專利名稱：：肉毒梭菌神經(jīng)毒素復(fù)合物的穩(wěn)定化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經(jīng)毒素的藥物組合物和穩(wěn)定它的方法。特別地，本發(fā)明涉及包括肉毒梭菌(C.botulinum)A型和環(huán)糊精的穩(wěn)定化的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：由厭氧菌肉毒梭菌生產(chǎn)肉毒桿菌神經(jīng)毒素。用不同芽孢桿菌屬(bacillus)菌林生產(chǎn)稱作A-G血清型的7種相關(guān)蛋白神經(jīng)毒素。肉毒桿菌神經(jīng)毒素的7種血清型各自為大蛋白質(zhì)，它們具有約150kDa的分子量和通過(guò)至少一個(gè)二硫鍵偶聯(lián)的lOOkDa的氨基酸殘基重鏈和50kDa的氨基酸殘基輕鏈。通過(guò)阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在神經(jīng)肌肉連接處釋放導(dǎo)致肉毒中毒疾病的肉毒梭菌神經(jīng)毒素為目前已知對(duì)人類的最具有毒性的蛋白質(zhì)。食物傳播的肉毒中度因消耗不適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存食物所致，其中厭氧肉毒梭菌生長(zhǎng)并且釋放毒素。在其它形式的肉毒中毒中，肉毒梭菌還產(chǎn)生導(dǎo)致毒素產(chǎn)生的神經(jīng)毒素。例如，在肉毒梭菌孢子導(dǎo)入開放皮膚損害時(shí)產(chǎn)生傷口型肉毒中毒。在傷口中定居后發(fā)生肉毒桿菌毒素釋放。類似地，嬰兒型肉毒中毒因消耗肉毒梭菌孢子，隨后在腸中定居和毒素產(chǎn)生所致。盡管已知肉毒桿菌神經(jīng)毒素為公知對(duì)人最具有致命性的天然毒素，但是這些致命性毒物已經(jīng)作為藥物用于具有許多適應(yīng)征的醫(yī)學(xué)群體中。在這方面，肉毒桿菌神經(jīng)毒素一直用于治療斜視，且目前認(rèn)為局部注射肉毒桿菌神經(jīng)毒素為用于許多神經(jīng)和非神經(jīng)疾病的安全且有效的治療手段。近來(lái)已經(jīng)觀察到肉毒桿菌神經(jīng)毒素用作胃腸道疾病的治療手段。肉毒桿菌神經(jīng)毒素不僅有效地阻斷骨骼神經(jīng)肌肉傳遞，而且阻斷自主神經(jīng)系統(tǒng)中的膽堿能神經(jīng)末梢。首先基于體外觀察結(jié)果提示了抑制胃腸道平滑肌收縮的能力且隨后在體內(nèi)得以證實(shí)，還證實(shí)肉毒桿菌神經(jīng)毒素不會(huì)阻斷由一氧化氮介導(dǎo)的非腎上腺素能非膽堿能反應(yīng)。這進(jìn)一步促進(jìn)了對(duì)使用肉毒桿菌神經(jīng)毒素作為平滑肌和括約肌活動(dòng)過(guò)度的興趣，諸如食道下端括約肌，以便治療食管失弛癥，或肛門內(nèi)括約肌，以便治療肛門裂縫。包含肉毒桿菌毒素的商購(gòu)藥物組合物在如下商標(biāo)下銷售，包括BOTOX(Allergan，Inc.IrvineCA.),Dysport(IpsenLtd.Berkshire,U.K.)和Myobloc(ElanCorp.DublinIreland)。一般而言，該藥物組合物作為必須在實(shí)際應(yīng)用前用稀釋劑再構(gòu)建的真空干燥形式銷售。使用商購(gòu)肉毒桿菌毒素制劑的一個(gè)主要缺陷在于該組合物的貯存期限極短。在這方面，應(yīng)在再溶解后約4小時(shí)內(nèi)給予實(shí)際應(yīng)用的藥物組合物，因?yàn)槿舛緱U菌毒素對(duì)因表面變性，加熱和堿性條件造成的變性極為敏感。肉毒桿菌神經(jīng)毒素再溶解的敏感性變性迫切需要保存肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肉毒梭菌分泌神經(jīng)毒素和一組與神經(jīng)毒素相關(guān)的蛋白質(zhì)("NAPs")。研究證實(shí)NAPs不僅在肉毒桿菌神經(jīng)毒素的毒性感染中具有關(guān)鍵作用，而且NAPs在肉毒桿茵神經(jīng)毒素毒性方面具有重要作用。特別地，已經(jīng)證實(shí)A型神經(jīng)毒素的口服毒性在除去NAPs時(shí)下降了43，000-倍。還證實(shí)NAPs起防止神經(jīng)毒素受到各種環(huán)境情況影響的作用，包括暴露于蛋白酶，酸性和加熱。參見Kitamura，M.,Sakaguchi，S.;和Sakaguchi，G.(1969):Significanceofthe12StoxinofClostridiumbotulinumtypeE.Bacteriol.98，1173-1178;Sugii，S.，0hishi，L，和Sakagch，G.