專利名稱：用于癌癥治療的抗ccr7受體的抗體的制作方法
用于癌癥治療的抗CCR7受體的抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及癌癥治療。更具體地，本發(fā)明涉及用CCR7受 體的抗體治療其腫瘤細(xì)胞是表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞的癌癥，該CCR7 受體的抗體能夠選捧性殺傷所述腫瘤細(xì)胞、減弱所述肺瘤細(xì)胞的遷移 和/或阻斷所述腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。發(fā)明背景癌癥是由不受控制的細(xì)胞分裂(或者存活或抗凋亡性增加)以及所 述細(xì)胞侵入其它鄰近組織(侵入)和擴(kuò)散至在正常情況下不存在該細(xì)胞 的身體其它區(qū)域(轉(zhuǎn)移)的能力所表征的疾病，所述擴(kuò)散通過淋巴管和 血管，通過血流的循環(huán)，然后侵入身體其它部位的正常組織。根據(jù)它 們是否能夠通過侵入和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，腫瘤被分類為良性的和惡性的兩 性腫瘤是不能夠通過侵入和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的腫瘤，即它們只能在局部生長； 而惡性腫瘤是能夠通過侵入和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的腫瘤。根據(jù)癌癥所來源的細(xì)胞類型和細(xì)胞位置可以將癌癥分類為數(shù)種類 型，即癌(cacinomas)，其發(fā)生自覆蓋身體外部和內(nèi)部表面的細(xì)^*，例 如皮膚、消化道或腺體；白血病，其從血液形成組織例如骨髓開始， 并造成大量的異常血細(xì)胞產(chǎn)生并進(jìn)入血流；淋巴癌，其為起源自淋巴 結(jié)和才幾體免疫系統(tǒng)的組織的癌癥；黑素瘤，其發(fā)生在黑素細(xì)^^中；肉 瘤(sarcoma)，其來自骨骼或肌肉的結(jié)締組織；及畸胎瘤，其來自生殖 細(xì)胞中。能夠通過手術(shù)、化療、放療、免疫治療或其它方法治療癌癥。治 療方法的選擇取決于腫瘤的位置和級別以及疾病的階段。在腫瘤治療方案中待解決的顯著問題是期望"殺傷全部細(xì)胞"。 這指越是有效的治療方案越接近于殺傷全部稱為"克隆發(fā)生"惡性細(xì) 胞的細(xì)胞，即具有不受控制生長和導(dǎo)致可以通過治療去除的腫瘤塊形成的能力的細(xì)胞。另一腫瘤治療策略是使用"免疫毒素"，其中使用抗腫瘤細(xì)胞抗 體遞送毒素至腫瘤細(xì)胞。然而，與上述化療方法相同，免疫毒素療法 也有明顯的缺點(diǎn)。例如，抗原陰性或抗原缺陷細(xì)胞能夠存活并重建腫 瘤或?qū)е逻M(jìn)一步轉(zhuǎn)移。即使原發(fā)癌被完全除去，惡性肺瘤也經(jīng)常是轉(zhuǎn) 移的。從原發(fā)腫瘤起始，在身體的或遠(yuǎn)或近的位置形成惡性腫瘤轉(zhuǎn)移， 是癌癥最嚴(yán)重的后果之一且目前沒有滿意的治療方法。目前擁有的癌 癥治療方法在防止轉(zhuǎn)移方面效果有限或產(chǎn)生嚴(yán)重的不期望的副作用。盡管諸如抗細(xì)胞劑、毒素和凝結(jié)因子的治療劑向腫瘤塊的特異遞 送代表了癌癥治療方法中的顯著進(jìn)步，但依然存在另外的或甚至可選 療法的空間。鑒定另外的允許特異體內(nèi)腫瘤破壞的靶標(biāo)自然會有助于 擴(kuò)大靶標(biāo)選擇的數(shù)目。癌癥治療的新治療策略正向使用特異治療發(fā)展，包括抗腫瘤細(xì)胞表達(dá)的不同抗原的單克隆抗體(mAb)，其可能有希望治愈所述疾病。免疫治療中的抗原選擇必須考慮抗原的腫瘤特異性、腫瘤細(xì)胞表 面的抗原密度及抗原調(diào)節(jié)或抗原-抗體復(fù)合體的內(nèi)化，其能夠降低產(chǎn) 生細(xì)胞死亡的能力。在大多數(shù)情況下，認(rèn)為補(bǔ)體依賴的細(xì)胞溶解(CDC) 和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)是造成未偶聯(lián)mAbs的臨床使 用的原因，盡管在其它情況中誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞周期阻滯可能也起重要 作用。癌癥細(xì)胞可以表達(dá)某些分子受體。不同研究顯示CC趨化因子受 體7 (CCR7)在不同胂瘤細(xì)胞中表達(dá)，例如B細(xì)胞慢性淋巴性白血病、 非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、惡性乳腺腫瘤等等。此外，看起來CCR7 受體在諸如胃癌、黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞白血病細(xì)胞等不同 癌癥的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起作用。因此，能夠選擇所述趨化因子受體(CCR7) 作為癌癥的mAb治療的可能靶標(biāo)。CCR7是7個跨膜結(jié)構(gòu)域G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。 G蛋白偶聯(lián)受 體家族(GPCRs)包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子和病毒的受體[Yoshie O, Imai T， Nomiyama H. Novel lymphocyte-specific CC chemokines and their receptors (新的淋巴細(xì)胞特異性CC趨化因子及其受體).J LeukocBiol. 1997; 62:634-644; Kim CH， Pelus LM, White JR， Applebaum E， Johanson K, Broxmeyer HE. CK beta-11/macrophage inflammatory protein-3 beta/EBIl-ligand chemokine is an efficacious chemoattractant for T and B cells (CK 1/巨噬細(xì)胞炎性蛋白30/ EBI1配體趨化因子是 T細(xì)胞和B細(xì)胞的有效化學(xué)吸引物).J Immunol. 1998; 160:2418-2424; Dieu MC， Vanbervliet B, Vicari A, & a/. Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites (在不同解剖位置表達(dá)的不同趨化因子選擇性募 集未成熟和成熟樹突狀細(xì)胞).J Exp Med. 1998; 188:373-386; Willimann K, Legler DF， Loetscher M， a/. The chemokine SLC is expressed in T cell areas of lymph nodes and mucosal lymphoid tissues and attracts activated T cells via CCR7 (趨化因子SLC在淋巴結(jié)的T細(xì) 胞區(qū)域和粘膜淋巴組織表達(dá)并通過CCR7吸引活化的T細(xì)胞).Eur J Immunol. 1998; 28:2025-2034; Yoshida R， Nagira M， lmai T, " a/. EBI1 -ligand chemokine (ELC) attracts a broad spectrum of lymphocytes: activated T cells strongly up-regulate CCR7 and efficiently migrate toward ELC (EBI1配體趨化因子(ELC)吸引多種淋巴細(xì)胞活化的T 細(xì)胞強(qiáng)烈上調(diào)CCR7且向ELC有效遷移).Int Immunol. 1998; 10:901 -910; Sallusto F, Schaerli P， Loetscher P， W a/. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation (樹突狀細(xì)胞成熟期間趨化因子受體表達(dá)的快速和協(xié)調(diào)的轉(zhuǎn)變).Eur J Immunol. 1998; 28:2760-2769]。腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的白血病的具體例子是慢性淋巴細(xì)胞白 血病(CLL),最常見的人成年白血病類型。所述白血病是B細(xì)胞白血 病，由強(qiáng)烈抗凋亡的CD5 + B細(xì)胞的單一克隆的積累所表征，所述抗凋 亡是由于涉及細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的失調(diào)造成 的。盡管其非常低的增殖指數(shù)，外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)達(dá)到大于5x lOVjLtL的值且白血病細(xì)l包顯示入侵淋巴結(jié)、胰和骨髓的明顯傾向。對CLL的治療基于使用噤呤類似物作為第一線方案，特別是氟拉 達(dá)濱，單獨(dú)或聯(lián)合使用。至今，僅有的導(dǎo)致比氟拉達(dá)濱更高完全好轉(zhuǎn)率的治療聯(lián)合為利妥昔單抗， 一種抗CD20單克隆抗體，與氟拉達(dá)濱 或氟拉達(dá)濱和環(huán)磷酰胺聯(lián)用。此外，在CLL患者中使用上述聯(lián)合達(dá)到骨 髓吸出物的分子好轉(zhuǎn)，產(chǎn)生了 CLL潛在地可以不通過干細(xì)胞移植而治愈 的可能性。獲得最好的初始應(yīng)答和除去接受自體移植的患者的接種體中 的CLL細(xì)胞構(gòu)成了 CLL的一些主要治療挑戰(zhàn)。
