專利名稱：文冠果的提取物和從提取物分離出的化合物的組成,功能和應(yīng)用,以及它們的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種叫文冠果(Xanthoceras sorbifolia)的植物的提取物，其特征在于從所述提取物中分離和提純的生物活性化合物的組成，功能和應(yīng)用，及其制備方法。
背景技術(shù)：
詳見專利申請書(PCT/US04/33359，2004年10月8日遞交)有關(guān)章節(jié)。
摘要本發(fā)明專利的扼要摘要，為了使本發(fā)明的某些條款更加突出或引入新條款，另一些條款的內(nèi)容可能在本摘要中被簡化甚至略去，但是，這不表明本發(fā)明專利僅限于這些在摘要中提到的內(nèi)容。
本發(fā)明涉及從文冠果的提取物中分離提純的化合物的用途，其特征在于所述的提取物可治療夜尿，遺尿，失禁，尿頻。文冠果的提取物治療夜尿，遺尿，失禁，尿頻的功能不僅和它可以改善膀胱功能相關(guān)，而且它可以改善大腦中樞系統(tǒng)的功能和泌尿系統(tǒng)信息的傳遞過程，使傳遞到大腦的信號不斷增強(qiáng)，改善了睡眠警覺系統(tǒng)，防止深度睡眠的發(fā)生，使大腦發(fā)出信號叫醒睡覺的人去撒尿，避免遺尿的發(fā)生。有助于松弛膀胱，提高儲尿量，從而避免遺尿的發(fā)生。
本發(fā)明專利公開的文冠果的這些化合物還有助于消除由于精神緊張，壓力，衰老活動(dòng)過度，反射亢進(jìn)和不穩(wěn)定而引起的避免逼尿肌不穩(wěn)定和膀胱的緊張，從而防止尿急和尿頻。文冠果提取物可松弛由乙酰膽堿(Ach)引起的膀胱的緊張。
本發(fā)明專利公開的文冠果的這些化合物還能抑制乙酰膽堿酶(AchE)的合成，調(diào)解制尿賀爾蒙(ADH)的釋放，從而控制膀胱產(chǎn)生過多的尿量，抗炎，從而避免遺尿的發(fā)生。
本發(fā)明公了從開文冠果提取皂甙化合物的方法，其特征在于所述文冠果的皂甙化合物是從文冠果的果殼和/或果柄，葉，種仁，種殼，枝干，樹皮和根中提取的。本發(fā)明還公開了一種組合物，其特征在于所述組合物含有文冠果的果殼和/或果柄，葉，種仁，種殼，枝干，樹皮和根的皂甙提取物。
本發(fā)明公了開文冠果皂甙化合物的用途，其特征在于所述文冠果的皂甙化合物可用于促進(jìn)膀胱生長，改善膀胱功能；改善睡眠警覺系統(tǒng)；調(diào)節(jié)制尿荷爾蒙(ADH)的釋放，分解和攝取及其受體的功能；調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)的荷爾蒙(ACTH)的釋放，分解和攝取及其受體的功能；調(diào)節(jié)5-羥色胺(5-HT)的釋放，分解和攝取及其受體的功能；調(diào)解乙酰膽堿(Ach)的釋放，分解和攝取及其受體的功能；調(diào)節(jié)腎上腺素(AD)的釋放，分解和攝取及其受體的功能；調(diào)解去甲腎上腺素(NE)的釋放，分解和攝取及其受體的功能；調(diào)節(jié)神經(jīng)肽的合成，釋放，分解和活性及其受體的功能；防止進(jìn)入睡眠麻痹的狀態(tài)；治療遺尿。治療癌癥，如卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌和腦癌，但又不限于上癌癥。以及改善肺的功能。
本發(fā)明專利還公開了一種化合物，其特征在于所述化合物含有三萜皂甙原或其它皂甙原，在碳3位上聯(lián)有糖鏈，在碳21和22位上聯(lián)有?；?或糖鏈，在糖鏈上聯(lián)有當(dāng)歸?；?。這些基團(tuán)有機(jī)(operatively)組成了具生物活性的化合物。
本發(fā)明專利公開了一種化合物，其特征在于所述化化合物中具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物Y-1 3-O-[(D-半乳糖吡喃?；?1(2)]-(-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1(3)-(-D-葡萄糖醛吡喃?；?21-O-(3，4-二黨歸酰基)-(L-鼠李糖吡喃?；?22-O-乙?；?3(，16(，21(，22，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
化合物R-1 3-O-[二黨歸?；?(1(3)-(-D-葡萄糖吡喃?；?(1(6)]-(-D-葡萄糖吡喃酰基-28-O-[(-L-鼠李糖吡喃?；?(1(2)-(-D-葡萄糖吡喃酰基-(1(6)-(-D-葡萄糖吡喃?；?-3(，21(，22(，28-四羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
本發(fā)明專利還公開了一類鹽類，其特征在于所述鹽類是由上述化合物形成的。本發(fā)明專利還公開了一類組合物(composition)，其特征在于所述組合物是由上述化合物或其鹽類和適當(dāng)載體形成的。
本發(fā)明專利還公開了一類藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物是由一定數(shù)量的上述化合物或其鹽類和適當(dāng)藥物載體所組成。
本發(fā)明專利還公開了從文冠果提取物中分離和提純化合物的方法，其特征在于所述方法如下采收文冠果樣品，清選，干燥；粉碎文冠果樣品，得文冠果樣品粉；用適量的一種或幾種有機(jī)溶劑浸提文冠果樣品粉(適當(dāng)?shù)拇螖?shù)和時(shí)間)，得機(jī)溶劑浸提液；收集浸提液，再回流熱提(適當(dāng)?shù)拇螖?shù))，得第二次提取物；回收有機(jī)溶劑得流浸膏；干燥和滅菌流浸膏，得粉狀文冠果提取物；把上述從從文冠果提出的粉狀取物分離成一至多個(gè)成分；用速效液相色譜(FPLC)分離和提純上述具有生物活性的成分；再用高效液相色譜(HPLC)分離出具有生物活性的化合物。
本發(fā)明專利公開了化合物Y-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證方法，其特征在于所述驗(yàn)證的方法是一維和二維的核磁共振法，其圖譜見圖7，8，9和10。
本發(fā)明專利公開了化合物R-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證的方法，其特征在于所述驗(yàn)證的方法是一維(氫的核磁共振和C-13核磁共振)和二維核磁共振法(HMBC和HMQC)，及質(zhì)譜法，其圖譜和數(shù)據(jù)見圖21，22，23，24和25。
本發(fā)明專利還公開了具有抗癌作用的上述從文冠果的提取物分離出的化合物Y-1及其衍生物，其特征在于所述Y-1的化學(xué)名稱為3-O-[(β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃?；?1→3)-(β-D-葡萄糖醛吡喃?；?21-O-(3，4-二黨歸酰基)-α-(L-鼠李糖吡喃?；?22-O-乙?；?3β，16α，21β，22α，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。其分子式為C65H100O27。
本發(fā)明專利還公開了具有抗癌作用的這些化合物或組合物，可癌通路(pathways)，其特征在于所述化合物或組合物可調(diào)節(jié)像G蛋白細(xì)胞和其受體，F(xiàn)as蛋白細(xì)胞和其受體，賴氨酸激酶和其受體，分裂素和其受體等的代謝活動(dòng)。這些化合物可從文冠果中提出，或人工合成，或從其它生物資源中提出。
本發(fā)明專利公開了具有抗癌作用的從文冠果的提取物分離出的化合物Y-1，其特征在于所述Y-1抗卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌和腦癌，但又不限于上癌癥。
本發(fā)明專利的扼要摘要，為了使本發(fā)明的某些條款更加突出或引入新條款，另一些條款的內(nèi)容可能在本摘要中被簡化甚至略去，但是，這不表明本發(fā)明專利僅限于這些在摘要中提到的內(nèi)容。
圖的詳細(xì)說明
圖1.用高效液相色譜(HPLC)在μbondapak C18柱上分離文冠果提取物成幾個(gè)組分的圖譜。
圖2.用膀胱細(xì)胞檢測被快速液相色譜(FPLC)從文冠果提取物中分離出的組分對細(xì)胞的生長的影響(MTT法)。2A.被快速液相色譜(FPLC)從文冠果提取物中分離出的組分。2B.不同組分對膀胱細(xì)胞的生長的影響不同。僅組分5962(Y)抑制細(xì)胞生長。橫坐標(biāo)濃度(μl/ml)，縱坐標(biāo)細(xì)胞生長(％)。
圖3.文冠果提取物組分5962的64％乙晴等梯度洗脫圖譜。在FPLC上兩個(gè)主要組分X和Y被分離出來。橫坐標(biāo)光強(qiáng)度(254nm)；縱坐標(biāo)組分編號(1ml/組分).
