專(zhuān)利名稱(chēng)：：細(xì)胞毒素化合物和分離方法細(xì)胞毒素化合物和分離方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求提交于2005年9月16日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/717，598的權(quán)益，在此將其包括圖表在內(nèi)的全部?jī)?nèi)容引入本申請(qǐng)作為參考。本發(fā)明以O(shè)PP-9卯1076和OPP-0125152得到國(guó)家科學(xué)基金會(huì)(NationalScienceFoundation)的資助，因此美國(guó)政府對(duì)于本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的最偉大的奮斗目標(biāo)之一就是控制和緩解細(xì)胞增生性疾病，例如癌癥。相當(dāng)多的研究一直在致力于尋找對(duì)特定癌癥具有有益活性的新的生物學(xué)活性化合物以及能夠產(chǎn)生這些化合物的生物。例如，某些海洋軟體珊瑚類(lèi)就是具有生物學(xué)活性的細(xì)胞毒素的來(lái)源。同樣，來(lái)自海綿動(dòng)物的化合物能夠有效對(duì)抗脂加氧酶介導(dǎo)的人類(lèi)疾病(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,750,247號(hào))。被嚢類(lèi)(tunicates)也被證實(shí)為是生物活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。在開(kāi)發(fā)的用于治療癌癥的海洋天然產(chǎn)物中，海鞘素類(lèi)(ecteinascidins)和膜海鞘素類(lèi)(didemnins)均得自被囊類(lèi)，覃狀海鞘素類(lèi)(eudistomins)具有很好的抗病毒活性。作為正在進(jìn)行的南極海洋無(wú)脊稚動(dòng)物的生物活性研究的一部分，本發(fā)明者有機(jī)會(huì)研究了被嚢類(lèi)Synoicumadareanum。S.adareanum為極地被嚢類(lèi)，通常位于南極Anvers島(64°46'S，64。03'W)的15-796米淺水區(qū)。S.adareanum集落由大的圓形或棒形頭部以及有鈹褶和皮革似的底柄組成，底柄只比頭部略窄。S.adareanum集落可以至多有18厘米高，直徑為12厘米。S.adareanum集落可以包括單頭或者至多六頭，多頭可以自單個(gè)柄上長(zhǎng)出。本發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及S.adareanum提取物及其用途，所述提取物包括帕莫諾立德(Palmerolide)A、帕莫諾立德B、帕莫i若立德C、帕莫i若立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H和/或帕莫諾立德K。Field-basedfeeding-deterrentassays表明本發(fā)明化合物具有生物活性。新的分離的聚酮類(lèi)化合物，帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H和帕莫諾立德K是得自S.adareanum提取物的主要天然產(chǎn)物。這些聚酮化合物在國(guó)立癌癥研究院(NationalCancerInstitute)(NCI)60細(xì)胞系中具有選擇性的細(xì)胞毒性，能夠抑制黑素瘤(UACC-64，LC5o0.018pM)，與其它測(cè)試細(xì)胞系相比，其敏感性高出三個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明也涉及治療癌癥患者的方法，該方法包括給予患者治療有效量的至少一種分離的化合物，該化合物獲自Synoicum種屬的提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，Synoicum種屬為S.adareanum,分離的化合物為帕莫諾立德。在特定的實(shí)施方案中，帕莫諾立德選自帕莫諾立德A1、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫i若立德H和帕莫i若立德K。圖1為帕莫諾立德A的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖2為帕莫諾立德A的NMR數(shù)據(jù)表格。圖3顯示選擇的ROE相關(guān)性，涉及C-ll和C-19之間的相對(duì)立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖4A為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目帕莫諾立德A的體外試驗(yàn)結(jié)果。圖4B為續(xù)表，顯示國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目帕莫諾立德A的體外試驗(yàn)結(jié)果。有的細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。圖6為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目測(cè)試的帕莫諾立德A對(duì)黑素瘤細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。圖7為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目測(cè)試的帕莫諾立德A對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。圖8為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目測(cè)試的帕莫諾立德A對(duì)腎癌細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。圖9為帕莫諾立德C的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖10為帕莫諾立德C的NMR數(shù)據(jù)表格。圖11A為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目帕莫諾立德C的體外試驗(yàn)結(jié)果。圖11B為續(xù)表，顯示國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目帕莫諾立德C的體外試驗(yàn)結(jié)果。圖12為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目測(cè)試的帕莫諾立德C對(duì)所有的細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。圖13為帕莫諾立德D的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖14為帕莫i若立德D的NMR數(shù)據(jù)表格。圖15為帕莫i若立德E的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透碎見(jiàn)圖。圖16為帕莫i若立德E的NMR數(shù)據(jù)表格。圖17A為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目帕莫諾立德E的體外試驗(yàn)結(jié)果。圖17B為續(xù)表，顯示國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目帕莫諾立德E的體外試驗(yàn)結(jié)果。圖18為國(guó)立癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目測(cè)試的帕莫諾立德E對(duì)所有的細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。圖19為分離帕莫諾立德A-G的純化步驟。圖20為帕莫諾立德B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖21為帕莫諾立德F的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖22為帕莫諾立德G的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖23為帕莫諾立德H的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。圖24為帕莫諾立德K的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的透視圖。本發(fā)明詳述本發(fā)明涉及S.adareanum的提取物及其用途，所述提取物在本文中稱(chēng)作帕莫諾立德。本文中具體示例的帕莫諾立德包括帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫i若立德H和帕莫諾立德K。Field-basedfeeding-deterrentassays表明本發(fā)明4匕合物具有生物活性。這些4匕合物在國(guó)立癌癥研究院(NCI)60細(xì)胞系中具有選擇性活性，特別是能夠抑制黑素瘤細(xì)胞系。本發(fā)明化合物包括那些具有下式(I)化學(xué)結(jié)構(gòu)式的化合物及其異構(gòu)體、外消4t體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式o(i)其中=單鍵或雙鍵；W為甲醛、-CHCHNHC(O)-烷基、-OC-烷基、-OC-芳基、-OC-氨基、芳基、絲、-乙烯基酰絲、芳基酰狄、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、鹵素或-CHO,它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代H、烷基、烷絲、畫(huà)OH、-N02、-NH2、-COOH、鹵素或-CH3;R2獨(dú)立為OH、O-酰基、絲曱酸酯、H、O-烷基、絲、-OS03H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、卣素和/或氧代；R"為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基l^基、芳氧基il基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、卣素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、-N02、-NH2、-COOH、卣素和/或-CH3;R"獨(dú)立為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基;烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基皿、囟素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、N02、-NH2、-COOH、卣素和/或畫(huà)CH3。在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中R"均甲基。在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中在一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)I^為-OH，并且至少一個(gè)R2為-OC(NH2)0，并且任選R3和R4為-CH3。本發(fā)明化合物包括那些具有下式(I)化學(xué)結(jié)構(gòu)式的化合物以及其異構(gòu),至少一個(gè)R2為-OC(NH;j)0。，R3為甲基。，至少一個(gè)R"為甲基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)，R、-CHCHNHC(0)CHC(CH3)2。，R1》CHCHNHC(0)CHC(CH3)CH2C(CH3)CH2。，Ri為-CHCH-NHC(0)CH2C(CH3)CH2。,R!為-CH:0。，至少一個(gè)R2為-OH。，至少一個(gè)R2為-OS03H。體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式其中:(ii)W為甲醛、-CHCHNHC(O)-烷基、-OC-烷基、-OC-芳基、-OC-#J^、芳基、氨基、-乙烯基酰氮基、芳基酰氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基H基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、卣素或-CHO，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代H、烷基、烷氧基、-OH、-N02、-NH2、-COOH、卣素或-CH3;R2獨(dú)立為OH、O-?；?、狄甲酸酯、H、O-烷基、>tJ^-OS03H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、卣素和/或氧代；W為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基氣基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基氟基、雜芳氧基H基、雜環(huán)烷氧基羰基、自素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、N02、-NH2、-COOH、面素和/或-CEb;R獨(dú)立為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基氟基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基)^基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳lL&氟基、雜環(huán)烷M羰基、卣素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、-N02、-NH2、-COOH、g素和/或匿CH3。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)F^為-OC(NH2)0。在一個(gè)實(shí)施方案中，W為甲基。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)R"為甲基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)R"均為甲基。在一個(gè)實(shí)施方案中，R1為-CHCHNHC(0)CHC(CH3)2。在一個(gè)實(shí)施方案中，R1為-CHCHNHC(0)CHC(CH3)CH2C(CH3)CH2。在一個(gè)實(shí)施方案中，R1為-CHCH-NHC(0)CH2C(CH3)CH2。在一個(gè)實(shí)施方案中，！^為-CH-0。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)I^為-OH。