套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的激進(jìn)亞型。細(xì)胞 被表征為CD20+ CD5+ CD23-以及t(ll;14)和細(xì)胞周期素Dl過表達(dá)。 通常用利妥昔單抗-CHOP (環(huán)磷酰胺、羥基柔紅霉素、Oncovin和潑尼松) 和隨后的干細(xì)胞移植或通過利妥昔單抗-HyperCVAD (環(huán)磷酰胺、長春 新堿、鹽酸阿霉素和地塞米松)。然而，在大多數(shù)情況下MCL未被治愈， 清楚表明需要新的治療方法。
最近證實(shí)了顯示臨床淋巴結(jié)病變的CLL患者在體外具有較高的 CLL細(xì)胞對CCR7配體、自穩(wěn)趨化因子CCL19 (MIP3-iS)和CCL21 (6Ckine)的遷移性應(yīng)答。因此，利用CCR7單克隆抗體阻斷CLL細(xì)胞 進(jìn)入次級淋巴組織可能是另一個優(yōu)勢。同樣，從這個角度，表達(dá)異位 CCR7的非淋巴樣腫瘤具有向次級淋巴器官轉(zhuǎn)移的能力，而缺乏此分 子或其它參與向次級淋巴器官歸巢的趨化因子受體的腫瘤呈現(xiàn)最小的 結(jié)節(jié)擴(kuò)散。
因此，亟需其他的癌癥療法，特別是表達(dá)CCR7受體的癌癥和腫 瘤細(xì)胞。有利地，所述療法應(yīng)允許體內(nèi)特異腫瘤破壞，例如通過殺傷 腫瘤細(xì)胞、減弱腫瘤細(xì)胞的遷移和/或阻斷肺瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于CCR7受體在某些腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，其在
而且它的表達(dá)限于幼稚T淋巴細(xì)胞和幼稚B淋巴細(xì)胞，以及成熟的樹 突狀細(xì)胞(DC)，因此在癌癥、特別是腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的癌癥 的治療中，所述CCR7受體成為使用單克隆抗體的令人感興趣的靶點(diǎn)。 發(fā)明者驚奇地觀察到CCR7的單克隆抗體，即識別CCR7受體上的表 位并且能夠與所述CCR7受體結(jié)合的抗體，在體外能夠殺傷CLL和MCL細(xì)胞，即表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞，但基本上不能殺傷表達(dá) CCR7的非肺瘤細(xì)胞，例如T淋巴細(xì)胞。
因此，本發(fā)明總體上涉及使用結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié) 合片段殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，該抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于治療癌癥的藥 物組合物中的用途；在具體的實(shí)施方案中，待治療的癌癥以表達(dá)CCR7 受體的腫瘤細(xì)胞為特征。
因此， 一方面，本發(fā)明涉及與CCR7受體結(jié)合的抗體，或其抗原 結(jié)合片段在制備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用于殺傷表達(dá) CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
另一方面，本發(fā)明涉及殺傷表達(dá)CCR7的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá) CCR7的腫瘤細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與結(jié)合所述 CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。
另一方面，本發(fā)明涉及在需要所述治療的個體中殺傷表達(dá)CCR7 受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方 法，所述方法包括給予所述個體治療有效量的結(jié)合CCR7受體的抗體 或其抗原結(jié)合片段。
另一方面，本發(fā)明涉及減弱表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞向次級淋 巴組織遷移和/或阻斷腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次級淋巴組織的方法，該方法 包括將所述腫瘤細(xì)胞與結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段接 觸。
另一方面，本發(fā)明涉及在需要所述治療的個體中減弱表達(dá)CCR7 受體的腫瘤細(xì)胞向次級淋巴組織遷移和/或阻斷腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次 級淋巴組織的方法，所述方法包括給予所述個體治療有效量的結(jié)合 CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞 或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物的方法，包括
a) 將表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞和與抗CCR7受體的抗體或其片段結(jié) 合的候選化合物相接觸，且
b) 確定所述候選化合物是否殺傷所述的表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞，其中，殺傷所述的表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞的化合物，為潛在用于 殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的肺瘤細(xì)胞凋 亡的化合物。
附圖簡要說明


圖1中，圖A顯示CCR7的表面表達(dá)在CLL細(xì)胞上要高于在正 常的B和T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)。通過流式細(xì)胞計(FCM)分析11名CLL 患者和6名健康供者的外周血樣品以區(qū)分不同的淋巴細(xì)胞群，其相應(yīng) 的CCR7表面密度以平均熒光強(qiáng)度(MFI)測量。柱以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的 形式表示；在圖B中，抗CCR7單克隆抗體并沒有造成受體的胞飲。 將來自CLL患者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)與抗CCR7單克隆抗體 (2iiig/ml)、 IgM單克隆抗體(克隆2H4)和IgG2a單克隆抗體(克隆 150503),或與作為陽性對照的CCR7的生理受體之一的CCL19(l/ig/ml) 一同孵育30秒到60分鐘的不同時間。然后，使用FCM，在電子設(shè)門 的CD19+CD5+ CCL細(xì)胞中測定CCR7 MFI。曲線代表CCR7相對于 基礎(chǔ)CCR7MFI的表達(dá)。顯示了代表性的例子。