圖4.文冠果提取物的組分X(2021)和Y(2728)對膀胱細(xì)胞生長的影響僅Y抑制膀胱細(xì)胞生長。
圖5.文冠果提取物組分Y的高效液相色譜(HPLC)35％乙晴等梯度洗脫圖譜，顯示Y(2728)含有4-5個(gè)組分Y0，Y1，Y2，Y3和Y4。
圖6.文冠果提取物組分Ys的高效液相色譜(HPLC)45％乙晴在C18柱(Delta PakC18)上的等梯度洗脫圖譜。Y1和Y2清晰地分離開來。
圖7.化合物Y的質(zhì)子核磁共振(NMR)的圖譜。
圖8.化合物Y1二維核磁共振(HMQC)圖譜。
圖9.化合物Y1二維核磁共振(HMBC)圖譜。
圖10.化合物Y1質(zhì)子COSY-NMR圖譜圖11.化合物Y2質(zhì)子核磁共振圖譜。
圖12.化合物Y2二維核磁共振(HMQC)圖譜。
圖13.化合物Y5質(zhì)子核磁共振圖譜。
圖14.化合物Y5二維核磁共振(HMQC)圖譜。
圖15.化合物Y1的四個(gè)可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)A化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-1；B化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-2；C化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-3；D化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-4。
圖16.化合物Y1的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖17.化合物Y1和Y1-2對卵巢癌細(xì)胞生長的影響。
圖18.用快速液相色譜(FPLC)純化化合物R。
圖19.用高效液相色譜(HPLC)分析從快速液相色譜(FPLC)獲得的組分#9，#10和#11。
圖20.用高效液相色譜(Delta-Pak C18柱)純化組分R。A被快速液相色譜(FPLC)分出的組分#10進(jìn)一步被高效液相色譜分離(1)Delta-Pak C18柱；(2)30％乙晴等梯度洗脫和(3)流速1ml/分，在207nm檢測，光密度-0.128。B在同等條件下，R的主要組分再次色譜分析。
圖21.化合物R1的質(zhì)子核磁共振(NMR)的圖譜。
圖22.化合物R1二維核磁共振(HMQC)圖譜。
圖23.化合物R1二維核磁共振(HMBC)圖譜。
圖24.化合物R1質(zhì)子COSY-NMR圖譜圖25.化合物R1的C13核磁共振圖譜。
圖26.化合物R1的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖27.化合物Y-a的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
R5＝B or C or S1(見注釋1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注釋1A＝當(dāng)歸酰基；B＝乙?；?；C＝H；S1＝側(cè)鏈含有一至多個(gè)糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它們的衍生物。
圖28.化合物Y-b的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
R5＝B or C or S1(見注釋1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注釋1A＝當(dāng)歸?；?；B＝乙酰基；C＝H；S1＝側(cè)鏈含有一至多個(gè)糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它們的衍生物。
圖29.化合物Y-c的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖30.化合物Y1-a的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
R5＝B or C or S1(見注釋1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注釋1A＝當(dāng)歸?；?；B＝乙?；?；C＝H；S1＝側(cè)鏈含有一至多個(gè)糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它們的衍生物。
圖31.化合物Y1-b的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
R5＝B or C or S1(見注釋1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注釋1A＝當(dāng)歸?；?；B＝乙?；?；C＝H；S1＝側(cè)鏈含有一至多個(gè)糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它們的衍生物。
圖32.化合物Y1-c的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
R5＝B or C or S1(見注釋1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注釋1A＝當(dāng)歸?；?；B＝乙?；籆＝H；S1＝側(cè)鏈含有一至多個(gè)糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它們的衍生物。
圖33.用高效液相色譜(HPLC 20％乙晴等梯度洗脫)分離從快速液相色譜(FPLC)獲得的組分O。
圖34.組分#28再次色譜分析。
圖35.組分#34再次色譜分析。
圖36.組分#54再次色譜分析。
專利申請的詳細(xì)說明本發(fā)明提供文冠果粗皂甙提取物，其特征在于所述文冠果粗皂甙提取物從文冠果的果殼和/或果柄，種仁，種殼，枝干，樹皮和根中取得的。其從文冠果制備粗皂甙的工藝過程如下采收文冠果，清選果殼，干燥；粉碎文冠果果殼，得文冠果果殼粉；用有機(jī)溶劑(乙醇，甲醇等)浸提文冠果果殼粉，有機(jī)溶劑∶果殼粉2∶1的比例，在室溫下，浸提4-5次，每次20-35小時(shí)，得有機(jī)溶劑提取物；收集浸提液，再回流熱提(80C)2-3次，得二次提取物；把二次提取物溶于水，得水提取液；用正丁醇萃取水提取液，得正丁醇提取物；正丁醇萃取物經(jīng)色譜分離得粗皂甙。該粗皂甙提取物主要含有皂甙。
根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，遺尿，尿頻和尿急是由腎虧引起的。因此，治療遺尿，尿頻和尿急要用草藥，如人參，巴戟天，肉蓯蓉，杜仲和蟲草固腎。這些固腎的草藥可增強(qiáng)腎功能，通過“腎經(jīng)”調(diào)節(jié)人體的水分代謝作用，從而達(dá)到治療遺尿，尿頻和尿急的目的。
本發(fā)明提供的文冠果提取物也可用于治療遺尿，尿頻和尿急，但是，是通過“膀胱經(jīng)”調(diào)節(jié)人體的水分代謝作用從而達(dá)到治療遺尿，尿頻和尿急的目的。本發(fā)明提供的文冠果提取物可刺激膀胱的生長(見圖9和23B)，增強(qiáng)膀胱控制排尿的能力和尿容量，詳見國際PCT專利申請No.PCT/US04/33359的實(shí)驗(yàn)5(101-106頁)。因而，把入“腎經(jīng)”的草藥和本發(fā)明提供的入“膀胱經(jīng)”的文冠果提取物結(jié)合起來用于治療遺尿，尿頻和尿急，會(huì)受到更佳的效果。
本發(fā)明還提供了由文冠果提取物制成的藥物或保健品，其特征在于所述這些文冠果提取物制成的藥物或保健品分別可和維生素B，D，K，葡萄籽提取物或其它抗氧化劑，冬蟲夏草及其提取物，銀杏及其提取物，人參和西洋參及其提取物，聚果菊及其提取物，小金絲桃及其提取物，葛根及其提取物，天麻及其提取物，蜜環(huán)菌及其提取物，丹參及其提取物，三七及其提取物，紅曲，黃芪及其提取物，地黃及其提取物，當(dāng)歸及其提取物，遠(yuǎn)志及其提取物，靈芝及其提取物，茯苓及其提取物，甘草及其提取物，石松堿A，敵百蟲，拉西汀(Lacithin)，腦洗泰來(Nocetile)，葉酸，氨基酸，肌酸激酶和纖維添加劑等配伍一起制成各種造新藥物和保健食品。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可抑制5-羥色胺(5-HT)的吸收，5-羥色氨的存在可維持和加強(qiáng)人的深度睡眠。文冠果提取物抑制5羥色氨的吸收’從而打破深度睡眠，使人在膀胱尿滿時(shí)可以驚醒，避免尿床。(詳見國際PCT專利申請No.PCT/US04/33359的38頁)。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可增強(qiáng)多巴胺的活力，從而提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的警覺能力。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可調(diào)節(jié)制尿賀爾蒙(ADH)的合成，以減少腎臟產(chǎn)尿量，防止遺尿發(fā)生。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可抑制乙酰膽堿酶(AchE)的合成，調(diào)解乙酰膽堿(Ach)的釋放，吸收和分解，從而改善大腦中樞系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)信息的傳遞過程，避免由5-羥色氨(5HT)造成的深度睡眠發(fā)生，而增加輕度睡眠。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可防止睡眠麻痹(sleepparalysis)的發(fā)生。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可為睡眠提供警覺系統(tǒng)。
本發(fā)明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物有助于膀胱和括約肌的生長發(fā)育，防止遺尿發(fā)生。發(fā)育不良的膀胱和括約肌不能控制排尿過程。
本發(fā)明提供從文冠果提取物提出的化合物，其特征在于所述化合物可治療癌癥，如卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌和腦癌，但又不限于上癌癥。
本發(fā)明專利還公開了一種化合物，其特征在于所述化合物含有三萜皂甙原或其它皂甙原，在碳3位上聯(lián)有糖鏈，在碳21和22位上聯(lián)有?；?或糖鏈，在糖鏈上聯(lián)有當(dāng)歸?；＿@些基團(tuán)有機(jī)(operatively)組成了具生物活性的化合物。
本發(fā)明專利公開了一種化合物，其特征在于所述化化合物中具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物Y1 3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃?；?1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二黨歸?；?-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙?；?3β，16α，21β，22α，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
