMNaH2PO4;140mMNaCl;1。/。嵌段式聚醚F68;pH7.4中。加入3.4ml水，在室溫下攪拌l小時(shí)，然后以3000g離心20分鐘。將上清液以8x0.5ml等分試樣在-20。C下儲藏。c)單體A(3(l-42)的NH4OH溶液的制備將lmgAP(l-42)固體粉末(BachemInc.,目錄號H-1368)溶于0.5ml0.1%NH4OH水溶液(剛制備)(2mg/ml)中，立即在室溫下振搖30秒鐘以獲得透明溶液。將樣品在-20。C下儲藏備用。d)單體Ap(l-40)的制備將lmg人A卩(l國40)(BachemInc,目錄號H-1194)懸浮于Eppendorff管中的0.25mlHFIP(4mg/ml懸浮液)中。將該管在37。C下振搖1.5小時(shí)(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)以獲得透明溶液，然后在speedvac濃縮器中干燥(l.5小時(shí))。將樣品重新溶于46^ilDMSO(21.7mg/ml溶液)中，振搖10秒鐘，然后在超聲浴中超聲處理20秒鐘。振搖(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)10分鐘后，將樣品在-20°C下儲藏備用。e)抗A|3小鼠單克隆抗體8F5的生物素?；瘜?00W抗Af3小鼠單克隆抗體8F5于PBS中的溶液(0.64mg/ml)加到剛?cè)苡谒?^120mg/mlSulfo-NHS-生物素(PierceInc.,目錄號21420),振搖(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)30分鐘，在透析管中6°C下對500ml20mMNaPi;140mMNaCl;pH7.4透析16小時(shí)。將透析液在-20DC下儲藏備用。8C5據(jù)此進(jìn)行生物素?；?。f)A卩樣品的夾心ELISA:g)試劑目錄1.F96Cert.MaxisorpNUNC-ImmunoPlate,目錄號4394542.結(jié)合抗體抗A卩小鼠單克隆抗體6G1，溶于PBS中；濃度0.4mg/ml;在-20。C下儲藏3.包被緩沖液100mM碳酸氫鈉；pH9.64.ELISA封閉劑；RocheDiagnosticsGmbH，目錄號11125895.PBST緩沖液20mMNaH2P04;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.46.牛清蛋白部分V(albuminbovinefractionV),無蛋白酶；Serva，目錄號11926.03;4°C下儲藏7.PBST+0.5%BSA緩沖液20mMNaH2PO4;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.4+0.5%BSA8.Ap(l-42)球聚體標(biāo)準(zhǔn)儲備液5mMNaH2P04;35mMNaCl的溶液；pH7.4;濃度10.77mg/ml;-20。C下儲藏9.A卩(l-42)單體HFIP處理標(biāo)準(zhǔn)儲備液3mMNaH2P04;21mMNaCl;0.15%嵌段式聚醚F68的溶液;pH7.4;濃度0.45mg/ml;-20。C下儲藏10.A(3(l-42)單體于NH4OH中的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；于0.1%NH4OH中的溶液；濃度2mg/ml;-20°(^下儲藏11.A卩(1-40)單體HFIP處理標(biāo)準(zhǔn)儲備液于DMSO中的溶液；濃度21.7mg/ml;-20。C下儲藏12.生物素?；目笰卩小鼠單克隆抗體克隆8F5;于PBS中的溶液；濃度0.24mg/ml;-80。C下儲藏13.鏈霉親和素-POD綴合物；Fa.Roche，目錄號108915314.染色TMB;RocheDiagnosticsGmbH,目錄號92817060;42mMDMSO溶液；3%H202水溶液；lOOmM乙酸鈉pH4.915.通過加入2M石黃酸溶液停止染色試劑的制備采用以下方案1.結(jié)合抗體將單克隆6G1儲備溶液解凍，在包被緩沖液中1:400稀釋。2.封閉劑將封閉劑溶于100ml水中制備封閉儲備溶液，以10ml的等分試樣在-20°C下儲藏。對于每個(gè)要封閉的板，將3ml封閉儲備溶液用27ml水稀釋。3.A卩標(biāo)準(zhǔn)溶液a)A卩(l-42)球聚體-將ljiilA卩(l-42)球聚體標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到1076plPBST+0.5%BSA=10|tig/ml-將10pg/mlA卩(l-42)球聚體標(biāo)準(zhǔn)溶液加到4950^1PBST+0.5%BSA=100ng/mlb)A卩(l-42)單體，HFIP處理-將10^1AP(1-42)單體HFIP預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到440^1PBST+0.5%BSA=10|iig/ml國將lOjug/mlA卩(l-42)單體HFIP預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)溶液加到4950^1PBST+0.5%BSA=100ng/mlc)A卩(l-42)單體于NH4OH中的溶液-將5plAp(l-42)單體于NH4OH中的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到995]ulPBST+0.5%BSA=10|Lig/ml-將50^110|ng/mlA卩(l-42)單體于NH4OH中的標(biāo)準(zhǔn)溶液加到4950plPBST+0.5%BSA=lOOng/mld)A卩(l-40)單體，HFIP預(yù)處理誦將l^ilAj3(l-40)單體HFIP預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到49plPBST+0.5%BSA=430ng/ml-將lO^il430嗎/mlA卩(l-40)單體HFIP預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到420^1PBST+0.5%BSA=10嗎/ml-將50^110pg/mlAB(l-40)單體HFIP預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)溶液加到4950^1PBST+0.5%BSA=lOOng/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線編號最終濃度儲備溶液PBST+0,5%BSA100ng/ml23lOng/ml43,16ng/ml5lng/ml60.32ng/ml80,Ong/ml2mlS0.633ml(1)0.S33ml(2)0.633ml(3)0.633ml(4)0,S33ml(5)0.633ml(6)Oml0ml1,367ml1,367ml1.367ml1.367nal,367rol1,367ml2ml1.第一抗體生物素?；膯慰寺】贵w8F5:將濃縮的生物素?；笰卩單克隆抗體8F5在PBST+0.5%BSA緩沖液中稀釋。稀釋系數(shù)為1/1200=0.2pg/ml。將抗體立即使用。2.才示i己i式劑使鏈霉親和素-POD綴合物凍千品在0.5ml水中復(fù)原。加入50(Hil甘油，以lOOpl的等分試樣在-20。C下儲藏備用。將濃縮的標(biāo)記試劑在PBST緩沖液中稀釋。稀釋系數(shù)為1/10000。立即使用。3.染色溶液TMB:將20mllOOmM乙酸鈉pH4.9與200WTMB溶液和3%過氧化物溶液進(jìn)行混合。立即使用。樣品板設(shè)置(注意所有的標(biāo)準(zhǔn)品均重復(fù)進(jìn)行兩次)<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>所采用的程序1.每孔加入100^1抗AP小鼠單克隆抗體6G1溶液，在4°C下溫育過夜。2.棄去抗體溶液，用25(^1PBST緩沖液洗滌各孔三次。3.每孔加入260)iil封閉溶液，在室溫下溫育2小時(shí)。4.棄去封閉溶液，用250^1PBST緩沖液洗滌各孔三次。5.標(biāo)準(zhǔn)品制備后，將標(biāo)準(zhǔn)品以100^1/孔加到板中。