圖2顯示抗CCR7單克隆抗體均介導(dǎo)CLL細(xì)胞的強(qiáng)烈和特異的補(bǔ) 體依賴的細(xì)胞溶解(CDC)。將來自CLL患者的PBMC與抗CCR7單克 隆抗體或其同種型對照(IC)一起孵育，然后暴露于家兔補(bǔ)體1小時。 通過7-AAD摻入和FCM分析在電子設(shè)門CLL細(xì)胞和正常T細(xì)胞中測 定細(xì)胞溶解。柱代表11個病例的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。(A)抗CCR7IgM 單克隆抗體(2/xg/mL), (B)抗CCR7IgG單克隆抗體(2/Ag/mL)。
圖3A顯示來自代表性套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(MCL)患者的腫瘤細(xì)胞 中的CCR7表面表達(dá)(黑線)，其通過包括相應(yīng)IC (灰線)的流式細(xì)胞術(shù) 測量，且圖3B顯示在抗CCR7單克隆抗體或其各自的IC存在下MCL 細(xì)胞的CDC。顯示了 4個病例的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
圖4描述CDC的劑量效應(yīng)曲線。用來自CLL患者(11=5)和健康供 者(n-2)的PBMC用濃度為0.5 /ig/mL至16 /xg/mL的抗CCR7單克隆 抗體進(jìn)行CDC測定。通過7-AAD摻入和FCM分析在電子設(shè)門的CLL 細(xì)胞、來自CLL患者的T細(xì)胞和來自健康供者的B和T細(xì)胞中測定CDC造成的細(xì)胞溶解的百分比。線條代表細(xì)胞溶解的平均值。(A)抗 CCR7IgM單克隆抗體，(B)抗CCR7IgG單克隆抗體。
圖5顯示CDC能力與CCR7表達(dá)水平相關(guān)。CLL細(xì)胞的CCR7 表面密度與在和家兔補(bǔ)體孵育1小時后的溶解的百分比相關(guān)0 = 0.602, P = 0.025， n = 11),該溶解是由于2 /ig/mL的抗CCR7 IgM單克隆抗體 介導(dǎo)的CDC。
圖6顯示鼠抗CCR7 IgG單克隆抗體不介導(dǎo)CLL細(xì)胞的ADCC。 先與抗CCR7IgG單克隆抗體(2pg/mL)、 IC或利妥昔單抗(作為陽性 對照)孵育的CLL細(xì)胞被暴露于人自然殺傷細(xì)胞(NK) 4小時。然后， 通過7-AAD摻入和FCM分析在電子設(shè)門CLL細(xì)胞中測定死亡細(xì)胞。 柱顯示6個實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7顯示抗CCR7單克隆抗體不誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖。來自健康 供者的PBMC與抗CCR7單克隆抗體、IC、抗CD3單克隆抗體加IL2 或僅與培養(yǎng)基一起培養(yǎng)72小時。通過pH]-胸苷摻入測定在培養(yǎng)的最后 16小時內(nèi)的DNA合成。柱代表重復(fù)三次的6個病例的平均值士標(biāo)準(zhǔn) 差。
圖8顯示抗CCR7單克隆抗體阻斷CLL和MCL細(xì)胞響應(yīng)CCL19 或CCL21的遷移。在用2 /ig/mL的抗CCR7 IgG (黑色柱)、IgM (灰色 柱)單克隆抗體或無單克隆抗體(白色柱)預(yù)孵育細(xì)胞30分鐘后，如方法 部分中所述進(jìn)行趨化性測定。(A)比較CLL細(xì)胞響應(yīng)CCL19(1 jiig/mL) 的遷移、基礎(chǔ)遷移和在CXCL12 (100 ng/mL)存在下的遷移，CXCL12 為不受抗CCR7單克隆抗體影響的趨化因子受體CXCR4的配體。顯 示了代表性病例。(B)比較MCL細(xì)胞響應(yīng)CCR7配體CCL19(1 jng/mL) 和CCL21 (1 ]Lig/mL)的遷移和基礎(chǔ)遷移。顯示了代表性病例。
發(fā)明詳細(xì)描述
本發(fā)明總體上涉及結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段在制 備用于治療癌癥，特別是腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的癌癥的藥物組合 物中的用途，所述治療通過殺傷所述腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì)胞的 凋亡。因此， 一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合 片段在制備用于殺傷表達(dá)CCR受體的胂瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR受體 的腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物中的用途。
待治療癌癥的腫瘤細(xì)胞是表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞。其腫瘤細(xì) 胞表達(dá)CCR7受體的癌癥類型的說明性、非限制性實(shí)例包括慢性淋巴 細(xì)胞白血病(CLL)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、濾泡型淋巴瘤、大B細(xì)胞淋 巴瘤、AIDS相關(guān)'淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma).伯基特淋巴瘤、B細(xì)胞急性原始淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、霍奇 金病、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤、蕈樣肉芽腫病、慢性骨髓增生性疾 病的暴發(fā)、骨髓增生異常綜合征的暴發(fā)、癌癥例如乳腺癌、非小細(xì)胞 肺癌、黑素瘤、胃癌或頭頸的鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌。
能夠通過常規(guī)方法鑒定表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞；例如，能夠 根據(jù)L印ez-Giral S.等人公開的方法(Journal of Leyukocyte Biology, Vol 76, Aug. 2004， 462-471)通過流式細(xì)胞術(shù)分析CCR7受體的表面表達(dá)。
本文所用的"治療癌癥"指抑制或控制腫瘤細(xì)胞的增殖，所述腫 瘤細(xì)胞是表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞。該術(shù)語包括，在其他情況中， 殺傷所述腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì)胞的凋亡、減弱所述腫瘤細(xì)胞向 次級淋巴組織的遷移和/或阻斷所述腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次級淋巴組織。
根據(jù)本發(fā)明，對CCR7受體特異的即結(jié)合CCR7受體的抗體或其 抗原結(jié)合片段，在本文中有時稱為本發(fā)明的抗體，能夠用于殺傷表達(dá) CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡。因此， 本發(fā)明的抗體能夠用于制備用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘 導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物。因此，本發(fā)明提供 用于治療癌癥，特別是其腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的癌癥的可選方法。
