專利名稱：兩親聚合物-pdgf復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與兩親聚合物結(jié)合的血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF )的新
型復(fù)合物，其可以改善用于藥物應(yīng)用的治療性蛋白質(zhì)的體外和體內(nèi)物 理和化學(xué)穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
PDGF類是通過(guò)經(jīng)由兩個(gè)二硫化物橋彼此連接的兩個(gè)多肽鏈構(gòu)成 的大約30 OOO道爾頓的糖蛋白類。已經(jīng)識(shí)別出四種類型的鏈A、 B、 C和D。天然蛋白質(zhì)以同二聚體或AB型異二聚體的形式存在(Oefner
C. EMBO J.11， 3921-2926， 1992 )。
PDGF最初分離自血小板。PDGF類是在血液凝結(jié)過(guò)程中釋放出來(lái) 的能夠促進(jìn)各種細(xì)胞類型的生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子(Ross R等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974，71， 1207; Kohler N. & Lipton A. ， Exp. Cell Res. ， 1974， 87， 297 )。已知的是，血小板以外的某些細(xì)胞也會(huì) 產(chǎn)生PDGF,其對(duì)于多數(shù)源自間葉細(xì)胞的細(xì)胞即血液、肌肉、骨骼和 軟骨細(xì)胞以及結(jié)締組織細(xì)胞來(lái)說(shuō)是促有絲分裂的(Raines E. W.， "Biology of Platelet-Derivated Growth Factor (血小板源生長(zhǎng) 因子生物學(xué))"，1993,Westermark， B.和C. Sorg， Ed. Basel, Kerger, 第74頁(yè))。許多文章往往也證實(shí)，巨噬細(xì)胞源PDGF對(duì)于平滑肌細(xì)胞 起到趨化和促有絲分裂劑的作用并且其有助于動(dòng)脈硬化特有的動(dòng)脈 壁的肌內(nèi)膜增厚(Ross R等人，Science(科學(xué))，1990， 248， 1009 )。 PDGF的活性此外還特別包括刺激嗜中性單核細(xì)胞的微粒釋放(Tzeng
D. Y等人，Blood (血液)，1985, 66, 179 )，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的類固醇 合成(Risbridger G. P. ， Mol. Cell, Endocrinol. ， 1993， 97， 125 )， 刺激嗜中性吞噬作用(WilsonE等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1987, 84, 2213 )，調(diào)節(jié)凝血栓蛋白表達(dá)和分泌(Ma jak R. A等人，J.Biol. Chem.， 1987， 262， 8821 ),以及血管平滑肌細(xì)胞中ICAM-1基因 的后調(diào)節(jié)(Morisaki N等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. ， 1994， 200, 612 )。
由于這些不同性質(zhì)，已經(jīng)設(shè)想了重組PDGF類在制藥領(lǐng)域中的應(yīng) 用。PDGF已經(jīng)特別#皮批準(zhǔn)用于糖尿病足部潰瘍的治療(Regranex， J&J)和用于牙周4I^卜(GEM 21S，Biomimetic)。
潰瘍愈合，就像一般來(lái)說(shuō)的皮膚愈合一樣，是一種復(fù)雜的現(xiàn)象， 其要求許多細(xì)胞類型隨時(shí)間和在空間上的協(xié)調(diào)干預(yù)，這可以概括為三 個(gè)階段發(fā)炎階段、增殖階段和重塑階段。
在對(duì)正常愈合而言大約7天的發(fā)炎階段中，巨噬細(xì)胞殺死細(xì)菌，
清除受損組織并使組織再生。為此，巨噬細(xì)胞分泌出膠原酶、細(xì)胞因 子和生長(zhǎng)因子。
在對(duì)正常愈合而言從第3天到第三周的增殖階段的過(guò)程中，相繼 發(fā)生三個(gè)事件。傷口被肉芽組織填充，血管生成且傷口被上皮細(xì)胞覆 蓋。肉芽組織從邊緣向中心生長(zhǎng)。成纖維細(xì)胞大量產(chǎn)生III型膠原。
在從第3周到l甚至2年的重塑過(guò)程中，肉芽組織成熟，且成纖 維細(xì)胞產(chǎn)生較少膠原。通過(guò)細(xì)胞凋亡消除肉芽形成過(guò)程中形成的沒用 的血管。III型膠原被I型膠原替代，其依照張力線組織和交聯(lián)。
在此過(guò)程中，PDGF起到基本作用。在傷口形成過(guò)程中，血小板 聚集并釋放PDGF。 PDGF將嗜中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞引 向傷口并且是有力的促細(xì)胞分裂劑。巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞又合成和分 泌PDGF。 PDGF刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生新的細(xì)胞外基質(zhì)，基本是非膠原 化合物，例如葡胺聚糖和粘著蛋白(J.F.Norton等人，Essential practice of surgery (夕卜科基本實(shí)踐)，Springer, 2003，第7章， 77-89)。
慢性傷口例如糖尿病足部潰瘍、靜脈潰瘍和壓瘡具有愈合非常緩 慢且有時(shí)不完全的特性，這是因?yàn)橛线^(guò)程不是正常進(jìn)行(R. Lobmann等人，J. of Diabetes and its complications (糖尿病及 其并發(fā)癥雜志)，2006， 20， 329-335 )。愈合過(guò)程實(shí)際上是消除對(duì)組織的損傷所必須的破壞過(guò)程與引起 新組織形成的修復(fù)過(guò)程之間的精妙平衡。蛋白酶和生長(zhǎng)因子在此過(guò)程 中通過(guò)調(diào)節(jié)此平衡來(lái)發(fā)揮基本作用。在慢性傷口的情況下，這種平衡 向著有利于破壞的方向被擾亂，因此這些傷口的愈合緩慢。盡管存在 不同類型的慢性傷口，但是在它們以持續(xù)發(fā)炎階段(這造成高的蛋白 酶含量并因此降低生長(zhǎng)因子活性)為特征的意義上，它們?cè)谏锘瘜W(xué)
上相對(duì)類似(G. Lauer等人，J. Invest. Dermatol. 115 (2000) 12-18 )。 這種生長(zhǎng)因子的劣化造成與這些慢性傷口有關(guān)的組織的整體損失，這 不利于愈合(D.R. Yager等人，J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748)。
目前在市場(chǎng)上存在與國(guó)際非有產(chǎn)權(quán)名稱"becaplermin (貝卡普 勒明)"對(duì)應(yīng)的，以商品名Regranex⑧出售的人重組PDGF-BB-基藥品。 這種藥品用于糖尿病的下肢潰瘍的治療。其是局部施用的凝膠形式并 且能夠促進(jìn)潰瘍愈合。其就像內(nèi)源PDGF—樣特別能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖 并因此促進(jìn)新組織的形成。