在室溫下溫育2小時(shí)，并在4。C下溫育過夜。6.棄去標(biāo)準(zhǔn)溶液，用250inlPBST緩沖液洗滌各孔三次。7.每孔加入200^1生物素?；牡谝豢贵w8F5溶液，在室溫下溫育1.5小時(shí)。8.棄去抗體溶液，用250^1PBST緩沖液洗滌各孔三次。9.每孔加入200pl標(biāo)記溶液，在室溫下溫育1小時(shí)。10.棄去標(biāo)記溶液，用250nlPBST緩沖液洗滌各孔三次。11.向每孔加入10(HilTMB溶液，在室溫下溫育(5-15分鐘)。12.觀察染色情況，在背景染色開始后每孔加入5(Hil終止溶液。13.在450nm下進(jìn)行UV讀數(shù)。14.從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。15.進(jìn)行評估抗體8F5的結(jié)果在圖1中顯示，抗體8C5的結(jié)果在圖8中顯示。在LogEC50值方面，相比于兩種不同制備的A(3(l-42)單體(分別為2.745和3.003)和A(3(l-40)單體(2.825)的較低值，A卩(l-42)球聚體抗原(1.958)明顯最低。這些數(shù)據(jù)表明，抗體8F5對Ap(l-42)球聚體的選擇性為對AP(l-42)單體的選擇性的約10倍。在抗體8C5上也獲得幾乎相同的結(jié)果，在圖8中顯示。實(shí)施例2.2:單克隆抗體8F5和8C5的寡聚體選擇性國通過斑點(diǎn)印跡方法區(qū)別A(3單體和A卩球聚體8F5和8C5與4G8的比專交。用PBS對A(3(l-42)球聚體、A|31-42單體和A(31-40單體進(jìn)行稀釋，濃度范圍為100pmol4il-0.01pmol/W。將每個(gè)樣品取1^1點(diǎn)滴到硝酸纖維素膜上。將小鼠單克隆抗體4G8和8F5(0.2嗎/ml)以及與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG作為第二抗體和染色試劑NBT/BCIP(RocheDiagnostics,Mannheim)—起用于#r測。通過顯密度計(jì)(GS800,Biorad,Hercules,CA,USA)在lOpmol的抗原濃度下對檢測信號分析其強(qiáng)度(反射密度=RD)。在此濃度下，對于每種A卩形式，所測得的反射密度都在顯像密度計(jì)檢測的線性范圍內(nèi)。另一種抗體8C5也以類似的方案進(jìn)行使用。結(jié)果在下表l中顯示<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表l:Api-40單體和A(31-42單體的抗AP抗體的區(qū)別。該區(qū)別計(jì)算為Api-42球聚體和A|3l-42單體分別與A(3l-40單體的檢測信號比。具體的說，以上結(jié)果表明，8F5和8C5與市售可得的映射到A|3(17-24)(即線型序列)的抗Ap(l-42)抗體4G8相比顯示出不同的結(jié)合譜(bindingprofile)。更具體的說，8F5和8C5顯示出對球聚體的結(jié)合優(yōu)先于對AP42單體的結(jié)合(參見第4列；比較1.4與l)和對球聚體的結(jié)合優(yōu)先于對A(340的結(jié)合(第5列；比較16.9與4.2)。這兩個(gè)相對于標(biāo)準(zhǔn)4G8的改進(jìn)的結(jié)合選擇性，如上所述應(yīng)導(dǎo)致在使用8F5和/或8C5時(shí)副作用的產(chǎn)生更少(例如蝕斑結(jié)合)。實(shí)施例III8F5和8C5與ABO-42)原纖維的結(jié)合由于8F5抗體是針對可溶性球聚體而產(chǎn)生的，猜測認(rèn)為8F5應(yīng)該不會結(jié)合沉積的斑塊或原纖維材料。因此，如以下實(shí)施例所述對8F5與聚合的A(3原纖維懸浮液的結(jié)合進(jìn)行測試。A(3(l-42)原纖維的制備將lmgA卩(l-42)(BachemInc.,目錄號H隱1368)溶于500^10.1%NH4OH(Eppendorff管)水溶液中，將樣品在室溫下攪拌1分鐘，然后以10000g離心5分鐘。將上清液吸取到新的Eppendorff管中，按照Bradford蛋白質(zhì)濃度測定法(BIO-RADInc.測定程序)測量A卩(l-42)濃度。將100^1的這一剛制備的AP(l-42)溶液用300^120mMNaH2PO4;140mMNaCl;pH7.4中和，然后用2%HC1調(diào)pH7.4。將樣品在37°C下再溫育20小時(shí)，離心(10min,10000g)。棄去上清液，將原纖維沉淀用400^120mMNaH2P04;140mMNaCl;pH7.4在Vortex混合器上攪拌l分鐘進(jìn)行重懸，然后進(jìn)行離心(10min，lOOOOg)。棄去上清液后，重復(fù)此重懸程序，對最終原纖維懸浮液再進(jìn)行離心沉淀(10min,lOOOOg)。再次棄去上清液，將最終沉淀在Vortex混合器上攪拌1分鐘重懸于380^120mMNaH2PO4;140mMNaCl;pH7.4中。將所得樣品的等分試樣在冷藏器中-20。C下儲藏。將80^1原纖維懸浮液與320pl20mMNaH2P04;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.4緩沖液進(jìn)行混合，在室溫下攪拌5分鐘，然后進(jìn)行超聲處理(20秒鐘)。離心(10min,10000g)后，將沉淀在Vortex混合器中攪拌重懸于190|il20mMNaH2P04;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.4中。-抗體與A(3(l-42)原纖維的結(jié)合將此原纖維懸浮液的10^1等分試樣與以下物質(zhì)一起進(jìn)行溫育a)1(Hil20mMNaPi;140mMNaCl;pH7.4b)lOplO.l牆l單克隆抗體6E10SignetInc.目錄號9320，20mMc)NaH2P04;140mMNaCl;pH7.4d)lOplO.lng/^il單克隆抗體4G8Signetlnc.目錄號9220，20mMNaPi;140mMNaCl;pH7.4中e)10|tilO.lixg/pl單克隆抗體8F5(8C5),于20mMNaPi;140mMNaCl;pH7.4中將樣品在37。C下溫育20小時(shí)。最后將樣品離心(10min，lOOOOg)。收集含有未結(jié)合抗體級分的上清液，與20^SDS-PAGE樣品緩沖液混合。將沉淀級分用50^120mMNaH2P04;140mMNaCl;pH7.4緩沖液在Vortex混合器中攪拌1分鐘進(jìn)行洗滌，然后離心(10min，lOOOOg)。將最終沉淀重懸于20pl20mMNaPi;140mMNaCl;0.025%Tween20;pH7.4緩沖液中，并溶于20[ilSDS-PAGE緩沖液中。-SDS-PAGE分析將上清液和重懸沉淀樣品在98°C下加熱5分鐘，在以下條件下加樣到4-20%Tris/GlycinGel上。SDS樣品緩沖液:0.3gSDS;0.77gDTT;4ml1MTris/HClpH6.8;8ml甘油；lml1%溴酚藍(lán)乙醇溶液；加水到50ml4-20%Tris/GlycinGel:InvitrogenInc.,No.:EC6025BOX中。電泳緩沖液7.5gTris;36g甘氨酸;2.5gSDS;加水到2.51。在20mA下進(jìn)行PAGE。凝膠進(jìn)行考馬斯藍(lán)R250染色。結(jié)果SDS-PAGE的考馬斯藍(lán)染色表明，抗體的重鏈和輕鏈主要存在于原纖維懸浮液的上清液中(泳道7，圖2)，原纖維懸浮液的剩余部分顯示極少的抗體物質(zhì)，同時(shí)還顯示4.5kDa的部分解聚AP。與8F5和8C5不同的是，相比于原纖維結(jié)合級分(泳道6，圖2)，其它抗AP抗體不在可溶性級分中出現(xiàn)(6E10，泳道3，圖2)，或者部分地出現(xiàn)(4G8，泳道5，圖2)。通過測量原纖維結(jié)合級分和上清液級分中的抗體重鏈的反射密度值，從SDS-PAGE分析對與原纖維類型的A(3的相對結(jié)合進(jìn)行評估，并按照下式進(jìn)行計(jì)算原纖維結(jié)合抗體級分=RD原纖韓分x100%/(RD糾維級分十RD上清液級分)獲得了以下數(shù)值:<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明結(jié)合的8F5和8C5與標(biāo)準(zhǔn)抗體6E10相比有顯著下降。