本文所用的術(shù)語"殺傷腫瘤細(xì)胞"指通過特異溶解所述細(xì)胞來特 異清除腫瘤細(xì)胞例如表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞的機(jī)制。所述溶解或 細(xì)胞毒性通常是由募集所述腫瘤細(xì)胞的補(bǔ)體蛋白(CDC)或例如NK細(xì) 胞(ADCC)的效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的，在用抗CCR7抗體處理所述肺瘤細(xì)胞后 所述蛋白和NK細(xì)胞分別能夠特異靶向所述肺瘤細(xì)胞和造成所述腫瘤 細(xì)月包的溶解。本文所用的術(shù)語"誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡"指表達(dá)CCR7受體的腫瘤 細(xì)胞在經(jīng)抗CCR7抗體處理后經(jīng)歷凋亡即細(xì)胞程序性死亡所通過的機(jī) 制。本文所用的術(shù)語"本發(fā)明的抗體"指對靶分子，即CCR受體(抗 原)顯示特異結(jié)合活性的7球蛋白或其片段。因此，本發(fā)明的抗體能夠 結(jié)合CCR7的表位；通常，形成表位需要至少6、 8、 10或12個連續(xù) 氨基酸，然而，包括非連續(xù)氨基酸的表位可以需要例如至少15、 25 或50個氨基酸。術(shù)語"本發(fā)明的抗體"例如包括多克隆抗體、單克隆 抗體、工程化的或經(jīng)修飾的抗體、嵌合抗體、人源化抗體、靈長動物 源化抗體、人抗體、例如Fab、 F(ab，)2、單鏈Fv(scFv)片段的抗體片段、 雙價小分子抗體(diabodies)雙特異性抗體和異源偶聯(lián)抗體。此外，本發(fā) 明的抗體還可以與其它化合物偶聯(lián)，例如治療劑、毒素等等?？梢酝?過多種方法產(chǎn)生這些抗體，包括雜交瘤培養(yǎng)、在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞 培養(yǎng)物中重組表達(dá)和在轉(zhuǎn)基因動物中重組表達(dá)。還能夠通過從表達(dá)在 展示系統(tǒng)中的序列文庫中選擇序列來產(chǎn)生抗體，所述展示系統(tǒng)例如絲 狀噬菌體、細(xì)菌、酵母或核糖體。在文獻(xiàn)中有關(guān)于選擇具體產(chǎn)生方法 的豐富指導(dǎo)，例:ft口 Chadd and Chamow， Curr. Opim Biotechnol.， 12: 188-194(2001)。制備方法的選擇取決于若干因素，包括期望的抗體結(jié) 構(gòu)、抗體上糖部分的重要性、容易培養(yǎng)和純化以及成本。使用標(biāo)準(zhǔn)表 達(dá)技術(shù)可以產(chǎn)生許多不同的抗體結(jié)構(gòu)，包括全長抗體、抗體片段例如 Fab和Fv片段、以及包含來自不同物種的組分的嵌合抗體。不具有效 應(yīng)物功能和具有有限的藥代動力學(xué)活性的小分子抗體片段，例如Fab 和Fv片段，可以在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。單鏈Fv片段顯示低免疫原 性且被從血液中快速清除。特異結(jié)合CCR7受體的表位的本發(fā)明抗體能夠被治療性使用，也 能夠用于免疫化學(xué)測定，例如免疫熒光測定、流式細(xì)胞術(shù)、Western 印跡、ELISAs、》文射免疫測定、免疫組化測定、免疫沉淀或本領(lǐng)域已 知的其它免疫化學(xué)測定。能夠使用多種免疫測定來鑒定具有期望特異 性的抗體。本領(lǐng)域公知多種用于竟?fàn)幮越Y(jié)合或免疫放射分析的實(shí)驗(yàn)方 案。這些免疫測定通常涉及測量免疫原和特異結(jié)合CCR7受體免疫原的抗體之間的復(fù)合物形成。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體。例如能夠在一次或多次注射免 疫劑優(yōu)選佐劑之后在哺乳動物例如非人哺乳動物中產(chǎn)生這些多克隆抗 體。通常，通過一系列皮下或腹膜內(nèi)注射將免疫劑和/或佐劑注射到哺乳動物中。免疫劑可以包括CCR7受體或其片段或其融合蛋白或者可 以包括表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞。或者，富集CCR7受體或其片段的粗 蛋白制劑能夠被用于產(chǎn)生抗體。這些蛋白、片段或制劑在適當(dāng)佐劑的 存在下被引入非人哺乳動物中。免疫原給藥的其它形式是作為細(xì)胞表 面的跨膜蛋白(方法描述在例如Spiller W a/. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)中)。這些細(xì)胞可以是在其細(xì)胞膜上天然表達(dá)抗原或在其 中能夠在用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后得到此表達(dá)的每一個，該DNA構(gòu) 建體含有編碼抗原的DNA序列、其在細(xì)胞中的充分表達(dá)所必需的 DNA序列以及其它DNA序列。不僅當(dāng)細(xì)胞膜是抗原表達(dá)的天然位點(diǎn) 時此方法是可行的，甚至當(dāng)抗原一旦在細(xì)胞中合成，就由被加到抗原 編碼序列的信號肽指引到這些位置時此方法也是可行的。如果血清含 有針對不期望表位的多克隆抗體，那么能夠通過免疫親和層析純化多 克隆抗體?；蛘撸隹贵w可以是單克隆抗體。可以通過雜交瘤產(chǎn)生單克隆 抗體，其中用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其它適合的宿主動物來引出產(chǎn) 生或能夠產(chǎn)生特異結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞，例如Kohler and Milstein， Nature 256:495 (1975)。免疫劑通常包括CCR7受體或其片段 或其融合蛋白且任選地包括載體或富集了 CCR7受體或其片段或表達(dá) CCR7受體的粗蛋白制劑。這些蛋白、片段或制劑在適合佐劑的存在 下被引入非人哺乳動物。免疫原給藥的其它形式是作為細(xì)胞表面的跨 膜蛋白(方法描述在例如Spiller " a/. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)中)。這些細(xì)胞可以是在其細(xì)胞膜上天然表達(dá)抗原或在其中能夠 在用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后得到此表達(dá)的每一個，該DNA構(gòu)建體含 有編碼抗原的DNA序列、其在細(xì)胞中的充分表達(dá)所必需的DNA序列 以及其它DNA序列。不僅當(dāng)細(xì)胞膜是抗原表達(dá)的天然位點(diǎn)時此方法 是可行的，甚至當(dāng)抗原一旦在細(xì)胞中表達(dá)就由被加到抗原編碼序列的信號肽指引到這些位置時此方法也是可行的?；蛘?，可以在體外免疫 淋巴細(xì)胞。通常，如果非人哺乳動物來源是期望的，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞，如果人源是期望的，則使用外周血淋巴細(xì)胞("PBLs")。 使用諸如聚乙二醇的合適融合試劑將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合， 產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。通常，永生化細(xì)胞系是大鼠、小鼠、?；蛉嗽吹墓?髓瘤細(xì)胞。在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有一 種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞的生長或存活的物質(zhì)。使用有限稀 釋法分離克隆，并且可以通過常規(guī)技術(shù)分析培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基 (上清液)中抗CCR7受體的單克隆抗體的存在，例如通過細(xì)胞流式術(shù) 或通過免疫沉淀或通過其它體外結(jié)合測定，例如RIA或ELISA。還能 夠作為動物體內(nèi)的腹水瘤體內(nèi)培養(yǎng)克隆。優(yōu)選地，由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫 沉淀或通過體外結(jié)合測定確定，例如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸 附測定(ELISA)或通過免疫熒光技術(shù)，例如焚光顯微法或流式細(xì)胞術(shù)。通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基、腹水液或血清適當(dāng)?shù)胤?離由亞克隆分泌的單克隆抗體，所述方法例如蛋白A瓊脂糖、羥基磷 灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。還可以通過重組DNA方法制備單克隆抗體，例如在US 4,816,567 中描述的。能夠使用常規(guī)方法從CCR7受體特異的雜交瘤細(xì)胞分離編 碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA及測序，例如通過能夠特異結(jié)合編碼鼠 抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針。雜交瘤為這些DNA的優(yōu) 選來源。 