專(zhuān)利名稱(chēng)：白色念珠菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測(cè)的方 法，具體是一種白色念珠菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
白色念珠菌(Canidia Albicans)屬于真菌界半知菌亞門(mén)一芽孢菌綱一隱球酵 母目一隱球酵母科，是雙相型單細(xì)胞酵母菌。在人體中，無(wú)癥狀時(shí)常表現(xiàn)為酵母 細(xì)胞型；侵犯組織和出現(xiàn)癥狀時(shí)常表現(xiàn)菌絲型。白色念珠菌是一種腐物寄生菌， 廣泛存在于自然界，是人體正常菌群之一，平時(shí)生存于人體的皮膚、粘膜、消化 道及其他臟器中，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，白色念珠菌就會(huì)繁殖，達(dá)到一定量時(shí)， 人體就會(huì)發(fā)病，所以白色念珠菌是一種條件致病菌。婦女陰道上皮細(xì)胞糖原增加， 酸性增強(qiáng)時(shí)，白色念珠菌會(huì)繁殖引起陰道炎，故本病常見(jiàn)于孕婦、糖尿病患者及 接受雌激素治療的患者。白色念珠菌可侵犯人體許多部位，引起(1)皮膚念珠 菌病，好發(fā)于皮膚皺褶處(腑窩、腹股溝，乳房下，肛門(mén)周?chē)凹诇?，指間)，皮 膚潮紅、潮濕、發(fā)亮，有時(shí)蓋上一層白色或呈破裂狀物，病變周?chē)行∷荨?2) 粘膜念珠菌病，以鵝口瘡、口角炎、陰道炎最多見(jiàn)，在粘膜表面蓋有凝乳大小不 等的白色薄膜，剝除后，留下潮紅基底，并產(chǎn)生裂隙及淺表潰瘍。(3)內(nèi)臟及中樞 神經(jīng)念珠菌病，可由粘膜皮膚等處病菌播散引起，有肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、 腦膜炎、腦炎等，偶而也可發(fā)生敗血癥。
現(xiàn)有的白色念珠菌的檢測(cè)方法有芽管法、NGL酶法、顯色培養(yǎng)法、普通PCR、熒 光定量PCR和直接免疫熒光法等，其中芽管法和NGL酶法均易出現(xiàn)假陽(yáng)性，特異性 不高；PCR靈敏卻有高成本。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法可彌補(bǔ)這些不足，目前尚未見(jiàn)用 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)白色念珠菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種白色念珠菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，以克服 現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別靶DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè) 內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個(gè)外引物(上游外引物和下游外引物)， 內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個(gè)內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨 后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟 動(dòng)，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外引物啟動(dòng)
的DNA合成模板，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟 動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一個(gè)新的由兩倍莖長(zhǎng)度的莖環(huán) DNA; (4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過(guò)鏈置換形成多個(gè)含有耙 DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使耙DNA累積到109拷貝，可通過(guò) 熒光染料來(lái)觀察擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明涉及的白色念珠菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法中，包括的試劑如下 (1) - (4):
(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液 其中包括10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4一10mmol/L 硫酸鎂(MgS04)、 0.8 — 1.6[Jmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、 0. 8 — 1, 6pmol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、 0.2—0.3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3iJmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜堿； 上游內(nèi)引物
5- CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT -3 、
下游內(nèi)引物
5畫(huà)TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT陽(yáng)CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA-3 、 上游外引物5-ACCGTTGATTTCCAATTCG-3、 下游外引物5墨TTAACTTGAGCCATGGAGAT陽(yáng)3 、
其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
其中所述的10XThermopol反應(yīng)緩沖液中含有200隱ol pH8.8的三羥基甲基氨 基甲烷一鹽酸(Tris—HC1)、 100 mmol/L氯化鉀(KC1)、 100鵬ol/L硫酸銨((NH4) 2S04)、 20咖ol/L硫酸鎂(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1 U/pL;
(3) Bst DNA聚合酶8 U /|jL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液每管共有22pL，其最佳組成為2. 5|JL
10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4yL 25mmol/L dNTP (四種脫氧核糖核酸的混合物)、 4.0pL 10iJmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 4. OyL 10iJmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 5pL 1(Hmo1/L上游外引物(F3)、 0.5pL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 2pL 100 mmol/L MgS04、 5|JL 5M甜菜堿和2. 1|JL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
使用上述方法檢測(cè)白色念珠菌，依次包括下列步驟(1) _ (3):
(1) 待檢樣品或真菌DNA的提取
提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26。/0D28。在1.6-2.0范圍內(nèi)，濃度 在10-100 ng/iJL范圍內(nèi)。
(2) 進(jìn)行白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22pL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2IJL待檢模板DNA,和O. 5yL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上1一3 min;
B. 在反應(yīng)管中加入1IJL Bst DNA聚合酶，并于水浴鍋中恒溫水浴上60—65'C 擴(kuò)增反應(yīng)45—90 min;
C. 將水浴調(diào)到80—85'C終止反應(yīng)，3—5min后取出待檢；
(3) 顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入lpL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品含有或?yàn)榘咨钪榫?br> 本發(fā)明是根據(jù)白色念珠菌SAP基因的六個(gè)序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性?xún)?nèi)引物和兩個(gè) 特異性外引物，該基因序列為白色念珠菌各不同菌株型所共有，以保證檢測(cè)不同 來(lái)源的白色念珠菌的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，該技術(shù) 特異性強(qiáng)，與PCR檢測(cè)方法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通 的水浴鍋即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀察，使用熒光染料來(lái)觀察即可， 簡(jiǎn)單而快速，特別適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例l
按下列配方制作白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液 (1) LAMP反應(yīng)液
含有2.5nL 10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4|jL 25咖ol/L dNTP (四種脫氧核 糖核酸的混合物)、4.0iJL10iJmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 4. O(JL 10iJmol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、 0.5|JL 10pmol/L上游外引物(F3)、 0. 5|JL 10ijmol/L下游外引物(B3)、 2|JL 100 mmol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜堿和2. lpL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物 5- CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT國(guó)3 、
下游內(nèi)引物