，(1977)Botulogenicpropertiesofvegetableswithspecialreferencetomolecularsizeofthetoxininthem,J.FoodSafety1,53-65。因此，提示NAPs與神經(jīng)毒素發(fā)生相互作用以防止其受到不良環(huán)境情況的影響。這種保護(hù)作用產(chǎn)生了如下推定NAPs對(duì)保護(hù)神經(jīng)毒素的結(jié)構(gòu)完整性和保護(hù)其活性而言具有重要性。環(huán)糊精為通過(guò)a-(l-4)鍵連接的環(huán)狀多環(huán)狀吡喃糖單元。最廣泛已知的環(huán)糊精為A,B，G-環(huán)糊精及其衍生物。環(huán)糊精的環(huán)狀性質(zhì)，其腔的疏水性及其外表面的親水性使它們能夠與其它化學(xué)品發(fā)生相互作用并且產(chǎn)生特征在于溶解度和穩(wěn)定性改善的包合物。例如，Ito等的美閨專利US6,818,662中披露了磺基丁基醚B-環(huán)糊精增加了N-(3-氯-4-嗎啉-4-基)苯基-r-羥基亞氨基甲脒的溶解度和光穩(wěn)定性。盡管已知環(huán)糊精與藥物形成包合復(fù)合物，但是尚未披露或提示環(huán)糊精可以使肉毒桿菌神經(jīng)毒素保持穩(wěn)定。實(shí)際上，認(rèn)為包括環(huán)糊精在內(nèi)的環(huán)狀聚合物不能有用保護(hù)或穩(wěn)定肉毒桿菌神經(jīng)毒素。參見Hunt的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)US2003/0118598,其中教導(dǎo)了肉毒桿菌神經(jīng)毒素不能使用環(huán)糊精腔，因?yàn)樵撉贿h(yuǎn)小于神經(jīng)毒素的大小。因此，環(huán)糊精不能與肉毒桿菌神經(jīng)毒素形成包合復(fù)合物。對(duì)制備包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素的藥物組合物的有效和經(jīng)濟(jì)方法和系統(tǒng)以及穩(wěn)定和保護(hù)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法仍然存在需求。本發(fā)明滿足了這些需求。發(fā)明概述本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)如下所述并且從如下的描述中顯而易見，與通過(guò)實(shí)施本發(fā)明得知的一樣。本發(fā)明的額外優(yōu)點(diǎn)可以通過(guò)特別在本文的書面描述和權(quán)利要求中指出的方法和組合物以及根據(jù)附圖得以實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。本發(fā)明尋求通過(guò)提供表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性的新組合物來(lái)緩解與肉毒桿菌神經(jīng)毒素快速降解或變性相關(guān)的問(wèn)題。特別地，本發(fā)明尋求提供以有效和經(jīng)濟(jì)的有利方式生產(chǎn)具有改善的穩(wěn)定性的肉毒桿菌神經(jīng)毒素組合物的方法。為了實(shí)現(xiàn)如本文所述的本發(fā)明的這些和其它優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明包括新的肉毒桿菌神經(jīng)毒素包合復(fù)合物，它們表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性。本發(fā)明還包括使肉毒桿菌神經(jīng)毒素穩(wěn)定的方法。優(yōu)選通過(guò)形成環(huán)糊精包合復(fù)合物使神經(jīng)毒素穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明，提供一種組合物，其包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素和環(huán)糊精或其衍生物。肉毒桿菌神經(jīng)毒素可以為純的或純化的并且可以為A,B，C，D，E，F(xiàn)或G型。優(yōu)選肉毒桿菌神經(jīng)毒素為A型。環(huán)糊精可以為a，(3或y環(huán)糊精。可選擇地，環(huán)糊精可以為環(huán)糊精衍生物，諸如，但不限于a-環(huán)糊精，P-環(huán)糊精或y-環(huán)糊精的羥基烷基，曱酰胺，二乙氨基乙基，羧甲基或二羥基烷基的衍生物。有利的是，環(huán)糊精以足以與肉毒桿菌神經(jīng)毒素形成復(fù)合物的用量存在以便提供穩(wěn)定的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。正如本領(lǐng)域中公知的，一般肉毒桿菌神經(jīng)毒素對(duì)降解或變性極為敏感。