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)F^為-OS03H。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)F^為-OH，并且至少一個(gè)R2為-OC(NH2)0，任選R3和R4為-CH3。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有分離的式(III)的帕莫諾立德A化合物的組合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)(in)在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有分離的式(IV)的帕莫諾立德C化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物o在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有分離的式(V)的帕莫諾立德D化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物O本發(fā)明也提供了含有分離的式(VI)的帕莫諾立德E化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物:0本發(fā)明也提供了含有分離的式(VII)的帕莫諾立德B化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(VII)本發(fā)明也提供了含有分離的式(VIII)的帕莫諾立德F化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>0NH2(vm)本發(fā)明也提供了含有分離的式(IX)的帕莫諾立德G化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(IX)本發(fā)明也提供了含有分離的式(X)的帕莫諾立德H化合物(或異構(gòu)體，外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物:OS03H(X)本發(fā)明也提供了含有分離的式(XI)的帕莫諾立德K化合物(或異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式)的組合物:(XI)在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，新化合物基本上是純的；理想的應(yīng)含有至少95%的化合物(根據(jù)已經(jīng)建立的分析方法測(cè)定)，可接受的應(yīng)含有至少90%的需要的化合物，可容許的應(yīng)含有至少75%的化合物。本發(fā)明也提供新的藥用組合物，其中本發(fā)明的新化合物或者兩種或多種此類(lèi)化合物的混合物占組合物總重量的0.01%-60%(重量比)，優(yōu)選0.1%-50%(重量比)，更優(yōu)選1%-35%(重量比)，該組合物還含有一或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本文中公開(kāi)的帕莫諾立德化合物存在多種互變異構(gòu)形式。所有的此類(lèi)互變異構(gòu)形式也是本發(fā)明的組成部分。本文所用的烷基是指具有1-20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的、飽和的或者單_或多不飽和的烴基，d-x烷基是指具有1至多至X個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，包括烷基、鏈烯基和炔基。例如，C^烷基指具有l(wèi)-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。烷氧基是指烷基-O-基團(tuán)，其中烷基如上所述。環(huán)烷基包括非芳族單環(huán)或多環(huán)體系，包括具有約3至約10個(gè)碳原子的稠合環(huán)和螺環(huán)。環(huán)烷基可以任選是部分不飽和。環(huán)烷氧基是指環(huán)烷基-O-基團(tuán)，其中環(huán)烷基如本文所定義。芳基是指芳族單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)體系，包括具有約6至約14個(gè)碳原子的稠合環(huán)和螺環(huán)。芳氧基是指芳基-O-基團(tuán)，其中芳基如本文所定義。烷基羰基是指RC(O)-基團(tuán)，其中R為本文所定義的烷基。烷氧基g是指ROC(O)-基團(tuán)，其中R為本文所定義的烷基。環(huán)烷基M是指RC(O)-基團(tuán)，其中R為本文所定義的環(huán)烷基。環(huán)烷氧基羰基是指ROC(O)-基團(tuán)，其中R為本文所定義的環(huán)烷基。雜烷基是指具有1-20個(gè)碳原子以及一或多個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的直鏈或支鏈，其中氮和硫原子可以任選被氧化，即它們可以是N-氧化物或S-氧化物的形式。雜環(huán)烷基是指單環(huán)或多環(huán)體系(它們可以是飽和的或部分不飽和的)，包括具有約5至約10個(gè)環(huán)成員的稠合環(huán)和螺環(huán)，其中在該環(huán)系中的一或多個(gè)環(huán)成員為不是碳的成員，可以選自氮、氧、硅或硫原子。雜芳基是指5至約14-元芳族單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)體系，包括稠合環(huán)和螺環(huán)，其中在該環(huán)系中的一或多個(gè)環(huán)成員為不是碳的成員，可以選自氮、氧、珪或硫原子，并且其中N原子可以是N-氧化物的形式。芳基羰基是指芳基-CO-基團(tuán)，其中芳基如本文所定義。雜芳基M是指雜芳基-CO-基團(tuán)，其中雜芳基如本文所定義，雜環(huán)烷基羰基是指雜環(huán)烷基-CO-基團(tuán)，其中雜環(huán)烷基如本文所定義。芳氧基羰基是指ROC(O)-基團(tuán)，其中R為如上所定義的芳基。雜芳氧基羰基是指ROC(O)-基團(tuán)，其中R為如上所定義的雜芳基。雜環(huán)烷氧基是指雜環(huán)烷基-O-基團(tuán)，其中雜環(huán)烷基如上所定義。雜環(huán)烷氧基M是指ROC(O)-基團(tuán)，其中R為如上所定義的雜環(huán)烷基。飽和的烷基的實(shí)例包括但不限于曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔-丁基、異丁基、仲-丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。不飽和的烷基為具有一或多個(gè)雙鍵或三鍵的烷基。不飽和的烷基包括，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、己烯基、乙烯基、2-丙炔基、2-異戊烯基、2-丁間二烯基、乙炔基、l-丙炔基、3-丙炔基和3-丁炔基。環(huán)烷基包括，例如環(huán)戊基、環(huán)己基、l-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基和環(huán)庚基。雜環(huán)烷基包括，例如1-p底咬基、2-派咬基、3-嗛咬基、3-嗎啉基、4-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、l-旅溱基、2-艱漆基和1，4-二氮雜雙環(huán)辛烷。芳基包括，例如苯基、茚基、聯(lián)苯基、l-萘基、2-萘基、蒽基和phenanthracenyl。雜芳基包括，例如l-處咯基、2-處咯基、3-p比咯基、呋喃基、塞汾基、咪唑基、嗜、唑基、噢唑基、吡唑基、吡咬基、吲咪基、會(huì)啉基、異喹啉基、苯并會(huì)啉基、啼唑基和二氮雜菲基。本文所用的鹵素是指元素氟(F)、氯(C1)、溴(Br)和碘(I)。本文所用的氧代是指含有與碳或其它元素以雙鍵連接的氧原子，即=0的化合物。該術(shù)語(yǔ)包括醛、羧酸、酮、磺酸、酰胺和酯。本發(fā)明也涉及試劑盒，在一或多個(gè)包裝中含有本發(fā)明的化合物或組合物。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有一或多種帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫i若立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H和帕莫諾立德K。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒另外含有藥學(xué)上可接受的載體，例如稀釋劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i試劑盒另外含有抗胂瘤或抗癌化合物。本發(fā)明也涉及抑制液胞(vacuolar)三磷酸腺苦酶(V-ATPase)的方法，該方法包括使得V-ATPase接觸或暴露于有效量的本發(fā)明化合物或組合物，所述有效量應(yīng)足以抑制V-ATPase的活性或阻斷其功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物或組合物包括一或多種帕莫諾立德，選自帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H和帕莫諾立德K。本發(fā)明還涉及抑制或殺死癌細(xì)胞的方法，包括使得所述細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明化合物或組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物或組合物含有一或多種帕莫諾立德，選自帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H和帕莫諾立德K?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明抑制或殺死的癌細(xì)胞的種類(lèi)包括但不限于下列組織或器官的癌細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞骨、乳房、腎、口腔、喉、食道、胃、睪丸、宮頸、頭部、頸、結(jié)腸、卵巢、肺、膀胱、皮膚(例如，黑素瘤)、肝、肌肉、胰腺、前列腺、血細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞)和腦。本發(fā)明也涉及治療與V-ATPase酶異常表達(dá)或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，它包括給予患有疾病并需要治療的人或動(dòng)物有效量的本發(fā)明化合物或組合物。可以才艮據(jù)本發(fā)明治療的疾病包括但不限于細(xì)胞增生疾病，例如癌癥；糖尿?。灰认傺?；和骨質(zhì)疏松癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物或組合物含有一或多種帕莫諾立德，選自帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫i若立德C、帕莫i若立德D、帕莫諾立德E、帕莫i若立德F、帕莫+若立德G、帕莫諾立德H和帕莫諾立德K。本發(fā)明也提供了治療患有癌癥或腫瘤疾病的人或動(dòng)物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予人或動(dòng)物治療有效量的至少一種獲自Synoicum種屬提取物的分離的化合物。所述動(dòng)物可以是(但不限于)哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類(lèi)(猴、黑猩猩、猿等)、犬、貓、牛、豬或馬，或者是患有腫瘤疾病的其它動(dòng)物。本發(fā)明的方法可以任選包括診斷人或動(dòng)物需要或可能需要進(jìn)行癌癥或腫瘤疾病的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，Synoicum種屬為S.adareanum，分離的化合物為帕莫諾立德。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，l帕莫諾立德選自帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H和帕莫諾立德K?？梢圆鹏迵?jù)本發(fā)明治療的癌癥的種類(lèi)包括但不限于下列組織或器官的癌癥和/或腫瘤疾病骨、乳房、腎、口腔、喉、食道、胃、睪丸、宮頸、頭部、頸、結(jié)腸、卵巢、肺、膀胱、皮膚(例如，黑素瘤)、肝、肌肉、胰腺、前列腺、血細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞)和腦。進(jìn)行腫瘤疾病的治療時(shí)，可以將本發(fā)明化合物和組合物與其它抗腫瘤或抗癌藥物聯(lián)合給藥于需要治療的患者，或者與放射治療和/或光動(dòng)力學(xué)治療或與外科手術(shù)治療一起聯(lián)合應(yīng)用以除去肺瘤。這些其它藥物或放療可以與本發(fā)明化合物或組合物在相同的時(shí)間或不同的時(shí)間給予。例如，本發(fā)明化合物或組合物可以與下列藥物聯(lián)合應(yīng)用有絲分裂抑制劑，例如紫杉醇或長(zhǎng)春喊；烷化劑，例如環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺；抗代謝物，例如5-氟尿嘧啶或羥基脲；DNA嵌入劑，例如阿霉素或博萊霉素；拓樸異構(gòu)酶抑制劑，例如依托泊甙或喜樹(shù)堿；血管新生抑制劑，例如血管抑素(angiostatin);抗雌激素藥物，例如他莫西芬；和/或其它抗癌藥物或抗體，例如，GLEEVEC(NovartisPharmaceuticalsCorporation)和HERCEPTIN(Genentech，Inc.)。本發(fā)明也涉及分離和純化本發(fā)明化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括溶劑萃取Synoiciim被嚢類(lèi)；除去所述溶劑得到提取物；將所述提取物分館以分離所述帕莫諾立德。本發(fā)明也涉及合成本發(fā)明化合物的方法。"藥學(xué)上可接受的載體"是指任何載體、稀釋劑、賦形劑、潤(rùn)濕劑、緩沖劑、混懸劑、潤(rùn)滑劑、輔助劑、溶媒、傳遞系統(tǒng)、乳化劑、崩解劑、吸收劑、防腐劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或餘朱劑，優(yōu)選無(wú)毒并適合用于藥用組合物的載體。"藥學(xué)上可接受的等價(jià)物(equivalent)"包括但不限于藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式、水合物、代謝物、前藥和等排體。許多藥學(xué)上可接受的等價(jià)物在體外或體內(nèi)都應(yīng)具有與本發(fā)明化合物相同或相似的活性。"藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式，，是指具有需要的藥理學(xué)活性的本發(fā)明化合物的鹽，它們既非生物學(xué)也非其它方面所不需要的?？