本發(fā)明專利公開了一種化合物，其特征在于所述化化合物中具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu) 化合物R13-O-[二黨歸?；?(1→3)-β-D-葡萄糖吡喃?；?(1→6)]-(-D-葡萄糖吡喃酰基-28-O-[(-L-鼠李糖吡喃酰基-(1(2)-(-D-葡萄糖吡喃?；?(1(6)-(-D-葡萄糖吡喃?；?-3(，21(，22(，28-四羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
本發(fā)明專利還公開了一種化合物，其特征在于所述化化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見于圖15A，15B，15C，15D，27，28，29，30，31和32。
本發(fā)明專利還公開了一類鹽類，其特征在于所述鹽類是由上述化合物形成的。
本發(fā)明專利還公開了一類組合物(composition)，其特征在于所述組合物是由上述化合物或其鹽類和適當(dāng)載體形成的。
本發(fā)明專利還公開了一類藥物組合物，其特征在于所述組藥物合物是由一定數(shù)量的上述化合物或其鹽類和適當(dāng)藥物載體所組成。
本發(fā)明專利公開了一種抗卵巢癌的物組合物，其特征在于所述組合物是由上述組和物所組成。
本發(fā)明還提供了檢測文冠果提取物的細(xì)胞特異性毒性反應(yīng)的方法，其特征在于所述方法是MTT檢測法。
材料和方法細(xì)胞下列人體癌細(xì)胞是從美國模式菌種保藏中心(Americarn TypeCulture Collection)獲得HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宮頸)，DU145(前列腺)，H460(肺)，MCF-7(乳腺)，k562(白細(xì)胞)，HCT116(結(jié)腸)，HepG2(肝)，U20S(骨)，T98G(腦)，和OVCAR-3(卵巢)。
培養(yǎng)HeLa-S3(宮頸)，DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和T98G(腦)細(xì)胞培養(yǎng)在MEN(Earle鹽)培養(yǎng)基上。HTB-9(膀胱)，H460(肺)，562(白細(xì)胞)和OVCAR-3(卵巢)培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基上，其它細(xì)胞在McCoy-5A培養(yǎng)基上。
這些培養(yǎng)基都要添加10％的牛胎兒血清，谷氨酰胺和抗菌素。在CO2濃度為5％的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT檢測檢測方法基本按照Carmicheal et al.1987的方法，僅個(gè)別地方小有改動(dòng)。這些細(xì)胞培養(yǎng)在有96個(gè)小穴的培養(yǎng)皿的小穴中24小時(shí)；每穴1萬HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宮頸)，H460(肺)，HCT116(結(jié)腸)，T98G(腦)，和OVCAR-3(卵巢)的細(xì)胞；每穴1.5萬DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和U20S(骨)的細(xì)胞；每穴4萬k562(白細(xì)胞)。然后，將文冠果提取物的試樣放入穴中，再培養(yǎng)48小時(shí)(肝和骨癌細(xì)胞72小時(shí)，乳腺癌細(xì)胞96小時(shí)。然后，MTT(0.5mg/ml)加入每個(gè)穴中，培養(yǎng)1小時(shí)。產(chǎn)生的formazan溶于DMSO，然后用ELISA讀數(shù)器(Dynatech，Model R700)測它的O.D.值(TD)。加入試樣前的MTTO.D.值(TO)也要測出。每種細(xì)胞生長的百分?jǐn)?shù)(％G)可按下面公式求出％G＝(TD-TO/TC-TO)×100 (1)(TC是對照細(xì)胞組的O.D.值)當(dāng)TO＜TD時(shí)，則細(xì)胞特異性毒性反應(yīng)(LC)值為％LC＝(TD-TO/TO)×100 (2)本發(fā)明提供的抗癌化合物，其特征在于所述化合物的分子式是C65H100O27，化學(xué)名稱3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃?；?1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃?；?21-O-(3，4-二黨歸?；?-α-L-鼠李糖吡喃?；?22-O-乙?；?3β，16α，21β，22α，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙，即化合物Y1。它的衍生物也具抗癌作用。另外，本發(fā)明還提供了化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Y，化學(xué)結(jié)構(gòu)R1，化學(xué)結(jié)構(gòu)1-4，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y-a，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y-b，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y-c，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-a，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-b，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-c，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-3，化學(xué)結(jié)構(gòu)Y1-4和它們的衍生物，詳見圖案5，27，28，29，30，31和32。這些化合物可從文冠果中提出或人工合成。
本發(fā)明提供的文冠果提取物的皂甙化合物及其衍生物可調(diào)節(jié)Wnt信號途徑中的生化環(huán)節(jié)或其受體，Wnt信號系統(tǒng)(Wht signaling pathway)調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞的增殖，死亡和形態(tài)發(fā)育，同時(shí)在癌細(xì)胞的發(fā)生方面也起著重要作用。發(fā)現(xiàn)一些癌癥發(fā)生是和Wnt信號系統(tǒng)被不適當(dāng)?shù)鼗罨嘘P(guān)。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控Wnt信號途徑中的生化環(huán)節(jié)或其受體，避免Wnt信號系統(tǒng)的不適當(dāng)?shù)鼗罨?，從而防止制癌?xì)胞的生成和增殖。
細(xì)胞有絲分裂和Ras-MAP激酶鏈信號途徑有關(guān)，如果Ras-MAP激酶鏈的活動(dòng)過分活躍，會(huì)導(dǎo)致基因調(diào)控蛋白Myc的生成，Myc會(huì)加快一些基因的復(fù)制，如果這一活動(dòng)過分活躍，會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的生成和增殖。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控Ras-MAP激酶鏈的活動(dòng)，使Ras-MAP激酶途徑的活動(dòng)不能過分活躍，從而不會(huì)引起癌細(xì)胞的生成和增殖。
有時(shí)Ras信號途徑中的氨基酸發(fā)生突變，引起含有這一氨基酸的蛋白永久性的過分活躍，導(dǎo)致從屬的Ras信號途徑在沒有有絲分裂的刺激的情況下也過分活躍。同樣，氨基酸發(fā)生突變也會(huì)引起Myc信號途徑活動(dòng)過分活躍。這都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常生長，而引起癌細(xì)胞的生成。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控氨基酸發(fā)生突變從屬的Ras信號途徑和Myc信號途徑，使它們不能過分活躍，從而不會(huì)引起細(xì)胞異常生長而導(dǎo)致癌變。
本發(fā)明提供的文冠果提取物的皂甙化合物及其衍生物可啟動(dòng)不正常細(xì)胞內(nèi)的監(jiān)控點(diǎn)(checkpoint)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)有一種監(jiān)控點(diǎn)(checkpoint)機(jī)制，監(jiān)控畸形有絲分裂和引起不正常過分活躍的細(xì)胞的死亡。癌細(xì)胞的監(jiān)控點(diǎn)機(jī)制由于編譯監(jiān)控點(diǎn)機(jī)制的基因突變而不能活動(dòng)，造成癌細(xì)胞無限制的生長和增殖。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的監(jiān)控點(diǎn)機(jī)制，及時(shí)制止不正常的有分裂活動(dòng)發(fā)生和制止癌細(xì)胞的生長和增殖。
本發(fā)明提供的文冠果提取物的皂甙化合物及其衍生物可調(diào)控胞外生長信號途徑。刺激細(xì)胞生長的胞外生長因子可通過細(xì)胞表面的受體啟動(dòng)胞內(nèi)信號途徑，激活PI3激酶促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，至少通過激活激酶eif4e和s6增加mRNA的擴(kuò)增，從而刺激細(xì)胞的生長。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控胞外生長信號途徑的環(huán)節(jié)或其受體，從而影響胞內(nèi)生長信號途徑，抑制細(xì)胞過分增殖，防止癌細(xì)胞的產(chǎn)生。
細(xì)胞分裂也要受到細(xì)胞核內(nèi)的Myc蛋白的控制。Myc蛋白過多會(huì)引起細(xì)胞的過分增殖，癌細(xì)胞形成。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，控制細(xì)胞內(nèi)Myc蛋白的過量產(chǎn)生，從而防止細(xì)胞過分增殖，導(dǎo)致腫瘤形成。
轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-alpha)可誘導(dǎo)鼠和雞的不成熟的先期造血細(xì)胞(例如BFU-E)的長期增值，還可誘導(dǎo)BFU-EDE細(xì)胞轉(zhuǎn)化成紅血球。轉(zhuǎn)化生長因子α還可刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。它在腫瘤組織的血管化方面起重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子α是由keratimcyte，巨噬細(xì)胞，肝細(xì)胞和血小板等產(chǎn)生的，病毒感染可刺激轉(zhuǎn)化生長因子α的合成。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子α信號途徑的環(huán)節(jié)或其受體，從而抑制卵巢和膀胱癌細(xì)胞的生長。
轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-beta)可調(diào)控細(xì)胞的增長，阻止許多細(xì)胞的生長。它有兩種受體受體1受體2。它們是絲氨酸-蘇氨酸激酶，通過SMAD編譯調(diào)節(jié)基因家族傳遞信號。轉(zhuǎn)化生長因子β信號途徑和SMAD編譯調(diào)節(jié)基因的突變和癌變有關(guān)。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β信號途徑的環(huán)節(jié)或其受體，從而抑制卵巢和膀胱癌細(xì)胞的生長。