實(shí)施例IV內(nèi)源A6Q-42)球聚體相對于ABn-40)的優(yōu)先結(jié)合基于AP的寡聚體概念，重要的是抗A|3寡聚體抗體也能顯示在體內(nèi)對Ap(l-42)寡聚體的優(yōu)先結(jié)合，特別是在輕度認(rèn)知損害和AD患者中優(yōu)先于A卩(l-40)的結(jié)合。將A卩(l-42)物質(zhì)相對于A卩(l-40)降低的這—想法，用于通過NSAID治療AD的治療方法中(Weggenetal.，Nature414,212-216(2001))。據(jù)認(rèn)為，與AJ3(1國40),那些NSAID降低A卩(l-42)，在阿爾茨海默病的治療中顯示最佳的功效。A|3(l-42)/AP(l-40)比對于選擇性療法以及對于診斷性目的都是重要的。用來自阿爾茲海默病患者和MCI患者的CSF樣品進(jìn)行分析。從圖3所示和以下描述的結(jié)果可以得出結(jié)論，8F5具有優(yōu)于諸如6E10的A卩抗體的重大優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)?F5檢測出A(3(l-42)的比例高于檢測出聚集度較低的AP(l-40)的比例。這個(gè)優(yōu)點(diǎn)使得可以更有選擇性地診斷和中和MCI和AD患者中的A卩(l-42)型寡聚體。A)用寡聚體選擇性抗A(3鼠單克隆抗體8F5進(jìn)行免疫沉淀后MCI和AD患者的CSF中的內(nèi)源AB(l-42)和AB(l-40)水平將抗AB單克隆抗體固定化于CNBr活化的Sephaiose4B:a)單克隆抗體6E10SignetInc.，目錄號9320b)單克隆抗體8F5^!導(dǎo)0.4gCNBr活化的Sepharose4B(AmershamPharmaciaBiotechAB,Uppsala,Sweden,Inc.,目錄號17-0430-01)加到10mllmMHCl水溶液中，在室溫下溫育30分鐘。將CNBr活化的Sepharose4B用10mllmMHCl洗滌三次，用10ml100mMNaHCO3;500mMNaCl;pH8.3洗滌兩次。對于每種固定化抗體，將lOOplCNBr活化的Sepharose4B基質(zhì)加到950^10.5mg/ml抗A|3鼠單克隆抗體溶液(于lOOmMNaHC03;500mMNaCl;pH8.3中)。在室溫下振搖2小時(shí)后，將樣品以lOOOOg離心5分鐘。然后，將500|illOOmM乙醇胺；lOOmMNaHC03;500mMNaCl;pH8.3緩沖液加到珠粒，將樣品在室溫下振搖1小時(shí)。將抗A卩鼠單克隆抗體-Sepharose樣品以lOOOOg離心5分鐘，用50(^120mMNaH2PO4;140mMNaCl;pH7.4洗滌5次。加入疊氮化鈉至0.02%終濃度使樣品穩(wěn)定化，然后在6°C下進(jìn)行儲藏。免疫沉淀a)小鼠單克隆抗體(mMAb)6E10-Sepharoseb)小鼠單克隆抗體(mMAb)8F5-Sepharose將200^1的人腦脊液樣品用200^120mMNaH2P04NaH2P04;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.4進(jìn)行稀釋。將這些樣品加到2^1抗A卩小鼠單克隆抗體-Sepharose基質(zhì)，在室溫下攪拌2小時(shí)。將樣品以10000g離心5分鐘。棄去上清液，將抗A|3小鼠單克隆抗體-Sepharose用PBS洗滌兩次，攪拌1分鐘后離心(5分鐘，lOOOOg)。棄去上清液，接著將Sepharose珠粒懸浮于50W2mMNaH2P04NaH2P04;14mMNaCl，pH7.4中，然后在室溫下攪拌1分鐘，以10000g離心5分鐘。在下一個(gè)步驟中，將抗Ap小鼠單克隆抗體-Sepharose珠粒用50^150%CH3CN;0.2%TFA水溶液進(jìn)行處理。在室溫下振搖10分鐘后，將樣品以lOOOOg離心5分鐘。收集上清液并轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管。將樣品與50W水混合，在SpeedVac濃縮器中蒸發(fā)。將沉淀重新溶解于化l70%HCOOH,在室溫下振搖10分鐘，用76^11MTris-溶液和720jul20mMNaH2P04NaH2P04;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.4中和。用于測定CSF中的Ap(l-40)、n-42)單體形式的樣品a)沒有進(jìn)行免疫沉淀時(shí)CSF樣品中的A|3含量將158^1CSF用342pl20mMNaH2P04;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.4進(jìn)行稀釋。將此1:3.16稀釋液進(jìn)行夾心ELISA，在評估過程中加以考慮。b)進(jìn)行免疫沉淀后CSF樣品中的A|3含量將得自上述程序的樣品進(jìn)行分析。用于測定CSF中的ABn-40)的夾心ELISA方案試劑目錄1.F96Cert.MaxisorpNUNC-ImmunoPlate，目錄號4394542.結(jié)合抗體抗A卩單克隆抗體克隆6E10;Signet目錄號9320;濃度0.4mg/mlBradford(BioRad);-20°C下儲藏3.偶聯(lián)緩沖液100mM碳酸氬鈉；pH9.64.ELISA封閉試劑；RocheDiagnosticsGmbH,目錄號11125895.PBST緩沖液20mMNaH2PO4NaH2PO4;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.46.A卩(l-40)標(biāo)準(zhǔn)品A卩(l-40)固體粉末；Bachem目錄號H-1194;-20°C下儲藏7.第一抗體抗AP(l-40)兔pAb;經(jīng)親和純化；于PBS中的溶液；濃度0.039mg/ml;Signet目錄號9130-005;-20°C下儲藏8.標(biāo)記試劑抗兔國POD綴合物；Fa.JacksonImmunoResearch目錄號111-036-045;9.染色TMB;RocheDiagnosticsGmbH目錄號92817060;42mM于DMSO;3%^02水溶液；lOOmM乙酸鈉pH4.910.終止;容液2M》黃酸用于制備試劑的方案1.結(jié)合抗體將抗A卩單克隆抗體6E10(SignetInc,目錄號9320)稀釋至終濃度0.7mg/ml。2.封閉劑為了制備封閉儲備溶液，將封閉試劑溶于100mlH2O中，以各為10ml的等分試樣在-20。C下儲藏。將3ml的封閉儲備溶液用27ml1420進(jìn)行稀釋，供封閉一個(gè)ELISA板。3.Ap(l-40)單體形式標(biāo)準(zhǔn)稀釋液A)A卩(l-40)單體標(biāo)準(zhǔn)儲備液將0.5mgA卩(l-40)溶于250^1650.P/0NH4OH中，濃度2mg/ml;剛制備；立即使用。B)將5|nlA卩(l-40)單體標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到995WPBST=10嗎/mlC)將5^1,10貼/mlA(3(l-40)單體標(biāo)準(zhǔn)溶液加到4995plPBST10ng/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線編號最終濃度10000pg/ml231000pg/ml45100pg/ml610pg/ml樣品IP:免疫沉淀樣品編號稀釋系數(shù)直接21'531:2541:12S4.第一抗體儲備溶液2mlB0.633nd(1)0.S33ml(2)0.633nd(3)0.633rol|"0.S33ml(5〉0,633ml(6)Oml樣品0.4mlIPO.lml(1>O.licd(2>O.lita(3)PBST1.3"ml1.367ml1,367ml1.367na1.367ml2mlPBSTOml0.4ml0,4ml0.4ml將濃縮的抗A(3(I-40)pAb稀釋在PBST緩沖液中稀釋。稀釋系數(shù)為1/200=0.2pg/ml。立即使用。5.第二抗體將凍干的抗兔-POD綴合物溶于0.5mlH20中，與500pi甘油混合。然后將抗體濃縮物以100[d等分試樣在-20。C下儲藏。