梢耘c酸形成的鹽包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚酸鹽(glucoheptanoate)、甘油砩酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、硫氰酸鹽、甲笨璜酸鹽和十一烷酸鹽。堿性鹽的實(shí)例包括銨鹽；堿金屬鹽，.例如鈉和鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鈣和鎂鹽；與有機(jī)堿形成的，例如二環(huán)己基胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺；與氨基酸例如精氨酸和賴(lài)氨酸形成的鹽。含有堿性氮的基團(tuán)可以用某些試劑季銨化，所述試劑包括低級(jí)烷基卣化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯，例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基琉酸酯；長(zhǎng)鏈卣化物，例如癸基、十二烷基、十四烷基和硬脂?；栈锖蚟fc物；芳烷基面化物，例如千基和苯乙基溴化物。"前藥"是指本發(fā)明化合物的衍生物，它經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化(例如經(jīng)過(guò)代謝)后發(fā)揮藥理學(xué)作用。制備前藥的目的在于提高化學(xué)穩(wěn)定性、改善患者的接受程度和依從性、改善生物利用度、延長(zhǎng)作用時(shí)間、改善器官選擇性、改善制劑性能(例如，增加水溶性)和/或降低副作用(例如，毒性)。采用本領(lǐng)域已知的方法，例如根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法(Burger'sMedicinalChemistryandDrugChemistry,第5版，第1巻，第172-178頁(yè)，第949-982頁(yè)(1995))可以容易地自本發(fā)明化合物制備前藥。本文所用的"帕莫諾立德"是指攜有碳酸酯和酰胺官能團(tuán)的多元大環(huán)聚酮化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，帕莫諾立德自采集自南極Palmer站附近的凈皮嚢類(lèi)Synoicwnadareanum分離得到。本文所用的"聚酮化合物，，是指任何含有交替的羰基和亞甲基的天然化合物(P-聚酮)，通過(guò)乙酰輔酶A的重復(fù)縮合而獲得。本文所用的"大環(huán)"是指各種半-化合物(semi-compounds)在各個(gè)位點(diǎn)上連接而成環(huán)狀排列的大分子。連接的位點(diǎn)和亞-分子的性質(zhì)決定了含有它們的化合物的性質(zhì)和生理學(xué)功能。本文所用的"大環(huán)內(nèi)酯"是指一類(lèi)抗生素，其特征在于分子由大環(huán)內(nèi)酯構(gòu)成。本文所用的"鏈烯烴"與"烯烴"具有相同意義，是指含有一或多個(gè)雙鍵的無(wú)環(huán)烴。本文所用的"臨床響應(yīng)"為細(xì)胞增生性疾病(例如黑素瘤、結(jié)腸癌和腎癌)對(duì)采用本文公開(kāi)的新化合物進(jìn)行治療的響應(yīng)。評(píng)價(jià)對(duì)治療的響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)已被廣泛接受，能夠比較不同治療的療效(參見(jiàn)Slapak和Kufe，PrinciplesofCancerTherapy,inHarrison'sPrinciplesofInternalMedicine,第13版，Isselbacher等編輯，McGraw-Hill,Inc.1994)。完全響應(yīng)(或完全緩解)是可檢測(cè)的惡性疾病消失。部分響應(yīng)是一或多個(gè)病變的最大垂直直徑降低約50%。任何病變的大小不再增加或者沒(méi)有新病變出現(xiàn)。進(jìn)行性疾病意^^木著一種病變或腫瘤的最大垂直直徑增加了至少約25%或者有新的病變或腫瘤出現(xiàn)。對(duì)治療的響應(yīng)的評(píng)價(jià)是在患者完成治療后進(jìn)行的。本發(fā)明的"藥用組合物"應(yīng)與預(yù)計(jì)的給藥途徑相符合。給藥途徑的實(shí)例包括腸胃外(例如，靜脈內(nèi))、真皮內(nèi)、皮下、口服或鼻腔(例如，吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直腸給藥。用于胃腸外、真皮內(nèi)或皮下給藥的溶液或懸浮液可以包含下列成分無(wú)菌稀釋劑，例如注射用水、生理鹽水、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如千醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；用于調(diào)節(jié)滲透壓的成分，例如氯化鈉或葡萄糖?？梢圆捎盟峄驂A(例如鹽酸或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)pH。腸胃外制劑可以封裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。適用于注射給藥的藥用組合物包括無(wú)菌含水溶液(水溶性的)或分散液和無(wú)菌粉末，該粉末可以臨時(shí)配制為無(wú)菌注射溶液或分歉液。對(duì)于靜脈給藥而言，適當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。在任何情況下，該組合物必須是無(wú)菌的，并且應(yīng)該是能夠流動(dòng)的以滿(mǎn)足易于注射的要求。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下它必須是穩(wěn)定的，它必須進(jìn)行防腐以對(duì)抗微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如7JC、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。通過(guò)例如采用包衣(例如卵磷脂包衣)、在分散液的情況下通過(guò)保持必需的粒子大小以及通過(guò)采用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。預(yù)防微生物的作用可以通過(guò)加入各種抗菌和抗真菌成分(例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)來(lái)進(jìn)行。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲成分，例如糖類(lèi)、多元醇類(lèi)(例如甘露醇或山梨醇)和/或氯化鈉。注射用組合物的延遲吸收可以通過(guò)在組合物中加入延遲吸收的成分來(lái)產(chǎn)生，所述成分例如單硬脂酸鋁和明膠。無(wú)菌注射溶液可以通過(guò)向適當(dāng)?shù)娜軇┲屑尤氡匦枇康幕钚曰衔镆约吧厦嫠信e的成分的一種或其組合進(jìn)行制備，如果需要，隨后過(guò)濾除菌。通常，通過(guò)將活性化合物加入無(wú)菌載體(含有堿性*介質(zhì)以及必需的上面所列舉的其它成分)中制備^t液。對(duì)于用于配制無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，由預(yù)先過(guò)濾除菌的溶液產(chǎn)生活性成分以及任何其它需要的成分的粉末?？诜M合物通常包含惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以包封在明膠膠嚢中或者壓制成片劑。為口服治療給藥，活性化合物可以與賦形劑混和，可以以片劑、錠劑或膠嚢的形式使用?？诜M合物也可以采用液體載體制備，用作漱口藥，其中液體栽體中的化合物可以經(jīng)口使用，漱口并吐出或者吞咽。藥學(xué)上可相容的粘合劑和/或輔料也可以作為組合物的組成部分。片劑、丸劑、膠嚢、錠劑等可以含有下列任何成分或相似性質(zhì)的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃茂膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸、羧甲基淀粉鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑；例如膠體二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸曱酯或橙味劑。對(duì)于吸入給藥而言，化合物以氣霧劑的形式自含有適當(dāng)拋射劑(例如氣體，如二氧化碳)的壓力容器或給藥器中或者自噴霧器中給藥。全身性給藥也可以通過(guò)透粘膜或透皮方法進(jìn)行。對(duì)于透粘膜或透皮給藥而言，在制劑中可以使用對(duì)需要進(jìn)行滲透的屏障而言適當(dāng)?shù)臐B透劑。此類(lèi)滲透劑通常在本領(lǐng)域中是已知的，對(duì)于透粘膜給藥而言，包括例如清潔劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。透粘膜給藥可以通過(guò)采用鼻腔噴霧劑或栓劑進(jìn)行。對(duì)于透皮給藥而言，可以將活性化合物制成本領(lǐng)域中已知的軟膏、油膏、凝膠或霜?jiǎng)??；衔镆部梢灾苽錇樗▌┑男问?例如采用常規(guī)栓劑基質(zhì)，例如可可油和其它甘油酯類(lèi))或用于直腸給藥的保留灌腸劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物可以與載體一起制備為例如控釋制劑，包括^和微嚢傳遞系統(tǒng)，所述載體可以保護(hù)化合物避免其在體內(nèi)的快速消除?？梢圆捎蒙锟山到?、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類(lèi)制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域才支術(shù)人員而言是已知的。該物質(zhì)也可以購(gòu)自AIzaCorporationandNovaPharmaceuticals,Inc.。月旨質(zhì)體懸浮液(包括對(duì)單克隆抗體(病毒抗原的抗體)感染的細(xì)胞靶向的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)上可接受的栽體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。通過(guò)直接與細(xì)胞接觸或者通過(guò)載體的方法，本發(fā)明化合物和組合物可以傳遞到細(xì)胞。將組合物傳遞到細(xì)胞的載體方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括例如將化合物或組合物包封到脂質(zhì)體中。將本發(fā)明化合物傳遞到細(xì)胞的另一種方法包括將化合物附著到能夠靶向傳遞到靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)或核酸上。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,960,648和公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030032594公開(kāi)了能夠與其它化合物偶聯(lián)的氨基酸序列，它能夠使得化合物改變位置通過(guò)生物膜。公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0020035243也描述了能夠?qū)⑸飳W(xué)成分轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜的組合物，用于細(xì)胞內(nèi)傳遞。化合物和組合物也可以結(jié)合到聚合物中，聚合物的實(shí)例包括用于顱內(nèi)腫瘤的聚(D-L丙交酯-共-乙交酉旨)聚合物；摩爾比為20:80的聚[雙(對(duì)^J^苯氧基)丙烷癸二酸](如GLIADEL中所使用的)；軟骨素；殼多糖；和殼聚糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明化合物可以含有一或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)取代的碳原子，因此，可以產(chǎn)生立體異構(gòu)體。所有此類(lèi)立體異構(gòu)體(包括對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體以及混合物，包括其外消旋混合物)都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。"治療有效量，，為本發(fā)明帕莫諾立德(包括帕莫諾立德A、B、C、D、E、F、G、H和K)或其任何組合的量，該量是能夠在體內(nèi)提供治療有效量的相應(yīng)的化合物所必須的量。該化合物的量必須是能夠有效地獲得響應(yīng)，包i括但不限于完全預(yù)防(例如，預(yù)防和完全治愈)和提高生存率或更快疾愈或選擇的指征。才艮據(jù)本發(fā)明，適當(dāng)?shù)膯蝿┝康拇笮樵谶m當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)給藥一或多次后能夠預(yù)防或緩解(減少或消除)患者癥狀的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)哺乳動(dòng)物的體積以及給藥途徑輕易地確定用于全身給藥的適當(dāng)?shù)膯蝿┝看笮　?shí)施例1-用于體內(nèi)初步試驗(yàn)的中空纖維分析(HOLLOWFIBERASSAYFORPRELIMINARYINVIVOTESTING)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)部門(mén)采用了體內(nèi)初步篩選工具用于評(píng)價(jià)大^U莫體外細(xì)胞篩選所鑒別的化合物的潛在的抗癌活性。該中空纖維分析自1995年6月就已經(jīng)開(kāi)始使用(http:〃dtp.nci,nih.gov/branches/btb/hfa.html)。測(cè)試每一個(gè)化合物對(duì)抗12種人類(lèi)胂瘤細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)群組，包括NCI-H23、NCI-H522、MDA-MB-231、MDAMB435、SW620COLO205、LOXIMVI、UACC-62、OVCAR-3、OVCAR5、U251和SF-295。將該細(xì)胞系在含有10%FBS和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640中進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)行中空纖維制備的前一天，將細(xì)胞補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基以保持對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。