DNA腫瘤病毒可通過干擾細(xì)胞循環(huán)控制蛋白E6和蛋白p53引起癌變。蛋白p53基因的突變使癌細(xì)胞在DAN損傷的情況下繼續(xù)生存和增長。乳頭瘤病毒利用蛋白E6和E7去分別使蛋白p53和Rb排序，這一過程會(huì)啟動(dòng)突變的細(xì)胞，使他們生存，分裂和增長。損傷細(xì)胞的增長會(huì)導(dǎo)致癌變。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)控蛋白E6和E7和釋放蛋白p53和Rb，而抑制畸形細(xì)胞的分裂生長。同時(shí)，還可以控制或者與這些蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，引起癌細(xì)胞死亡。
蛋白p53可以幫助多細(xì)胞有機(jī)體在DAN損傷和其它不利的情況下安全的自我復(fù)制，并在危險(xiǎn)的情況下停止細(xì)胞分裂和增長。癌細(xì)胞往往含有大量突變的蛋白p53，表明在不利的情況下遺傳上的突變或者生長受到壓抑會(huì)啟動(dòng)蛋白p53。因而，失去蛋白p53的活性是很危險(xiǎn)的，因?yàn)樗鼤?huì)使突變的細(xì)胞繼續(xù)完成它的生長周期，避免死亡。所以，如果DAN受到損傷，一些細(xì)胞會(huì)死亡，那些沒有修復(fù)損傷而生存下來并能繼續(xù)增長的細(xì)胞，可能攜帶一組敗壞的基因組，在基因擴(kuò)增的過程中，導(dǎo)致失去抑制癌的基因，而啟動(dòng)致癌基因。同時(shí)，基因擴(kuò)增也可能使細(xì)胞發(fā)展抗藥性。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可調(diào)蛋白質(zhì)53信號途徑的環(huán)節(jié)或其受體，從而抑制癌細(xì)胞增殖。
所有細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)都有各種休眠的procaspase，等待命去殺死細(xì)胞。procaspase是一種休眠的酶原，由自殺蛋白酶形成。它可通過蛋白酶的裂被另外caspase酶組動(dòng)。兩個(gè)裂的碎片結(jié)合在一起組成了caspase的有活性的部分。一個(gè)有活性的酶都被認(rèn)為是這兩個(gè)部分之一的四分體。每一動(dòng)了的caspase分子可裂成多個(gè)procaspase分子，它們反過來又動(dòng)更多的caspase分子。通過這一鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致大量procaspase分子的爆炸式的活動(dòng)。一些動(dòng)了的procaspase裂成多個(gè)關(guān)鍵的蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞液蛋白和nuclear-lamins，控制細(xì)胞的死亡。動(dòng)細(xì)胞外的死亡受體也能動(dòng)procaspase。但是，由于基因突變癌細(xì)胞的殺死細(xì)胞的信號被阻斷了。因而，癌細(xì)胞就不斷的分裂，導(dǎo)致了癌變。本發(fā)明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其組合物，可疏通阻滯癌細(xì)胞“自殺”信號傳遞的通路，使癌細(xì)胞“自殺”。
本發(fā)明專利還公開了一種化合物，其特征在于所述化合物含有三萜皂甙原或其它皂甙原，在碳3位上聯(lián)有糖鏈，在碳21和22位上聯(lián)有酰基和/或糖鏈，在糖鏈上聯(lián)有當(dāng)歸酰基。這些基團(tuán)有機(jī)(operatively)組成了具生物活性的化合物。
本專利還公開了一種抑制癌細(xì)胞生長的方法，其特征是所述方法是使一定量的上述化合物和適當(dāng)?shù)乃幬镙d體所組成的藥物去接觸所述癌細(xì)胞。
本專利還公開了一種抑制癌細(xì)胞生長的方法，其特征是調(diào)整上述藥物的用量。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本專利公開的文冠果提取物，它的組成，功能和應(yīng)用，以及他們的制備方法。
實(shí)施例之一 文冠果提取物的制備制備工藝過程如下(a)采收文冠果果殼，枝干，葉，種仁，根和樹皮，清選，干燥，粉碎，得文冠果原料粉；(b)用有機(jī)溶劑浸提文冠果原料粉，有機(jī)溶劑∶原料粉2∶1的比例，浸提4-5次，每次20-35小時(shí)，得有機(jī)溶劑提取物；(c)收集浸提液，再回流熱提(80C)2-3次，得二次提取物；(d)回收有機(jī)溶劑，得文冠果提取物浸膏；(e)干燥和滅菌，得粉狀文冠果提出物。
實(shí)施例之二 用高壓液相色譜(HPLC)分離提純文冠果提取物方法和材料色譜柱采用C18逆相μbondapak柱(Water P/N 27324)，乙睛(10％)，三氟乙酰酸(TFA，0.005％)為平衡液。
進(jìn)樣樣品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)中，濃度為1mg/ml；進(jìn)樣20μg。
洗脫用乙睛逐梯度洗脫，在70分鐘內(nèi)，濃度由10％升到80％；流速0.5ml/分。然后，在濃度80％時(shí)再保持10分鐘(70-80分)。然后，乙睛濃度降到10％(80-85分)，并保持25分鐘(85-110分)。
檢測吸收波長207nm。
記錄紙速度0.25cm/分。
光密度(OD)滿程，0.128。
所用儀器Waters Model 510溶劑傳送系統(tǒng)；Waters 484吸收率可調(diào)探測器；Waters 745/745B數(shù)據(jù)模型。
結(jié)果HPLC圖譜顯示，有60-70個(gè)峰。其中有4個(gè)為主要的峰，10個(gè)中等的峰，余者為小峰(見圖5)。其中27個(gè)主要的峰按乙睛洗脫液的濃度遞增的順序編號為a-z(見圖1)。
實(shí)施例之三 MTT檢測文冠果提取物的細(xì)胞特異性毒性反應(yīng)的方法方法和材料細(xì)胞下列人體癌細(xì)胞是從美國模式菌種保藏中心(American TypeCulture Collection)獲得HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宮頸)，DU145(前列腺)，H460(肺)，MCF-7(乳腺)，k562(白細(xì)胞)，HCT116(結(jié)腸)，HepG2(肝)，U20S(骨)，T98G(腦)，和OVCAR-3(卵巢)。
培養(yǎng)HeLa-S3(宮頸)，DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和T98G(腦)細(xì)胞培養(yǎng)在MEN(Earle鹽)培養(yǎng)基上。HTB-9(膀胱)，H460(肺)，562(白細(xì)胞)和OVCAR-3(卵巢)培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基上，其它細(xì)胞在McCoy-5A培養(yǎng)基上。
這些培養(yǎng)基都要添加10％的牛胎兒血清，谷氨酰胺和抗菌素。在CO2濃度為5％的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT檢測檢測方法基本按照Carmicheal et al.1987的方法，僅個(gè)別地方小有改動(dòng)。這些細(xì)胞培養(yǎng)在有96個(gè)小穴的培養(yǎng)皿的小穴中24小時(shí)；每穴1萬HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宮頸)，H460(肺)，HCT116(結(jié)腸)，T98G(腦)，和OVCAR-3(卵巢)的細(xì)胞；每穴1.5萬DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和U20S(骨)的細(xì)胞；每穴4萬k562(白細(xì)胞)。然后，將文冠果提取物的試樣放入穴中，再培養(yǎng)48小時(shí)(肝和骨癌細(xì)胞72小時(shí)，乳腺癌細(xì)胞96小時(shí)。然后，MTT(0.5mg/ml)加入每個(gè)穴中，培養(yǎng)1小時(shí)。產(chǎn)生的formazan溶于DMSO，然后用ELISA讀數(shù)器(Dynatech，Model R700)測它的O.D.值(TD)。加入試樣前的MTTO.D.值(TO)也要測出。每種細(xì)胞生長的百分?jǐn)?shù)(％G)可按下面公式求出％G＝(TD-TO/TC-TO)×100(1)(TC是對照細(xì)胞組的O.D.值)當(dāng)TO＜TD時(shí)，則細(xì)胞特異性毒性反應(yīng)(LC)值為％LC＝(TD-TO/TO)×100 (2)結(jié)果在這10種癌細(xì)胞中，可根據(jù)對文冠果提取物的敏感程度分為4組最敏感的是卵巢癌細(xì)胞；第二敏感的是膀胱，骨，前列腺和白血病癌細(xì)胞；有點(diǎn)敏感的是肝，乳房和腦癌細(xì)胞；不太敏感的是結(jié)腸，宮頸和肺癌細(xì)胞(圖23和國際專利申請書No.PCT/US04/33359的表8.1)。
表A文冠果提取物的MTT檢測結(jié)果
同時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度的文冠果提取物可刺激膀胱，骨，和肺細(xì)胞的生長(詳見國際專利申請書No.PCT/US04/33359的109-110頁)。
實(shí)施例之四 文冠果的化合物Y1的提純分離和化學(xué)結(jié)構(gòu)確定的方法(A)用快速液相色譜(FPLC)分離文冠果的提取物的組分的方法方法色譜柱采用octadecyl活化的硅膠柱，2cm×28cm，用乙睛(10％)-TFA(0.005％)為平衡液。
進(jìn)樣樣品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)，濃度為100mg/ml；進(jìn)樣體積1-2ml。
梯度洗脫用10-80％的乙睛(總共500ml)梯度洗脫。
檢測吸收波長254nm。
收集分離組分從10％-72％的乙睛洗脫液中共得到90個(gè)組分，每組分5ml。
所用儀器AKTA-FPLC；泵P920；檢測器UPC-900；Frac-900。
結(jié)果FPLC洗脫圖譜顯示，有4-5大的組分(見圖4)。這些組分進(jìn)一步用高效液相色譜(HPLC)分析，其中一些在圖21L按a-z編號的特別的小峰(成分)再在FPLC的組分圖譜上定位。
經(jīng)FPLC分離的組分被分為7組，并用于膀胱細(xì)胞生長的MTT檢測。結(jié)果表明，至少有一組(5962)對膀胱細(xì)胞生長有抑制作用(圖2B)。
純的文冠果提取物Y(5962)組分失去了刺激膀胱，骨，和肺細(xì)胞的生長的能力，但是，仍然保持抑制癌細(xì)胞的能力。
(B)用快速液相色譜(FPLC)進(jìn)一步分離文冠果生物活性物質(zhì)組分#5962。
方法色譜柱采用octadecyl活化的硅膠，50ml，2cm×28cm，用乙睛(64％)-TFA(0.005％)為平衡液。
進(jìn)樣樣品溶入65％的乙睛-TFA，濃度為1-2mg/ml；
進(jìn)樣體積1-2ml。
洗脫用64％乙睛等梯度洗脫。
檢測吸收波長254nm。
收集分離組分從洗脫液中收集前90個(gè)組分，每組分1ml。
所用儀器AKTA-FPLC；泵；P920；檢測器UPC-900；Frac-900。
