專利名稱：肉毒梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測的方 法，具體是一種A型肉毒梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法。
背景技術(shù)：
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)屬于厭氧性梭狀芽胞桿菌屬，具有該菌的 基本特性，即厭氧性的桿狀菌，形成芽胞，芽胞比繁殖體寬，呈梭狀，革蘭氏染 色為陽性，產(chǎn)生劇烈細(xì)菌外毒素，即肉毒毒素。肉毒毒素能引起人和動物的肉毒 中毒，根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、 B、 C (1、 2)、 D、 E、 F、 G 七個型。引起人群中毒的，主要有A、 B、 E三型；C、 D二型毒素主要是畜、禽肉毒 中毒的病原；F、 G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報道。肉毒梭 菌廣泛存在于自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。 在美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，在我國主要以發(fā)酵食品為主， 如臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等，其它也引起中毒的食品還有熏制未去內(nèi)臟 的魚、填餡茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。肉毒梭菌是致死性 最高的病原體之一，感染劑量極低，每個人都易感。攝食18-36小時后發(fā)病為典型 病癥，但不典型的可在4小時至8天不等，癥狀為虛弱、眩暈、伴隨視覺成雙、漸 進(jìn)性說話障礙、呼吸和吞咽困難，最終引起麻痹、死亡。據(jù)統(tǒng)計，1899年至1990 年，在美國共有2305人中毒，經(jīng)檢測，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人 感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、 B二種毒素引起。而在我 國，各地發(fā)生的肉毒中毒事件也主要是A型和B型。
現(xiàn)有肉毒梭菌及肉毒毒素的檢測方法有血清學(xué)實驗、小白鼠腹腔注射及中和試 驗、ELISA多用雙抗體夾心法、PCR方法等，這些方法各有優(yōu)勢，但也有不足，或
所需時間過長、或步驟繁瑣、或成本較高。而環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法方便、快速、 成本低，適于現(xiàn)場檢測，有較好的應(yīng)用性，目前尚未見用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法檢 測肉毒梭菌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種A型肉毒梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增方法，以克服現(xiàn)有 技術(shù)的缺點，從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個 內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，
內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引物首先和耙DNA雜交，隨 后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由 一個外弓I物啟 動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動 的DNA合成模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟 動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環(huán) DNA; (4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有耙 DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到109拷貝，可通過 熒光染料來觀察擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明涉及的A型肉毒梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法中，其中包括的試劑 如下(1) - (4):
(1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液 其中包括10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4一8mmol/L 硫酸鎂(MgS04)、 0.8 —1.6nmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、 0. 8 — 1. 6iJmol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、 0.2—0. 3nmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3iJmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜堿；
上游內(nèi)引物
5- GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG -3、
下游內(nèi)引物
5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA -3 、 上游外引物5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3 、 下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3 、
其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP 二2:1:1:1。
其中所述的10XThermopol反應(yīng)緩沖液中含有200 mmol pH8.8的三羥基甲基氨 基甲烷一鹽酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化鉀(KC1)、 100 mmol/L硫酸銨((NHJ 2S04)、 20咖ol/L硫酸鎂(MgS04)和1^曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) 跳酶1 U/pL;
(3) Bst DNA聚合酶8 U /yL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液每管共有22iJL，其最佳組成為2.5JJL 10 X
Thermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、4. 0|jL 10nmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 4.0ijLl(Hjmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 5pL 10|jmol/L 上游外引物(F3)、 0.5pL10iJniol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5jjL
5M甜菜堿和2. 1|JL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
使用上述試劑檢測A型肉毒梭菌的方法，依次包括下列步驟(1) - (3):
(1) 待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取
提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26。/0D28。在1.6-2.0范圍內(nèi)，濃度 在IO-IOO ng/ijL范圍內(nèi);
(2) 進(jìn)行A型肉毒梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22jjL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2pL待檢模板DNA,和O. 5ijL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上1一3 min;
B. 在反應(yīng)管中加入lpL Bst DNA聚合酶，并于水浴鍋中恒溫水浴上60—65。C 擴(kuò)增反應(yīng)45—90 min;
C. 將水浴調(diào)到80—85"C終止反應(yīng)，3—5min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應(yīng)管中加入lpL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有或為A型肉毒梭菌。
本發(fā)明是根據(jù)A型肉毒梭菌保守區(qū)的六個序列設(shè)計了兩個特異性內(nèi)引物和兩個 特異性外引物，該保守基因序列為A型肉毒梭菌所共有，以保證檢測不同來源的A 型肉毒梭菌的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，與PCR 檢測方法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且 結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速，特別 適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)。
具體實施例方式
下列實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。 實施例l
按下列配方制作A型肉毒梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液
(1) LAMP反應(yīng)液
含有2. 5pL 10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4pL 25mmol/L dNTP (四種脫氧核 糖核酸的混合物)、4.0|JL 10iJmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 4. 0yL 10ymol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、 0.5|JL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5pL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜堿和2. l|jL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中，所述的上游內(nèi)引物