為進(jìn)行纖維制備，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶處理技術(shù)收獲細(xì)胞，將其以所需的細(xì)胞密度(根據(jù)細(xì)胞系的不同，密度為2-10xl(^細(xì)胞/ml)懸浮。將細(xì)胞懸浮液沖洗到1mmI.D.聚乙二烯中空纖維(排阻分子量為500,000Da)中。將該中空纖維以2cm的間隔進(jìn)行熱密封，在#^進(jìn)行前將這些密封段中的樣品置于組織培養(yǎng)基中于37。C、5。/。C02中培養(yǎng)24-48小時(shí)。對(duì)于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)均制備共3種不同的肺瘤細(xì)胞系以使得每一個(gè)小鼠都可以接受3種M內(nèi)植入物(每一個(gè)腫瘤系植入1種)和3種皮下植入物(每一個(gè)腫瘤系植入1種)。在植入進(jìn)行的當(dāng)天，每一個(gè)腫瘤細(xì)胞系的樣品均通過(guò)穩(wěn)定的終點(diǎn)MTT分析進(jìn)行活細(xì)胞定量，以獲知零時(shí)(0)的細(xì)胞量。所以，可以測(cè)定實(shí)驗(yàn)化合物抑制細(xì)胞和殺滅細(xì)胞的能力。中空纖維植入后的第3或4天開(kāi)始用實(shí)驗(yàn)物質(zhì)治療小鼠，每天一次，共4個(gè)劑量。每一種物質(zhì)通過(guò)腹膜內(nèi)注射2個(gè)劑量水平來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，方案為3只小鼠/劑量/實(shí)驗(yàn)。載體對(duì)照包括6只小鼠，只接受化合物稀釋劑。在第四次化合物治療后的當(dāng)天自小鼠回收纖維，進(jìn)行穩(wěn)定的終點(diǎn)MTT分析。在540nm處光度法測(cè)定每一個(gè)樣品的光密度，計(jì)算每一個(gè)治療組的均值。計(jì)算每一個(gè)治療組中凈細(xì)胞生長(zhǎng)的百分率，與載體處理的對(duì)照組中的凈細(xì)胞生長(zhǎng)的百分率進(jìn)行比較。在共4個(gè)實(shí)驗(yàn)(3細(xì)胞系/實(shí)驗(yàn)x4實(shí)f12細(xì)胞系)中評(píng)價(jià)每一個(gè)化合物。根據(jù)多個(gè)中空纖維分析的數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行篩選進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)(例如，時(shí)間/劑量暴露研究的初步藥理學(xué)研究，皮下異種移植療效研究)。標(biāo)準(zhǔn)包括(1)48個(gè)可能的實(shí)驗(yàn)組合(12細(xì)胞系x2個(gè)位點(diǎn)x2個(gè)化合物劑量)中有10個(gè)凈細(xì)胞生長(zhǎng)降低50%或者更多；(2)24個(gè)遠(yuǎn)位點(diǎn)組合(腹膜內(nèi)給藥/皮下培養(yǎng)物)中最少有4個(gè)凈細(xì)胞生長(zhǎng)降低50%或者更多；和/或(3)在任一個(gè)植入位點(diǎn)中一或多個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞被殺滅(活細(xì)胞量降低至低于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的水平)。為了簡(jiǎn)化評(píng)價(jià)，采用分值系統(tǒng)(pointsystem)進(jìn)行評(píng)價(jià)，它能夠快速考察指定化合物的活性。為此，給能夠使得活細(xì)胞數(shù)量降低50%或以上的每一個(gè)化合物指定為2分。腹膜內(nèi)和皮下樣品分別計(jì)分以便于將標(biāo)準(zhǔn)(1)和(2)定值。IP+SC結(jié)合給藥的化合物計(jì)分為20分，SC給藥的化合物計(jì)分為8分，或者凈細(xì)胞殺滅一或多個(gè)細(xì)胞系的化合物可以考慮進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。一種藥物的最大可能的分值為96分(12細(xì)胞系x2個(gè)位點(diǎn)x2個(gè)劑量水平x2[分值)。在中空纖維分析和異種移植實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)比較>80個(gè)隨機(jī)選擇的化合物的活性結(jié)果從統(tǒng)計(jì)學(xué)上證實(shí)了這些標(biāo)準(zhǔn)。該比較顯示如果將中空纖維分析用作體內(nèi)初篩選方法，那么遺漏異種移植活性化合物的可能性非常小。因?yàn)橹锌绽w維分析設(shè)計(jì)上的原因，不能報(bào)告單一細(xì)胞系的結(jié)果，因?yàn)樵摲治龅慕y(tǒng)計(jì)能力是基于化合物對(duì)整個(gè)細(xì)胞系組的影響。除了中空纖維分析結(jié)果外，其它因素(例如，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理等)也可能導(dǎo)致對(duì)化合物進(jìn)行其它研究(如果化合物不能滿(mǎn)足這些中空纖維分析的標(biāo)準(zhǔn))。實(shí)施例II-帕莫諾立德的分離獲自S.adareanum的提取物(帕莫諾立德A、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D和帕莫諾立德E)在field-basedfeeding-deterrentassays中顯示活性，使得本發(fā)明者對(duì)這些活性的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。提供了新的分離的聚酮化合物，帕莫諾立德A、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D和帕莫諾立德E，它們是獲自S.adareanum提取物的主要天然產(chǎn)物。這些聚酮化合物在國(guó)家癌癥研究院(NCI)60細(xì)胞系組(panel)中顯示有細(xì)胞毒性，特別是能夠抑制其中黑素瘤(UACC-64，LC500.018nM)，較其它實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系的敏感性高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。根據(jù)相似的方法，采用發(fā)明人的用于分餾親脂性天然產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)方案分離帕莫諾立德A-H和K。凍干的生物質(zhì)(biomass)盡可能用二氯甲烷/甲醇1:1(3x)萃取完全，將合并的萃取物濃縮至干。將萃取物上樣到用100。/。己烷填充的珪膠柱上。兩倍柱體積的己烷分兩部分洗脫，隨后采用兩倍柱體積的1:9、2:8、4:6、8:2的乙酸乙酯/己烷、100%乙酸乙酯和最后的5%、10。/。和20。/。MeOH/乙酸乙酯梯度洗脫，收集每一個(gè)柱體積作為一個(gè)流分。重復(fù)進(jìn)行高效液相色譜(HPLC;WatersYMC5n，ODS10mmx30mm，采用不同量的水MeCN洗脫，取決于分離要求)，得到純化的5種帕莫諾立德。(參見(jiàn)圖19)。其它帕莫諾立德代謝物可以自該親脂性提取物的極性更大的流分分離。例如，自親脂性提取物的快速色譜的乙酸乙酯/甲醇洗脫流分的其它分餾產(chǎn)物獲得三種極性更大的帕莫諾立德(通過(guò)^NMR色i普檢測(cè)，這些帕莫諾立德更高度羥基化)。本文所述的生物分析以及其它本領(lǐng)域已知的分析可以證實(shí)這些分離產(chǎn)物的生物活性。在親水性提取物中存在的極性更大的帕莫諾立德或其它黑素瘤-生物活性化合物可以通過(guò)反相真空色i普進(jìn)行分餾。用水通過(guò)真空漏斗填充C-18改良珪膠，然后將提取物上樣，采用兩倍柱床體積的水和1:9、2:8、4:6、8:2的甲醇/水、然后是100%甲醇真空洗脫，收集每一個(gè)柱床體積的流分?；蛘?，可以將極性成分吸附在聚苯乙烯樹(shù)脂(HP-20或XAD)上，采用相似的曱醇或丙酮梯度洗脫方案。然后將如此獲得的色i普流分濃縮并進(jìn)4亍生物分析。隨后或者可選擇進(jìn)行本領(lǐng)域已知的色鐠步驟，采用上述相同的固定相，釆用更窄的溶劑梯度，或者如果需要的話(huà)，采用其它固定相例如凝膠滲透(LH-20或G-IO)以獲得純化。通過(guò)HPLC對(duì)生物活性分離產(chǎn)物進(jìn)^f亍最后的純化。才艮據(jù)分離產(chǎn)物的色譜行為采用多種固定相在HPLC上進(jìn)行分離。通常，反相(C-18，苯基)柱適用于非極性化合物，正相柱適用于中等極性的化合物，其它多種鍵合相(氨基、氰基、二醇)柱適用于與填充物具有相似性質(zhì)的化合物。然而，采用反相HPLC分離極性最大的有機(jī)化合物并非罕見(jiàn)。值得注意的是，發(fā)明人已經(jīng)成功地采用聚合固定相C-18(YMC和/或Waters)(適用于純水和/或緩沖溶劑)以便于可以通過(guò)反相HPLC分離極性最大的代謝物(氨基酸，核苷)。發(fā)明人的HPLC設(shè)備裝配有系列質(zhì)量敏感性(差示折光率(RI)和/或蒸發(fā)光散射(ELSD))檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器。雙重檢測(cè)是重要的，因?yàn)镽I或ELSD檢測(cè)器盡管相對(duì)不敏感但是對(duì)質(zhì)量有成比例的響應(yīng)。紫外檢測(cè)器是高度敏感的，但是其響應(yīng)根據(jù)生色團(tuán)的消光系數(shù)而改變。該HPLC裝置包括分析、半制備和制備性能(四種設(shè)備，0.1mL/min至300mL/min)，當(dāng)需要時(shí)，發(fā)明人的LC/MS可以與任何設(shè)備整合以添加MS(總離子色譜，TIC)檢測(cè)，以保證分離產(chǎn)物具有質(zhì)譜特征的優(yōu)點(diǎn)。盡管發(fā)明人具有用于制備性分離帕莫諾立德的HPLC設(shè)備，但該方法也有某些缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)可以通過(guò)采用本領(lǐng)域已知的高速逆流色譜法(CCC)或高速分配色譜法(CPC)克服。CCC和CPC對(duì)兩種不混容相之間的被分析物的分離具有優(yōu)點(diǎn)，與吸收色i普相比，物理性質(zhì)使其具有較高的回收率。目前可用的設(shè)備包括用于制備量分離的多體積轉(zhuǎn)子(兩種技術(shù)均采用旋轉(zhuǎn)誘發(fā)的重力梯度)。Foucault等采用水/DMSO/THF系統(tǒng)完成了聚酮大環(huán)內(nèi)酯(兩性霉素B)的成功純化，這是帕莫諾立德純化的良好開(kāi)端。(FoucauIt，A.P.等，1993)。實(shí)施例III-帕莫諾立德A自粗品親脂性(l:l曱醇/二氯甲烷)提取物的硅膠色鐠洗脫的1:1曱醇/乙酸乙酯流分中分離獲得的帕莫諾立德A為白色固體。通過(guò)質(zhì)傳分析得知分子式為C33H48N207(HRFABMSm/z585.3539，A0.1mmu，[M++l])。中白莫諾立德A的C-l至C-24碳骨架可以根據(jù)^-"C連接性排布由gHMBC光傳清楚地歸屬。通過(guò)觀察C-19(373.69)次甲基與C-l酯羰基之間的相關(guān)性可以完成大環(huán)的連接。根揚(yáng)gHMBC和COSY波鐠中羥基質(zhì)子的偶合可以明確歸屬C-7和C-10處的羥基次甲基在gHMBC波譜中，羥基質(zhì)子與a-和(5-碳分別相關(guān)，而在COSY波鐠中，可以觀察到羥基質(zhì)子和羥基次甲基質(zhì)子相關(guān)。異戊烯酰基酰胺(通過(guò)2DNMR分析確定的)完成了大體結(jié)構(gòu)，除了分子式中C02NH2未能歸屬外。該剩余的碳與攜有氧的C-ll(575.25)上的質(zhì)子相關(guān)，但其它連接性不明顯。最后剩余的化M—定是被-NH2占有的，從而得到在C-ll上的氨基甲?；?，完成了帕莫諾立德A的平面結(jié)構(gòu)。立體化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所有雙取代的烯烴均為E構(gòu)型，這是根據(jù)它們的較大的偶合常數(shù)(>14Hz)確定的。根據(jù)在ROESY波i普中觀察到的H-16與H2-18和H-15與H3-25的相關(guān)性，將C-16位的三取代的烯烴也指定為E構(gòu)型。同樣，根據(jù)H-24與,Hb-27、H-23與H3-27和H-21以及H3-27與H-20和H3-26的ROESY相關(guān)性，也將C-21烯烴指定為E構(gòu)型。帕莫諾立德A的(R)-和(S)-MTPA酯41證明C-7和C-10均為R構(gòu)型。根據(jù)觀察到的鄰位質(zhì)子間小的3Jh-io/h-ii以及H-10/C-12和H-ll/C-9關(guān)聯(lián)的大的3jCH，C-10/C-11片段的構(gòu)型分析42確定了H-10和H-ll的旁式(gauche)關(guān)系。在2jon/h-k)和^cm()/h-ll中也發(fā)現(xiàn)了構(gòu)像的其它證據(jù)，它們兩者均為大和負(fù)的，從而確定C-ll的絕對(duì)立體化學(xué)為R。同樣，根據(jù)大3Jh-19/H-20、小3Jc-21/H-19、3Jc-26/H-19和3Jc.l8/H-20以及大2Jc-19/H-20，C-19/C-20體系的構(gòu)型分析表明各個(gè)質(zhì)子的反式(anti)關(guān)系。在該碎片中C-18的相對(duì)位置通過(guò)下述確定觀察到的H2-18和H-20以及H2-18和H3-26之間的ROESY相關(guān)性，而在H2-18和H-21之間沒(méi)有觀察到ROESY相關(guān)性，需要19R*、208*的相對(duì)構(gòu)型。帕莫諾立德A的NMR數(shù)據(jù)可以參見(jiàn)表2。在大環(huán)中的四個(gè)烯烴限制了大環(huán)內(nèi)酯中常見(jiàn)的柔性，j吏得易于用NOE研究進(jìn)行立體化學(xué)分析。ROESY波鐠的進(jìn)一步分析顯示大環(huán)內(nèi)酯具有淚滴形狀的環(huán)的兩個(gè)較大的平面?zhèn)让?，一?cè)由C-1至C-6構(gòu)成，另一側(cè)由C-11至C-19構(gòu)成，C-7至C-10提供了彎曲的連接。特別的是，H-19、H3-27、H-15和112-13(參見(jiàn)圖3)在ROESY光i普中順序相關(guān)，H3-26、H2-18、H-16、H-14和H-12同樣如此，從而定義了西半球的頂部和底部的邊界。H-ll只與頂部的一系列質(zhì)子相關(guān)，結(jié)果只與C-19和C-11均為R構(gòu)型一致。被嚢類(lèi)并非公知的I型聚酮化合物的產(chǎn)生者，盡管patellazoles和iejimalides是重要的具有生物活性的代表。帕莫諾立德A與眾不同地?cái)y有小的大環(huán)，它為20元環(huán)(而patellazoles和iejimalides為24元環(huán))，并攜有乙烯基酰胺，該特征與衍生自藍(lán)藻的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)例如tolytoxin更相關(guān)。