這種治療的效力有限(Cullen等人，The international journal of biochemistry & Cell Biology (國(guó)際生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)雜志) 34， 1544-1556， 2002 )，即使臨床研究已經(jīng)顯示了在愈合和愈合所需 的時(shí)間周期方面的改進(jìn)(Greenhalgh等人，American Journal of pathology (美國(guó)病理學(xué)雜志)，136， 1235-1246 1990; LadinPlastic and Reconstructive Surgery ( Ladin 整形和重建夕卜科 學(xué))，105, 1230-1231 2000; Holloway等人，Wounds, 5/4， 198-206; Mandracchia等人，Clinics in Podiatric Medecine and Surgery (足病醫(yī)學(xué)和外科學(xué)臨床)，18， 189-209 2001; WiemanT. J. American Journal of Surgery (美國(guó)外科學(xué)雜志)，176， 74S-79S 1998 )。
JT&J出售的含有PDGF-BB的Regranex產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)將治療的患 者的康復(fù)率提高至50%而證實(shí)了其效力，與之相比，僅接受標(biāo)準(zhǔn)傷口 治療的患者的康復(fù)率僅為36°/。。盡管在糖尿病足部潰瘍的治療中具有 這種顯著改進(jìn)，但必須指出，只有50%患者在長(zhǎng)期和昂貴的治療后實(shí)現(xiàn)康復(fù)。在未康復(fù)的情況下，后果可能極其嚴(yán)重，在許多情況下則導(dǎo) 致下肢切除。應(yīng)該補(bǔ)充的是，該治療的平均持續(xù)時(shí)間非常長(zhǎng)，大約
20周，且其施用昂貴并有限制，這是因?yàn)楸仨毲鍧崅诓⒃谠绯渴?用Regranex，然后在12小時(shí)后清潔傷口 。這兩個(gè)程序大多需要護(hù)士 的護(hù)理。此外，持續(xù)20周的平均治療成本過(guò)高(大約1400美元)。
可以通過(guò)PDGF在要治療的傷口上的迅速降解來(lái)解釋這種部分效 力。這種降解在慢性傷口的情況下來(lái)自持續(xù)的發(fā)炎狀態(tài)，這由于刺激 蛋白酶的過(guò)度生產(chǎn)而在傷口上產(chǎn)生對(duì)PDGF不利的環(huán)境。
盡管降解控制對(duì)于傷口愈合是必須的，但過(guò)度的蛋白水解活性是 有害的，因?yàn)槠湓斐杉?xì)胞外基質(zhì)的降解(F. Grinnell等人，J. Invest. Dermatol. 106 (1996) 335-341和C. N. Rao等人，J. Invest. Dermatol. 105 (1995) 572-578 )和具有關(guān)鍵功能性作用的分子如生長(zhǎng)因子的降解 (V. Falanga等人，J. Derm. Surg. One. 18 (1992) 604-606; D. R. Yager 等人，Wound Rep， Reg. 5 (1997) 23-32.和M.Wlaschek等人， Br. J. Dermatol. 137 (1997) 646-647 )。實(shí)際上，生長(zhǎng)因子如PDGF、 TGFI3或bFGF由于它們誘發(fā)細(xì)胞遷移、增殖、蛋白質(zhì)合成和基質(zhì)形成 的能力，并且更一般地由于它們控制修復(fù)過(guò)程的事實(shí)而成為愈合過(guò)程 中的關(guān)鍵因素。但是，這些生長(zhǎng)因子是蛋白質(zhì)分子并因此對(duì)蛋白水解 降解敏感。 一些研究表明，在它們與來(lái)自慢性傷口的流體接觸時(shí)，如 PDGF這樣的生長(zhǎng)因子的降解快得多，這是因?yàn)樗鼈兒懈邼舛鹊慕?屬蛋白酶(D.R. Yager等人，J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748)。
對(duì)于靜脈潰瘍的治療，在出版物(T. J. Wieman， Wounds, 2003， 巻15， No. 8， 257-264 )中報(bào)道的試驗(yàn)性臨床研究中，與基于用加壓 療法常規(guī)清潔傷口的現(xiàn)有治療相比，Regranex僅表現(xiàn)出輕微改進(jìn)。
在蛋白質(zhì)生成過(guò)程中體現(xiàn)出例如PDGF的不穩(wěn)定性的問題。已知 的是，PDGF對(duì)轉(zhuǎn)譯后的蛋白水解特別敏感(Hart等人，Biochemistry (生物化學(xué))29: 166-172， 1990和美國(guó)專利序列號(hào)07/557, 219 )，尤 其是在蛋白質(zhì)的成熟鏈的位置32處的精氨酸氨基酸與位置33處的蘇氨酸氦基酸之間的結(jié)合程度上。其它位置對(duì)蛋白水解敏感，例如PDGF 的B鏈的位置79處的精氨酸與位置80處的賴氨酸之間的結(jié)合，或位 置27處的精氨酸與位置28處的精氨酸之間的結(jié)合。
這種蛋白水解不穩(wěn)定性在獲得這種蛋白質(zhì)方面具有嚴(yán)重問題，其 根據(jù)美國(guó)專利No. 4, 845， 075中所述的方法在酵母中以重組方式制 成。具體而言，美國(guó)專利No. 7， 084， 262教導(dǎo)我們，PDGF-BB的分析 和提純導(dǎo)致由轉(zhuǎn)譯后內(nèi)切蛋白酶解裂解產(chǎn)生21種異型。這種極大的
結(jié)構(gòu)異質(zhì)性周此導(dǎo)致基因工程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性與成熟形式的完整 蛋白質(zhì)相比降低50%。
此外，根據(jù)日期為2006年8月14日的關(guān)于在14周后尚未康復(fù) 的糖尿病足部潰瘍的新聞公才艮(www, prnewswire. com) ， Cardium最 近的臨床結(jié)果表明使用PDGF-BB的治療可以提供的潛力。Cardium提 出的解決方案在于在傷口細(xì)胞中引入表達(dá)PDGF-BB的基因以使其局 部過(guò)度表達(dá)。借助腺病毒載體的這種基因療法在15位患者組中能夠 使耐受普通治療的這些糖尿病足部潰瘍愈合接近80°/。。這種治療方案 是有前途的。但是，由于與腺病毒型病毒載體的使用有關(guān)的安全性， 基因療法的制藥發(fā)展迄今仍然非常危險(xiǎn)。
因此需要改進(jìn)和有可能改進(jìn)使用PDGF的糖尿病足部潰瘍的現(xiàn)有 治療。
在糖尿病足部潰瘍治療的情況下，最終目的是三重的 -加速康復(fù) -提高康復(fù)率 -簡(jiǎn)化治療程序。
也存在靜脈潰瘍和壓瘡的情況，它們會(huì)造成相當(dāng)大的疼痛和非常 嚴(yán)重的醫(yī)療并發(fā)癥。
因此，要解決的問題基本上是保護(hù)慢性傷口上的PDGF。 已經(jīng)提出各種解決方案。
美國(guó)專利5， 905， 142描述了通過(guò)產(chǎn)生對(duì)蛋白水解侵襲具有更高 抗性的蛋白質(zhì)突變體，通過(guò)取代或通過(guò)刪除一個(gè)或多個(gè)接近潛在裂解位點(diǎn)的賴氨酸或精氨酸氨基酸來(lái)減輕與PDGF有關(guān)的這些蛋白水解問 題。制造更耐受蛋白酶的蛋白質(zhì)的這種策略并不令人滿意。PDGF的 這種基因改性會(huì)導(dǎo)致生物活性的改變，產(chǎn)生不同的與其各種受體的親 合力，這也可能引發(fā)毒理學(xué)問題。此外，PDGF的這種改性要求新的 藥物開發(fā)，這是極其昂貴和冒險(xiǎn)的。