一旦分離，DNA可以被插入到表達(dá)載體中，然后該載體^皮轉(zhuǎn) 染到宿主細(xì)胞中，例如猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn) 生另外免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以獲得單克隆抗體在重組宿主細(xì)胞 中的合成。產(chǎn)生反應(yīng)性抗靶分子的特異抗體或抗體片段的另一方法為篩選表 達(dá)在細(xì)菌、酵母、絲狀噬菌體、核糖體或核糖體亞基及其它的展示系 統(tǒng)中的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫。這些方法通常使用 得自諸如健康供者、患者或健康或不健康的動物的多種來源的抗體序 列或抗體片段序列的大文庫。這些序列被克隆和表達(dá)在適當(dāng)系統(tǒng)中并通過其對抗原的結(jié)合親和性被選擇。以描述了多種選擇具有期望特性的抗體或片段的方法，例如中和、激動等等(Femdndez， Curr. Op. Biotech., 15: 364-373 (2004); Schmidt, Eur. J. Biochem,， 268: 1730-1738 (2001))。在一個實(shí)施方案中，還能夠通過重組方法產(chǎn)生作為本發(fā)明雜 交瘤特征的抗體和抗體片段，所述重組方法通過提取信使RNA、構(gòu)建 cDNA文庫和選擇編碼抗體分子片,殳的克隆。工程化的或經(jīng)修飾的抗體許多方法使用分子生物學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)，例如對遺傳學(xué)和免疫球 蛋白結(jié)構(gòu)的良好了解，構(gòu)建免疫球蛋白分子的不同修飾以改良其特性 用于臨床或其它用途。它們中的 一些傾向于降低分子在要使用的物種 中的免疫原性且得到的分子具有與該物種更加同源的序列。已使用了 多種方法獲得人源的單克隆抗體，避免了在健康人體中的倫理不允許 的舉動。在其它方法中，減小了分子量和大小，例如為了提高分子向 實(shí)體瘤的分布。其它可能性為在分子中結(jié)合用于多于一個靶分子的結(jié) 合結(jié)構(gòu)域(雙特異性抗體或三特異性的等等)，或者結(jié)合抗體或片段與 具有期望功能的另一分子，例如毒性劑、激素、生長因子、免疫調(diào)節(jié) 劑(免疫抑制劑或免疫刺激劑)、細(xì)胞生長抑制劑等等。通常，所有得 到的分子保留至少一個抗體可變結(jié)構(gòu)域，其賦予作為抗原-抗體結(jié)合 特征的高特異性和親和性。這樣的構(gòu)建的一些實(shí)例為嵌合抗體這些指用來自某些物種(通常是產(chǎn)生單克隆抗體的哺乳動物)的抗 體的可變區(qū)和其它物種(將要使用嵌合抗體的物種)的恒定區(qū)構(gòu)建的抗 體。這樣的構(gòu)建的目的是獲得具有原始單克隆抗體但具有較小免疫原 性且在待治療個體中被更好耐受的抗體，其具有增加的血清半衰期且 其能夠被識別用于效應(yīng)免疫機(jī)制，即補(bǔ)體、細(xì)胞毒細(xì)胞的Fc受體或其 它顯示物種特異性的免疫球蛋白的特異受體。人源化抗體"人源化抗體"指衍生自非人抗體，通常是鼠抗體的保留母體抗 體的抗原結(jié)合特性但在人中有較小免疫原性的抗體。這可以通過多種方法達(dá)成，包括(a)嫁接完整的非人可變區(qū)到人恒定區(qū)上產(chǎn)生嵌合抗 體；(b)僅嫁接非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)到人框架和保留或未保留關(guān)鍵 框架殘基的恒定區(qū)中；以及(c)移植完整的非人可變結(jié)構(gòu)域，但通過 取代表面殘基用人樣部分遮蓋它們。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了用于人源化非人抗體的方法。優(yōu)選地，人源化 抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸 殘基經(jīng)常被稱為"輸入"殘基，其通常取自"輸入"可變結(jié)構(gòu)域?；旧夏軌蚋鶕?jù)Winter和同事的方法(Jones Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann W a/., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen " a/., Science, 239:1534-1536 (1988))進(jìn)行人源化，通過用超 變區(qū)序列替代人抗體的對應(yīng)序列。實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中某 些超變區(qū)殘基和可能某些框架區(qū)(FR)殘基被來自嚙齒動物抗體的類似 位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。用于制備人源化抗體的、輕鏈和重鏈的人 可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的選擇對于減小免疫原性保留對抗原的特異性和親和性 是非常重要的。根據(jù)所稱的"最適"方法，用嚙齒動物抗體的可變結(jié) 構(gòu)域的序列篩選已知人可變區(qū)結(jié)構(gòu)域序列的全部文庫。與嚙齒動物的 序列最接近的人序列被接受為人源化抗體的人框架區(qū)(FR) (Suns W a/., J Immunol., 151:2296 (1993), Chothia & a/.， J Mol Biol， 196:901 (1987))。另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈的特定亞群的所有人抗體的 共有序列的特定框架區(qū)。同樣的框架區(qū)可以用于若干種不同的人源化 抗體(Carter " a/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 89:4285 (1992); Presta " a/" J. Immunol., 151:2623 (1993))。更重要的是抗體被人源化，保留對抗原的高親和性和其它有利的 生物學(xué)特性。為達(dá)成此目的，根據(jù)優(yōu)選方法，通過使用母體和人源化 序列的三維模型分析母體序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法制備 人源化抗體。靈長類源化的抗體此方法中使得抗體與人更加相似的進(jìn)一步步驟是制備所稱的靈長 類源化的抗體，即被工程化以含有猴(或其它靈長動物)抗體，特別是 食蟹猴抗體的可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域的重組抗體，且其含有人恒定結(jié)構(gòu)域序列，優(yōu)選人免疫球蛋白或74恒定結(jié)構(gòu)(或PE變體)。在 Newman & a/.， Biotechnology, 10: 1458-1460 (1992); US 5，658，570和 US 6，113，898中描述了這些抗體的制備。已凈艮道這些抗體展示與人抗 體的高度同源性，即85-98%，顯示人效應(yīng)功能，具有減小的免疫原性， 且可能顯示對人抗原的高親和性。Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)公開了產(chǎn)生重組抗體的另 一高效方法。人抗體"人抗體，，指含有完整人輕鏈和重鏈以及恒定區(qū)的抗體，通過任 何已知的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生。作為除人源化之外的另一選擇，能夠產(chǎn)生人抗體。例如，目前可 以產(chǎn)生經(jīng)過免疫能夠在不存在內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生下產(chǎn)生人抗體的全 部庫的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了在嵌合和種系突變 體小鼠中刪除抗體重鏈連接區(qū)PH基因?qū)е聝?nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。 在這些種系突變體小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在免 疫后產(chǎn)生人抗體。仿J:i口參見，Jakobovits W a/.， Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits " a/.， Nature, 362:255-258 (1993)。