帕莫諾立德A對(duì)多種其它黑素瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性(見(jiàn)圖2)，M14(LC500.076jiM)、SK-MEL-5(6.8jiM)和LOXIMVI(9.8jiM)，對(duì)前述UACC-62也具有細(xì)胞毒性。除了黑素瘤(圖3)、一種結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCC-2998，6.5nM)(圖4A)和一種腎癌細(xì)胞系(PvXF393，6.5jiM)(圖4B)外，帕莫諾立德A對(duì)其他缺乏細(xì)胞毒性(LCs(^10nM)，這表示在測(cè)試細(xì)胞系中對(duì)大多數(shù)敏感細(xì)胞的選擇性指數(shù)為103。重要的是，在NCI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)帕莫諾立德A進(jìn)行檢索為COMPARE.-陰性的，顯示其作用機(jī)理未見(jiàn)才艮道。圖4A和4B顯示了國(guó)家癌癥研究院開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目對(duì)帕莫諾立德A進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5顯示了國(guó)家癌癥研究院(NCI)開(kāi)發(fā)治療項(xiàng)目給出的帕莫諾立德A對(duì)所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線。作為比較，對(duì)黑素瘤(圖6)、結(jié)腸癌(圖7)和腎癌(圖8)分別給出了單獨(dú)的試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例IV-帕莫諾立德C的細(xì)胞毒性帕莫諾立德C(在下面和圖9中列示)的化學(xué)式為C33H49N207(NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)圖10)。NCI細(xì)胞毒性在圖IIA和圖IIB中給出。NCI給出的對(duì)所有細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線列示于圖12。實(shí)施例V-帕莫諾立德D的細(xì)胞毒性帕莫諾立德D(在下面和圖13中列示)的化學(xué)式為C36H53N207。帕莫諾立德DNMR數(shù)據(jù)列示于圖14。實(shí)施例VI-帕莫諾立德E的細(xì)胞毒性帕莫諾立德E(在下面和圖15中列示)的化學(xué)式為C27H39N07(NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)圖16)。NCI細(xì)胞毒性在圖17A和圖17B中給出。NCI給出的對(duì)所有細(xì)胞系的劑量響應(yīng)曲線列示于圖18。實(shí)施例VII一生物分4斤確定的細(xì)胞系(UACC-62、SK-MEL-5和MK14，它們都對(duì)帕莫諾立德A敏感)獲自用于細(xì)胞培養(yǎng)的NCI標(biāo)準(zhǔn)方案。在空氣濕度為95%、于5%C02、37。C的環(huán)境中使UACC-62(Amundson等，2000)和MEL14(Lin等，2003)細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血清和谷氨酰胺并采用抗生素(IOO單位/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素)處理。SK-MEL-5(Miracco等，2003)。在空氣濕度為95%、于5%C02、37。C的環(huán)境中，使細(xì)胞在含有Earle氏BSS的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基使其中含有1.5g/L碳酸氬鈉、O.lmM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸鈉。生物分析采用96-孔格MTT-based(Vogt等，2004)方法對(duì)帕莫諾立德及其衍生物導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞致死率進(jìn)行定量。在該分析中，代謝活性細(xì)胞裂解甲基瘞唑四唑(MTT)(它是黃色的)形成紫色甲臘染料，同時(shí)伴有紫外位移，可以采用讀板4義于540nm處測(cè)定吸收進(jìn)行定量。實(shí)施例VIII-生物活性代謝物的結(jié)構(gòu)闡述當(dāng)分離代謝物時(shí)，分離物的鑒另"(去冗余)是重要的。，HNMR色語(yǔ)檢測(cè)(與LC/MS和/或ESIMS的質(zhì)譜喉息結(jié)合使用)通?？梢杂糜阼b別前述化合物。海洋天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和追溯非常有助于去冗余；Drs.J.Blunt和M.Munro(Blunt，J.W.;Munro,M.H.G.MarinLit.UniversityofCanterbury,Christchurch，NewZealand,12.4版，2004)出品的海洋天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)以及NIST和Wiley的質(zhì)譜庫(kù)在這方面是有用的。如帕莫諾立德A的初期數(shù)據(jù)部分所述，將新化合物進(jìn)行徹底的波譜分析。當(dāng)代色i普方法可以用于新分離物的結(jié)構(gòu)確定(Crews等人，1998;Silverstein等人，1998)。一維質(zhì)子和碳NMR波i普，與質(zhì)語(yǔ)分析(得自LC/MS或電噴霧離子化(ESI)或基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)質(zhì)譜儀)結(jié)合使用，可以保證新化合物分子式的準(zhǔn)確歸屬。組合4吏用二維NMR技術(shù)例如COSY(Aue等人，1976)或具有TOCSY的擴(kuò)展的自旋系統(tǒng)(Braunschweiler等人，1983)，可以確立雙鍵和三鍵質(zhì)子-質(zhì)子的連接。采用HMQC或HSQC(Bax等人，1986a;Bodenhausen等人，1980)(—鍵)和HMBC(Bax等人，1986b)(兩鍵或三鍵)可以確立質(zhì)子-碳的連接。這些NMR實(shí)驗(yàn)最通常以用于得到最大敏感性的梯度(Maudsley等人，1978;Ruiz-Cabello等人，1992)模式獲得，如果需要的話(huà)，可以釆用溶劑峰壓制法。如果有足夠的物質(zhì)可用，則可以通過(guò)采得2D-INADEQUATE波譜圖(Bax等人，1980)確立碳-碳連接；13C-13C偶合的直接測(cè)定使得結(jié)構(gòu)的重要部分容易確定。如果可能的話(huà)，根據(jù)偶合常數(shù)數(shù)據(jù)和原子核歐沃豪斯效應(yīng)(nuclearOverhauserenhancement)的結(jié)果或NOESY(Crews等人，1998;Silverstein等人，1998)技術(shù)或者通過(guò)衍生化或降解對(duì)構(gòu)型限定體系中的立體化學(xué)進(jìn)行確定。以采用分析31冊(cè)和2'3jcH(分別衍生自去偶合和/或ECOSY(Griesinger等人，1985)(3j冊(cè))或J-分解的HMBC(Furihata等，1999)(2，3Jch))的Murata方法(Murata等，1999)對(duì)柔性體系(線性或大環(huán))的立體化學(xué)進(jìn)行分析。在波鐠方法不能確定的情況下，則可以采用化學(xué)衍生化和/或降解技術(shù)進(jìn)步一闡明結(jié)構(gòu)，或者可以生長(zhǎng)晶體以便于X-射線晶體分析(Yoshida等人，1995;Ankisetty等，2004)。實(shí)施例IX-降解研究帕莫諾立德為降解研究提供了豐富的官能化作用(functionalization)。帕莫諾立德A、D和/或E的還原臭氧分解產(chǎn)生三種己烷多元醇(11-13，流程l)。通過(guò)將11的旋光與確鑿的(R，+)-l，2，6-三羥基己烷(Wu等人，2000)的旋光比較，可以獲得這些帕莫諾立德中C-7位的立體化學(xué)構(gòu)象。通過(guò)與四-醇12比較可以證明C-10和C-ll的位置，所述醇在化學(xué)文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。才艮據(jù)制備相似化合物的流程(Zhu等人，2001)，可以容易地自D-半乳糖制備四-醇12(流程2)。通過(guò)采用高碘酸裂解D-半乳糖1,3-乙縮醛(16)(Dolder等人，1990)，然后通過(guò)Wittig反應(yīng)同系化、氫化(Zhu等人，2001)和水解可以提供需要的12，用于比較。帕莫諾立德E(9，R:CHO)OH13流程l:帕莫諾立德A(l)、D(8)和E(9)的降解研究(臭氧分解)。流程2:制備(2R，3R)-1，2，3，6-四羥基己烷(12)的合成方法將化合物13與通過(guò)已經(jīng)公開(kāi)的途徑(流程3)(Ohi等，1999)得到的合成樣品進(jìn)行比較，可以證實(shí)C-19和C-20位的立構(gòu)中心。在已經(jīng)公開(kāi)的途徑中的手性誘導(dǎo)可以通過(guò)6-甲基-2，6-庚烯-l-醇(19)的Sharpless環(huán)氧化作用而完成，將所述醇采用甲基鋰處理，從而將甲基引入該醇的對(duì)面。公開(kāi)的方法采用L-酒石酸二乙酯(L-DET)以獲得2S，3S異構(gòu)體；如果需要制備2R，3R異構(gòu)體，則采用D-酒石酸二乙酯(D-DET)。如果被保護(hù)為乙縮醛22，則C-6醇可以被氧化為酮，該酮可以通過(guò)Wittig反應(yīng)同系化，產(chǎn)生化合物23，將其去保護(hù)可以制備比較樣品21。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>流程3.i)Ti(O4誦Pr)4(0'2eq)，D-DET(0.3eq)，t畫(huà)BuOOH。ii)CuCN，MeLi，Et20。iii)ll，TsOH。iv)Swern氧化(Mancuso等，1981)。v)Ph3PCH3，BuLi。vi)TsOH3，H20。帕莫諾立德B(6)和C(7)的降解研究可以同樣提供多元醇(流程4和5)。預(yù)期在所有的帕莫諾立德中，C-19和C-20的立體化學(xué)相同，所以帕莫諾立德B和C的臭氧分解產(chǎn)物可以提供含有所述立構(gòu)中心的相同的產(chǎn)物(13)。對(duì)于帕莫諾立德B而言，產(chǎn)生了兩種新的降解產(chǎn)物(24，25)。由D-和L-谷氨酸得到的24的兩種對(duì)映異構(gòu)體均是已知的(Brunner等，1989;Larcheveque等，1984)，經(jīng)過(guò)測(cè)定排序后可以提供手性光學(xué)比較。通過(guò)流程2技術(shù)可以獲得具有三醇末端官能團(tuán)的產(chǎn)物25，如果需要可以任選采用另外的糖開(kāi)始反應(yīng)，并采用衍生自3-溴丙醇的C3Wittig試劑進(jìn)行同系化。o流程4.帕莫諾立德B(6)的臭氧分解<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>26帕莫諾立德C(7)流程5.帕莫諾立德C(7)的臭氧分解衍生自帕莫諾立德C(7)還原臭氧分解的戊-醇26(流程5)可以通過(guò)選自,Cs糖類(lèi)庫(kù)(pool)的前體進(jìn)行制備(流程6)，如果適當(dāng)?shù)脑?huà)，可以通過(guò)光i普確定立體化學(xué)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>26流程6.i)乙基乙烯基醚，PPTS，CH2C12，ii)Ph3PCH2CH2CH2OH,(TMS)2NLi。iii)H2/Pd。iv)lNHCl,室溫。流程1-6總結(jié)了帕莫諾立德A-G立體化學(xué)的降解結(jié)構(gòu)的證據(jù)。當(dāng)分離出新的帕莫諾立德時(shí)，它們可以依此處理以證實(shí)所有的立體化學(xué)排序。實(shí)施例X-帕莫諾立德的結(jié)構(gòu)-活性研究帕莫諾立德通過(guò)抑制液胞三磷酸腺苷酶(V-ATPases)而具有抗黑素瘤活性。它們是多蛋白跨膜酶，能夠?qū)①|(zhì)子自胞漿中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH，是體內(nèi)平衡的重要機(jī)能(Sun-Wadaa等，2004)。它們?cè)谡婧松锛?xì)胞內(nèi)普遍存在，在原核生物中也偶有所發(fā)現(xiàn)。該酶的兩個(gè)域均由約六個(gè)亞基組成，共含有20個(gè)蛋白質(zhì)集聚(proteinassemblage)。嵌入膜內(nèi)V0域?yàn)橘|(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的基因座，而亞-膜(sub-membrance)V,域具有催化(ATP至ADP)活性(Mshi等，2002)。除了pH調(diào)節(jié)外，V-ATPases參與了下列過(guò)程內(nèi)吞作用、膜融合(Morel等，2003)、骨吸收(Nomiyama等，2005)及并非簡(jiǎn)單的酸化作用(functionsofacidity)的其它功能(Nishi等，2002)。然而，它們可能在癌癥-調(diào)節(jié)通路中起到了特殊的作用，所述通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化(Martinez-Zaguilan等，1993)、血管生成(Martinez-Zaguilan等，1999a)、多藥物-抗性(Laurencot等，1995;Raghunand等，1999;Martinez曙Zaguilan等，1999b;Sennoune等，2004)和轉(zhuǎn)移(Martinez-Zaguilan等，1998)有關(guān)。對(duì)V-ATPases的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究可以更好地理解配體/受體的相互作用，所述研究包括對(duì)F亞基的NMR研究(Jones等，2001)以及原核V-型Na+-ATPase的K環(huán)亞基(它與真核H+V-ATPases的c/c'/c"環(huán)相似)的更新的X-射線數(shù)據(jù)(Murata等，2005)的研究。該X-射線數(shù)據(jù)的重要性在于已知的H+V-ATPases抑制劑與c亞基結(jié)合(Pali等，2004;Huss等，2002)，X-射線數(shù)據(jù)證明了抑制劑的配體/受體結(jié)合。V-ATPases與多種疾病狀態(tài)有關(guān)，包括I型糖尿病(Myers等，2003a;Myers等，2003b)、骨質(zhì)疏松癥(Nomiyama等，2005;Sundquist等，19卯)和多種癌癥(Sennoune等，2004)，例如宮頸癌(Ellegaard等，1975)、乳腺癌(Martinez-Zaguilan等，1999b)和黑素瘤(Martinez-Zaguilan等，1998)。已經(jīng)證明在轉(zhuǎn)移性乳癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上V-ATPase酶的數(shù)量顯著增加(Martinez-Zaguilan等，1993;Sennoune等，2004)。