一般而言，商購(gòu)肉毒桿菌神經(jīng)毒素，諸如BOTOX,DYSP0RT⑧和MY0BL0C⑧在約4小時(shí)內(nèi)失去其功效。令人意外地發(fā)現(xiàn)形成環(huán)糊精-肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物可以將肉毒桿菌神經(jīng)毒素的功效保護(hù)至少約23周。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素和a-環(huán)糊精。在4'C時(shí)僅約4%的肉毒桿菌神經(jīng)毒素在23-周期限內(nèi)降解，而在25。C下約52-48%的神經(jīng)毒素在23-周期限內(nèi)降解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素和p-環(huán)糊精。在4。C下低于7°/。的肉毒桿菌神經(jīng)毒素在23-周期限內(nèi)降解，而在25'C下低于65%的肉毒桿菌神經(jīng)毒素在相同時(shí)間期限內(nèi)降解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素和Y-環(huán)糊精。在該實(shí)施方案中，在23-周期限內(nèi)，神經(jīng)毒素在4'C時(shí)的降解低于2%,而神經(jīng)毒素在25'C下的降解低于55%。因此，該組合物具有隨時(shí)間增加的穩(wěn)定性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的肉毒桿菌神經(jīng)毒素包合復(fù)合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑，載體或賦形劑(包括其組合)混合形成藥物組合物。該藥物組合物可以用于人和獸藥中的人或動(dòng)物應(yīng)用，并且一般包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑，載體或賦形劑中的任意一種或多種。用于治療應(yīng)用的可接受的載體或稀釋劑為制藥領(lǐng)域眾所周知的，并且，例如描述在Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中。可以根據(jù)計(jì)劃的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐選擇藥用載體，賦形劑或稀釋劑。藥物組合物可以包含或還包含任意合適的粘合劑，潤(rùn)滑劑，懸浮劑，包衣劑，增溶劑作為載體，賦形劑或稀釋劑。合適的載體的實(shí)例包括乳糖，淀粉，葡萄糖，曱基纖維素，硬脂酸鎂，甘露糖醇，山梨醇等。合適的稀釋劑的實(shí)例包括乙醇，甘油和水。合適的粘合劑的實(shí)例包括淀粉；明膠；天然糖類，諸如葡萄糖，無(wú)水乳糖，自由流動(dòng)的乳糖，乳糖；玉米甜味劑，天然和合成樹膠，諸如阿拉伯糖.，黃蓍膠或藻酸鈉，羧曱基纖維素和聚乙二醇。合適的潤(rùn)滑劑的實(shí)例包括油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯曱酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉等?？梢栽谒幬锝M合物中提供防腐劑，穩(wěn)定劑，染料乃至矯味劑。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉，山梨酸和對(duì)-羥基苯甲酸酯類。還可以使用抗氧化劑和懸浮劑。本發(fā)明組合物還可以包括，例如，但不限于可注射溶液，真空干燥制劑或冷凍干燥制劑形式。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了增加肉毒桿菌神經(jīng)毒素穩(wěn)定性的方法，包含將肉毒桿菌神經(jīng)毒素與環(huán)糊精制成包合復(fù)合物。優(yōu)選環(huán)糊精與肉毒桿菌神經(jīng)毒素的摩爾比至少為25:1-50:1，且最優(yōu)選39:1。本文所用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)糊精"意旨具有多個(gè)環(huán)吡喃糖單元的化合物并且包括于a，P或y-環(huán)糊精，其任意的衍生物或鹽及其任意的組合。本發(fā)明的方法提供了具有顯著改善的穩(wěn)定性的環(huán)糊精-肉毒桿菌神經(jīng)毒素包合復(fù)合物。因此，這種改善的穩(wěn)定性用于提供具有增加的貯存期限的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。優(yōu)選使肉毒桿菌神經(jīng)毒素在含水系統(tǒng)中接觸環(huán)糊精。