或者，能夠使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty e《a/., Nature 348:552-553 (1990))體外產(chǎn)生來自供者的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基 因庫的人抗體和抗體片段。根據(jù)此技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域被符合讀框地 克隆到諸如M13或fd的絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中， 并作為功能抗體片段被展示在噬菌體顆粒的表面上。因?yàn)榻z狀顆粒含 有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體功能特性的選擇還 導(dǎo)致選擇編碼顯示那些特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細(xì)胞 的某些特性。能夠以多種形式進(jìn)行噬菌體展示；關(guān)于其綜述，例如參 見 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)。還可以通過體外活化的B細(xì)胞或用人細(xì)胞重建其免疫系統(tǒng)的 SCID小鼠產(chǎn)生人抗體。一旦獲得人抗體，其編碼DNA序列就能夠被分離、克隆并引入 到適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)中，即細(xì)胞系，優(yōu)選來自哺乳動物，其隨后表達(dá)并釋 放人抗體到培養(yǎng)基中，能夠從該培養(yǎng)基中分離抗體?？贵w片段抗體片段是抗體的片段，例如Fab、 F(ab，)2、 Fab，和scFv。已經(jīng)開 發(fā)了多種產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過完整抗體的蛋白水解消 化衍生這些片段，但近來能夠通過重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。 在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv(scFv)片段，其還可以是單 特異性的或雙特異性的。抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab" 片段，每一個具有單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及剩余的"Fc"片段，其 名稱反應(yīng)出其容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合 位點(diǎn)且仍然能夠交聯(lián)抗原的F(ab，)2片段。"Fv"是最小的含有完整抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。 該區(qū)域由一條重鏈和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的緊密、非共價連接的二聚 體組成。在這種構(gòu)型下每一可變結(jié)構(gòu)域的三個超變區(qū)相互作用以確定 VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。總的說來，這六個超變區(qū)賦予 抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單一可變結(jié)構(gòu)域(或包含三個對抗 原特異的超變區(qū)的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗體的能力，盡管比完 整結(jié)合位點(diǎn)的親和性低。Fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第 一'度定結(jié)構(gòu)域 (CHI)。 Fab，片段與Fab片段的不同在于Fab，片段中增加了重鏈CH1 結(jié)構(gòu)域羧基末端的包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸的少數(shù) 殘基。Fab，-SH是本文中對恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸具有至少一個自由 巰基的Fab，的命名。F(ab，)Z抗體片段最初是作為Fab，片段對產(chǎn)生的， 該Fab，片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已 知的。"單鏈Fv，，或"scFv，，抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域， 其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含VH和 VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物，其使得scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的 期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113， Rosenburg and Moore eds.， Springer曙Verlag， N. Y" pp. 269-315 (1994)。術(shù)語"雙價小分子抗體(diabodies)"指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小 抗體片段，那些片段包含在同一多肽鏈中(VH-VL)與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 (VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用足夠短使得同一鏈上的兩 個結(jié)構(gòu)域不能配對的連接物，強(qiáng)迫該結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配 對并創(chuàng)造出兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙價小分子抗體在例如EP 404,097、 WO 93/11161和Hollinger " a/" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)中有更詳細(xì)的描述。本發(fā)明包括的結(jié)合CCR7受體的抗體的功能片段保留衍生該片段 的全長抗體的至少一種結(jié)合功能和/或調(diào)節(jié)功能。優(yōu)選的功能片段保留 相應(yīng)全長抗體的抗原結(jié)合功能(例如結(jié)合哺乳動物CCR7受體的能力)。 特別優(yōu)選的功能片段保留抑制哺乳動物CCR7受體的一種或多種特征 功能的能力，所述特征功能例如結(jié)合活性、信號傳導(dǎo)活性和/或刺激細(xì) 胞應(yīng)答。例如，在一個實(shí)施方案中，功能片段能夠抑制CCR7與一個 或多個其配體的相互作用和/或能夠抑制一種或多種受體介導(dǎo)的功能。雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩種不同的表位具有結(jié)合特異性的抗體。 實(shí)例性雙特異性抗體可以結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志物的兩種不同表位。其 它的這樣的抗體可以結(jié)合第一B細(xì)胞標(biāo)志物且進(jìn)一步結(jié)合第二B細(xì)胞 表面標(biāo)志物?；蛘撸笲細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)合臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā) 分子的臂組合以將細(xì)胞防御機(jī)制集中到B細(xì)胞，白細(xì)胞上的觸發(fā)分子 例如T細(xì)月包受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcyR)，例 如FcyRI (CD64)、 FcyRII (CD32)和FcyRIII (CD 16)。雙特異性抗體還 可以被用于將細(xì)胞毒試劑定位到B細(xì)胞。這些抗體具有B細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒試劑(例如皂草素、抗干擾素a、長春花生物堿、 蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗 體能夠被制備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab)2雙特異性抗體)。