癌癥細(xì)胞需要低pH的胞漿并主務(wù)農(nóng)賴(lài)于V-ATPases維持i^JL(Martinez-Zaguilan等，1993;Raghunaiid等，1999)。巴佛洛霉素A1(4，圖3)為原型V-ATPase抑制劑(Zhang等，1994)，盡管其結(jié)合性和特異性不如最近發(fā)現(xiàn)的下列抑制劑好例如salicylihalamides(vis5)(Erickson等，1997;Boyd等,2001)、oximidines(Kim等，1999)、lobatamides(McKee等，1998;Shen等，2002)和帕莫諾立德。除了巴佛洛霉素外，concanamycins(Huss等，2002)同樣為大環(huán)類(lèi)，盡管poecillastrins和chondropsins(Xie等，2004)為更大的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，除了內(nèi)酯鍵外，它還含有內(nèi)酰胺鍵。巴佛洛霉素A,(4)Salicylihal卿ideA(5)V-ATPase抑制劑成為癌癥治療的新的目標(biāo)藥物(Chene等，2003;Beutler等，2003)。產(chǎn)生一流藥物(例如紫杉醇是用于抑制微管蛋白解聚(Horwitz等，2004))的關(guān)欲t現(xiàn)最終導(dǎo)致了用于該適應(yīng)癥的藥物增長(zhǎng)，極大地豐富了治療的選擇。組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(Arts等，2003)也同樣激發(fā)了人們對(duì)這方面的興趣，食品藥品管理局(FDA)最近批準(zhǔn)了幾種新藥臨床申請(qǐng)研究(IND)申請(qǐng)。在目前已知的幾種有效的V-ATPase抑制劑中，預(yù)期有一種很快能夠a申請(qǐng)IND階段。目標(biāo)官能團(tuán)的修飾根據(jù)Lipinski等于2001年闡述的"5法則(Ruleof5)"進(jìn)行，以解決吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADMET)問(wèn)題。在Lipinski法則中，帕莫諾立德的結(jié)果很好存在5個(gè)或更少的H-鍵供體，MLogP約為1.8至2.76(采用SimulationsPlus，Inc.(Lancaster，CA)ADMET預(yù)測(cè)軟件計(jì)算)，存在少于10個(gè)H-鍵受體。分子量較高，跨度為550左右至610;帕莫諾立德E為唯--個(gè)小于500的，但是它缺乏具有V-ATPase活性所要求的乙烯基酰胺。采用ADMET預(yù)測(cè)完善研究方法，很明顯，溶解度和滲透性是需要集中進(jìn)行衍生作用研究的兩個(gè)方面，但是，這兩個(gè)方面似乎是相互背離的兩個(gè)方向。所以，溶解度提高伴隨著極性官能團(tuán)增加，而滲透性的提高則需要除去極性官能團(tuán)。該兩種相反需要的調(diào)和需要根據(jù)生物學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)行根據(jù)上述方法對(duì)根據(jù)本文方法制備的化合物的抗黑素瘤和/或V-ATPase活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，只對(duì)那些能夠保持足夠的生物活性(亞-亳克分子)并具有良好的ADMET特性(根據(jù)ADMET預(yù)測(cè)評(píng)價(jià))的化合物進(jìn)行中空纖維分析和/或xenograph分析。C-24酰胺的缺失導(dǎo)致活性降低，C-6與C-12羥基化/烯化類(lèi)型的另一個(gè)重排同樣也使活性降低，這可以通過(guò)帕莫諾立德C(7)和E(9)證明，它們均經(jīng)過(guò)NCI60細(xì)胞系生物分析。其它帕莫諾立德也同樣進(jìn)行了分析。對(duì)于化學(xué)衍生作用的研究而言，帕莫諾立德的總體結(jié)構(gòu)可以分為三個(gè)重要區(qū)域(l)C-24末端及相連的乙烯基酰胺(SAR1區(qū)域，流程7);("CV7至C-12位上相連的羥基化/烯化(SAR2區(qū)域，流程7);和(3)烯烴基團(tuán)，它們均可以進(jìn)行化學(xué)處理。流程7:基于結(jié)構(gòu)-活性模式的天然產(chǎn)物的多樣性進(jìn)行衍生作用研究增加每一個(gè)區(qū)域的極性基團(tuán)、減少每一個(gè)區(qū)域的極性基團(tuán)和在不改變極性基團(tuán)數(shù)量的情況下進(jìn)行修飾。在核心結(jié)構(gòu)的不同部位上進(jìn)行極性基團(tuán)的取代可能產(chǎn)生其它可能的改性。隨著生物學(xué)數(shù)據(jù)的逐漸積累，人們可以選擇需要的生物活性模式(療效和ADMET預(yù)測(cè)特性)，而不僅僅是產(chǎn)生大量的衍生物。下面所述的是本領(lǐng)域所集中的處理方法以及添加、除去或保持極性基團(tuán)數(shù)目不變的處理方法。i.SAR1區(qū)域指定為SAR1的區(qū)域可以通過(guò)至少四種天然產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。帕莫諾立德A(l)、D(8)、E(9)和F(10)只是在帕莫諾立德母鏈的末端的性質(zhì)有所不同。引入的進(jìn)一步探測(cè)C-24末端的合成修飾可以包括下列鏈末端基團(tuán)保留極性官能團(tuán)非共軛的共輒的:某些極性基團(tuán)被還原:添加極性官能團(tuán):非共軛的共輒的:通過(guò)銅催化的乙烯基酰胺化反應(yīng)制備時(shí)生物30至45(流程8)(Shen等，2000)。采用瘞吩羧酸銅(I)(CuTC)為催化劑，將需要的酰胺與乙烯基碘46進(jìn)行偶合，可以高收率地制備帕莫諾立德的立體控制的E乙烯基酰胺類(lèi)似物。流程8.i:CuTC，N，N，-二甲基-乙二胺，K2C03，50°C，R'CONH2。ii:HF'吡勿吡咬。必需的E-乙烯基哄46可以根據(jù)兩種方法之一制備。最直接的途徑包括鉻催化的(Takai烯化，Takai等，1986)三叔丁基甲珪烷基保護(hù)的帕莫諾立德E的同系化(vis47，流程9)。需要注意因?yàn)榕聊Z立德的官能團(tuán)化不像discodermolide的官能團(tuán)化(Gunasekera等，19卯)，所以，它們對(duì)本文所述條件的穩(wěn)定性可以通過(guò)應(yīng)用于discodermolide的合成方法加以證實(shí)，所述的合成方法是本領(lǐng)域中已知的(Paterson等，2001;Smith等，2000)。帕莫i若立德E(9):R=H47:R=TBS流程9.i:TBSC1,咪唑。Ii:CHI3，CrCl2，THF，。C?；蛘撸蚁┗?6可以自帕莫諾立德A制備；盡管涉及更多的步驟，但是，由于帕莫諾立德A在被嚢類(lèi)中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，所以這是需要的。因此,可以將帕莫諾立德A適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)(流程10),從而將C-7和C-10位的氧官能團(tuán)與C-ll位的氧官能團(tuán)區(qū)別開(kāi)來(lái)，然后將酰胺選擇性水解(Eaton等，1988)，將得到的鄰苯二甲酰亞胺水解產(chǎn)生醛48。采用Danishefsky方法(DiGrandi等，1993)將醛48直接轉(zhuǎn)化為乙烯基哄，Danishefsky方法也可以直接由酮產(chǎn)生乙烯基哄。得到熱動(dòng)力學(xué)E乙烯基哄(49)。在應(yīng)用的條件下將氨基曱酸酯水解；在該位置采用對(duì)-甲氧基芐基醚(PMBO(C-NH)CCl3，PPTS)(Nakajima等，1988)保護(hù)基團(tuán)，以便于在其它方法中將其與C-7和C-10氧化的官能團(tuán)區(qū)別開(kāi)來(lái)。流程10.i)TBSCl，咪唑。ii)四氯代鄰苯二甲酸酐，A。iii)a.肼，b.TsOH/H20。iv)肼。v)I2,DBU。如果Danishefsky方法(流程9)不合需要，也可以通過(guò)Baeyer-Villiger氧化將醛(48)降解為保護(hù)的帕莫諾立德E(47，R=PMB)，將產(chǎn)生的甲酰基酯水解，然后經(jīng)過(guò)Dess-Martin氧化(Dess等，1991)得到醛(流程11)。然后如流程9所示，可以將中間體47制備為乙烯基碘46。注意Baeyer-Villiger試劑(例如那些采用Lewis-酸催化的三甲基甲硅烷基過(guò)氧化物的試劑)通?？梢栽谙N存在下進(jìn)行，無(wú)需擔(dān)心環(huán)氧化作用(Brink等，2004)485047:R=PMB流程11.i)Baeyer-Villiger(Nakajima等，1988)。ii)TsOH/H20。iii)DMP，NaHC03。帕莫^若立德類(lèi)似物39-41可以如下制備:使,皮保護(hù)的帕莫諾立德E(47)與甲基三苯基溴化鎮(zhèn)/BuLi進(jìn)行Wittig反應(yīng)(得到39)，使羥甲基衍生物48經(jīng)NaBH4/CoCl2還原(得到40)，或者使40經(jīng)過(guò)乙?；?得到41)。ii.SAR2區(qū)域C-7至C-12SAI^區(qū)域可以通過(guò)天然產(chǎn)物包括帕莫諾立德A(l)、B(6)和C(7)進(jìn)行查明，所述天然產(chǎn)物僅在SAF^區(qū)域有所不同。帕莫諾立德C較帕莫諾立德A效果差。通過(guò)保留、減少和添加極性官能團(tuán)對(duì)模板51進(jìn)行修飾，其它合成衍生作用可以判斷醇基團(tuán)的作用?；蛘呖梢匀菀椎孬@得其他修飾o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>SAR2修飾模板1(51)保留極性基團(tuán)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>減少極性基團(tuán)57:58:59:60:61:62:63:64:65:Si_MeHMeH=oHCONH2HCONH2HMeMeHH=0HCONH2CONH2_CONH2CONH2CONH2MeCONH2CONH2CONH2CONH2CONH2SAR2修飾模板2(66)添加極性基團(tuán)(模板2):RR367:CONH2HCONH268:HCONH2CONH269:CONH2CONH2CONH2衍生物52-69的制備C國(guó)7位上的反應(yīng)先于C-10位上的反應(yīng)進(jìn)行(Diyabalanage等，2006)。所以，C-7位單-衍生化的化合物可以直接制備。C-10位單-衍生物可以通過(guò)C-7的保護(hù)(三叔丁基甲珪烷基醚)/去保護(hù)制備。Descarbamato(55)反應(yīng)在流程10中描述;對(duì)C-7位和C-10位醇類(lèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)可以提供對(duì)C-11位的修飾。如果乙酸酯63-65的生物活性有保障的話(huà)，那么氨基曱酸酯可以在C-7位、C-10位和C-ll位互換(CbCC(O)NCHO,然后K2C03)(Kocovsky,1986)。纈氨酸酯62和63是按類(lèi)似的伐昔洛韋前藥模型制備的，已經(jīng)證明后者能夠顯著改善藥物動(dòng)力學(xué)性能(Guglidmo等，2004)?；衔?7-69可以通過(guò)63-65的四氧化鋨(osmimumtetroxide)二羥基化進(jìn)行制備(形成非對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)物，因而經(jīng)過(guò)分離后自63-65每一個(gè)獲得兩個(gè)產(chǎn)物)。iii.烯烴的作用最后，烯烴官能團(tuán)的作用采用選擇性氫化催化劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)采用H2、Pd/C處理帕莫諾立德A進(jìn)行全氫化反應(yīng)合成70，通過(guò)硼化鎳使得二取代的烯烴(71)選擇性氫化(Choi等，1996)。通過(guò)10%Pd/C和甲酸銨可以進(jìn)行與a，p-不飽和的氟基(vis72)有關(guān)的烯烴的選擇性還原(Ram等，1992)。通過(guò)多種氫化技術(shù)，例如采用硼氫化物交換樹(shù)脂/Ni2B催化劑，可以進(jìn)行孤非共軛烯烴(73)的選擇性還原(Yoon1996)。除了能夠產(chǎn)生不同氬化產(chǎn)物的其它帕莫諾立德天然產(chǎn)物外，這些帕莫諾立德A衍生物提供了烯烴在帕莫諾立德生物活性中起作用的證據(jù)。如果生物活性和/或ADMET預(yù)測(cè)模擬需要，則用于SAR1、SAW和/或氫化作用的修飾可以容易地組合使用。在確定化合物的明確結(jié)構(gòu)時(shí)，天然產(chǎn)物的全合成是主要工具。全合成也作為合成天然產(chǎn)物類(lèi)似物的成功策略，通過(guò)原料或合成流程中各反應(yīng)的簡(jiǎn)單改變即可進(jìn)行。發(fā)明人建議的對(duì)于帕莫諾立德的合成研究詳述了會(huì)聚(convergent)的方法，在所述方法中，每一個(gè)成分均可以改變，從而可以提供通過(guò)用V-ATPase進(jìn)行的X-射線共結(jié)晶研究和采用ADMET的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)產(chǎn)生的類(lèi)似物。該合成方法也可以用于證實(shí)帕莫諾立德的結(jié)構(gòu)和絕對(duì)立體化學(xué)。這對(duì)于少量存在的帕莫諾立德尤為重要，例如帕莫諾立德D、E和F，因?yàn)樗鼈兛梢苑蛛x出的只是痕量。該合成可以不那么嚴(yán)格地針對(duì)片段進(jìn)行，這些片段獲自采用帕莫諾立德A還原臭氧分解的降解研究(如上所述)。根據(jù)前述降解研究結(jié)果，發(fā)明人設(shè)計(jì)了帕莫諾立德A的逆合成分析(流程12)。該逆合成將分子分成3個(gè)主要片段。通過(guò)前體76的環(huán)閉合置換反應(yīng)可以容易地形成帕莫諾立德A的大環(huán)母核(Grubbs等，1995)。通過(guò)用78酯化醇77可以形成所述置換的前體76。片段79和80可以作為Heck反應(yīng)的偶合對(duì)，產(chǎn)生需要的醇片段77(Harris等，1996)。通過(guò)銅-催化的酰胺化反應(yīng)，可以將酰胺80嵌入C-21側(cè)鏈，所述反應(yīng)直接涉及Co-PI促進(jìn)的延長(zhǎng)(devdop)(Shen等，2000:Klapars等，2001;Jiang等，2003)。酰胺化反應(yīng)需要的乙烯基棟82可以采用相應(yīng)的醛前體的Takai烯烴化反應(yīng)進(jìn)行制備(Takai等，1986)。然后，采用Wittig反應(yīng)的Schlosser改ii^應(yīng)可以形成C-22雙鍵(Schlosser等，1966)。這就選擇性地形成了(E)-烯烴。通過(guò)Evans開(kāi)發(fā)的具有高預(yù)測(cè)性的非對(duì)映選擇性羥醛反應(yīng)可以確定C-20和C-21的立體化學(xué)(Evans等，1981)。