將濃縮物在PBST緩沖液中進(jìn)行1:10'000稀釋。將抗體溶液立即使用。6.TMB溶液將20ml的100mM乙酸鈉pH4.9與200piTMB溶液和29.5pi3%過氧化氬混合在一起。將此溶液立即使用。樣品板設(shè)置(注意所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均重復(fù)運(yùn)行兩次。)<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>Ul-U#=未知樣品所用的程序1.每孔加入10(V1結(jié)合抗體溶液，在4。C下溫育過夜。2.棄去抗體溶液，用25(^1PBST援沖液洗滌各孔三次。3.每孔加入260iiil封閉溶液，在室溫下溫育2小時(shí)。4.棄去封閉溶液，用250^1PBST緩沖液洗滌各孔三次。5.標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備后，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品以100^1/孔加到板中，在室溫下溫育2小時(shí)，并在4。C下溫育過夜。6.棄去標(biāo)準(zhǔn)品/樣品溶液，用250plPBST緩沖液洗滌各孔三次。7.每孔加入200^1第一抗體溶液，在室溫下溫育1.5小時(shí)。8.棄去抗體溶液，用250inlPBST緩沖液洗滌各孔三次。9.每孔加入200^1標(biāo)記溶液，在室溫下溫育1小時(shí)。10.棄去標(biāo)記溶液，用250nlPBST緩沖液洗滌各孔三次。11.向每孔加入10(HUTMB溶液，在室溫下溫育(5-15分鐘)。12.觀察顏色發(fā)展情況，每孔加入50nl終止溶液。13.在450nm下讀數(shù)。14.從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。15.進(jìn)行評估如果未知樣品的消光不在校準(zhǔn)曲線的線性范圍，那么以適當(dāng)?shù)臉悠废♂尪戎貜?fù)進(jìn)行ELISA。用于測定CSF中的ABn-42)單體形式的夾心ELISA方案試劑目錄1.F96Cert.MaxisorpNUNC畫ImmunoPlate目錄號4394542.結(jié)合抗體抗A|3單克隆抗體克隆6E10;Signet目錄號9320;濃度0.4mg/mlBradford(BioRad);-20°C下儲藏3.包被緩沖液100mM碳酸氫鈉；pH9.64.ELISA封閉劑；RocheDiagnosticsGmbH，目錄號11125895.PBST緩沖液20mMNaH2PO4NaH2PO4;140mMNaCl;0.05%Tween20;pH7.46.A(3(l-42)標(biāo)準(zhǔn)品A卩(l-42)固體粉末；Bachem目錄號H-1368;-20°C下儲藏7.第一抗體抗AJ3(l-42)兔pAb;經(jīng)親和純化；經(jīng)生物素?；?；于PBS中的溶液，含50%甘油；濃度0.25mg/ml;Signet目錄號9137-005;-20。C下儲藏8.才示i己i式劑抗兔-POD綴合物；Fa.JacksonImmunoResearch,目錄號111-036-0459.染色TMB;RocheDiagnosticsGmbH,目錄號92817060;42mMDMSO溶液3%&02水溶液lOOmM乙酸鈉，pH4.9終止液2M磺酸用于制備試劑的方法1.結(jié)合抗體將抗A|3單克隆抗體克隆6E10以1:400稀釋在包被緩沖液中。2.封閉劑將封閉試劑溶于100ml水中制備封閉儲備溶液，將各10ml等分試樣在-20。C下儲藏。對于每個(gè)要封閉的板，將3ml封閉儲備溶液用27ml水進(jìn)行稀釋。3.A(3(l-42)單體形式，標(biāo)準(zhǔn)稀釋液Ap(l-42)單體標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液將0.5mgA卩(l-42)溶于250|nl0.1%NH4OH;濃度2mg/ml;剛制備；立即使用。將5^1A卩(l-42)單體標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液加到995^1PBST=10嗎/ml。將5^1、10昭/mlA(3(l-42)單體標(biāo)準(zhǔn)溶液加到4995^1PBST=10ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線編號最終濃度lOOOOpg/na23lS0pg/ml31000pg/nOL4316pg/ml31.6pg/ml7B0Opg/ml樣品IP:免疫沉淀樣、儲備溶液0,633ml(1>0,633ml(2》0,633ml(3)0.S33ml(4)0.633ral(5)0.S33ml(S)OmlPBST1.367tnl1.367;rd1,367ml1.367ml1.367na2ml編號稀釋系數(shù)直接2li531:254樣品0.4mlIPO.IkvI(I)O,lnd(2)O.lml(3)PBSTOml0,4ml1,125所用的程序1.第一抗體將濃縮的抗A|3(l-42)pAb稀釋在PBST緩沖液中。稀釋系數(shù)為1/1250=0.2ng/ml。立即使用。2.標(biāo)i己i式劑使抗兔-POD綴合物凍干品在0.5ml水中復(fù)原。加入500pl甘油，將各100^1的等分試樣在-20。C下儲藏備用。將濃縮的標(biāo)記試劑在PBST緩沖液中稀釋。稀釋系數(shù)為1/5000。立即使用。3.T認(rèn)溶液將20ml100mM乙酸鈉pH4.9與200WTMB溶液和29.5|li13%過氧化物溶液進(jìn)行混合。立即使用。樣品板設(shè)置(注意所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均重復(fù)運(yùn)行兩次)<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>Ul-U#=未知樣品所用的程序1.每孔加入100nl結(jié)合抗體溶液，在4。C下溫育過夜。2.棄去抗體溶液，用25(HUPBST緩沖液洗滌各孔三次。3.每孔加入260^1封閉溶液，在室溫下溫育2小時(shí)。4.棄去封閉溶液，用25(HUPBST緩沖液洗滌各孔三次。5.標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備后，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品以1OOiliI/孔加到板中。在室溫下溫育2小時(shí)，并在4。C下溫育過夜。6.棄去標(biāo)準(zhǔn)品/樣品溶液，用250^1PBST緩沖液洗滌各孔三次。7.每孔加入200^1第一抗體溶液，在室溫下溫育1.5小時(shí)。8.棄去抗體溶液，用250^1PBST緩沖液洗滌各孔三次。9.每孔加入200^1標(biāo)記溶液，在室溫下溫育1小時(shí)。10.棄去標(biāo)記溶液，用250nlPBST緩沖液洗滌各孔三次。11.向每孔加入100nlTMB溶液，在室溫下溫育(5-15分鐘)。12.觀察染色情況，每孔加入50^1終止溶液。13.在450nm下讀數(shù)。14.從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。15.進(jìn)行評估如果未知樣品的消光不在校準(zhǔn)曲線的線性范圍，那么以適當(dāng)?shù)臉悠废♂尪戎貜?fù)進(jìn)行ELISA。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>以上結(jié)果表明了以下情況a.與非球聚體選擇性抗體如6E10相比，球聚體優(yōu)先抗體如8F5(或8C5)對A(342的結(jié)合優(yōu)先于對AP40的結(jié)合，這不受疾病狀態(tài)的限制。這個(gè)結(jié)果表明阿爾茲海默病得到成功治療，因?yàn)閷(342優(yōu)先于A(340進(jìn)行消除被遵循為一種AD治療的思想(例如通過使用R-氟比洛芬(Flurizan)，R-氟比洛芬在MyriadInc所公布的臨床試驗(yàn)中證明具有AD治療功效)。這個(gè)思想是由S.Weggen等(JBiolChem.(2003)278(34):31831-7)公布。結(jié)果在圖3中顯示。