本領(lǐng)域已知制備雙特異性抗體的方法。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng) 生產(chǎn)是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)，其中所述兩條鏈具 有不同的特異性(MillsteineM/.， Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫 球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)搭配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)產(chǎn)生10種不 同抗體分子的可能混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。 通常通過親和層析步驟完成的正確分子的純化是比較困難的，并且產(chǎn) 物產(chǎn)率低。在WO 93/08829和Traunecker " a/.， EMBO J， 10:3655-3659 (1991)中公開了相似的方法。根據(jù)不同的方法，具有期望結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))被融合到免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。優(yōu)選地，該融合 是利用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu) 域。優(yōu)選在至少一個融合中存在含有輕鏈結(jié)合所必需位點(diǎn)的第一重鏈 恒定區(qū)(CHI)。編碼免疫球蛋白重鏈融合的DNA以及，如果需要，編 碼免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到分別的表達(dá)載體中，并且被共轉(zhuǎn) 染到合適的宿主生物中。這提供了當(dāng)在構(gòu)建中使用不等比例的三種多 肽鏈以提供最佳產(chǎn)率時，調(diào)節(jié)實(shí)施方案中的三種多肽片段的相互比例 的很大靈活性。然而，當(dāng)?shù)缺壤磉_(dá)至少兩種多肽鏈導(dǎo)致高產(chǎn)率時或 當(dāng)比例不特別重要時，有可能將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插 入到一個表達(dá)載體中。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或"異偶聯(lián)物"抗體。例如，異偶聯(lián)物 中的抗體之一能夠與抗生物素蛋白耦合，另一個與生物素耦合。例如 提出這樣的抗體將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞。異偶聯(lián)物抗體可 以使用任何方便的交聯(lián)方法制備。本領(lǐng)域公知合適的交聯(lián)劑和許多交 聯(lián)技術(shù)，且US 4,676,980公開了合適的交聯(lián)劑。文獻(xiàn)中還描述了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，能 夠使用化學(xué)鍵制備雙特異性抗體?？贵w偶聯(lián)癌癥的細(xì)胞毒化療或放療受到因?yàn)樗鲋委煵痪哂袑盒约?xì)胞的 選擇性而導(dǎo)致對敏感正常細(xì)胞的毒性而產(chǎn)生的嚴(yán)重的、有時致命的副 作用。避免這些問題的一種方法是將治療劑和抗體或其它識別腫瘤相 關(guān)抗原的配體偶聯(lián)。這增加惡性細(xì)胞暴露于配體靶向的治療劑并減少 正常細(xì)胞暴露于配體靶向的治療劑。參見Allen, Nature, 2: 750-763 (2002)。治療劑還可以是免疫抑制劑，即抑制或遮蔽本文中接受治療的哺 乳動物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將會包括抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑 制自身抗原表達(dá)或遮蔽MHC抗原的物質(zhì)。治療劑還可以是細(xì)胞毒性劑，即抑制或防止細(xì)胞的功能和/或造成 細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性同位素、化療劑和毒素，化 療劑即可用于癌癥治療的化學(xué)化合物，毒素例如細(xì)菌、真菌、植物或 動物源的小分子毒素或酶活性毒素或其片段。治療劑還可以是細(xì)胞因子、激素、生長因子、壞死因子，即由一 群細(xì)胞釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)(mediators)作用于另 一細(xì)胞或甚至同 一細(xì)胞群的蛋白或多肽。如本文中所用，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然 來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物和天然序列細(xì)胞因子的生物活性等價物的 蛋白和多肽。治療劑還可以是前藥，其指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生形式，該 藥物活性物質(zhì)與母體藥物相比對腫瘤細(xì)胞具有較小的細(xì)胞毒性且能夠 被酶促活化或轉(zhuǎn)化成更具活性的母體形式?？贵w和一種或多種小分子毒素的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，拮抗劑與一個或多個毒素分子偶聯(lián)。能夠使用的酶促活化 的毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A 鏈(來自銅綠假單胞菌CPsewJo附owas flen/g/"o; a))、蓖麻毒蛋白A鏈、 相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、a帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石沖十素(dianthin)蛋白、美洲商陸(尸/ ;^o/aca a附en.cawa)蛋 白(PAPI、 PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹 毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白、mitogellin 、 restrictocin 、 酚霉素(phenomycin)、 伊諾霉素 (neomycin)和tricothecene。本發(fā)明還涉及與具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA 內(nèi)切酶例如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)或其它能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或細(xì) 胞器且因此殺傷細(xì)胞或減小細(xì)胞存活力的化合物偶聯(lián)的抗體。還可以將本發(fā)明的抗體與將前藥轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物的前藥活化 劑偶聯(lián)。這些偶聯(lián)物的試劑組分包括任何能夠作用于前藥以便于將其 轉(zhuǎn)化為其活性更強(qiáng)的細(xì)胞毒形式的試劑。或者，能夠使用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建至少與本發(fā)明 的酶的功能活性部分連接、至少包含本發(fā)明拮抗劑的抗原結(jié)合區(qū)的融 合蛋白(例如參見Neuberger " a/" Nature, 312:604-608 (1984))?？梢杂枚喾N雙功能蛋白耦合劑或連接物制備抗體和細(xì)胞毒試劑的 偶聯(lián)物。該連接物可以是促進(jìn)細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的"可切割連 接物"。例如，可使用易酸解連接物、肽酶敏感連接物、二曱基連接物 或含有二硫鍵的連接物?；蛘?，例如可以通過重組技術(shù)或肽合成制備包含抗體和細(xì)胞毒試 劑的融合蛋白。