在1970年代，大量研究了這種蛋白質(zhì)，據(jù)發(fā)現(xiàn)，提純極其棘手， 因?yàn)镻DGF由于其陽(yáng)離子和疏水性質(zhì)而是"非常粘的蛋白質(zhì)"(Heldin， C. H. EMBO J. 11: 4251-4259，1992; Raines和Ross,J. Biol. Chem. 257 (9): 5154-5160， 1982; Antoniades， PNAS 78: 7314， 1981; Deuel等人， J. Biol. Chem. 256: 8896， 1981) 。 PDGF實(shí)際上是高度陽(yáng)離子性的蛋白 質(zhì)，其等電點(diǎn)為9. 8至10.5。其它作者證實(shí)了這一性狀，例如Wei 等人(Journal of controlled release(受控釋放雜志)112: 103-110， 2006 )，其解釋了 PDGF容易吸附到容器表面上，其在該容器中處于 溶解狀態(tài)。該作者通過(guò)在該混合物中加入0. "/。BSA或0. 1% BSA/Tween 20混合物來(lái)解決該問題。這些解決方案在很大程度上解決了該問題， 因?yàn)槎噙_(dá)95°/。的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)處于溶解狀態(tài)。但是，考慮到BSA的動(dòng) 物來(lái)源和與牛綿狀腦病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，從制藥角度看，這些解決方案并 不令人滿意。
相同的作者提出的另一解決方案在于加入更有力的陰離子表面 活性劑(SDS)，其能夠使PDGF保持溶解。遺憾地，SDS也引發(fā)蛋白 質(zhì)的部分變性，造成生物活性的損失。這種解決方案因此對(duì)于蛋白質(zhì) 的穩(wěn)定化并不令人滿意。
在專利WO93/08825中，發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，純化的PDGF在以局部 施用的凝膠形式配制時(shí)具有極大的不穩(wěn)定性。作為例子，他們舉出 PDGF與某些傳統(tǒng)用于配制藥品的產(chǎn)品如曱基纖維素或羥丙基纖維素 以及某些傳統(tǒng)防腐劑如節(jié)基醇的不相容性。作者通過(guò)解釋需要在具有 良好長(zhǎng)期穩(wěn)定性的同時(shí)配制局部施用的凝膠形式PDGF來(lái)提出此問 題。相同的作者表示，溶解的PDGF由于在中性pH值下的脫酰胺作用 而降解且蛋白質(zhì)在微酸性pH值下更穩(wěn)定。該作者表示，通過(guò)結(jié)合幾
ii種參數(shù)-沒有與蛋白質(zhì)表現(xiàn)出任何相互作用的聚合物、能夠限制脫
酰胺反應(yīng)的在微酸性pH值下的緩沖劑和對(duì)于蛋白質(zhì)為中性的防腐 劑，從而可以配制PDGF以獲得從制藥角度來(lái)看穩(wěn)定的制劑。
該作者表示，通過(guò)加入沒有與蛋白質(zhì)表現(xiàn)出任何相互作用的聚合 物可以獲得儲(chǔ)存穩(wěn)定的制劑，只要該制劑保持在微酸性pH值下以避 免通過(guò)脫酰胺作用使蛋白質(zhì)降解的反應(yīng)。但是，這一解決方案并不令 人滿意，因?yàn)槠洳荒鼙Ｗo(hù)生長(zhǎng)因子避免在生理pH值下的體內(nèi)蛋白水
在專利WO 97/12601中描述了凝膠形式的PDGF制劑，作者解釋 到，他們使用的纖維素衍生物能夠使生長(zhǎng)因子穩(wěn)定化以避免儲(chǔ)存過(guò)程 中可能的活性損失。為此，他們使用之前在美國(guó)專利4， 717， 717中對(duì) EGF獲得的結(jié)果作為基礎(chǔ)。但是，他們還解釋到，通過(guò)在制劑中加入 帶電化學(xué)物質(zhì)如帶電氨基酸或金屬離子，可以極大改進(jìn)含有PDGF的 纖維素凝膠的穩(wěn)定性。在此，該解決方案能夠使制劑中的生長(zhǎng)因子在 產(chǎn)品儲(chǔ)存過(guò)程中穩(wěn)定化，但不能使這些生長(zhǎng)因子在生理pH值下對(duì)慢 性傷口中存在的蛋白酶穩(wěn)定化。
因此在穩(wěn)定化和保護(hù)生長(zhǎng)因子(特別是PDGF)方面存在治療優(yōu) 點(diǎn)，從而提高其在慢性傷口治療，更特別是糖尿病足部潰瘍傷口治療 中的效力。本發(fā)明因此涉及通過(guò)開發(fā)出兩親聚合物與PDGF之間的復(fù) 合物，從而在體外和體內(nèi)在生理pH值下可能發(fā)生的化學(xué)或物理降解 方面使PDGF穩(wěn)定化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明因此涉及兩親聚合物與PDGF之間的復(fù)合物(兩親聚合物 -PDGF)的形成，這種復(fù)合物為蛋白質(zhì)提供了對(duì)于在體外和體內(nèi)在生 理pH值下在降解方面的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。
本發(fā)明因此涉及水溶性的物理和化學(xué)穩(wěn)定的兩親聚合物-PDGF 復(fù)合物，其特征在于
-該兩親聚合物根據(jù)下列通式由用疏水取代基和親水基團(tuán)官能 化的親水聚合物骨架構(gòu)成<formula>formula see original document page 13</formula>
DP = m個(gè)單體單元 .R、 R，是鍵或包含1至18個(gè)碳的鏈，任選地支化和/或不飽 和，包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，例如O、 N和/或S， R和R，彼此相同或不同 F、 F，是酯、疏酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、 胺、F和F，彼此相同或不同 X是親水基團(tuán)，其可以是° 羧酸根 ° 硫酸根 ° 磺酸根 。 磷酸根 ° 膦酸根 Y是親水基團(tuán)，其可以是。 硫酸根 ° 磺酸根 ° 磷酸根 ° 膦酸根 Hy是疏水基團(tuán)，其可以是。"至"直鏈或支化烷基，任選不飽和和/或含有一個(gè)或多個(gè)雜原子，例如0、 N或S， ° Cs至Cu直鏈或支化烷基芳基或芳基烷基，任選不飽和和/或任選含有雜原子， 。Cs至C3。多環(huán)，任選不飽和。n和o為1至3，h代表疏水單元相對(duì)于單體單元的摩爾分?jǐn)?shù)，其為0.01至0.5， x代表親水基團(tuán)相對(duì)于單體單元的摩爾分?jǐn)?shù)，其為0至2.0， y代表親水基團(tuán)相對(duì)于單體單元的摩爾分?jǐn)?shù)，其為Q至O. 5。 - PDGF從PDGF類(血小板源生長(zhǎng)因子類)的組中選擇。 本發(fā)明涉及一種復(fù)合物，其特征在于PDGF從由含有兩個(gè)B鏈的 人重組PDGF類(rhPDGF-BB)構(gòu)成的組中選擇。本發(fā)明涉及一種復(fù)合物，其特征在于PDGF是PDGF-BB。 兩親聚合物的取代基以受控或無(wú)規(guī)的方式分布。在具有取代基受 控分布的聚合物中，可以提到例如嵌段共聚物和交替共聚物。單體 一 單體——單體 一 單體 一*I疏水單體——單體——單體 一 單體 一* I疏水 ，單體——單體——單體 一…單體——*I I 疏水 疏水因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種兩親聚合物-PDGF 復(fù)合物，其特征在于該聚合物選自其取代基無(wú)規(guī)分布的聚合物。