然后，采用Sharpless不對(duì)稱(chēng)二羥基化反應(yīng)可以對(duì)映選擇性地制備手性二醇79(Jacobsen等，1988)。也可以采用不對(duì)稱(chēng)二羥基化反應(yīng)合成手性醇片段78。這就對(duì)映選擇性地形成了C-8位上的手性仲醇。片段78中的類(lèi)似乙烯酉旨(vinylogousester)可以通過(guò)Horner-Wadsworth-Emmons烯烴化反應(yīng)制備(Stocksdale等，1998)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>流程12.帕莫諾立德A(l)的逆合成分析自片段79的構(gòu)建開(kāi)始合成帕莫諾立德A。根據(jù)已知的方法(Hanessian等，1975)，采用咪唑和TBDPS-C1處理醇，將得自商業(yè)的炔醇85(流程13)保護(hù)為T(mén)BDPS醚。采用多聚甲醛和n-BuLi處理炔86形成已知的炔丙基醇87(Nicolaou等，1989)。采用Red-Al(雙(2-甲氧基乙^J^)氫化鋁鈉)處理87形成已知的E-取代的烯丙基醇88。采用Sharpless條件，將88不對(duì)稱(chēng)二羥基化以高度對(duì)映選擇性形成需要的二醇89(Jacobsen等，1988)。需要注意的是此時(shí)，在反應(yīng)的這個(gè)階段應(yīng)進(jìn)行Sharpless不對(duì)稱(chēng)氨基羥基化反應(yīng)(Li等，1996)。這就形成了對(duì)映體純的1，2-氛基醇。酰胺親核基團(tuán)通常偏愛(ài)烯烴碳具有較小的阻礙。據(jù)此觀察，保護(hù)的胺應(yīng)位于帕莫諾立德A的C-ll上。該^J^羥基化反應(yīng)途徑能夠提供帕莫諾立德的氮雜變體。采用丙酮和TsOH處理，化合物89的兩個(gè)仲醇基團(tuán)可以選擇性地保護(hù)為丙酮化合物(Coe等，1989)。由于該產(chǎn)物的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，這能夠保護(hù)兩個(gè)仲醇，有利于伯醇。此時(shí)，90中的伯醇可以采用TIPS基團(tuán)保護(hù)(Cunico等，1980)。然后，丙酮化合物可以在氯仿中采用FeCl3和Si02打開(kāi)(Kim等，1986)。這能夠打開(kāi)丙酮化合物而不會(huì)影響甲硅烷基保護(hù)的醇。此時(shí)，C-12上的仲醇可以采用TBS-C1和咪唑保護(hù)(Corey等，1972)。由于C-10幾基上存在的TIPS保護(hù)基團(tuán)的體積，保護(hù)的C-12醇應(yīng)是主要產(chǎn)物。此時(shí)，C-ll醇可以在THF采用MOM-Cl、NaH保護(hù)(Kluge等，l972)。采用不同的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)所有的羥基基團(tuán)的能力對(duì)^究而言是非常重要的，因?yàn)樗軌蜻_(dá)到該研究的主要目標(biāo)-帕莫諾立德A的衍生作用。通過(guò)將TBDPS選擇性脫去，然后采用Dess-Martin氧化劑氧化(Dess等，1983)，可以制備酪92。然后通過(guò)Takai烯烴化反應(yīng)(Jiang等，2003),可以將該醛轉(zhuǎn)化為乙烯基碘93。該烯烴化反應(yīng)選擇性地形成(E)-乙烯基哄。該乙烯基哄具有后面合成途徑中Heck反應(yīng)所需要的正確的立體化學(xué)。流程13.i)TBDPSCl，咪唑，DMF。ii)BuLi，(CH20)n，THF。iii)Red-Al，Et20。iv)AD-mix卩，t-BuOH/H20。v)丙酮，TsOH。vi)TIPS曙Cl，吡咬。vii)FeCl3/Si02，CHC13。viii)TBS-Cl，咪唑，DMF。ix)MOM-Cl，NaH,THF。x)5NNaOH，EtOH。xi)Dess-Martin氧化劑，DCM。xii)CHI3，CrCl2，THF，°C。帕莫諾立德A合成的下一個(gè)主要步驟為根據(jù)逆合成制備片段78。78的合成從采用Dess-Martin氧化劑(Dess等，1983)氧化94開(kāi)始(流程14)。烯烴的Sharpless不對(duì)稱(chēng)二羥基化反應(yīng)可以對(duì)映選擇性地形成二醇95(Jacobsen等，1988)。伯醇可以采用TBDPS-Cl和咪唑選擇性地加以保護(hù)(Hanessian等，1975)。在二氯甲烷中采用SEM-Cl和DIPEA，可以將仲羥轉(zhuǎn)化為SEM醚96(Lipshutz等，1980)。通過(guò)Horner-Wadsworth-Emmons烯烴化反應(yīng)可以形成97(Stocksdale等，1998)。然后在EtOH中采用5NNaOH脫去TBDPS基團(tuán)，采用Dess-Martin氧化劑將醇氧化，得到化合物98(Dess等，1983)。醛官能團(tuán)的Petassis烯烴化反應(yīng)可以獲得烯烴99(Petassis等，1990)。用DIBAL對(duì)化合物99的酯官能團(tuán)進(jìn)行還原可以獲得醛100(Sunazuka等，2000)。在Jones氧化條件下使得該醛氧化可以形成羧酸101(Bowden等，1946)。在后面的反應(yīng)中，化合物101可以直接用于形成酯鍵。然而，采用草酰氯102將酸轉(zhuǎn)化為酰氯的反應(yīng)可能產(chǎn)生輕度的酯化。94o.■OHO.95OH、OTBDPS-%6SEMvEtO、O97、OTBDPSOSEM0.ixEtO、100OSEMvi''O98OSEMHO、102OSEM流程14.i)Dess-Martin氧化劑，DCM。ii)AD誦mixp，t-BuOH/H20。iii)TBDPS-Cl，咪唑，DMF。iv)SEM-Cl，DIPEA,DCM。v)膦酰基乙酸三乙酯，KHMDS，18畫(huà)冠畫(huà)6，甲苯。vi)5NNaOH，EtOH。vii)Dess-Martin氧化劑。viii)Cp2Ti(Me2)，THF，回流。ix)DIBAL畫(huà)H，Et20。x)NaC102，NaH2P04，2-甲基-2-丁烯，t-BuOH。xi)(COCl)2，苯。最后需要制備的分子片段為C-17至C-25酰胺側(cè)鏈。合成該片段的第一步(流程15)為將得自商業(yè)的geraneol進(jìn)行PDC氧化反應(yīng)，得到103(Reiter等，2003)。此時(shí)，采用Evans非對(duì)映選擇性羥醛縮合可以形成104(Evans等，1981)。該Evans方法已經(jīng)被證明是化學(xué)合成工作者用來(lái)合成順式-選擇性羥醛產(chǎn)物的最可靠的工具之一?？梢愿淖僞悉唑烷酮的R基團(tuán)，以最高非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量獲得產(chǎn)物。對(duì)化合物104的醇進(jìn)行保護(hù)形成105(Lipshutz等，1980)。然后，通過(guò)將105暴露于NaOMe的甲醇液中除去^t、唑烷酮輔助基團(tuán)，形成酯106(Evans等，1981)。采用LiAlH4將酯106還原，隨后采用PPh3和Br2進(jìn)行溴化，形成溴化物107(Wiley等，1964)。釆用Wittig反應(yīng)的Schlosser變通方法，使得107和108反應(yīng)專(zhuān)一形成(E)-烯烴109(Schlosser等，1966)。然后將化合物109經(jīng)過(guò)流程16的合成步驟，隨后將縮醛去保護(hù)。這就合成了帕莫諾立德E?？s醛去保護(hù)后進(jìn)行Takai烯經(jīng)化反應(yīng)，形成化合物110(Takai等，1986;Hagiwara等，1987)。在銅-催化下使得乙烯基哄與必要的酰胺進(jìn)行偶合得到lll(Shen等，2000;Klapars等，2001;Jiang等，2003)。改變?cè)撆己戏磻?yīng)中采用的酰胺可以分別合成帕莫諾立德D和F。流禾呈15.i)a)Bu2BOTf，DIPEA，DCM，。C，然后加入103,-78至0。C。b)MeOH/30%H2O2。ii)咪唑，SEM-C1，DMF。iii)NaOMe3，MeOH，0°C。iv)LiAlH4，Et20。v)PPh3，Br2，三甘醇二甲醚。vi)PPh3，PhLi,LiBr，Et20，甲苯，然后加入108。vii)PPTS，丙酮，H20，A。viii)CHI3，CrCl2，THF，0。C。ix)酰胺，CuTC，N，N'-二甲基-乙二胺，K2C03，50°C。合成帕莫諾立德A的最后步驟(流程16)自乙烯基哄93和烯烴111的Heck偶合開(kāi)始，該反應(yīng)形成二烯112(Harris等，1996)。先脫去TIPS基團(tuán)然后進(jìn)行Petasses烯烴化反應(yīng)，得到化合物113(Petassis等，19卯)。發(fā)明人選擇采用Petassis烯烴化反應(yīng)，因?yàn)樵摲椒梢栽试S化合物112中存在官能團(tuán)。先脫去化合物113的SEM基團(tuán)，然后采用化合物101進(jìn)行酯化反應(yīng)，形成114(Schlessinger等，1986)。采用第二代Grubbs催化劑進(jìn)行114的環(huán)-閉合置換反應(yīng)，形成大環(huán)115(Grubbs等，1995)。據(jù)觀察，該置換反應(yīng)已經(jīng)成功地用于與帕莫諾立德A結(jié)構(gòu)相似的天然產(chǎn)物合成中的大環(huán)閉合。例如，天然產(chǎn)物的埃博霉素家族中RCM方法有助于形成(E)-雙鍵(Meng等，1997)。采用異氰酸和CuCl處理115可以形成氨基甲酸酯116(Duggan等，1989)。合成帕莫諾立德A的最后步驟為在Et20中采用MgBr2和BuSH將剩余的保護(hù)基團(tuán)全部除去(Kim等，1991)。這是一個(gè)溫和的去保護(hù)方法，不會(huì)打開(kāi)內(nèi)酯或者裂解存在的氨基曱酸酯官能團(tuán)。流程16.i)Pd(PPh3)4，Et3N，DMF。ii)40%KOH，MeOH,回流。iii)Cp2Ti(Me2)，甲苯。iv)TFA，DCM,0'C。v)NaH，DMF，101。vi)Grubb第二代催化劑，甲苯，A。vii)AcOH，H20，THF。viii)HNCO，CuCl，DMF。ix)MgBr2，Et20，BuSH，室溫?？梢岳斫猓疚乃龅膶?shí)施例和實(shí)施方案僅用于說(shuō)明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行各種修改或改變，并且這些修改或改變?cè)诒旧暾?qǐng)以及權(quán)利要求所要求保護(hù)的精神和范圍內(nèi)。另外，本文所公開(kāi)的任何發(fā)明或?qū)嵤┓桨傅乃械囊鼗蛳薅梢耘c本文所公開(kāi)的其他發(fā)明或?qū)嵤┓桨傅娜魏我鼗蛳薅ê?或所有要素或限定(單個(gè)或任何組合)組合使用，所有的此類(lèi)組合均不加限定地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,750,247號(hào)美國(guó)專(zhuān)利第6，960，648號(hào)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20030032594號(hào)Diyabalanage，T.K.;Amsler，C.D.;McClintock,J.B.;Baker，B.J.(2006)"巾白莫諾立德A，acytotoxicmacrolidefromtheAntarctictunicateiS);膨/cw附a^immw附.丄J附.Ore附.5W"，128，5630-5631.Sun畫(huà)Wadaa，G.H.;Y.WadaajM.Futa(2004)"Diverseandessentialrolesofmammalianvacuolar-typeprotonpumpATPase:towardthephysiologicalunderstandingofinsideacidiccompartments"祝o由'附.5/。/7/^s.爿c似1658:106-114.Nishi，T.;M.Forgac(2002)"Thevacuolar(H+)-ATPases-Nature'smostversatileprotonpumps"7Vfl^.及ev.Mo/.3:94-103.Morel,N.;J.C.Dediu;J.-M.Philippe(2003)"SpecificsortingofthealisoformoftheV-H+ATPaseasubunittonerveterminalswhereitassociateswithbothsynapticvesiclesandthepresynapticplasmmembrane"/CW/S".116:4751-4762.Nomiyama，H.;K.Egami;N.Wada;K.Tou;M.Horiuchi(2005)"在破骨細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)的基因的鑒定(Identificationofgenesdifferentiallyexpressedinosteoclast-Iikecells)"/J>ite//dY7fiQ^汰25:227-231.Martinez-Zaguilan，R.;R.M.Lynch;G..M.Martinez;R.J.Gillies(l993)"Vacuolar-typeH+畫(huà)ATPasesarefunctionallyexpressedinplasmamembranesofhumantumorcells"j附./尸/^sio/.Ce//尸/^sio/.265:C1015-C1029.Martinez-Zaguilan,R.(1999a)"Angiostatin'spartners"Science284:433-434.Laurencot,C.M.;P.A.Andrews;K.A.Kennedy(1995)"細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)的抑制劑可以誘導(dǎo)在EMT6小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生順鉑抗性(InhibitorsofintracellularpHregulationinducecisplatinresistanceinEMT6mousemammarytumorcells)"Oncol.Res.7:363-369.Raghunand，N.;R.Martinez-Zaguilan;S.Wright;R.J.Gillies(1999)"pHanddrugresistance.II.Turnoverofacidicvesiclesandresistancetoweaklybasicchemotherapeuticdrugs"必f》cAe附.P/rnwaco/.57:1047-1058.Martinez-Zaguilan，R.;N.Raghunand;R.M.Lynch;W.Bellamy;G..M.Martinez;B.Rojas;D.Smith;W.S.Dalton;R.J.Gillies(1999b)"pHanddrugresistance.I.FunctionalexpressionofplasmalemmalV-typeH+畫(huà)ATPaseindrug-resistanthumanbreastcarcinomacelllines"必i》c/re附.