含水系統(tǒng)具有約6.8-7.6的pH，并且可以包含3-25mM環(huán)糊精，5-25nM磷酸鹽緩沖液。最優(yōu)選含水系統(tǒng)包含lOmM環(huán)糊精，lOmM磷酸鈉緩沖液并且具有pH7.4。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明肉毒桿菌神經(jīng)毒素的環(huán)糊精包合制品的水溶液可以以各種形式使用。例如，正如本領(lǐng)域中公知的，可以將該復(fù)合物制備成可注射藥物或可以將其干燥成可再構(gòu)建的粉末。應(yīng)理解上述一般性描述和如下詳細(xì)描述為典型的并且指定用于對(duì)請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明提供進(jìn)一步解釋。包括引入本說(shuō)明書并且構(gòu)成其組成部分的附圖，以便解釋和提供對(duì)本發(fā)明方法和系統(tǒng)的進(jìn)一步理解。附圖與本說(shuō)明書一起用于解釋部分的原理。附圖簡(jiǎn)述圖1為例示了本發(fā)明A型神經(jīng)毒素與a，P或Y環(huán)糊精的復(fù)合物在4'C下孵育的23-周研究結(jié)構(gòu)的棒形圖2和2a為例示本發(fā)明來(lái)自在4TC下Y-環(huán)糊精孵育的A型神經(jīng)毒素的光謙的色i普?qǐng)D3,3a和3b為例示本發(fā)明來(lái)自在4匸下oc-環(huán)糊精孵育的A型神經(jīng)毒素的光語(yǔ)的色譜圖4，4a和4b為例示本發(fā)明來(lái)自在4'C下(3-環(huán)糊精孵育的A型神經(jīng)毒素的光鐠的色鐠圖5為例示了本發(fā)明A型神經(jīng)毒素與a，(3或y環(huán)糊精的復(fù)合物在室溫下孵育的23-周研究結(jié)構(gòu)的棒形圖6，6a，6b和6c為例示來(lái)自本發(fā)明在室溫下A型神經(jīng)毒素對(duì)照品的光鐠的色鐠圖7，7a，7b,7c和7d為例示來(lái)自本發(fā)明在室溫下a-環(huán)糊精孵育的A型神經(jīng)毒素的光語(yǔ)的色鐠圖8，8a，8b和8c為例示來(lái)自本發(fā)明在室溫下p-環(huán)糊精孵育的A型神經(jīng)毒素的光鐠的色譜圖9，9a和9b為例示來(lái)自本發(fā)明在室溫下y-環(huán)糊精孵育的A型神經(jīng)毒素的光鐠的色鐠圖10例示了6周時(shí)A型復(fù)合物的SNAP25裂解；且圖11例示了6周儲(chǔ)存后TANC的內(nèi)肽酶活性。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述現(xiàn)在詳細(xì)提及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其實(shí)施例例示在附圖。結(jié)合對(duì)系統(tǒng)的詳細(xì)描述來(lái)描述本發(fā)明的方法和相應(yīng)步驟。本文提供的方法和組合物可以用于緩解與肉毒桿菌神經(jīng)毒素不穩(wěn)定性相關(guān)的問(wèn)題。本發(fā)明特別適合于提供表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的新的包合復(fù)合物和制備包合復(fù)合物的方法。為了解釋和例證而非限制，本發(fā)明系統(tǒng)的典型實(shí)施方案如圖1-11中所示。特別地且按照本發(fā)明，組合物包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素和環(huán)糊精。肉毒桿菌神經(jīng)毒素和環(huán)糊精形成表現(xiàn)出明顯改善的穩(wěn)定性的包合復(fù)合物。本文為典型的肉毒桿菌神經(jīng)毒包括A，B，C，D,E，F(xiàn)和G型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，肉毒桿菌神經(jīng)毒素為A型。本文中典型的環(huán)糊精包括a,P或Y-環(huán)糊精及其任意的衍生物或鹽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了穩(wěn)定肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法。該方法包括使肉毒桿菌神經(jīng)毒素與環(huán)糊精形成穩(wěn)定的包合復(fù)合物。對(duì)比研究對(duì)A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素和環(huán)糊精包合物("TANC/CD")的穩(wěn)定性和保存進(jìn)行一系列研究。在系列研究中，將來(lái)自芽孢桿菌屬(bacillus)的肉毒梭菌的A型神經(jīng)毒素("TANC")與ot，P或y環(huán)糊精各自孵育23-周，并且通過(guò)如本領(lǐng)域中公知的HPLC-Gel過(guò)濾("HPLC-GF")方法分析。