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種兩親聚合物-PDGF復(fù)合 物，其特征在于兩親聚合物選自聚氨基酸。在一種實(shí)施方案中，聚氨基酸選自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。在一種實(shí)施方案中，聚氨基酸是均聚谷氨酸。無(wú)規(guī)共聚物單體'一 單體疏水 疏水嵌段共聚物 單體 一 單體I I疏水 疏水交替共聚物一單體 一 單體 I疏水在一種實(shí)施方案中，聚氨基酸是均聚天冬氨酸。在一種實(shí)施方案中，聚氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸的共聚物。這 些共聚物是嵌段共聚物或無(wú)規(guī)共聚物。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種兩親聚合物-PDGF復(fù)合物，其特征在于該聚合物選自多糖。在一種實(shí)施方案中，多糖從由乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronanes )、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖、聚半乳糖醛酸(galacturonanes)、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素構(gòu)成的組中選擇。纖維素的組由用酸官能化的纖維素如羧曱基纖維素構(gòu)成。 葡聚糖的組由用酸官能化的葡聚糖如羧曱基葡聚糖構(gòu)成。 在一種實(shí)施方案中，多糖是與下式(I)對(duì)應(yīng)的可溶性葡聚糖的衍生物DMCaBbSu。
( I)其中- D代表多糖鏈，優(yōu)選由糖苷單元的鏈狀連接(enchainements) 構(gòu)成，- MC代表甲基羧基基團(tuán)，-B代表N-節(jié)基亞甲基甲酰胺(carboxamide)基團(tuán)，- Su代表硫酸根基團(tuán)(糖苷單元所帶的游離羥基官能團(tuán)的硫酸 化(sulfatation))，-a、 b和c分別代表基團(tuán)MC、 B和Su的取代程度(ds )，其中i) a嚴(yán)格大于0;ii) b為 要么b大于或等于0. 3且c為0. 1至0. 5; 要么b嚴(yán)格小于0. 3且c符合下式(1): c>8. 5b2-5. 41b+0. 86 (1)。 式(I)的這些葡聚糖衍生物及其制備方法更一般性地描述在專 利申請(qǐng)W099/29734中。式(I)的這些葡聚糖衍生物俗稱DMCBSu并 且被視為由R-0H和R-OX子單元構(gòu)成的共聚物，X可以是甲基羧基基團(tuán)(MC)、節(jié)基酰胺(B)或硫酸根(Su)基團(tuán)。因此，甲基羧基基 團(tuán)的取代程度(ds)為0. 6的甲基羧基葡聚糖(DMC)每個(gè)糖苷單元 含有0. 6個(gè)被取代的基團(tuán)(R-MC )和2. 4個(gè)羥基基團(tuán)(R-OH )。在一種實(shí)施方案中，D具有1000至2 000 000 Da的摩爾質(zhì)量， 并且在一種實(shí)施方案中，小于70 000 Da。在一種實(shí)施方案中，葡聚糖的衍生物選自其中b大于或等于0. 35 的式(I)化合物。在此情況下，并且根據(jù)一種實(shí)施方案，葡聚糖的衍生物選自其中 a為0. 5至0. 8且c為0. 1至0. 5的式(I )化合物。在一種實(shí)施方案中，多糖從由乙酰透明質(zhì)酸、藻酸鹽、脫乙酰殼 多糖構(gòu)成的組中選擇。這些不同的多糖可以如下表示R-H，葡聚糖R-CH2COOH或H，羧甲基葡聚糖該多糖可以具有IO至IO 000的平均聚合程度m。 在一種實(shí)施方案中，其具有10至5000的平均聚合程度m。 在另一實(shí)施方案中，其具有10至500的平均聚合程度m。 在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種兩親聚合物-PDGF復(fù)合
物，其特征在于疏水基團(tuán)Hy從由脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、千胺、
膽固醇衍生物和酚的組中選擇。
在一種實(shí)施方案中，膽固醇衍生物是膽酸。 在另一實(shí)施方案中，酚是cx-生育酚。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物是可逆的。
所用聚合物根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)合成，或者購(gòu)自例 如Sigma-Aldrich， NOF Corp.或CarboMer Inc.的供應(yīng)商。
PDGF選自根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)獲得的或者購(gòu)自如 Gentaur公司(USA)或Research Diagnostic Inc. (USA)的供應(yīng) 商的人重組PDGF。
化學(xué)和物理的同時(shí)穩(wěn)定性的驗(yàn)證尤其可以通過(guò)實(shí)施下列試驗(yàn)來(lái) 進(jìn)行
通過(guò)凝膠電泳(凝膠遷移率變動(dòng)分析(Gel Mobility Shift Assay))進(jìn)行的驗(yàn)證本發(fā)明兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的試驗(yàn)；
通過(guò)與蛋白酶接觸進(jìn)行的本發(fā)明兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的酶促降解減緩的試驗(yàn)；
.通過(guò)SDS-Page進(jìn)行的本發(fā)明兩親聚合物-PDGF復(fù)合物在生理 pH值下的物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)。
本發(fā)明還涉及一種兩親聚合物-PDGF復(fù)合物，其特征在于其滿足 驗(yàn)證化學(xué)和物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)，即對(duì)復(fù)合物的驗(yàn)證試驗(yàn)(凝膠遷移率 變動(dòng)分析)、通過(guò)與蛋白酶接觸進(jìn)行的酶促降解減緩的試驗(yàn)以及通過(guò) SDS-Page進(jìn)行的在生理pH值下的物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)。
通過(guò)凝膠遷移率變動(dòng)分析進(jìn)行的復(fù)合物驗(yàn)證試驗(yàn)基于離子在電 場(chǎng)作用下的位移。陰離子復(fù)合物向陽(yáng)極遷移，而陽(yáng)離子復(fù)合物向陰極 位移。在遷移后，通過(guò)毛細(xì)作用使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并借助該
蛋白質(zhì)的特異性抗體揭示，該特異性抗體由與過(guò)氧化物酶偶合的二抗 來(lái)識(shí)別。單獨(dú)的蛋白質(zhì)極少或完全不遷移，與兩親聚合物復(fù)合的蛋白 質(zhì)向陽(yáng)極或陰極遷移，這取決于復(fù)合物的總電荷。