結(jié)果組分#5692用開式ODS-C18分流柱和64％的isocratic乙睛洗脫進(jìn)一步分離和純化，得到兩個(gè)主要組分X和Y(圖3)。但是，MTT檢測結(jié)果顯示，僅組分Y癌細(xì)胞有抑制反應(yīng)(圖4)。
(C)高壓液相色譜(HPLC)分離文冠果生物活性物質(zhì)組分Y方法色譜柱采用Waters μbondapak C18(3.9mm×300cm)。
洗脫35％或45％的等梯度洗脫。
流動(dòng)速率0.5ml/分，檢測吸收波長207nm。
檢測光密度(O.D.)標(biāo)度0.128；記錄紙速度0.25cm/分。
結(jié)果用35％等梯度洗脫，組分Y分離出4-5成份(Y0，Y1，Y2，Y3，Y4和Y5)(圖5)。
(D)用HPLC把組分Y中的生物活性成分分離提純出來方法色譜柱采用Waters Delta Pak C18-300A。
洗脫45％的等梯度洗脫。
流動(dòng)速率1.0ml/分。
檢測吸收波長207nm。
結(jié)果Y1和Y2被很好地分離出來，并分別予以收集。但是，Y3/Y4和Y5沒有很好地分離開(圖6)。Y1峰的部分收集起來，并真空冷凍干燥(化合物Y1)。
最終提純的Y1組分外觀呈不定型的白色粉末狀。可溶于水醇中(甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。
Y1和Y2 MTT檢測結(jié)果顯示，它們都有很強(qiáng)的抗癌活性(圖17)。
(E)文冠果生物活性物質(zhì)Y組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)的測定方法核磁共振(NMR)分析純的文冠果提取物Y組分樣品溶在含有0.05％TMS的吡啶-d5(pydine-D5)中，用帶有QXI探頭(1H/13C/15N/31P)的Bruker Avance 600MHz核磁共振儀，獲得所有樣品的298k核磁共振譜。一維1H的核磁共振譜的掃描次數(shù)(16-128)取決于樣品的濃度。二維HMQC核磁共振譜，譜寬6000×24000Hz，t1和t2維的資料點(diǎn)分別為2024×256，掃描次數(shù)為4-128。二維HMBC核磁共振譜，譜寬6000×30000Hz，t1和t2維的資料點(diǎn)分別為2024×256，掃描次數(shù)為64。這些二維數(shù)據(jù)通過數(shù)學(xué)演算和運(yùn)用XWIN-NMR軟件進(jìn)行Fourier變換，最后得到的二維HMQC和HMBC核磁共振譜的矩陣的規(guī)模分別是2048×256和2048×512(data points，F(xiàn)2×F1)。
質(zhì)譜分析文冠果提取物樣品的質(zhì)量通過MALDI-TOF質(zhì)譜測定法來測定。
首先將樣品溶于乙睛中，然和CHCA母液混合(α-氰-4-羥基肉硅酸10mg/ml，溶于50∶50水/乙睛和0.1％TFA中)。樣品完全溶于乙睛中，和母液混合后仍保持溶解狀態(tài)。分子量通過高分辨率的質(zhì)譜儀測定。
結(jié)果組分Y1組分Y1的質(zhì)子核磁共振譜見圖7。組分Y1的二維HMQC核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖8，二維HMBC核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖9，二維COSY核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖10。
根據(jù)這些資料和分析(見表1)，從文冠果提取物分離出具生物活性的化合物Y1是一種三萜皂甙，含有2個(gè)糖鏈4個(gè)糖，聯(lián)在其中含有1個(gè)糖的糖鏈上的2個(gè)當(dāng)歸?；?，化合物Y1的分子式C65H100O27，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示
化學(xué)名稱3-O-[β-D-半乳糖吡喃?；?1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖吡喃?；?21-O-(3，4-二黨歸?；?-α-L-鼠李糖吡喃?；?22-O-乙?；?3β，16α，21β，22α，28-五羥基齊墩果-12-烯三萜皂甙。
表1.化合物Y1的13C和1H NMR數(shù)據(jù)(溶在吡啶-d5d中)a
a數(shù)據(jù)是根據(jù)HMQC和HMBC的相關(guān)資料確定(The data were assigned based on HMQC andHMBC correlations.)Y1的質(zhì)量根據(jù)MALDI-TOF測定是is 1358.71，和Y1理論值加上兩個(gè)鈉(Na)和一個(gè)氫(H)是一致的(1312.64)。
組分Y2組分Y2的質(zhì)子核磁共振譜見圖11。組分Y2的二維HMQC核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖12。
組分Y5組分Y5的質(zhì)子核磁共振譜見圖13。組分Y2的二維HMQC核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖14。
實(shí)施例之五 文冠果的化合物Y1的酸解化合物Y是從文冠果純化分離出來的(詳見國際PCT專利申請No.PCT/US04/33359的107-108，110和136頁)通過酸解，化合物Y1-c的化學(xué)結(jié)構(gòu)被確定下來。
方法5mg的文冠果提取物Y溶于3ml的甲醇中，然后用3ml的3N HCl酸處理，回流4小時(shí)，進(jìn)行水解。水解后用5％Na2CO3中和，然后用EtOAc萃取三次，得到水溶性部分，含糖類，和脂溶性部分，含皂甙元(aglycon)。皂甙元(aglycon)用硅膠柱色譜法(CHCl3∶MeOH，1∶9)或C18 ODS柱高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)一步提純。得到約2mg新化合物Y-c(方法參閱Essentials of Carbohydrate Chemistry.By John F.Robyt，Springer，1998)。
低聚糖通過不完全酸水解和特殊酶水解來裂解。如，阿拉伯呋喃糖醛酸1→4鍵可被α-淀粉酶裂解。其它酶如β-淀粉酶，異粉酶，葡萄糖氧化酶，甘露聚糖酶(mannanse)和麥芽糖酶也可來裂解皂甙中的低聚糖。
皂甙中的當(dāng)歸酰胺基可用堿水解來裂解。如，把化合物Y溶于1M NaOH，室溫下攪拌2-3小時(shí)，用2M HCl酸化或中和，水解了的皂甙再用乙酸乙酯萃取。然后，再在C18柱上用HPLC進(jìn)一步提純。通過酶水解，化合物Y可轉(zhuǎn)化為下列化合物
和化合物 通過酸解，化合物Y1-c的化學(xué)結(jié)構(gòu)被確定下來，如下 實(shí)施例之六 文冠果的化合物R1的提純分離和化學(xué)結(jié)構(gòu)確定的方法(A)用快速液相色譜(FPLC)分離文冠果的提取物的組分的方法方法色譜柱采用octadecyl活化的硅膠柱，2cm×28cm，用乙睛(10％)-TFA(0.005％)為平衡液。
進(jìn)樣樣品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)，濃度為100mg/ml；
進(jìn)樣體積1-2ml。
梯度洗脫用10-80％的乙睛(總共500ml)梯度洗脫。
檢測吸收波長254nm。
收集分離組分從10％-72％的乙睛洗脫液中共得到90個(gè)組分，每組分5ml。
所用儀器AKTA-FPLC；泵P920；檢測器UPC-900；Frac-900。
結(jié)果FPLC洗脫圖譜顯示，有4-5大的組分(見圖2A)。這些組分進(jìn)一步用高效液相色譜(HPLC)分析，其中一些的特別的小峰(成分)，如a-z再在FPLC的組分圖譜上定位編號(見圖1)。
(B)用快速液相色譜(FPLC)進(jìn)一步分離文冠果組分R方法色譜柱采用octadecyl活化的硅膠，50ml，2cm×28cm，用乙睛(30％)-TFA(0.005％)為平衡液。
進(jìn)樣樣品溶入30％的乙睛-TFA，濃度為1-2mg/ml；進(jìn)樣體積0.2ml。
洗脫用30％乙睛等梯度洗脫。
檢測吸收波長254nm。
收集分離組分從洗脫液中收集前90個(gè)組分，每組分1ml。
所用儀器AKTA-FPLC；泵P920；檢測器UPC-900；Frac-900。
結(jié)果從快速液相色譜(FPLC)等梯度洗脫所得組分39-41(圖2A)。用開式ODS-C18分流柱30％的isocratic乙睛洗脫進(jìn)一步分離和純化，得到兩個(gè)主要組分中的兩個(gè)成分得以確定(圖18)。組分6-13的特性也得到進(jìn)一步分析。
(C)高壓液相色譜(HPLC)分離組分R方法色譜柱采用Waters μbondapak C18(3.9mm×300cm)。
洗脫30％的乙睛梯度洗脫(10-80％)。
流動(dòng)速率0.5ml/分，檢測吸收波長207nm。
檢測光密度(O.D.)標(biāo)度0.128；記錄紙速度0.25cm/分。
結(jié)果用30％梯度洗脫，組分9-11含有一個(gè)主成分和幾個(gè)次要成份(圖19)。這些成分進(jìn)一步用Delta Pak柱30％的乙睛等梯度洗脫，分離出4-5成分，其中主成分被確認(rèn)為R1(圖20A)。R1隨后從柱上收集起來(圖20B)。最終提純的R1外觀呈不定型的白色粉末狀?？扇苡谒贾?甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。
(D)文冠果化合物R1的化學(xué)結(jié)構(gòu)的測定方法核磁共振(NMR)分析請見實(shí)施例之四的核磁共振(NMR)分析。
質(zhì)譜分析請見實(shí)施例之四的MALDI-TOF質(zhì)譜測定法。
結(jié)果組分R1的質(zhì)子核磁共振譜見圖21，二維HMQC核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖22，二維HMBC核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖23，二維COSY核磁共振譜的數(shù)據(jù)見圖24。組分R1的碳13核磁共振譜見圖25，
根據(jù)上述這些資料，R1的功能集團(tuán)和化學(xué)結(jié)構(gòu)見表2。
表2.化合物R1的13C和1H NMR數(shù)據(jù)(溶在吡啶-d5d中)a
a功能集團(tuán)的結(jié)構(gòu)根據(jù)COSY，HMQC和HMBC的相關(guān)資料確定(The data were assigned based on COSY，HMQC and HMBC correlations.)b，c，d，f每縱行中數(shù)據(jù)具有相同字母的，是相互重迭的。e每縱行中數(shù)據(jù)具有相同字母的，是可能相互交換的。
根據(jù)對以上數(shù)據(jù)的分析，從文冠果提取物分離出具生物活性的化合物R1是一種三萜皂甙，含有2個(gè)糖鏈5糖，和聯(lián)在其中含有2個(gè)糖的糖鏈上的一個(gè)當(dāng)歸?；?，化合物R1的分子式C65H105O29，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示 化合物R1化學(xué)名稱為3-O-[黨歸?；?(1(3)-(-D-葡萄糖吡喃?；?1(6)]-(-D-葡萄糖吡喃?；?28-O-[(-L-鼠李吡喃酰基-(1(2)-(-D-葡萄糖吡喃?；?(1(6)-(-D-葡萄糖吡喃?；?3(，21(，22(，28-四羥基齊墩果-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
實(shí)施例之七 文冠果的化合物O的提純分離和化學(xué)結(jié)構(gòu)確定的方法(A)用快速液相色譜(FPLC)分離文冠果的提取物的組分O的方法方法色譜柱采用octadecyl活化的硅膠柱，2cm×28cm，用乙睛(10％)-TFA(0.005％)為平衡液。