正如圖1中所示，23-周TANC/CD研究結(jié)果例示了在4t)下測(cè)定為未降解的TANC的總峰面積。本文所用的術(shù)語(yǔ)"總峰面積"意旨通過(guò)洗脫時(shí)間峰表示的蛋白質(zhì)的量?？偡迕娣e減小可以反映出在該峰處的蛋白質(zhì)的量減少，從而提示復(fù)合物降解或分解成較小的碎片或成分。正如所示的，對(duì)照品的總峰面積在整個(gè)23-周期限內(nèi)為100%。因此，對(duì)照品在23-周時(shí)間期限內(nèi)未發(fā)生TANC降解。在本研究中使用的對(duì)照品包含10mM環(huán)糊精和10mMpH7.4的磷酸鈉緩沖液。圖l描述了a，P或y環(huán)糊精各自孵育的TANC具有表示至少少量降解的峰。正如所示的，Y-環(huán)糊精孵育的TANC在4X:下表現(xiàn)出約2%的最少降解。P-環(huán)糊精孵育的TANC具有超過(guò)6%的最大降解(與其它環(huán)糊精相比)。Y-環(huán)糊精孵育的TANC樣品的少量降解最可能是少量包合物結(jié)構(gòu)變性的結(jié)果。正如圖5中所示和描述的，在室溫(25'C)下觀察到了10mM磷酸鈉緩沖液的穩(wěn)定作用的進(jìn)一步控制，并且描述復(fù)合物降解了約42%。如圖2中所示在280nm處提取的色i瞽圖表示TANC峰具有約7.4分鐘的相對(duì)穩(wěn)定的保留時(shí)間。然而，降解峰具有約18.3分鐘的保留時(shí)間。因此，較小的蛋白質(zhì)碎片或成分在凝膠過(guò)濾柱上保留較長(zhǎng)的時(shí)間期限。較長(zhǎng)的保留時(shí)間意旨可以通過(guò)復(fù)合物降解或其成分解離產(chǎn)生的較小大小的蛋白質(zhì)。此外，正如圖2a中所示，從y-孵育的TANC樣品色譜圖中提取的200nm-400nm波長(zhǎng)掃描表示18.3分鐘峰在約225和280nm處具有入max值，由此表示存在蛋白質(zhì)。因此，y-環(huán)糊精孵育的TANC降解是對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的破壞并且不是TANC周圍的環(huán)糊精復(fù)合物的降解。a-和(3-環(huán)糊精孵育的TANC樣品各自顯示了兩個(gè)降解峰。從a和P環(huán)糊精孵育的TANC樣品的首批降解峰中提取的光譜展示出與y-環(huán)糊精峰的光謙類似的結(jié)果，正如分別如圖3a和4a中例示的。特別地，如圖3a中所示，從oc-環(huán)糊精孵育的TANC樣品色語(yǔ)圖中提取的200nm-400nm波長(zhǎng)掃描表示16.9分鐘峰在約280nm處具有Xmax值，由此表示存在蛋白質(zhì)。另外并且如圖4a中所示，從p-環(huán)糊精孵育的TANC樣品中提取的200nm-400nm波長(zhǎng)掃描表示17.4分鐘峰在約280nm處具有入max值，由此表示存在蛋白質(zhì)。此外，圖4a中所示的光鐠還表示在約265nm處的Xmax值，由此表示p-環(huán)糊精不再與TANC復(fù)合。分別如圖3b和4b中所示的a-環(huán)糊精孵育的TANC和p-環(huán)糊精孵育的TANC的第二個(gè)降解峰為未復(fù)合的環(huán)糊精的特征。圖3b和4b中例示的光謙各自在約225nm和約265nm具有Xmax值。正如可以從圖3和4中觀察到的，a-環(huán)糊精TANC包合物的7.4分鐘峰和P-環(huán)糊精TANC的7.6分鐘峰各自在約9分鐘處具有特征肩峰。對(duì)這些肩峰各自提取的光譜例示了各肩產(chǎn)生TANC自身的峰代表。該數(shù)據(jù)表示大部分TANC復(fù)合物(a-約22%;p約31%吸收)從TANC/CD復(fù)合物中脫離。正如圖5中所示和本文為典型的，23-周TANC/CD研究結(jié)果例示了在室溫下測(cè)定為未降解TANC的總峰面積。正如所示的，包括對(duì)照品的環(huán)糊精TANC樣品各自表示高于在4'C下孵育的對(duì)比樣品的降解量。正如在4'C下孵育的結(jié)果，室溫對(duì)照樣品在23周期限內(nèi)具有約44%降解的最低程度的TANC降解。圖5還表示與p-和y-環(huán)糊精孵育的TANC復(fù)合物相比，a-環(huán)糊精孵育的TANC樣品在23-周期限內(nèi)具有最少的降解。a-環(huán)糊精TANC降解為約52-48%,而P-環(huán)糊精孵育的TANC具有65%的降解，并且y-環(huán)糊精孵育的TANC具有55%的降解。正如圖5中所示，在室溫下對(duì)照品的總峰面積在1周內(nèi)為100%。然而，對(duì)照品在第2周內(nèi)表現(xiàn)出約23%的一些降解并且在23周期限內(nèi)持續(xù)降解至第23周內(nèi)的約44%的降解。