酶促降解減緩的試驗(yàn)基于本發(fā)明的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物與 蛋白酶接觸后的蛋白質(zhì)完整性的檢驗(yàn)。將蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶等)的溶液添加到復(fù)合物溶液中并實(shí)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)。通過(guò)添加該酶 的特異性抑制劑。引咪、節(jié)脒)來(lái)停止反應(yīng)。然后通過(guò)聚丙烯酰胺凝 膠電泳(SDS-Page)分析蛋白質(zhì)的完整性。
PDGF的物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)基于通過(guò)比較本發(fā)明的兩親聚合物 -PDGF復(fù)合物溶液與單獨(dú)的PDGF的溶液在pH 7. 4下的溶液中蛋白質(zhì) 濃度來(lái)進(jìn)行的蛋白質(zhì)完整性的檢驗(yàn)。將這兩種溶液在搖振臺(tái)上在環(huán)境 溫度下放置48小時(shí)，然后離心處理。通過(guò)SDS-Page評(píng)測(cè)每種溶液中 的PDGF濃度。
在不使用任何可使蛋白質(zhì)變性的有機(jī)溶劑的情況下，通過(guò)在生理 pH值下制成PDGF和兩親聚合物的水溶液來(lái)形成本發(fā)明的兩親聚合物 -PDGF復(fù)合物。兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的形成是自發(fā)的并且不涉及 PDGF與兩親聚合物之間的任何共價(jià)鍵。這種結(jié)合經(jīng)由基本上是疏水 相互作用和離子相互作用的弱鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的方法，其特征在于使PDGF和兩親聚合物在生理pH值下在溶液中接觸?？梢越⑵渌囼?yàn)以完成對(duì)本發(fā)明兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的 形成的驗(yàn)證 通過(guò)圓振二向色性測(cè)定的PDGF三級(jí)結(jié)構(gòu)的保持試驗(yàn)； .本發(fā)明的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物中的PDGF在生理pH值下在 應(yīng)力下的穩(wěn)定性試驗(yàn)。該應(yīng)力可以是特定攪拌方式、鹽的存在等。本發(fā)明還涉及一種兩親聚合物-PDGF復(fù)合物，其特征在于PDGF/ 兩親聚合物比率為1/5至1/5000。在一種實(shí)施方案中，其為1/100至1/5000。 在另一實(shí)施方案中，其為1/300至1/700。本發(fā)明還涉及一種治療性組合物，其特征在于其包含本發(fā)明的兩 親聚合物-PDGF復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"治療性組合物"是指可用在人藥或獸藥中的組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為局部施用的組合物，其可呈現(xiàn)為凝 膠、乳骨、噴霧劑、糊料或貼劑的形式?？梢耘c本發(fā)明的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物一起配制的賦形劑的 種類根據(jù)草本學(xué)家(gal6nist)的一般知識(shí)隨其呈現(xiàn)形式來(lái)選擇。因而，當(dāng)本發(fā)明的組合物是凝膠形式時(shí)，其例如是由聚合物如羧 甲基纖維素(CMC)、乙烯基聚合物、PEO-PPO型共聚物、多糖、PEO、 丙烯酰胺或丙烯酰胺衍生物獲得的凝膠?？梢栽诒景l(fā)明中使用其它賦形劑來(lái)調(diào)節(jié)配制劑的參數(shù)，例如用于 調(diào)節(jié)pH值的緩沖劑，用于調(diào)節(jié)等滲性的試劑，防腐劑如對(duì)羥基苯曱 酸曱酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，間曱酚或苯酚，或者抗氧化劑如鹽酸 L-賴氨酸。根據(jù)本發(fā)明，該治療性組合物的特征在于，其能夠以大約100 微克/毫升的PDGF施用。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物用于制備通過(guò) 局部途徑治療潰瘍用的具有愈合作用的治療性組合物的用途。本發(fā)明還涉及人用或獸用治療方法，其特征在于其包括在治療位置施用包含本發(fā)明的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的治療性組合物。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例實(shí)施例1: PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物 用節(jié)胺改性的疏酸化羧甲基葡聚糖(DMCBSu)的合成該兩親聚合物由每個(gè)糖單元的羧甲基取代程度為l.O且平均摩 爾質(zhì)量為40 GOO克/摩爾的羧甲基葡聚糖合成。根據(jù)傳統(tǒng)偶聯(lián)方法在 水中在水溶性碳化二亞胺存在下將節(jié)胺接枝到這種聚合物的酸上。每 個(gè)糖單元的千胺取代程度通過(guò)卞NMR測(cè)定為0.4。然后用S07吡啶復(fù) 合物將該聚合物硫酸化。每個(gè)糖單元的硫酸根取代程度為0. 3。PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物的制備將10微升的0. 1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50 毫克/毫升DMCBSu溶液中。將PDGF-BB和DMCBSu溶液在pH7. 4和300 mOsm下緩沖。將該溶液在環(huán)境溫度下溫和攪拌2小時(shí)，然后儲(chǔ)存在4 。C下。PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物的形成的驗(yàn)證將10微升上述PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物溶液加載到瓊脂糖凝膠 上?；衔锏倪w移在電場(chǎng)(200mA-4小時(shí))作用下進(jìn)行。在遷移后， 將PDGF-BB轉(zhuǎn)移到PVDF膜上過(guò)夜，然后通過(guò)用山羊抗-PDGF-BB抗體 的免疫印跡法來(lái)揭示，在該抗體上固定有偶聯(lián)到HRP過(guò)氧化物酶上的 抗-山羊IgG 二抗，該HRP過(guò)氧化物酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲味 基磷酸酯/硝基藍(lán)四氮唑)來(lái)揭示。PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物向陽(yáng)極遷移。其負(fù)電荷可以通過(guò)其組成 中的DMCBSu比PDGF-BB多得多的事實(shí)來(lái)解釋。僅由PDGF-BB構(gòu)成的 對(duì)照物不遷移。PDGF/DMCBSu復(fù)合物的溶液的穩(wěn)定性的驗(yàn)證將pH值為7.4的IO微升的0. 01毫克/毫升PDGF-BB溶液和上述 pH值為7. 4的10微升PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物溶液在搖振臺(tái)上在環(huán) 境溫度下放置48小時(shí)。在離心后，通過(guò)SDS-Page評(píng)測(cè)每種溶液中的 PDGF-BB濃度。