b.患者與健康對照者相比，球聚體優(yōu)先抗體如8F5(或8C5)結(jié)合AJ342更多過結(jié)合AP40。這個(gè)結(jié)果更加說明阿爾茲海默病得到成功治療，如上所述，將Af342優(yōu)先于A(340進(jìn)行消除纟皮遵循為一種AD治療思想(例如使用非類固醇的抗炎藥物，如R-氟比洛芬)。(參見圖3)。B)用球聚體選擇性抗AI3鼠單克隆抗體8F5或8C5進(jìn)行免疫沉淀后相比于用球聚體非選擇性抗體6E10進(jìn)行免疫沉淀后，人CSF中的內(nèi)源AB(l-42)和A卩(l-40)水平bl)用DynabeadsM-280綿羊抗小鼠IgG進(jìn)行免疫沉淀(IP)A|3抗體溶液以下純抗體是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)純化程序從雜交瘤獲得。-鼠單克隆抗體6E10;Fa.SignetNr.:9320;lmg/ml于PBS緩沖液中-鼠單克隆抗體8F5;1.65mg/ml于PBS緩沖液中-鼠單克隆抗體805;1.44mg/ml于PBS緩沖液中DynabeadsM-280綿羊抗小鼠IgG:將綿羊抗小鼠IgG(InvitrogenInc.,目錄號112.02)與磁珠(Dynabeads)共價(jià)結(jié)合。用單克隆小鼠抗體激活Dynabeads-將dynabeads(DynabeadsM-280綿羊抗小鼠IgG，Invitrogen;Prod.No.112.02)的儲備懸浮液小心振搖，以防止發(fā)泡。-無菌移取lmL，轉(zhuǎn)移到1.5mL反應(yīng)小瓶中。-將dynabeads用1mL免疫沉淀(IP)洗滌緩沖液(IP洗滌緩沖液PBS(20mMNaH2P04,140mMMaCl,pH7.4),0.1%(w/v)BSA)洗滌3次5分鐘。在洗滌程序過程中，小心除去上清液，同時(shí)用磁性分選儀架(magneticseparatorstand,MSS)將dynabeads固定化在反應(yīng)小并瓦的側(cè)壁。畫將洗滌過的dynabeads與40嗎A卩抗體在1mLPBS,0.1%(w/v)BSA中一起溫育。-該活化在4°C下振搖溫育過夜來進(jìn)行。-將活化的dynabeads用1mLIP洗滌緩沖液(PBS(20mMNaH2P04,140mMNaCl,pH7.4),0.1%(w/v)BSA)洗滌4次30分鐘(再次使用MSS)。-將活化的dynabeads用1mLPBS，0.1%(w/v)BSA,0.02(w/v)%疊氮化鈉重懸；旋渦混合并稍作離心。-將抗體活化的dynabeads在4°C下儲藏備用。CSF樣品制備將來自阿爾茲海默病患者的400|iiLCSF加到4|iL完全蛋白酶抑制劑混合物(RocheInc.目錄號1697498,1片劑溶于1mL水中)，將0.8500mMPMSF溶于曱醇中。10分鐘后，加入1.6mL20mMNaH2P04,140mMNaCl,0.05%Tween20,pH7.4(PBST)。人AD-CSF的A卩物質(zhì)的免疫沉淀將所制備的CSF樣品的250等分試樣加到25抗A|3-Dynabeads懸浮液。免疫沉淀是在6°C攪拌下進(jìn)行16小時(shí)。隨后的洗滌是用1mLPBS/0,1%(w/v)BSA洗滌三次5分鐘、最后用1mL10mMTris/HCLpH7.5緩沖液洗滌一次3分鐘。在洗滌程序過程中，小心除去上清液，同時(shí)用磁性分選儀架(MSS)將dynabeads固定化在反應(yīng)小瓶的側(cè)壁。在最后洗滌步驟后，將殘余上清液徹底除去。AP肽和相應(yīng)的抗體是這樣從Dynabeads除去將25無(3-巰基乙醇的樣品緩沖液(0.36MBistris,0.16MN誦二甘氨酸，1%SDS(w/v),15%(w/v)蔗糖，0.004%(w/v)溴酚藍(lán))力。到Eppendorff管，在微量恒溫儀中于95°C加熱5分鐘。冷卻到室溫后，用磁性分選儀架(MSS)將dynabeads固定化在反應(yīng)小瓶的側(cè)壁，將上清液轉(zhuǎn)移到另一Eppendorff管(IP洗脫液)。用尿素-PAGE然后是蛋白質(zhì)印跡程序?qū)P免疫沉淀物進(jìn)行分析A(31-40和A卩l(xiāng)-42物質(zhì)的定量是按照H.W.Klafkietal.,AnalyticalBiochemistry237,24-29(1996)最早描述的、后來也被J.Wiltfangetal.,J.Neurochemistry81,481-496,2002使用的程序，通過8M尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和隨后的蛋白質(zhì)印跡分析來進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)程序中只作了兩個(gè)小改動1)將積層凝膠中的SDS濃度調(diào)至0.25%(w/v)而不是0.1%(w/v)。2)對于蛋白質(zhì)印跡，用抗人A(3(N)(82El)小鼠IgG單克隆抗體(IBL,目錄號10323)替代抗體1E8(SenetekDrugDeliveryTechnologiesInc.St.Louis，MO,USA)。將免疫沉淀樣品的15IP洗脫液等分試樣加樣到8M尿素PAGE上。在100V下進(jìn)行電泳(15分鐘)，并在60V下繼續(xù)。當(dāng)藍(lán)色樣品加樣染料的運(yùn)動前4奪離凝膠末端還有0.5cm時(shí)，停止電泳。蛋白質(zhì)印跡程序蛋白質(zhì)印跡分析是在半干燥印跡室(BioRadInc.,75mA下45分鐘)中,在7.5cmx9cm硝酸纖維素0.45pm(BioRadInc.)上進(jìn)行。印跡緩沖液6gTris;28.1g甘氨酸；500mL曱醇；用水調(diào)至2.5L。將硝酸纖維素印跡在PBS中100°C煮沸10分鐘。該印跡通過用50mL5%(w/v)BSA于PBST中的溶液在室溫下處理1小時(shí)進(jìn)行飽和。除去流體相后，進(jìn)行如下的洗滌步驟兩次50mLTTBS(25mMTris/HCl;150mMNaCl緩沖液;0.05%Tween20;pH7.5)室溫下10分鐘，然后50mLTBS(25mMTris/HC1;150mMNaCl緩沖液；pH7.5)室溫下10分鐘。對于進(jìn)一步的顯影，將最終洗滌緩沖液從印跡棄去，加入15mL抗體I溶液(0.2嗎/mL82E1=1:500于3%(w/v)脫脂奶粉(LasanaInc.),于15mLTBS中)，6。C下保持20小時(shí)。除去緩沖液后，如上所述進(jìn)行三個(gè)洗滌步驟。將印跡與抗體溶液II(抗小鼠-POD1:10000稀釋于15mL3%(w/v)脫脂奶粉(于15mLTBS中))一起在室溫下溫育l小時(shí)。除去緩沖液后，如上所述進(jìn)行三個(gè)洗滌步驟。除去最后的洗滌緩沖液后，將2mLSuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrateEnhancer禾口2mL過氧4b4勿'溶、液進(jìn)4亍〉'昆合。將剛制備的溶液倒在已在暗處預(yù)溫育5分鐘的印跡上。用VersaDoc成像系統(tǒng)(BioRad)記錄化學(xué)發(fā)光。成像參數(shù)-曝光時(shí)間180秒。在30秒、60秒、120秒和180秒后記錄照片。結(jié)果是從180秒暴露時(shí)間的照片獲得。<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>以上結(jié)果表明，球聚體優(yōu)先抗體如8F5或8C5與非球聚體選擇性抗體如6E10相比，結(jié)合人CSF中的AP42比結(jié)合A|340要多。這個(gè)結(jié)果說明阿爾茲海默病得到成功治療，如上所述，將A(342優(yōu)先于A|340進(jìn)行消除被遵循為一種AD治療思想(例如通過使用R-氟比洛芬(參見上文》。實(shí)施例V8F5在APP轉(zhuǎn)基因小鼠中能改進(jìn)新物體識別能力為驗(yàn)證抗體8F5的中和性內(nèi)部Ap(l-42)球聚體表位對認(rèn)知的正向作用，用APP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行被動免疫實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中測試該小鼠記住它們曾探究過的物體的能力。