其它環(huán)糊精孵育的TANC具有較高程度的TANC降解。特別地，在室溫下P-環(huán)糊精孵育的TANC降解了約65%,并且在室溫下y-環(huán)糊精孵育的TANC在23-周期限內(nèi)降解了約55%。a-環(huán)糊精孵育的TANC在室溫下具有低于p和Y-環(huán)糊精孵育的TANC的降解(約52-48°/。)。圖6，6a，6b和6c各自表示在室溫下對(duì)照品環(huán)糊精孵育的TANC的色譜圖和提取的光譜。圖7，7a，7b和7c各自表示在室溫下ot-環(huán)糊精孵育的TANC的色譜圖和提取的光譜，圖8，8a，8b和8c各自例示了在室溫下p-環(huán)糊精孵育的TANC的色i普?qǐng)D和提取的光諳，且圖9,9a和9b各自例示了在室溫下Y-環(huán)糊精孵育的TANC的色鐠圖和提取的光語(yǔ)。在每個(gè)色i脊圖中，代表環(huán)糊精孵育的TANC復(fù)合物各自的降解產(chǎn)物的峰的波長(zhǎng)掃描與在4'C下環(huán)糊精孵育的TANC復(fù)合物的降解產(chǎn)物的峰的波長(zhǎng)掃描類似，正如圖2-4b并且包括4b中例示的。圖6-9中代表的的波長(zhǎng)掃描表示蛋白質(zhì)復(fù)合物，環(huán)糊精復(fù)合物或它們兩者的變性。圖7a，7b和8a中分別在約15.3分鐘，17.1分鐘和17.3分鐘的早期降解峰各自描繪了稍高于300nm的max值。降解產(chǎn)物分子量使用從該柱生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y--1.667x+7.409)嘗試測(cè)定降解產(chǎn)物的分子量。BlueDextrin的洗脫時(shí)間(5.115分鐘)用作用于Rr計(jì)算(Vet/V。t)的空體積(V。t)。下表1和2各自表示來(lái)自計(jì)算的值。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*表示低于GF柱的線性范圍的值。表2室溫降解產(chǎn)物分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*表示低于GF柱的線性范圍的值。正如上述表1和2中所示，數(shù)值表示主要TANC蛋白質(zhì)中沒有一種從包合物結(jié)構(gòu)中脫離。ANC包合物降解部分的小分子量明顯低于GF柱線性范圍的下限。根據(jù)極小分子量計(jì)算的分子量表示包合物仍然完整。DNA/RNA的存在Rnases添加到TANC溶液顯示丕存在RNAs或DNAs。在260nm處按照分光光度法監(jiān)測(cè)添加的核酸酶的吸收度增加，因?yàn)榘我獯嬖诘腞NA/DNA的核苷酸從其三級(jí)結(jié)構(gòu)中釋放。盡管觀察到吸收度增加(3小時(shí)內(nèi)增加0.002)，但是不能確定這類小的增加說(shuō)明存在任何較大濃度的RNAs或DNAs。實(shí)施例A型肉毒梭菌的制備通過(guò)Cai等EnhancementoftheEndopeptidaseActivityofBotulinumNeurotoxinsbyItsAssociatedProteinsandDithiothreitol,Biochemistry,1999，38，6903-6910中所示的方法制備A型肉毒梭菌(菌林Hall)復(fù)合物，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。使用用IO個(gè)柱體積的pH7.4的lOmM磷酸鈉平衡的5mLSephadexG-25柱使純化的A型復(fù)合物進(jìn)行緩沖液交換。通過(guò)SDS-PAGE分析測(cè)定A型復(fù)合物具有典型亞單位結(jié)構(gòu)。將A型復(fù)合物在7.4的生理pH下稀釋至0.75mg/mL濃度，并且將1mL等分部分放入8支1.5mL微量離心管。通過(guò)高效液相色譜法，在溶液中的0.1mMa-，p-或y-環(huán)糊精存在下使用凝膠過(guò)濾(大小排阻)柱(HPLC-GF)分析25°C和4°C下A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物的1.5mgmL—1溶液。給WATERSHPLC系統(tǒng)安裝Waters996光敏二極管陣列(PDA)檢測(cè)器和雙Waters515HPLC泵。將Waters泵系統(tǒng)與WatersPumpControlModule整合并且用WatersMillenniumSoftware控制。將樣品通過(guò)Rheodyne77251ManualInjectionSystem導(dǎo)入該系統(tǒng)。用于分離樣品的柱為WatersProteinPak300SW(4.6x300mm)。