進(jìn)樣樣品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)，濃度為100mg/ml；進(jìn)樣體積1-2ml。
梯度洗脫用10-80％的乙睛(總共500ml)梯度洗脫。
檢測吸收波長254nm。
收集分離組分從10％-72％的乙睛洗脫液中共得到90個(gè)組分，每組分5ml。
所用儀器AKTA-FPLC；泵P920；檢測器UPC-900；Frac-900。
結(jié)果FPLC洗脫圖譜顯示，有4-5大的組分(見圖2A)。這些組分進(jìn)一步用高效液相色譜(HPLC)分析，其中一些的特別的小峰(成分)，如a-z再在FPLC的組分圖譜上定位編號(見圖1)。
(B)用快速液相色譜(HPLC)進(jìn)一步分離文冠果組分O方法色譜柱采用Waters Delta Pak C18-300A柱。
進(jìn)樣收集從FPLC分離出的樣品#280，進(jìn)HPLC分析。
進(jìn)樣體積0.2ml。
洗脫用20％乙睛等梯度洗脫。進(jìn)樣速度1ml/min，檢測吸收波長254nm。收集組分28，34和54，并凍干燥。在同等條件下，再次把組分28，34和54進(jìn)行液相色譜分析。
結(jié)果
從快速液相色譜(FPLC)等梯度洗脫觀察到16個(gè)組分(圖33)。用HPLC進(jìn)一步分離和純化組分34，35和36，得到單一峰的組分28，34和54，說明它們是單一的成分。
最終提純的成分0-28和0-34外觀呈不定型淡黃色粉末狀?？扇苡谒贾?甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。最終提純的成分0-54外觀呈不定型白色粉末狀?？扇苡谒贾?甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。
(C)從文冠果化合物O中純化組分化學(xué)結(jié)構(gòu)的測定方法核磁共振(NMR)分析請見實(shí)施例之四的核磁共振(NMR)分析。
質(zhì)譜分析請見實(shí)施例之四的MALDI-TOF質(zhì)譜測定法。
盡管本專利發(fā)明僅對一些特別關(guān)注的方面做了詳盡的說明，但這并不意味著對其它不同的方面不能加以說明，和不能對已詳盡說明的部分加以改變。很明顯，詳盡說明這些變化和改變是受到了本專利發(fā)明規(guī)模的影響。同時(shí)，上面提供的發(fā)明，說明和圖表僅用于表述目的，并不能限制本專利發(fā)明對專利權(quán)利的要求。
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1，本專利申請的一種組合物，其特征在于所述組合物含有從冠果的果殼和/或果柄，葉，枝干，種仁，根和樹皮中提出的化合物。
2，如申請專利范圍第1項(xiàng)所述組合物，其特征是該組合物含有皂甙化合物。
3，本專利申請的一種治療遺尿的藥物或保健食品，其特征在于所述藥物或保健食品含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
4，本專利申請的一種松弛膀胱的藥物或保健食品，其特征在于所述藥物或保健食品含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
5，本專利申請的一種可能改善大腦皮層和小腦反應(yīng)能力的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2所述的組合物。
6，本專利申請的一種能防止睡眠進(jìn)入深度睡眠的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2所述的組合物。
7，本專利申請的一種能改善膀胱壁中的擴(kuò)約感受接收器給中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出信號能力的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2所述的組合物。
8，本專利申請的一種能用作乙酰膽堿酯酶(AchE)的抑制劑的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
9，本專利申請的一種抗炎的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
10，本專利申請的一種抗病毒的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
11，本專利申請的一種能治療人體免疫缺失的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-7項(xiàng)所述的組合物。
12，本專利申請的一種可用作癌細(xì)胞抑制劑的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
13，本專利申請的一種可降低血液中膽固醇和甘油三酯的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是含有如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物。
14，本專利申請的一種能防止大腦衰老，增進(jìn)記憶和改善腦功能；治療夜尿，尿頻，尿失禁，癡呆，弱智，老年癡呆，孤獨(dú)癥，腦損傷，帕金森病等和其它由于腦功能不健全或障礙所引起的病癥；醫(yī)治關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕癥，循環(huán)不良，動(dòng)脈硬化，雷諾病，心絞痛，心臟功能紊亂，冠心病，頭痛，眩暈，腎臟功能紊亂，陽萎和早瀉的組合物，其特征是所述的組合物是含有申請專利范圍第1或2項(xiàng)所述的組合物。
15，本專利申請的一種配伍的藥物或保健食品，其特征是所述的配伍的藥物或保健食品是由如申請專利范圍第1-2項(xiàng)所述的組合物所制成藥物或保健食品和下列植物或其提取物，或其它藥物配伍葡萄籽提取物或其它抗氧化劑提取物；蟲草(Cordycepsspp.)或其提取物，銀杏(Gingko biloba)或其提取物，人參(Panax ginseng)或其提取物，西洋參(P.quinquefolium)或其提取物，黃皮(Clausena lansium)或其提取物，聚果菊(Echinacea)或其提取物，小金絲桃(Hypericumperforatum)或其提取物，葛根(Pueraria lobata) 或其提取物，天麻(Gastrodia elata)或其提取物，蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)或其提取物，丹參(Salvia miltiorrhiza)或其提取物，三七(Panax notoginsen)或其提取物，紅曲(Monascus)或發(fā)酵物(Red yeast rice)，黃芪(Hedysarumpolybotrys) 或其提取物，地黃(Rehmannia glutinosa)或其提取物，當(dāng)歸(Anqelica sinensis)或其提取物，遠(yuǎn)志(Polygala tenuifoila)或其提取物，靈芝(Ganoderma spp.)或其提取物，茯苓(Poria cocos)或其提取物，甘草(Glycyrrhiza uralensis)或其提取物，石杉堿A(Huperzine A)，Lacithin，Metrifonate，Nocetile，reatine，葉酸，氨基酸，維他命B，D，K和纖維添加物等。
16，本專利申請的由如申請專利范圍第1或2項(xiàng)所述的文冠果的植物的組合物所制成藥物或保健食品的劑型，其特征是所述的劑型為膠囊，片劑，散劑，水劑或其它劑型。
17，如申請專利范圍第2項(xiàng)所述的從從冠果的果殼和/或果柄，葉，枝干，種仁，根和樹皮中提出柄粗皂甙提取物，其特征是制備粗皂甙提取物方法依下列步驟(a)采收文冠果，清選果殼和/或果柄，葉，枝干，種殼，根和樹皮，干燥，粉碎，得文冠果粉；用有機(jī)溶劑浸提文冠果粉(2∶1)4-5次，每次20-35小時(shí)，得有機(jī)溶劑浸提液；(b)收集浸提取液，再回流熱提(80℃)2-3次，得二次浸提液；(c)溶解流浸膏于水中，得水浸提液；集合并提取液；(d)用正丁醇浸提水浸提液，得正丁醇浸提物；(e)用色譜法分離正丁醇浸提物，得粗皂甙提取物。
18，如申請專利范圍第17項(xiàng)所述有機(jī)溶劑，其特征在于所述有機(jī)溶劑是乙醇或甲醇。
19，如申請專利范圍第2項(xiàng)所述的從從冠果的種仁中提出柄粗皂甙提取物，其特征是制備粗皂甙提取物方法依下列步驟(a)采收文冠果，剝殼得到種仁，壓軋種仁去油得種仁餅；(b)干燥，粉碎種仁餅得種仁粉，用正己烷提取種仁粉進(jìn)一步去油；(c)回收正己烷；(d)干燥，磨粉得去油種仁霜；(e)用有機(jī)溶劑(乙醇，甲醇等)浸提種仁霜，(2∶1)4-5次，每次20-35時(shí)，得有機(jī)溶劑浸提液；(f)收集浸提液，再回流熱提(80℃)2-3次，得二次浸提液；(g)溶解二次浸提液于水中，得水浸提液；(h)用正丁醇浸提水浸提液，得正丁醇浸提物；(i)用色譜法分離正丁醇浸提物，得粗皂甙提取物。
20，如申請專利范圍第19項(xiàng)所述有機(jī)溶劑，其特征在于所述有機(jī)溶劑是乙醇或甲醇。
21，本專利申請的一種由如申請專利范圍第1或2項(xiàng)所述的文冠果的組成物所制成的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品可促進(jìn)膀胱發(fā)育，可制止深度睡眠，可提高睡眠警覺狀態(tài)，可調(diào)節(jié)制尿荷爾蒙(ADH)和促腎上腺皮質(zhì)的荷爾蒙(ACTH)的釋放，分解和攝取及其受體，可調(diào)節(jié)5-羥色胺(5-HT)的釋放，分解和攝取及其受體，可調(diào)解乙酰膽堿(Ach)的釋放，分解和攝取及其受體，可調(diào)節(jié)腎上腺素(AD)的釋放，分解和攝取及其受體，可調(diào)節(jié)多巴胺(DA)的釋放，分解和攝取及其受體和可調(diào)解去甲腎上腺素(NE)的釋放，分解和攝取及其受體。
22，本專利申請的一種由如申請專利范圍第1或2項(xiàng)所述的文冠果的組成物所制成的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品有助防止睡眠麻痹，可調(diào)節(jié)肽的合成，釋放，分解和活性及其受體。
23，本專利申請的一種治療癌癥的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品是由如申請專利范圍第1或者說所述的文冠果的組成取物所制成。
24，如申請專利范圍第23項(xiàng)所述治療癌癥，其特征是所述的癌癥包括卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌，結(jié)腸癌，宮頸癌，皮膚癌和腦癌。
25，本專利申請的一種由如申請專利范圍第1或2項(xiàng)所述的文冠果的組成物所制成的藥物或保健食品，其特征是所述的藥物或保健食品可改善肺和膀胱功能；促進(jìn)骨胳生長發(fā)育；減少尿量和次數(shù)和推遲排尿。
26，本專利申請的一種配伍的藥物或保健食品，其特征是所述的配伍的藥物或保健食品是由如申請專利范圍第1或2項(xiàng)所述的組合物所制成藥物或保健食品和下列草藥配伍人參，巴戟天，肉蓯茸，杜仲或冬蟲夏草。
27，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下化合物Y1 3-O-[β-D-半乳糖吡喃?；?1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃?；?1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二黨歸?；?-α-L-鼠李糖吡喃?；?22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