一定時(shí)間后，延長第一次和第二次碰到物體之間的時(shí)間，APP轉(zhuǎn)基因小鼠不能夠識別已經(jīng)探究過的物體。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是基于動物的天然好奇性，對已經(jīng)探究過的物體明顯缺乏興趣i正明了對該物體的識別。實(shí)施例V.l:單克隆抗體8F5能提高識別指數(shù)動物使用FVBxC57B1背景(APP/L,ReMYND,Leuven,Belgium)的阿爾茲海默病單一轉(zhuǎn)基因小鼠模型的雌性小鼠和FVBxC57B1背景的、作為野生型對照的3月齡陰性同胎仔鼠。所有小鼠在3周齡時(shí)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行基因型分型并得到唯一的身份登記號，一旦得知PCR結(jié)果，進(jìn)行第二次PCR加以核實(shí)，然后再開始研究。將所有小鼠進(jìn)行隨機(jī)分配和年齡匹配，即通過計(jì)算機(jī)給予它們隨機(jī)的號碼，隨機(jī)分配到某個(gè)治療。在研究開始前18天通過處理組將各小鼠關(guān)入籠中，以讓它們熟悉新的籠子環(huán)境。小鼠能自由獲得預(yù)過濾的無菌水(紫外燈)和標(biāo)準(zhǔn)的鼠糧。該食物是在通風(fēng)良好的儲藏室中在干燥和涼爽的條件下儲藏。每日檢查水和食物的量，必要時(shí)加以供應(yīng)，每周兩次進(jìn)行更新。將小鼠在顛倒的日夜節(jié)律下關(guān)養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的RVST2型金屬籠(面積540cm"中，從下午7時(shí)起14小時(shí)光亮/10小時(shí)黑暗?；\子裝有結(jié)實(shí)的地板和一層墊草。每籠的小鼠數(shù)量按照動物福利立法受到限制。在行為試驗(yàn)開始前5天，將小鼠換到macrolonType2籠中運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境為行為試驗(yàn)做準(zhǔn)備。處理(被動免疫)進(jìn)行了三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，其中小鼠(每組至少9只)在第1、8和15天接受腹膜內(nèi)注射(500昭，240pL/小鼠)。用單克隆抗體6G1、8F5和其它非公開的抗體，所有抗體均溶于磷酸緩沖鹽水或者用320^L磷酸緩沖鹽水處理小鼠。新物體識別試一驗(yàn)在第三次處理的當(dāng)天進(jìn)行新物體識別試驗(yàn)。所用的方案遵循Dewachter等(JournalofNeurosdence,2002,22(9):3445畫3453)所描述的方法。讓小鼠熟悉Plexiglas開放空間箱(52x52x40cm)1小時(shí)，該箱有黑色垂直壁和透明地板，由放置在箱子下方的燈暗淡照明。第二天，將各小鼠放在該箱中，進(jìn)行10分鐘識別試驗(yàn)。在這個(gè)試驗(yàn)過程中，將各小鼠分別放入有2個(gè)完全相同物體A(橙色圓筒或綠色立方體，大小類似土4cm)的開力丈空間中，通過計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)(Ethovision,NoldusinformationTechnology,Wageningen,Netherlands)i己錄'J、鼠〗笨究4勿體A(當(dāng)小鼠口鼻朝向該物體距離小于1cm和小鼠朝該物體的方向靈壽文地嗅聞時(shí))的持續(xù)時(shí)間(timeAA)和頻率(FreqAA)。在進(jìn)行2.5小時(shí)后的10分鐘保持試驗(yàn)(第二試驗(yàn))過程中，將新的物體(物體B,綠色立方體或橙色圓筒)與熟悉的物體(物體A)—起放入開放空間中(分別是FreqA和Fr叫B及TimeA和TimeB)。用識別指數(shù)(RI)測量非空間記憶力，識別指數(shù)定義為探究新物體的持續(xù)時(shí)間與探究兩個(gè)物體的持續(xù)時(shí)間之比[TimeB/(TimeA+TimeB)x100]。在識別試驗(yàn)過程中探究物體A的持續(xù)時(shí)間和頻率(TimeAA和FreqAA)用來測量好奇性。將所有三個(gè)研究的接受單克隆抗體6G1或8F5或磷酸緩沖鹽水的APP轉(zhuǎn)基因小鼠和接受磷酸緩沖鹽水的非轉(zhuǎn)基因同胎仔鼠進(jìn)行合并，以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(圖4)。不能區(qū)別舊物體和新物體的小鼠其識別指數(shù)為50。能識別舊物體的小鼠會優(yōu)先探究新物體，因此識別指數(shù)變成大于50。專門探究新物體的小鼠其識別指數(shù)為100。將每組的平均識別指數(shù)通過t檢驗(yàn)與機(jī)會水平(即50)進(jìn)行比較。將所有各組的平均識別指數(shù)也通過ANOVA然后是post-hoct檢驗(yàn)進(jìn)行比較。PBS組和野生型組之間的差異表明這個(gè)示例中的APP轉(zhuǎn)基因小鼠有認(rèn)知缺損。注射PBS的小鼠以機(jī)會水平(即不顯著偏離50)發(fā)揮，而所有其它小鼠顯示物體識別力(圖4:星號)。當(dāng)將抗體處理過的APP轉(zhuǎn)基因小鼠的性能與對照組進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，與PBS處理的小鼠有顯著差異，但與野生型小鼠比較沒有顯著差異(圖4:圓圈)，表明用抗體8F5進(jìn)行的處理逆轉(zhuǎn)了這些APP轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知缺損。實(shí)施例VI抗體8F5和8C5與淀粉樣斑塊形式的原纖維淀粉樣13肽和老齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠和阿爾茲海默病患者腦膜血管中的淀粉樣蛋白的特異性反應(yīng)的原位分析抗體8F5和8C5顯示出對原纖維A卩肽沉積物的染色減低，這提是通過與可溶性球聚體形式的而不是原纖維沉積形式的A(3肽結(jié)合來介導(dǎo)的。由于抗體與原纖維Ap肽結(jié)合會導(dǎo)致聚集物的快速溶解和隨后可溶性A(3濃度的增加，而后者據(jù)認(rèn)為具有神經(jīng)毒性并可能導(dǎo)致微出血，因此優(yōu)選的是能影響可溶性球聚體而不是單體的抗體療法。方法對于這些實(shí)驗(yàn)，使用了幾種大腦材料樣品來自兩個(gè)AD患者的皮層組織(RZ16和RZ55)和來自19月齡Tg2576小鼠(APPSWE#001349,Taconic,Hudson,NY,USA)或12月齡老的APP/L小鼠(ReMYND,Leuven,Belgium)的皮層組織。小鼠過量表達(dá)帶家族性阿爾茲海默病突變的人APP，在大約11月齡時(shí)在腦實(shí)質(zhì)中形成卩淀粉樣沉積物，在大約18月齡時(shí)在較大的腦血管中形成卩淀粉樣沉積物。將小鼠深度麻醉，穿心灌注0.1M磷酸緩沖鹽水(PBS)以沖洗血液。然后，從頭蓋移取大腦，縱向切開。將其中半個(gè)大腦急凍(shock-frozen),另半個(gè)大腦通過浸入4%多聚曱醛進(jìn)行固定。將浸入固定的大腦半球通過在30%覆糖的PBS溶液中浸泡進(jìn)行低溫保護(hù)，然后裝在冰凍切片機(jī)上。將整個(gè)前腦切成40pm橫切片，收集在PBS中，用于后面的染色程序。來自阿爾茲海默病患者的新皮層樣品是獲自德國慕尼黑Brain-Net,為冷凍組織，在解凍過程中在4%多聚曱醛中浸入固定，隨后同小鼠組織一樣進(jìn)行處理。用以下方案對各個(gè)切片進(jìn)行剛果紅染色材料隱淀粉樣蛋白染料剛果紅試劑盒(Sigma-Aldrich;HT-60),由NaCl酒精溶液、NaOH溶液和剛果紅溶液組成。-染色皿-顯微鏡載玻片S叩erfrostPlus和蓋玻片畫乙醇、二曱苯，包埋介質(zhì)試劑79-NaoH用NaCl溶液1:100稀釋產(chǎn)生堿性鹽水-堿性鹽水用剛果紅溶液1:100稀釋產(chǎn)生石威性剛果紅溶液(在使用前15分鐘內(nèi)制備，過濾)-將切片裝在載玻片上，讓它們干燥。