用于各分離嘗試的緩沖液條件如下所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線生成凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)品(SigmaChemicalCo.)用于確定ProteinPak柱的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的緩沖系統(tǒng)為pH7.4的10mM磷酸鈉緩沖氣來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的結(jié)果如下表1中所示。將根據(jù)Log分子量與Vst/V。t關(guān)系的圖確定的線性方程計(jì)算為y=-1.7417x+7.399，R2=0.9398。神經(jīng)毒素A復(fù)合物分析來(lái)自HPLC-GF分析的結(jié)果表明能夠在生理pH下穩(wěn)定肉毒桿菌神經(jīng)毒素及其復(fù)合物NAPs。在pH6.8的50mM磷酸鈉緩沖液中，85°/。蛋白質(zhì)以復(fù)合形式保留。在pH7.4的10mM磷酸鈉緩沖液中發(fā)現(xiàn)了較低9/。的復(fù)合物(70%)。在pH7.4下復(fù)合物的％較低是因直接將包合物導(dǎo)入新緩沖系統(tǒng)所致。如果在導(dǎo)入HPLC-GF系統(tǒng)前將肉毒桿菌毒素和NAPs透析入pH7.4緩沖液中，將會(huì)是與pH6.8緩沖系統(tǒng)類似的結(jié)果。此外，在5X:和25。C下在有和沒有a-環(huán)糊精存在下進(jìn)行A型神經(jīng)毒素包合物(TANC)的內(nèi)肽酶活性的穩(wěn)定性研究。研究結(jié)果提示6-周期限內(nèi)，TANC在5'C和25。C下在有和沒有0.1mMa環(huán)糊精存在下仍然保留酶活性。A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素底物SNAP-25(泳道2中的箭頭所示的完整SNAP-25)的蛋白水解(內(nèi)肽酶)產(chǎn)物的電泳分析如圖10中所示。在用150nMTANC(泳道3)處理后，完整SNAP-25帶消失。對(duì)在5'C下pH7.4的10mM磷酸鈉緩沖液中儲(chǔ)存的TANC，獲得了與(泳道6)或沒有任何a-環(huán)糊精(泳道5)類似的結(jié)果。在25'C下也保留了內(nèi)肽酶活性(泳道7&8)。圖11描述了在不同儲(chǔ)存條件下內(nèi)肽酶活性的圖解表示。正如所示的，在每種儲(chǔ)存條件下TANC內(nèi)肽酶活性仍然保持較高。在5C下緩沖液中儲(chǔ)存的TANC和在TANC中SNAP-25強(qiáng)度的負(fù)強(qiáng)度表明在相當(dāng)于SNAP-25的蛋白質(zhì)帶的強(qiáng)度測(cè)定中的誤差。在每種條件中測(cè)試的TANC的內(nèi)肽酶活性由此與實(shí)驗(yàn)誤差相同。如上所述和附圖中所示的本發(fā)明方法和系統(tǒng)提供了穩(wěn)定的肉毒梭菌神經(jīng)毒素復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見可以在不脫離本發(fā)明精神或范圍的情況下對(duì)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進(jìn)行各種變型和變化。因此，指定本發(fā)明包括在附屬的權(quán)利要求及其等價(jià)物范圍內(nèi)的變型和變化。權(quán)利要求1.組合物，包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和環(huán)糊精或其衍生物，其中所述環(huán)糊精與所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素形成包合復(fù)合物。2.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述環(huán)糊精與肉毒桿菌神經(jīng)毒素以摩爾比至少為25:1-50:1存在，以使肉毒桿菌神經(jīng)毒素表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性。3.權(quán)利要求1所述的組合物，具有至少4周的貯存期限，并且約55%-約80%的所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素作為所述復(fù)合物保持至少2周的期限。4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素在4'C-25'C的儲(chǔ)存溫度下在約23周的期限內(nèi)具有約2%-低于65%的降解。5.權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述肉毒桿菌毒素選自A,B，C，D，E，F(xiàn)和G型肉毒桿菌毒素。