28，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物含有三萜類化合物或其它皂甙元，在碳3位有一個(gè)糖鏈，在碳21和22位有一乙?；?或糖鏈，當(dāng)歸?；瘓F(tuán)聯(lián)在糖鏈上，糖鏈和當(dāng)歸?；瘓F(tuán)有機(jī)的(operatively)和皂甙元聯(lián)在一起形成了該化合物。
29，如申請專利范圍第28項(xiàng)所述的化合物，其特征是所述化合物至少含有兩個(gè)糖。
30，如申請專利范圍第28項(xiàng)所述的化合物，其特征是所述化合物至少一個(gè)當(dāng)歸酰基集團(tuán)
31，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-1)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖15A所示。
32，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖15B所示。
33，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-3)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖15C所示。
34，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-4)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖15D所示。
35，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y-a)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖27所示。
36，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y-b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖28所示。
37，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y-c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖29所示。
38，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-a)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖30所示。
39，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖31所示。
40，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物(Y1-c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖32所示。
41，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(R1)具有如下化學(xué)名稱3-O-[β-D-半乳糖吡喃?；?1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃?；?1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃?；?21-O-(3，4-二黨歸?；?-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙?；?3β，16α，21β，22α，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
42，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示
43，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或質(zhì)子核磁共振譜如圖7所示。
44，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖8所示。
45，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMBC圖譜如圖9所示。
46，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振圖譜(COSY)如圖10所示。
47，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的質(zhì)子核磁共振譜如圖11所示。
48，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖12所示。
49，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或質(zhì)子核磁共振譜如圖13所示。
50，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖14所示。
51，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或質(zhì)子核磁共振譜如圖21所示。
52，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖22所示。
53，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMBC圖譜如圖23所示。
54，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振圖譜(COSY)如圖24所示。
55，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的C13核磁共振譜如圖25所示。
56，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的質(zhì)子核磁共振譜如圖37所示。
57，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖38所示。
58，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的質(zhì)子核磁共振譜如圖39所示。
59，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖40所示。
60，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的質(zhì)子核磁共振譜如圖41所示。
61，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC圖譜如圖42所示。
62，本專利申請一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMBC圖譜如圖43所示。
63，本專利申請的一種鹽類化合物，其特征是所述鹽類化合物為如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述化合物的鹽類化合物。
64，本專利申請的一種可抑制癌細(xì)胞生長的組合物，其特征是所述組合物含有申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物。
65，本專利申請的一種可抑制癌細(xì)胞生長的組合物，其特征是所述組合物由如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述化合物中任一項(xiàng)化合物和一種適合的載體所組成。
66，本專利申請的一種可抑制癌細(xì)胞生長的組合物，其特征是所述組合物是由一定數(shù)量的如申請專利范圍第27-62所述任一項(xiàng)化合物和一種適合的藥物載體所組成。
67，本專利申請的一種抑制卵巢癌細(xì)胞生長的方法，其特征是所述抑制卵巢癌細(xì)胞生長的方法是用一定濃度的如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述組合物去接觸卵巢癌細(xì)胞。
68，本專利申請的一種治療遺尿的方法，其特征是所述方法是用一定濃度的如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述組合物去治療遺尿。
69，本專利申請的一種松弛膀胱的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
70，本專利申請的一種能改善大腦皮層和小腦反應(yīng)能力的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
71，本專利申請的一種能防止睡眠進(jìn)入深度睡眠的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
72，本專利申請的一種能改善膀胱壁中的擴(kuò)約感受接收器給中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出信號能力的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
73，本專利申請的一種能治療膀胱組織緊張的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
74，本專利申請的一種能用作乙酰膽堿酯酶(AchE)的抑制劑的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
75，本專利申請的一種抗炎的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62所述任一項(xiàng)化合物。
76，本專利申請的一種抗病毒的的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
77，本專利申請的一種能抑制人體免疫缺失病毒蛋白酶的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
78，本專利申請的一種用作癌細(xì)胞抑制劑的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
79，如申請專利范圍第78項(xiàng)所述治療癌癥，其特征是所述的癌癥包括卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌，結(jié)腸癌，宮頸癌，皮膚癌和腦癌。
80，本專利申請的一種可降低血液中膽固醇和甘油三酯的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
81，本專利申請的一種能防止大腦衰老和改善腦功能，治療夜尿，尿頻，尿失禁，癡呆，弱智，老年呆，孤獨(dú)癥，腦損傷，帕金森病等和由于腦功能不健全或障礙所引起的病癥，醫(yī)治關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕癥，循環(huán)不良，動(dòng)脈硬化，雷諾病，心絞痛，心臟功能紊亂，冠心病，頭痛，眩暈，腎臟功能紊亂，陽萎和早瀉的的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
82，本專利申請的一種能改善膀胱功能或預(yù)防膀胱癌的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