-將載玻片在染色皿中溫育，首先是在堿性鹽水中溫育30-40分鐘，然后是在堿性剛果紅溶液中溫育30-40分鐘。-用新鮮乙醇清洗三次，用二曱苯包埋。首先對染色用ZeissAxioplan顯微鏡(Zeiss,Jena,Germany)進(jìn)行照相，定性評估。紅顏色表明是斑塊形式的和在較大腦膜血管中的淀粉樣沉積物。之后對抗體染色的評估集中在這些結(jié)構(gòu)。染色是按照以下方案通過將切片與含有0.07-0.7pg/ml的各個(gè)抗體的溶液一起溫育來進(jìn)行材料-TBST洗滌溶液(Tris緩沖鹽水加Tween20;10x濃縮液；DakoCytomationS3306,DAKO,Hamburg,Germany)1:10于Aquabidest中)-0.3%^02的曱醇溶液國驢血清(Serotec,Diisseldorf,Germany),5。/oTBST溶液，作為封閉血清-單克隆小鼠抗球聚體抗體，在TBST中以給定濃度稀釋。-第二抗體生物素酰化的驢抗小鼠抗體(JacksonImmuno/Dianova，Hamburg,Germany;715-065-150;在TBST中1:500稀釋)-StreptABComplex(DakoCytomationK0377,DAKO,Hamburg,Gsrmany)畫過氧化物酶底物試劑盒二氨基聯(lián)苯胺—DAB;SK隱4100;VectorLaboratories,Burlingame,CA，USA)-SuperfrostPlus顯微鏡載玻片和蓋玻片-無二曱苯包埋介質(zhì)(Medite,Burgdorf,Germany;X-traKitt)程序-將漂浮的切片轉(zhuǎn)移到用冰冷的0.3%H2O2t,溫育30分鐘-在TBST緩沖液中洗滌5分鐘隱與驢血清/TBST—起溫育20分鐘國與第一抗體一起在室溫下溫育24小時(shí)。-在TBST緩沖液中洗滌5分鐘-與封閉血清一起溫育20分鐘-在TBST緩沖液中洗滌5分鐘-與第二抗體一起在周圍環(huán)境溫度下溫育60分鐘-在TBST緩沖液中洗滌5分鐘-與StreptABComplex—起在周圍環(huán)境溫度下溫育60分鐘-在TBST緩沖液中洗滌5分鐘-與DAB—起溫育20分鐘-將切片裝在載玻片上，將載玻片風(fēng)干，用酒精使載玻片脫水，將載玻片包埋除了在顯微鏡下對切片進(jìn)行目視檢查外，另外還對淀粉樣染色進(jìn)行定量，做法是用ImagePro5.0圖像分析系統(tǒng)從組織學(xué)圖像目視切取IO個(gè)隨機(jī)選擇的斑塊，測定它們的平均灰度值。從灰度值計(jì)算出光密度值，做法是將淀粉樣斑塊的密度減去染色材料的平均背景密度(0%-沒有超過周圍背景的斑塊染色，100%-沒有透射/最大染色)。用ANOVA檢驗(yàn)抗體6E10/4G8分別與6G1、8C5和8F5的差值的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果所有所述的抗體染色材料證明是親剛果紅淀粉樣沉積物(圖7(A))。球聚體優(yōu)先抗體8F5和8C5對A卩肽的腦實(shí)質(zhì)和腦膜親剛果紅沉積物的染色顯著少于對抗體6G1和6E10的染色(圖7(B)-(C),(H))。對腦實(shí)質(zhì)淀粉樣斑塊染色的定量分析揭示，所有抗體都結(jié)合斑塊(統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的超出對照的密度)，但抗體8F5和8C5的結(jié)合顯著^f氐于參考抗體犯10(針對A(3的N末端序列)，等于或低于參考抗體4G8(針對A卩的N末端序列)(圖7(D)-圖(G))。抗體8F5和8C5與淀粉;f羊沉積物的結(jié)合小于能識別A|3單體或一部分A卩序列的抗體。用結(jié)合原纖維A|3肽的抗體進(jìn)行處理會導(dǎo)致大腦組織中的淀粉樣斑塊的快速溶解和隨后可溶性AP濃度的增加，而后者據(jù)認(rèn)為具有神經(jīng)毒性并可能導(dǎo)致微出血，和/或血管淀粉樣蛋白的快速溶解，這也會導(dǎo)致微出血。因此，優(yōu)選能影響可溶性球聚體而不是單體的抗體療法。權(quán)利要求1.一種分離抗體，所述分離抗體結(jié)合淀粉樣β(Aβ)蛋白球聚體的特異性大于結(jié)合淀粉樣β蛋白單體的特異性。2.權(quán)利要求1的分離抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。3.權(quán)利要求2的分離抗體，其中對所述球聚體的結(jié)合特異性與所述單體的結(jié)合特異性之比為至少1.4。4.權(quán)利要求3的分離抗體，其中所述比例為1.4-16.9。5.權(quán)利要求4的分離抗體，其中所述淀粉樣(3蛋白單體選自A(3(l-42)單體和A(3(l-40)單體。6.權(quán)利要求5的分離抗體，其中所述單克隆抗體由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為PTA-7238或PTA-7407的雜交瘤產(chǎn)生。7.—種雜交瘤，所述雜交瘤的美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為PTA-7238。8.—種單克隆抗體(8F5)，所述單克隆抗體由權(quán)利要求7所述的雜交瘤產(chǎn)生。9.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含由SEQIDNO:1編碼的可變重鏈。10.權(quán)利要求9的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。11.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含由SEQIDNO:2編碼的可變輕鏈。12.權(quán)利要求11的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。13.權(quán)利要求11的單克隆抗體，所迷單克隆抗體還包含由SEQIDNO:1編碼的可變輕重鏈。14.權(quán)利要求13的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。15.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含SEQIDNO:3。16.權(quán)利要求15的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。17.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含SEQIDNO:4。18.權(quán)利要求17的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。19.權(quán)利要求17的單克隆抗體，所述單克隆抗體還包含SEQIDNO:3。20.權(quán)利要求19的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。21.—種分離抗體，所述分離抗體結(jié)合淀粉樣P蛋白球聚體的特異性大于結(jié)合淀粉樣|3蛋白原纖維的特異性。22.權(quán)利要求22的分離抗體，其中所迷抗體是單克隆抗體。23.權(quán)利要求23的分離抗體，其中所述單克隆抗體由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為PTA-7238或PTA-7407的雜交瘤產(chǎn)生。24.—種雜交瘤，所述雜交瘤的美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為PTA畫7407。25.—種單克隆抗體(8C5),所述單克隆抗體由權(quán)利要求24所述的雜交瘤產(chǎn)生。26.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含由SEQIDNO:11編碼的可變重鏈。27.權(quán)利要求26的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。28—種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含由SEQIDNO:12編碼的可變輕鏈。