6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中在形成所述復(fù)合物之前純化所述肉毒桿菌毒素。7.權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述環(huán)糊精包含a環(huán)糊精，P-環(huán)糊精，y-環(huán)糊精，或者a環(huán)糊精、p-環(huán)糊精或y-環(huán)糊精的羥基烷基，曱酰胺，二乙氨基乙基，羧甲基或二羥基烷基的衍生物。8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述環(huán)糊精存在于進(jìn)一步包含磷酸鹽緩沖液的穩(wěn)定溶液中。9.權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述緩沖液為磷酸鈉并且該溶液的pH為約6.8-約7.6。10.權(quán)利要求1所述的組合物，為可注射溶液或干燥制劑的形式。11.穩(wěn)定肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，該方法包含提供肉毒桿菌神經(jīng)毒素；和使所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素經(jīng)歷環(huán)糊精處理，其中以足以與所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素形成包合復(fù)合物的量來(lái)提供所述環(huán)糊精。12.權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)以至少25:1-50:1的摩爾比提供所述環(huán)糊精與肉毒桿菌神經(jīng)毒素，將改善的穩(wěn)定性傳遞給所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素。13.權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括提供一定量的環(huán)糊精，以便賦予所述復(fù)合物至少4周的貯存期限，其中作為所述復(fù)合物的約55%-約80%的肉毒桿菌神經(jīng)毒素保持至少2周的期限。14.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素在4'C-25。C的儲(chǔ)存溫度下在約23周的期限內(nèi)具有約2%-低于65%的降解。15.權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述肉毒桿菌毒素選自A，B，C，D，E,F和G型肉毒桿菌毒素。16.權(quán)利要求11所述的方法，其中在形成所述復(fù)合物前純化所述肉毒桿菌毒素。17.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述環(huán)糊精包含a環(huán)糊精，P-環(huán)糊精，y-環(huán)糊精，或在a環(huán)糊精、p-環(huán)糊精或r"環(huán)糊精的羥基烷基，曱酰胺，二乙氨基乙基，羧曱基或二羥基烷基的衍生物。18.權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括提供所述環(huán)糊精的穩(wěn)定溶液，其中該溶液進(jìn)一步包含磷酸鹽緩沖液。19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述緩沖液為磷酸鈉且該溶液的pH為約6.8-約7.6。20.權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括提供可注射溶液或干燥制劑形式的所述復(fù)合物。全文摘要本發(fā)明涉及包括肉毒桿菌神經(jīng)毒素和環(huán)糊精的穩(wěn)定的組合物以及保存肉毒桿菌神經(jīng)毒素和以有效和經(jīng)濟(jì)上有利的方式生產(chǎn)具有改善的穩(wěn)定性的肉毒桿菌神經(jīng)毒素組合物的方法。本發(fā)明尋求通過(guò)提供表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性的新組合物緩解與肉毒桿菌神經(jīng)毒素快速降解或變性相關(guān)的問(wèn)題。優(yōu)選通過(guò)形成環(huán)糊精包合復(fù)合物穩(wěn)定肉毒桿菌神經(jīng)毒素。文檔編號(hào)A61K39/02GK101316612SQ200680044226公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2006年9月22日優(yōu)先權(quán)日2005年9月26日發(fā)明者A·M·里斯,B·R·辛申請(qǐng)人:B.B.科學(xué)有限責(zé)任公司