其表明，在PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物的情況下溶解的 PDGF-BB的濃度不變，而單獨(dú)的PDGF-BB的溶液的該濃度降低。在該P(yáng)DGF-BB/DMCBSu復(fù)合物中針對(duì)胰蛋白酶的PDGF-BB保護(hù)的驗(yàn)證 將10微升上述BMP-2/DMCTrpOMe復(fù)合物溶液倒入37'C的90微升的10納克/毫升胰蛋白酶溶液中。每30分鐘提取IO微升樣品，并在通過(guò)添加10微升的10微克/毫升吲哚溶液來(lái)停止酶促反應(yīng)后通過(guò)E1 i s a測(cè)量PDGF-BB的濃度。 這些動(dòng)力學(xué)表明，單獨(dú)的PDGF-BB在1小時(shí)30分鐘內(nèi)完全降解，而這不是PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物的情況。PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物的生物活性的檢驗(yàn)在37。C的溫度下在含有10%胎牛血清(SVF)和1%青霉素-鏈霉 素的aMEM培養(yǎng)基中在濕度飽和并富含C02 (5%)的氣氛中實(shí)現(xiàn)人皮 膚成纖維細(xì)胞(人皮膚成纖維細(xì)胞-成人(HDFa))的原代培養(yǎng)。該 培養(yǎng)基每4天更新。然后實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)基中的稀釋以便對(duì) 96孔板(Nunc公司)以5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種培養(yǎng)皿。對(duì)于每一批細(xì)胞，通過(guò)引入氚化的胸腺嘧咬核苷(在IOO微升中 5000個(gè)細(xì)胞/孔)，檢驗(yàn)借助各種濃度的復(fù)合物的PDGF-BB穩(wěn)定化作 用。在提取24小時(shí)后，通過(guò)在不存在或存在濃度為l微克/毫升的兩 親聚合物的情況下添加0. 1至100納克/毫升的各種濃度下的PDGF-B 來(lái)刺激成纖維細(xì)胞。在存在或不存在該復(fù)合物的情況下用PDGF-BB 刺激后18小時(shí)，通過(guò)添加50jLiCi/ml,即0. 5pCi/孔的溶液來(lái)進(jìn)行 氚化的胸腺嘧啶核苷的引入。在計(jì)數(shù)瓶中恢復(fù)放射性，用100微升的 100mM NaOH漂洗孔，并在加入l毫升閃爍流體(Zinsser Analytic ) 后在自動(dòng)計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)放射性。所得結(jié)果表示在附

圖1中，其中通過(guò)成纖維細(xì)胞引入的氚化的胸腺嘧啶核苷的量(Dpmx103)作為以微克/毫升(ng/ml)計(jì)的PDGF-BB 濃度的函數(shù)表示。實(shí)線曲線代表本發(fā)明復(fù)合物在1微克/毫升葡聚糖衍生物濃度下 的結(jié)果，虛線曲線代表不存在葡聚糖衍生物時(shí)的結(jié)果。ED50對(duì)應(yīng)于用于實(shí)現(xiàn)50%人成纖維細(xì)胞增殖的PDGF-BB濃度。比 率R是如下計(jì)算的ED50值的比率R-ED50 (PDGF-BB) / ED50 ( PDGF-BB +匿BSu )這些結(jié)果表明，當(dāng)單獨(dú)使用PDGF-BB時(shí)，必須使用6微克/毫升 以獲得50%增殖，而在PDGF-BB與式(I)的葡聚糖衍生物復(fù)合時(shí)，2 微克/毫升就足以獲得50%增殖。在這種情況下，比率R等于3。實(shí)施例2: PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物用色氨酸曱酯改性的羧曱基葡聚糖(DMCTrpOMe)的合成該兩親聚合物由每個(gè)糖單元的羧甲基取代程度為l.O且平均摩 爾質(zhì)量為40 000克/摩爾的羧曱基葡聚糖合成。根據(jù)傳統(tǒng)偶聯(lián)方法在 水中在水溶性碳化二亞胺存在下將色氨酸甲酯接枝到這種聚合物的酸上。每個(gè)糖單元的色氨酸取代程度通過(guò)111 NMR測(cè)定為0.3。PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物的制備將10微升的0. 1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50 毫克/亳升DMCTrpOMe溶液中。將PDGF-BB和DMCTrpOMe溶液在pH 7. 4 和300 mOsm下緩沖。將該溶液在環(huán)境溫度下溫和攪拌2小時(shí)，然后 儲(chǔ)存在4'C下。PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物的形成的驗(yàn)證將10微升上述PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物溶液加載到瓊脂糖凝 膠上以便進(jìn)行利用免疫印跡法的凝膠電泳?；衔镌陔妶?chǎng)(200 mA-4 小時(shí))作用下遷移。在遷移后，將PDGF-BB轉(zhuǎn)移到PVDF膜上過(guò)夜，然后通過(guò)用山羊抗-PDGF-BB抗體的免疫印跡來(lái)揭示，在該抗體上固 定有偶聯(lián)到過(guò)氧化物酶上的抗-山羊IgG二抗，該過(guò)氧化物酶借助底 物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍(lán)四氮唑)來(lái)揭示。PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物向陽(yáng)極遷移。其負(fù)電荷可以通過(guò)其組 成中的DMCTrpOMe比PDGF-BB多得多的事實(shí)來(lái)解釋。僅由PDGF-BB 構(gòu)成的對(duì)照物不遷移。PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物的穩(wěn)定性的驗(yàn)證將pH值為7. 4的IO微升的0. 01毫克/毫升PDGF-BB溶液和上述 pH值為7. 4的IO微升PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物溶液在搖振臺(tái)上在 環(huán)境溫度下》文置48小時(shí)。通過(guò)SDS-Page評(píng)測(cè)每種溶液中PDGF-BB 的濃度。其表明，在PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物的情況下溶液中 PDGF-BB的濃度不變，而單獨(dú)的PDGF-BB的溶液的該濃度降低。在該P(yáng)DGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物中針對(duì)胰蛋白酶的PDGF-BB保護(hù)的驗(yàn) 證將10微升上述PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物溶液用37'C的90微 升的10納克/毫升胰蛋白酶溶液培養(yǎng)。每30分鐘提取IO微升樣品， 并在通過(guò)添加IO微升的10微克/毫升丐|咮溶液來(lái)停止酶促反應(yīng)后通 過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Page)評(píng)測(cè)PDGF-BB的結(jié)構(gòu)完整性。