29.權(quán)利要求28的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。30.權(quán)利要求28的單克隆抗體，所述單克隆抗體還包含由SEQIDNO:11編碼的可變輕鏈。31.權(quán)利要求30的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。32.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含SEQIDNO:19。33.權(quán)利要求32的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。34.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體包含SEQIDNO:20。35.權(quán)利要求34的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。36.—種包含可變重鏈的單克隆抗體，其中所述可變重鏈包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。37.—種包含可變輕鏈的單克隆抗體，其中所述可變輕鏈包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的CDR。38.權(quán)利要求37的單克隆抗體，所述單克隆抗體還包含可變重鏈，其中所述可變重鏈包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15的CDR。39.—種包含可變重鏈的單克隆抗體，其中所述可變重鏈包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。40.—種包含可變輕鏈的單克隆抗體，其中所述可變輕鏈包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的CDR。41.權(quán)利要求40的單克隆抗體，所述單克隆抗體還包含可變重鏈，其中所述可變重鏈包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的CDR。42.—種對阿爾茲海默病需要患者治療或預(yù)防的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體以足以實(shí)現(xiàn)所述治療或預(yù)防的量給予所述患者。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述分離抗體通過選自肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥和皮下給藥的途徑給予。44.一種對懷疑患有阿爾茲海默病的患者進(jìn)行診斷的方法，所述方法包括以下步驟a.從所述患者分離生物樣品；b.使所述生物樣品與權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的所述分離抗體進(jìn)行接觸，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗原/抗體復(fù)合物得以形成；和c.檢測所述樣品中所述抗原/抗體復(fù)合物的存在，所述復(fù)合物的存在表明所述患者患有阿爾茲海默病。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗原是球聚體。46.—種對懷疑患有阿爾茲海默病的患者進(jìn)行診斷的方法，所述方法包括以下步驟a.從所述患者分離生物樣品；b.使所述生物樣品與抗原進(jìn)行接觸，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗原/抗體復(fù)合物得以形成；c.向所得的抗體/抗原復(fù)合物加入綴合物，加入的時(shí)間和條件足夠使所述綴合物與結(jié)合抗體發(fā)生結(jié)合，其中所述綴合物包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的所述分離抗體而且該抗體與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物連接；和d.通過檢測所述信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的信號檢測在所述生物樣品中可能存在的抗體的存在，所述信號表明所述患者患有阿爾茲海默病。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述抗原是球聚體。48.—種對懷疑患有阿爾茲海默病的患者進(jìn)行診斷的方法，所述方法包括以下步驟a.從所述患者分離生物樣品；b.使所述生物樣品與抗抗體進(jìn)行接觸，其中所述抗抗體對權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的所述抗體具有特異性，接觸的時(shí)間和條件足夠使抗抗體/抗體復(fù)合物得以形成，所述復(fù)合物含有所述生物樣品中存在的抗體；c.向所得的抗抗體/抗體復(fù)合物加入綴合物，加入的時(shí)間和條件足夠使所述綴合物與結(jié)合抗體發(fā)生結(jié)合，其中所述綴合物包含抗原，該抗原與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物結(jié)合；和d.檢測所述信號產(chǎn)生化合物所產(chǎn)生的信號，所述信號表明所述患者患有阿爾茲海默病。49.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體。50.—種對阿爾茲海默病需要患者預(yù)防或治療的方法，所述方法包括將權(quán)利要求49所述的組合物以足以實(shí)現(xiàn)所述預(yù)防或治療的量給予所述患者的步驟。51.—種疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的所述分離抗體及藥學(xué)上可接受的佐劑。52.—種對阿爾茲海默病需要患者預(yù)防或治療的方法，所述方法包括將權(quán)利要求51所述的疫苗以足以實(shí)現(xiàn)所述預(yù)防或治療的量給予所述患者的步驟。53.—種鑒定對預(yù)測會發(fā)生阿爾茲海默病的患者適合的自動免疫接種的化合物的方法，所述方法包括a)使一種或多種目的化合物暴露于權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體，暴露的時(shí)間和條件足以使所述一種或多種化合物與權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體發(fā)生結(jié)合；和b)鑒定與權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體發(fā)生結(jié)合的那些化合物，所鑒定出的化合物用于對預(yù)測會發(fā)生阿爾茲海默病的患者進(jìn)行主動免疫4妄種。54.—種試劑盒，所述試劑盒包含a)權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體和b)包含與信號產(chǎn)生化合物連接的抗體的綴合物，其中所述綴合物的所述抗體不同于所述分離抗體。55.—種試劑盒，所述試劑盒包含a)抗權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體的抗抗體和b)包含與信號產(chǎn)生化合物連接的抗原的綴合物。56.權(quán)利要求55的試劑盒，其中所述抗原是^求聚體。全文摘要本發(fā)明涉及可用于例如阿爾茲海默病或其它神經(jīng)變性性疾病的預(yù)防、治療和診斷的單克隆抗體(例如8F5和8C5)。文檔編號A61P25/28GK101506236SQ200680051985公開日2009年8月12日申請日期2006年11月30日優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日發(fā)明者A·R·斯特里賓格,B·拉布科夫斯基,H·希倫,P·克勒,S·巴格霍恩,U·埃貝爾特申請人:艾博特公司;艾博特股份有限兩合公司