83，本專利申請的一種可提高睡眠警覺狀態(tài)的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
84，本專利申請的一種可調(diào)節(jié)制尿荷爾蒙(ADH)的釋放，分解和攝取的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
85，本專利申請的一種可調(diào)節(jié)制促腎上腺皮質(zhì)荷爾蒙(ACTH)的分泌，分解和攝取及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
86，本專利申請的一種可調(diào)節(jié)多5-羥色胺(5-HT)的釋放，分解和攝取及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
87，本專利申請的一種可調(diào)乙酰膽堿(Ach)的釋放，分解和攝取及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
88，本專利申請的一種可調(diào)節(jié)腎上腺素(AD)的釋放，分解和攝取及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
89，本專利申請的一種可調(diào)節(jié)多巴胺(DA)的釋放，分解和攝取及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
90，本專利申請的一種可調(diào)去甲腎上腺素(NE)的釋放，分解和攝取及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
91，本專利申請的一種可調(diào)節(jié)肽的合成，釋放，分解和活性及其受體的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
92，本專利申請的一種改善肺或膀胱功能的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一項(xiàng)化合物。
93，本專利申請的一種從文冠果提取化合物的方法，其特征是所述提取化合物的方法依下列步驟a.用有機(jī)溶劑浸提文冠果樣品粉，得有機(jī)溶劑浸提液；b.收集合并浸提液；c.再回流熱提浸提液，得二次浸提液；d.回收有機(jī)溶劑得流浸膏；e.干燥，滅菌流浸膏得文冠果粗提取物粉。f.用高效相色譜(HPLC)和快速液相色譜(FPLC)分離文冠果粗提取物粉，得一或多種組分；g.檢測吸收波長為207nm或254nm；h.從上述組分中鑒定出具生物活性的組分；i.用快速液相色譜(FPLC)分離提純出生物活性的成分(一種或幾種)；j.再用高效相色譜(HPLC)從中提純分離出具有生物活性的化合物。
94，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述文冠果樣品是文冠果的果殼和/或果柄，枝干，葉，種仁，種殼，根，和樹皮。
95，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述有機(jī)溶劑是乙醇，甲醇，乙醚，氯仿和丙醇等。
96，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述有機(jī)溶劑和文冠果樣品的比例是2比1。
97，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑浸提文冠果樣品，浸提4-5次，每次20-35小時(shí)。
98，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述的回流熱提是回流熱提2-3次。
99，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述的回流熱提溫度是80℃。
100，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的制備文冠果提取物的方法，其特征是所述鑒定生物活性成分的方法是用MTT鑒定法。
101，如申請專利范圍第93(i-j)項(xiàng)所述的從文冠果提取物中分離提純出的一種或幾種生物活性成分，其特征是所述一種或幾種生物活性成分的HPLC圖譜見于圖5-6。
102，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的從文冠果提取物中分離和提純出的的化合物，其特征是所述化合物的HPLC圖譜見于圖19-20。
103，如申請專利范圍第93項(xiàng)所述的從文冠果提取物中分離和提純出的的化合物，其特征是所述化合物的HPLC圖譜見于圖20。
104，本專利申請的一種能能治療膀胱癌的組合物，其特征是所述組合物含有如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所任一種述化合物。
105，本專利申請的一種能抑制卵巢癌細(xì)胞的方法，其特征是所述抑制卵巢癌細(xì)胞的方法是用一定濃度的如申請專利范圍第27-62項(xiàng)中所述任一種組合物去接觸卵巢癌細(xì)胞。
106，本專利申請的一種能治療或抗卵巢癌的方法，其特征是所述的方法是用適當(dāng)?shù)臐舛鹊娜缟暾垖＠秶?7-62項(xiàng)中所述組合物去治療卵巢癌。
107，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)Wnt通路中的組元或它們的受體以阻止癌細(xì)胞增殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
108，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)Ras-MAP激酶鏈中的組元或它們的受體的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
109，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)Ras-pendent或Myc通路中的組元或它的受體的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
110，本專利申請的一種能啟動(dòng)“檢查機(jī)制”(checkpoint mechanism)以阻止癌細(xì)胞增殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
111，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)孢外生長的組元或其受體的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
112，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)Ras和MAP激酶鏈中的組元或其受體以阻止卵巢癌細(xì)胞增殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
113，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)Myc細(xì)胞增殖以阻止癌細(xì)胞裂殖的組元或其受體的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
114，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)α-TGF的組元或其受體以抑制卵巢和膀胱癌細(xì)胞增殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
115，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)β-TGF的組元或其受體以抑制卵巢和膀胱癌細(xì)胞增殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
116，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)E6，E7和釋放蛋白質(zhì)Rb，p53以抑制畸形細(xì)胞裂殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
117，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)或能與蛋白質(zhì)起反應(yīng)以引起癌細(xì)胞死亡的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
118，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)合成蛋白質(zhì)p53的通路和其受體以抑制癌細(xì)胞裂殖的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
119，本專利申請的一種能使細(xì)胞中被阻斷的自殺信號(suicidesignal)重新釋放的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第301-308項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
120，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)BMP，GF，Jak-jnk-STAT和Junfos的通路和其受體的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
121，本專利申請的一種能調(diào)節(jié)糖腎上腺皮質(zhì)激素，雌激素，酪氨酸激酶，G-蛋白，和EGF的受體的組合物，其特征是所述組合物是由一定濃度如申請專利范圍第27-62項(xiàng)所述的任一化合物所組成。
122，本專利申請的一種抑制癌細(xì)胞生長的方法，其特征是所述方法是使一定量的具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物去接觸所述癌細(xì)胞 3-O-[β-D-半乳糖吡喃?；?1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃?；?21-O-(3，4-二黨歸酰基)-α-L-鼠李糖吡喃?；?22-O-乙?；?3β，16α，21β，22 α，28-五羥基-12-烯五環(huán)三萜皂甙。
全文摘要
本發(fā)明提供了從文冠果(Xanthoceras sorbifolia)分離，提純和鑒定具生物活性的化合物的方法和工藝。本發(fā)明同時(shí)提供了含有從文冠果提純的化合物的組合物。從文冠果提純的化合物中有皂甙化合物。組合物可以用于抗癌，防止腦衰老，增強(qiáng)記憶，改善腦功能，治療夜尿，尿頻，尿急，弱智，癡呆和老年癡呆，孤獨(dú)癥，腦創(chuàng)傷，帕金森病，和其它由于腦功能不健全或障礙所引起的病癥，還可用于治療關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕癥，循環(huán)不良，動(dòng)脈硬化，雷諾氏癥，心絞痛，心臟功能紊亂，冠心病，頭痛，頭暈，腎功能紊亂，陽萎和早瀉。本發(fā)明提供的化合物，含有三萜類化合物皂甙原或其它皂甙原，在碳21和22位有含乙?；蛱擎?，在糖鏈上聯(lián)有當(dāng)歸酰基，這些功能集團(tuán)有機(jī)地連在一起形成了該化合物。
文檔編號A61K131/00GK1972702SQ200480038698
公開日2007年5月30日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者陳沛光, 麥美送, 王云 申請人:太平洋艾瑞有限公司