這些動(dòng)力學(xué)表明，單獨(dú)的PDGF-BB在1小時(shí)30分鐘內(nèi)完全降解， 而這不是PDGF-BB/DMCTrpOMe復(fù)合物的情況。實(shí)施例3: PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物 用節(jié)胺改性的硫酸化羧曱基纖維素(CMCBSu)的合成該兩親聚合物由每個(gè)糖單元的羧曱基取代程度為1.2且平均摩 爾質(zhì)量為30 000克/摩爾的羧甲基纖維素合成。根據(jù)傳統(tǒng)偶聯(lián)方法在 水中在水溶性碳化二亞胺存在下將節(jié)胺接枝到這種聚合物的酸上。每 個(gè)糖單元的千胺取代程度通過(guò)醒R測(cè)定為0. 2。在SO廣吡啶復(fù)合物23存在下進(jìn)行疏酸化，硫酸根取代程度為0. 30。PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物的制備將10微升的0. 1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50 毫克/毫升CMCB溶液中。將PDGF-BB和CMCBSu溶液在pH 7. 4和300 mOsm下緩沖。將該溶液在環(huán)境溫度下溫和攪拌2小時(shí)，然后儲(chǔ)存在4 。C下。PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物的形成的驗(yàn)證將10微升上述PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物溶液加載到瓊脂糖凝膠上 以便進(jìn)行利用免疫印跡法的凝膠電泳?；衔镌陔妶?chǎng)(200 mA-4小 時(shí))作用下遷移。在遷移后，將PDGF-BB轉(zhuǎn)移到PVDF膜上過(guò)夜，然 后通過(guò)用山羊抗-PDGF-BB抗體的免疫印跡法來(lái)揭示，在該抗體上固 定有偶聯(lián)到HRP過(guò)氧化物酶上的抗-山羊IgG 二抗，該HRP過(guò)氧化物 酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍(lán)四氮唑)來(lái)揭示。PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物向陽(yáng)極遷移。這種負(fù)電荷可以通過(guò)其組 成中的CMCBSu比PDGF-BB多得多的事實(shí)來(lái)解釋。僅由PDGF-BB構(gòu)成 的對(duì)照物不遷移。PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物的穩(wěn)定性的驗(yàn)證將pH值為7.4的IO微升的0. 01毫克/毫升PDGF-BB溶液和上述 pH值為7. 4的10微升PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物溶液在搖振臺(tái)上在環(huán) 境溫度下放置48小時(shí)。通過(guò)SDS-Page評(píng)測(cè)每種溶液中PDGF-BB的濃 度。其表明，在PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物的情況下溶液中PDGF-BB的 濃度不變，而單獨(dú)的PDGF-BB的溶液的該濃度降低。在該P(yáng)DGF-BB/CMCBSu復(fù)合物中針對(duì)胰蛋白酶的PDGF-BB保護(hù)的驗(yàn)證 將10微升上述PDGF-BB/CMCBSu復(fù)合物溶液用37C的90微升的 10納克/亳升胰蛋白酶溶液培養(yǎng)。每30分鐘提取IO微升樣品，并在通過(guò)添加IO微升的10微克/毫升吲咮溶液來(lái)停止酶促反應(yīng)后通過(guò)聚 丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Page)評(píng)測(cè)PDGF-BB的結(jié)構(gòu)完整性。這些動(dòng)力學(xué)表明，單獨(dú)的PDGF-BB在1小時(shí)30分鐘內(nèi)完全降解， 而這不是PDGF-BB/DMCBSu復(fù)合物的情況。對(duì)比例1: PDGF-BB/CMCB復(fù)合物 用節(jié)胺改性的羧甲基纖維素(CMCB)的合成該兩親聚合物由每個(gè)糖單元的羧曱基取代程度為1.2且平均摩 爾質(zhì)量為30 000克/摩爾的羧甲基纖維素合成。根據(jù)傳統(tǒng)偶聯(lián)方法在 水中在水溶性碳化二亞胺存在下將節(jié)胺接枝到這種聚合物的酸上。每 個(gè)糖單元的千胺取代程度通過(guò)'H NMR測(cè)定為0.2。PDGF-BB/CMCB復(fù)合物的制備將10微升的0. 1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50 毫克/毫升CMCB溶液中。將PDGF-BB和CMCB溶液在pH 7. 4和300 mOsm 下緩沖。將該溶液在環(huán)境溫度下溫和攪拌2小時(shí)，然后儲(chǔ)存在4'C下。PDGF-BB/CMCB復(fù)合物的未形成的驗(yàn)證將10微升上述PDGF-BB/CMCB復(fù)合物溶液加載到瓊脂糖凝膠上以 便進(jìn)行利用免疫印跡法揭示的凝膠電泳?；衔镌陔妶?chǎng)(200mA-4小 時(shí))作用下遷移。在遷移后，將PDGF-BB轉(zhuǎn)移到PVDF膜上過(guò)夜，然 后通過(guò)用山羊抗-PDGF-BB抗體的免疫印跡法來(lái)揭示，在該抗體上固 定有偶聯(lián)到HRP過(guò)氧化物酶上的抗-山羊IgG 二抗，該HRP過(guò)氧化物 酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍(lán)四氮唑)來(lái)揭示。該揭示沒有顯示出單獨(dú)同兩親聚合物的PDGF-BB的任何遷移。在 CMCB與PDGF-BB之間沒有形成復(fù)合物。
權(quán)利要求
1.水溶性的物理和化學(xué)穩(wěn)定的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物，其特征在于-該兩親聚合物根據(jù)下列通式由用疏水取代基和親水基團(tuán)官能化的親水聚合物骨架構(gòu)成DP＝m個(gè)單體單元·R、R’是鍵或包含1至18個(gè)碳的鏈，任選地支化和/或不飽和，包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，例如O、N和/或S，R和R’彼此相同或不同·F、F’是酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、胺，F(xiàn)和F’彼此相同或不同·X是親水基團(tuán)，其可以是ο羧酸根ο硫酸根ο磺酸根ο磷酸根ο膦酸根·Y是親水基團(tuán)，其可以是ο硫酸根ο磺酸根ο磷酸根ο膦酸根·Hy是疏水基團(tuán)，其可以是οC8至C30直鏈或支化烷基，任選不飽和和/或含有一個(gè)或多個(gè)雜原子，例如O、N或S，οC8至C18直鏈或支化烷基芳基或芳基烷基，任選不飽和和/或任選含有雜原子，οC8至C30多環(huán)，任選不飽和；n和o為1至3，h代表疏水單元相對(duì)于單體單元的摩爾分?jǐn)?shù)，其為0.01至0.5，x代表親水基團(tuán)相對(duì)于單體單元的摩爾分?jǐn)?shù)，其為0至2.0，y代表親水基團(tuán)相對(duì)于單體單元的摩爾分?jǐn)?shù)，其為0至0.5；-PDGF從PDGF類(血小板源生長(zhǎng)因子類)的組中選擇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其特征在于PDGF從由含有兩個(gè)B 鏈的人重組PDGF類(rhPDGF-BB)構(gòu)成的組中選擇。