5- gagccataaccatttcgcgta-agtttgaatgtaaaagctttgg -3、
下游內(nèi)引物
5- gcccagattttacatttggttttga-gtagcaaatttgcctgca -3 、
上游外引物5- AGTAATAATAGGACCCTCAGC -3 、 下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3 ;
其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP二 2:1:1:1。
(2) 謠酶1 U/pL;
(3) Bst DNA聚合酶:8U /jjL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)程序進(jìn)行檢測
(1) 樣品DNA的提取
檢測菌種A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum A)，菌種來源中國人民解放 軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，編號62A。
使用北京天根生物工程公司的細(xì)菌核酸提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D26。/ 0D娜能夠達(dá)到1.8，濃度達(dá)到20 ng/|jL0
(2) 進(jìn)行A型肉毒梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22lJL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2jjL待檢模板DNA，和O. 5nL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置5 min,立即置于冰上l min;
B. 在各反應(yīng)管中加入l |jL Bst DNA聚合酶，并于恒溫水浴上65 。C擴(kuò)增反應(yīng)l 小時；
C. 將水浴調(diào)到80 'C終止反應(yīng)，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應(yīng)管中加入l pL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品為A型肉毒梭菌。 實施例2
按下列配方制作A型肉毒梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液 (1) LAMP反應(yīng)液
含有2. 5pL 10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP、4. 0 JJL 10|jmol/L 上游內(nèi)引物(FIP)、 4.0 yL 10 口mol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.5 |JL 10jJmol/L上游 外引物(F3)、 0.5 口L 10 pmol/L下游外引物(B3)、 2 |JL 100 mmol/L MgS04、 5pL 5mol/L甜菜堿和2. lyL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物同上。 上述混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP二 2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /pL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序進(jìn)行檢測
(1) 樣品DNA的獲得
檢測菌種A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum A)，菌種來源山東省疾病預(yù) 防控制中心，編號SDCDC9501。
使用大連寶生物工程公司的植物核酸提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D260/ 0D280能夠達(dá)到1.8，濃度達(dá)到20 ng/fjL。
(2) 進(jìn)行A型肉毒梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22ijL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2口L待檢模板DNA，禾ao. 5ijL的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應(yīng)管中加入liJLBstDNA聚合酶，并于恒溫水浴上65。C擴(kuò)增反應(yīng)1 h;
C. 將水浴調(diào)到8(TC終止反應(yīng)，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應(yīng)管中加入1JJL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，則待檢樣品也為A型肉毒梭菌。
核苷酸序列表
〈110〉山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
〈120〉肉毒梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法
〈160> 4
〈210〉 1
〈211〉 43
〈212> DNA
〈213〉人工序列
〈221〉 prim一bind
〈222〉 (1)…(43)
<400> 1
GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGMTGTMMGCTTTGG 43
〈210〉 2 〈211〉 43 <212〉腿 〈213〉人工序列 <221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(43) 〈400> 2
GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCMATTTGCCTGCA 43
〈210〉 3 <211> 21 〈212〉腿 <213>人工序列 <221> prim_bind <222〉 (1)…(21) 〈400〉 3
AGTAATMTAGGACCCTCAGC 21
<210> 4 <211> 20 〈212〉腿 〈213〉人工序列 〈221> prim—bind 〈222〉 (1)…(20) 〈400〉 4
TCATGTGCTAATGTTACTGC 20
權(quán)利要求
1. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測肉毒梭菌的試劑，其特征是該試劑包括(1)-(4)(1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸鎂(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷—鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X—100；其中，上游內(nèi)引物:5-GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG-3；下游內(nèi)引物:5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA-3；上游外引物:5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3；下游外引物:5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測肉毒梭菌的試劑，其特征是上述的dNTP內(nèi)的四種脫 氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1 。
3、 利用權(quán)利要求1所述的試劑進(jìn)行等溫快速檢測肉毒梭菌的方法，其特征 是依次包括(1) - (3)下列步驟(1) 待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D柳/ 0D卿在1.6-2.0范 圍內(nèi)，濃度在10-100 ng/"L范圍內(nèi)；(2) 進(jìn)行A型肉毒梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)A.在裝有22uLLAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2uL待檢樣品模板DNA，和 0. 5uL的UNG酶，于恒溫95 。C放置3 —5 min，立即置于冰上1 — 3 min ; B. 再在反應(yīng)管中加入luL Bst DNA聚合酶，并于恒溫65 。C擴(kuò)增反應(yīng)45 一90 min;C. 將溫度調(diào)到80 。C終止反應(yīng)，3 — 5 min后取出待檢；(3)顯色檢測在每個反應(yīng)管中加入luL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液 顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有或為A型肉毒梭菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肉毒梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法。其中的試劑包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、顯色劑；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物5-GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG-3、下游內(nèi)引物5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA-3、上游外引物5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3、下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3和甜菜堿；檢測A型肉毒梭菌的方法包括細(xì)菌DNA的提取、肉毒梭菌A型的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增和顯色檢測。其優(yōu)點是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號C12Q1/04GK101381774SQ20081015790
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者劉云國, 靜 唐, 姜英輝, 健 張, 房保海, 李正義, 祝素珍, 楠 賀, 賈俊濤, 趙麗青, 雷質(zhì)文, 馬維興 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心