戶(hù)to附flo/.57:1037-1046.Seimoune，S.R.;D.F.Lu05R.Martinez-Zaguilan(2004)"Plasmalemmalvacuolar-typeH十-ATPaseincancerbiology"CellBiochem.Biophys.40:185-206.Martinez-Zaguilan,R.;G.M.Martinez;A.Gomez;M.J.Hendrix;R.J.Gillies(1998)"DistinctregulationofpHinand[CA2+ininhumanmelanomacellswithdifferentmetastaticpotential"/CW/尸/r戸V/.176:196-205.Jones,R.P.O.;I.E.Hunt;J.Jaeger;A.Ward;J.O'Reilly;E.A.Barratt;J.B.C.Findlay;M.A.Harrison(2001)"Expression，purificationandsecondarystructureanalysisof5Wc/ra,o考ces1cev/s/"evacuolarH十-ATPasesubunitF(VMA7p)"Mol.MembraneBiol.18:283-290.Murata，T.;I.Yamato;Y.Kakinuma;A.G.W.Leslie;J.E.Walker(2005)"StructureoftherotoroftheV-typeNa+-ATPasefrom^fefwocc"51/r/me"Science308:654-659.P犯，T.，G.Whyteside，N.Mxon，T.P.Kee，S.Ball,M.A.Harrison,J.B.C.Findlay,M.E.Finbow,D.Marsh(2004)"InteractionofinhibitorsofthevacuolarH+誦ATPasewiththetransmembraneVo畫(huà)sector"必,VcZre附.43:12297-12305.Huss，M.，G.Ingenhorst，S.K6nig，M.Ga^el，S.Dr6se，A.Zeeck，K.Altendorf，H.Wieczorek(2002)"ConcanamycinA，thespecificinhibitorofV-ATPases，bindstotheVosubunitc"丄A/o/.C7^附.277:40544-40548.Myers,M.A.，I.R.Mackay，P.Z.Zimmet(2003)"毒性的1型糖尿病(Toxictype1diabetes)"iev.￡>iflfo.Afe^ift.Z)/son/.4:225-231.Myers,M.A.，K.D.Hettiarachchi，J.P.Ludeman,A.J.Wilson,C.R.Wilson,P.Z.Zimmet(2003)"飲食性微生物毒素和1型糖尿病(Dietarymicrobialtoxinsandtype1diabetes)"j/i".TV.EJcfl^f.1005:418-422.Sundquist，K,，P.Lakkakorpie,B.Wallmark，K.Vaananen(1990)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-OH、-NO2、-NH2、-COOH、鹵素或-CH3；R2獨(dú)立為OH、O-酰基、氨基甲酸酯、H、O-烷基、氨基、-OSO3H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、鹵素和/或氧代；R3為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、鹵素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、-NO2、-NH2、-COOH、鹵素和/或-CH3；R4獨(dú)立為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、鹵素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、-NO2、-NH2、-COOH、鹵素和/或-CH3。2.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)I^為-OC(NH2)0。3.權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中R3為甲基。4，權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)W為甲基，在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)R"均為甲基。5.權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中R1為-CHCHNHC(0)CHC(CH3)2。6.權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中R1為CHCHNHC(0)CHC(CH3)CH2C(CH3)CH2.7.權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中R1為-CHCHNHC(0)CH2C(CH3)CH2。8，權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中R1為-CENO。9.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)I^為-OH。10.權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)F^為-OSO;jH。11.權(quán)利要求1的帕莫諾立德化合物，其中至少兩個(gè)R為-OH并且至少一個(gè)R2為-OC(NH2)0，任選R3和R4為-CH3。12.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu)13.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>14.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>15.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>O16.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):17.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):18.權(quán)利要求l的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>19.分離的式II的帕莫諾立德化合物及其異構(gòu)體、外消旋體或其外消旋混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或結(jié)晶形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中=單鍵或雙鍵；W為甲醛、-CHCHNHC(O)-烷基、-OC-烷基、-OC-芳基、-OC-氨基、芳基、氨基、-乙烯基酰氨基、芳基酰氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基l^l基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、鹵素或-CHO，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代H、烷基、烷氧基、-OH、-N02、-NH2、-COOH、鹵素或-CH3;R2獨(dú)立為OH、O-?；?、氨基曱酸酯、H、O-烷基、氨基、-OS03H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基；烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳*^羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、囟素和/或氧代；RS為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基氣基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷氧基羰基、鹵素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、-N02、NH2、畫(huà)COOH、卣素和/或畫(huà)CH3;W獨(dú)立為H、烷基、烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷氧基羰基、環(huán)烷基羰基、環(huán)烷氧基羰基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)烷基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)烷IUJ^、囟素，它們每一個(gè)均可以任選被下列基團(tuán)取代烷基、烷氧基、-OH、-N02、-NH2、-COOH、囟素和/或畫(huà)CH3。20.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)R2為-OC(NH2)0。21.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中R"為甲基。22.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)W為甲基，在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)R"均為甲基。23.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中R1為-CHCHNHC(0)CHC(CH3)2。24.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中R1為CHCHNHC(0)CHC(CH3)CH2C(CH3)CH2。25.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中R1為-CHCHNHC(0)CH2C(CH3)CH2。26.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中R1為-CH-O。27.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)W為-OH。28.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中至少一個(gè)I^為-OS03H。29.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中至少兩個(gè)W為-OH并且至少一個(gè)R2為-OC(NH2)0，任選R3和R4為-CH3。30.權(quán)利要求9的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):O31.權(quán)利要求19的帕莫諾立德化合物，其中所述化合物具有下列結(jié)構(gòu):O32.組合物，該組合物含有權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的帕莫諾立德化合物以及藥學(xué)上可接受的載體。33.抑制V-ATPase酶的方法，所述方法包括使所述V-ATPase酶接觸或暴露于權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的帕莫諾立德化合物，所述化合物的量能夠有效地抑制所述V-ATPase的活性或者阻斷所述V-ATPase的功能。34.治療與V-ATPase酶表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的人或動(dòng)物有效量的權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的帕莫諾立德化合物。35.治療患有癌癥或胂瘤疾病的人或動(dòng)物的方法，所述方法包括給予所述人或動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的帕莫諾立德化合物。36.分離帕莫諾立德的方法，所述方法包括a)溶劑提取Synoicumtunicate;b)除去所述溶劑得到提取物；和c)分餾所述提取物以分離所述帕莫諾立德。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述溶劑為CH2CH2/MeOH。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述提取物采用快速色鐠進(jìn)行分離。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述快速色鐠為珪膠梯度快速色i普。40.權(quán)利要求36的方法，其中在步驟c)中所述分餾后獲得的流分在硅膠上經(jīng)過(guò)梯度洗脫。41.權(quán)利要求36的方法，其中在步驟c)中所述分餾后獲得的流分經(jīng)過(guò)高效液相色譜(HPLC)，例如反相HPLC。42.權(quán)利要求36的方法，其中所述溶劑通過(guò)蒸發(fā)除去。43.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(b)后，所述提取物在溶劑中分配。44.權(quán)利要求42的方法，其中所述溶劑為乙酸乙酯。45.權(quán)利要求42的方法，其中所述分配提取物的溶劑經(jīng)過(guò)洗滌和干燥。46.權(quán)利要求36的方法，其中所述方法另外包括獲得所述被嚢類(lèi)。47.權(quán)利要求36的方法，其中所述,皮嚢類(lèi)為Synoicumadareanum。48.權(quán)利要求36的方法，其中所述被嚢類(lèi)為冷凍干燥的。49.權(quán)利要求36的方法，其中所述帕莫諾立德為帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H或帕莫諾立德K。50.試劑盒，該試劑盒在一或多個(gè)容器中含有權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的帕莫諾立德。51.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述帕莫諾立德為帕莫諾立德A、帕莫諾立德B、帕莫諾立德C、帕莫諾立德D、帕莫諾立德E、帕莫諾立德F、帕莫諾立德G、帕莫諾立德H或帕莫諾立德K。全文摘要本發(fā)明涉及衍生自Synoicum種屬的被囊類(lèi)的一組化合物，還涉及含有這些化合物的藥用組合物及其用途。被囊類(lèi)提取物對(duì)NCI60細(xì)胞系中的多種不同癌細(xì)胞系具有選擇性細(xì)胞毒性。因此，這些化合物可以有效治療癌癥，特別是惡性黑素瘤、結(jié)腸癌和腎癌細(xì)胞系。文檔編號(hào)A61K31/365GK101277942SQ200680036645公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2006年9月18日優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日發(fā)明者B·貝克爾,C·D·阿姆斯勒,J·B·麥克林托克,T·迪亞卜阿拉納日申請(qǐng)人:南佛羅里達(dá)大學(xué);Uab研究基金會(huì)