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于聚合物選自取 代基無(wú)規(guī)分布的聚合物。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于兩親聚合物選 自聚氨基酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的復(fù)合物，其特征在于聚氨基酸選自聚谷氨酸 或聚天冬氨酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的復(fù)合物，其特征在于聚氨基酸是均聚谷氨酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的復(fù)合物，其特征在于聚氨基酸是均聚天冬氨酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的復(fù)合物，其特征在于聚氨基酸是天冬氨酸和 谷氨酸的共聚物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的復(fù)合物，其特征在于該聚合物選自 多糖。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的復(fù)合物，其特征在于多糖從由乙酰透明質(zhì) 酸、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖、聚半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、 纖維素構(gòu)成的組中選擇。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的復(fù)合物，其特征在于纖維素的組由用酸官能化的纖維素如羧甲基纖維素構(gòu)成。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10的復(fù)合物，其特征在于葡聚糖的組由用酸官能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖構(gòu)成。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9的復(fù)合物，其特征在于多糖從由乙酰透明質(zhì) 酸、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖構(gòu)成的組中選擇。
14. 根椐權(quán)利要求9的復(fù)合物，其特征在于多糖從由與下式(I) 對(duì)應(yīng)的可溶性葡聚糖的衍生物所構(gòu)成的組中選擇DMCaBbSiic ( I )其中-D代表多糖鏈，優(yōu)選由糖苷單元的鏈狀連接構(gòu)成，-MC代表甲基羧基基團(tuán)，-B代表N-節(jié)基亞曱基曱酰胺基團(tuán)，-Su代表硫酸根基團(tuán)(糖苷單元所帶的游離羥基官能團(tuán)的硫酸 化)，-a、 b和c分別代表基團(tuán)MC、 B和Su的取代程度(ds),其中i) a嚴(yán)格大于0;ii) b為 要么b大于或等于0. 3且c為0. 1至0. 5; '要么b嚴(yán)格小于0. 3且c符合下式(1): c>8. 5b2-5. 41b+0.86 (1)。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于疏水基團(tuán)Hy 從由脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、節(jié)胺、膽固醇衍生物和酚構(gòu)成的組中 選擇。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于兩親聚合物 -PDGF復(fù)合物的形成是可逆的。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于其滿足驗(yàn)證 化學(xué)和物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的復(fù)合物，其特征在于驗(yàn)證化學(xué)和物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)選自復(fù)合物的驗(yàn)證試驗(yàn)(凝膠遷移率變動(dòng)分析)、通過(guò)與 蛋白酶接觸進(jìn)行的酶促降解減緩的試驗(yàn)以及通過(guò)SDS-Page進(jìn)行的在生理pH值下的物理穩(wěn)定性的試驗(yàn)。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于PDGF/兩親聚 合物比率為1/5至1/5000。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于PDGF/兩親聚 合物比率為1/100至1/5000。
21. 根據(jù)前迷權(quán)利要求任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于PDGF/兩親聚 合物比率為1/300至1/700。
22. 制備根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的方法，其特征在于在含水介質(zhì)中在不存在可使蛋白質(zhì)變性的有機(jī)溶劑 的情況下制備這種聚合物/PDGF-BB復(fù)合物。
23. 治療用組合物，其特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求1至22任一 項(xiàng)的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20的治療用組合物，其特征在于其能夠以100 微克/毫升的PDGF施用。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物用于 制備通過(guò)局部途徑治療潰瘍用的具有愈合作用的治療性組合物的用 途。
26. 人用或獸用治療方法，其特征在于其包括在治療位置施用包 含根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的兩親聚合物-PDGF復(fù)合物的治療性組合 物。
全文摘要
本發(fā)明涉及與兩親聚合物結(jié)合的血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)的新型復(fù)合物，其可以改善用于藥物應(yīng)用的治療性蛋白質(zhì)的體外和體內(nèi)物理和化學(xué)穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及制備PDGF-兩親聚合物復(fù)合物的方法，其特征在于在含水介質(zhì)中和在不存在可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的有機(jī)溶劑的情況下制備這種聚合物/PDGF-BB復(fù)合物并涉及所述兩親聚合物-PDGF復(fù)合物用于制備通過(guò)局部途徑治療潰瘍用的具有愈合作用的治療性組合物的用途。
文檔編號(hào)A61K47/36GK101316607SQ200680044233
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月26日
發(fā)明者D·迪拉謝爾, G·蘇拉, G·迪布勒克, J·科雷亞, L·達(dá)里-科雷亞, O·蘇拉, R·蘇拉 申請(qǐng)人:阿道恰公司