5-TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT-CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA -3 、 上游外引物5- ACCGTTGATTTCCAATTCG -3 、 下游外引物5- TTAACTTGAGCCATGGAGAT -3
其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP= 2:1:1:1。
(2) 跳酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /pL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I。
按照以下(1) _ (3)程序進(jìn)行檢測(cè)
(1) 樣品DNA的提取
檢測(cè)菌種白色念珠菌(Canidia Albicans),菌種來(lái)源美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，編號(hào)ATCC10261。
使用北京天根生物工程公司的酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D26。/ 0d28。能夠達(dá)到L8，濃度達(dá)到20 ng/|jL。
(2) 進(jìn)行白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22ijL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2ijL待檢模板DNA，和O. 5nL的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5 min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應(yīng)管中加入l pL Bst DNA聚合酶，并于恒溫水浴上65 'C擴(kuò)增反應(yīng)1 小時(shí)；
C. 將水浴調(diào)到80 。C終止反應(yīng)，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入l JJL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品為白色念珠菌。 實(shí)施例2
按下列配方制作白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液 (1) LAMP反應(yīng)液
含有2.5ijL lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1.4pL 25鵬ol/L dNTP、 4.0 pL 10iJmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、4. 0 yL 10 iJmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 5 |jL 10|jmol/L 上游外引物(F3)、 0. 5 pL 10 pmol/L下游外引物(B3)、 2 |jL 100 mmol/L MgS04、 5 ML 5 mol/L甜菜堿和2. lpL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP= 2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/pL;(3) Bst DNA聚合酶8U /|JL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序進(jìn)行檢測(cè)
(1) 樣品DNA的提取
檢測(cè)菌種白色念珠菌(canidia Albicans),菌種來(lái)源美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，編號(hào)ATCC14053。
使用大連寶生物工程公司的基因組DNA小量抽提試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D260/ 0D280能夠達(dá)到L8，濃度達(dá)到20 ng/|jL。
(2) 進(jìn)行白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)-
A. 在裝有22ijL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2iJL待檢模板DNA,和O. 5ijL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min, 95X:放置5min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應(yīng)管中加入llJLBstDNA聚合酶，并于恒溫水浴上65r擴(kuò)增反應(yīng)l h;
C. 將水浴調(diào)到8(TC終止反應(yīng)，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入lpL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，則待檢樣品也為白色念珠菌。核苷酸序列表
〈110〉山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 <120〉白色念珠菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法
〈160〉4
〈210〉1
〈211〉47
〈212〉腿
〈213>人工序列
〈221〉prim bind
〈222〉(1)…(47)
〈400〉1
CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCMGATTTCCGT 47
〈210〉 2 〈211〉 48 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (48) 〈400〉 2
TCGTGTTCGTGMAGTGAAGATMT-CTTTCTATCATCCAMTCGTAGA 48
〈210〉 3 〈211〉 19 〈212〉腿 <213>人工序列 〈221> prim—bind <222〉 (l)... (19) 〈400〉 3
ACCGTTGATTTCCMTTCG 19
〈210〉 4 〈211〉 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (20) 〈400〉 4
TTAACTTGAGCCATGGAGAT 20
權(quán)利要求
1. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)白色念珠菌的試劑，其特征是該試劑包括(1)-(4)(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—10mmol/L硫酸鎂(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷—鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X—100；其中，上游內(nèi)引物:5-CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT-3；下游內(nèi)引物:5-TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT-CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA-3；上游外引物:5-ACCGTTGATTTCCAATTCG-3；下游外引物:5-TTAACTTGAGCCATGGAGAT-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)白色念珠菌的試劑，其特征是上述的dNTP內(nèi)的四 種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 利用權(quán)利要求1中所述的試劑進(jìn)行等溫快速檢測(cè)白色念珠菌的方法，其 特征是依次包括(1) - (3)下列步驟(1)待檢樣品或真菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26。/ 0D咖在1. 6-2. 0范圍 內(nèi)，濃度在10-100 ng/nL范圍內(nèi)； (2) 進(jìn)行白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)A. 在裝有22uL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2u L待檢樣品模板DNA，和 0.5uL的UNG酶，于恒溫95 。C放置3 —5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 再在反應(yīng)管中加入luL Bst DNA聚合酶，并于恒溫65 。C擴(kuò)增反應(yīng)45 一90 min;C. 將溫度調(diào)到80 -C終止反應(yīng)，3_5 min后取出待檢；(3) 顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入liiL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液 顏色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品含有或?yàn)榘咨钪榫?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種白色念珠菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法。其中的試劑包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和顯色劑；其中的反應(yīng)液含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物5-CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT-3、下游內(nèi)引物5-TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT-CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA-3、上游外引物5-ACCGTTGATTTCCAATTCG-3、下游外引物5-TTAACTTGAGCCATGGAGAT-3和甜菜堿；檢測(cè)白色念珠菌的方法包括真菌DNA的提取、白色念珠菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、顯色檢測(cè)。本發(fā)明的特點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101381775SQ20081015790
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者劉云國(guó), 靜 唐, 姜英輝, 健 張, 房保海, 李正義, 祝素珍, 楠 賀, 賈俊濤, 趙麗青, 雷質(zhì)文, 馬維興 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心