其它潛在有用的修飾還涉及本文描述的蛋白或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可 能期望提高抗體的結(jié)合親和性和/或其它生物學(xué)特性。通過向抗體編碼 核酸中引入適當(dāng)?shù)睾塑账岣淖儯蛲ㄟ^肽合成來制備抗體的氨基序列 變體。這樣的修飾例如包括拮抗劑氨基酸序列中殘基的刪除和/或插入 和/或替代。進(jìn)行刪除、插入和替代的任意組合以完成最終構(gòu)建體，條 件是最終構(gòu)建體具有期望的特征。氨基酸變化還可以改變拮抗劑的翻 譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。氨基酸序列插入包括長度從一個殘基到含有一百或更多殘基的多 肽的氨基和/或羧基末端融合以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插 入。末端插入的實(shí)例包括具有N末端蛋氨酸基殘基的拮抗劑或與細(xì)胞 毒多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括與酶的拮抗劑的N或C末端的融合，或增加拮抗劑的血清半衰期的多肽。另一類型的變體是氨基酸替代變體。這些變體中，拮抗劑分子的 至少一個氨基酸殘基被不同的殘基取代?？贵w拮抗劑的用于替代誘變 的最感興趣位點(diǎn)包括超變區(qū)，但也考慮FR的改變。抗體的另一類型的氨基酸變體是改變拮抗劑的原始糖基化模式。 改變指刪除在拮抗劑中發(fā)現(xiàn)的一個或多個糖部分，和/或添加在拮抗劑 中不存在的一個或多個糖基化位點(diǎn)。多肽的糖基化通常是N連接或O 連接的。N連接指糖部分連接到天冬酰胺的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰 胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸之外的 任何氨基酸，是糖部分酶促連接到天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此， 在多肽中存在這些三肽序列的任何一個創(chuàng)造出潛在的糖基化位點(diǎn)。O 連接糖基化指單糖或單糖衍生物N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一 連接到羥基氨基酸上，最常見絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥 脯氨酸或5-羥賴氨酸。通過改變氨基酸序列使得其含有一個或多個上 述的三肽序列(用于N連接糖基化位點(diǎn))方便地完成向抗體中加入糖基 化位點(diǎn)。還可通過向原始抗體的序列添加或用一個或多個絲氨酸或蘇 氨酸替代來進(jìn)行改變(用于O連接糖基化位點(diǎn))。通過多種本領(lǐng)域已知 的方法制備編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但 不限于從天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)或通 過寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和拮抗劑的較早制備變體 或非變體版本的盒式誘變?？赡芷谕揎棻景l(fā)明使用的抗體以提高效應(yīng)物功能，例如，以便 于增強(qiáng)抗體的ADCC和/或CDC。這可以通過向抗體的Fc區(qū)中引入一 個或多個氨基酸替代完成。通過若千單糖或單糖衍生物形成加入到例如抗體的糖蛋白的氨基 酸骨架上的糖基基團(tuán)，導(dǎo)致能夠在來自不同哺乳動物或組織的細(xì)胞中 產(chǎn)生的同一抗體上不同的組成。此外，已經(jīng)顯示糖基的不同組成能夠 影響介導(dǎo)抗體的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴 的細(xì)胞毒(CDC)的效力。因此有可能通過研究不同來源的抗體的糖基 化模式來提高那些特性。這類方法的實(shí)例是Niwa e, a/.， Cancer Res.2004 Mar 15;64(6):2127-33?；蛘呋蛄硗獾?，可以將半胱氨酸引入Fc區(qū)中，由此允許在此區(qū)域 中形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可能具有提高的內(nèi)化 能力和/或增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴的細(xì)胞性細(xì)胞毒 (ADCC)。參見Caron"a/.，J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)和Shopes， B.J. Immunol. 148:2918-2922(1992)。還可以使用異雙功能交聯(lián)劑制備 具有增強(qiáng)的抗腫瘤能力的同型二聚體抗體，如Wolff" a/. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)所述?；蛘?，具有雙Fc區(qū)的抗體能夠祐: 工程化且可能因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson & a/. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)。為了增加抗體的血清半衰期，可以例如如US 5,739,277所述將補(bǔ) 救受體結(jié)合表位并入抗體(特別是抗體片段)中。如本文中所用，術(shù)語 "補(bǔ)救受體結(jié)合表位"指IgG分子(例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4) 的Fc區(qū)的負(fù)責(zé)提高IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體，例如單克隆抗體、Fv片段、Fab片段或 其它衍生自本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合組合物，對CCR7具有高親和 性?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)測量單克隆抗體和相關(guān)分子對CCR7受體的親 和性。抗體對抗原的親和性能夠被定義為抗體結(jié)合所述抗原的有效性。 抗原-抗體結(jié)合是可逆結(jié)合，因此當(dāng)兩種分子在同一溶液中稀釋足夠 時間后，此溶液達(dá)到平衡，其中抗原-抗體復(fù)合物(AgAb)、游離抗原 (Ag)和游離抗體(Ab)的濃度恒定。因此比例[AgAb]/[Ag"[Ab]也是常 數(shù)，定義為稱為Ka的結(jié)合常數(shù)，其能夠被用于比較一些抗體對其各 自表位的親和力。測量親和力的通常方法為實(shí)驗(yàn)測定結(jié)合曲線。這包括測量抗體-抗原復(fù)合物的量，其為游離抗原濃度的函數(shù)。有兩種進(jìn)行該測量的常 見方法(i)使用Scatchard分析的經(jīng)典平4軒透析以及(ii)表面等離子 體振子(plasmon)共振方法，其中抗體或抗原被結(jié)合到導(dǎo)電表面上且抗 原或抗體分別影響此表面的電特性。經(jīng)常只需要測定結(jié)合同一表位的兩種或更多種單克隆抗體的相對親和力。在該情況下，可以進(jìn)行竟?fàn)帨y定，其中單克隆抗體之一的系 列稀釋與恒定量的配體醉育，然后加入用適合示蹤劑標(biāo)記的第二單克隆抗體。結(jié)合此單克隆抗體并洗滌未結(jié)合抗體后，測量第二單克隆抗體的濃度并對第一單克隆抗體的濃度作圖，用Scatchard方法分析。實(shí) 例是Tamura " a/,， J. Immunol. 163: 1432-1441 (2000)。此外，本發(fā)明的抗體能夠用于檢測CCR7受體。這些檢測方法有 利地應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞是表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞的癌癥的診斷和/或預(yù) 后。此外，本發(fā)明的抗體能夠用于通過諸如免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、 親和層析或免疫沉淀的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞。例如， 本發(fā)明的抗體能夠有助于表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞的鑒定。此外， 本發(fā)明的抗體能夠用于鑒定表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞以評價其在特 定組織中的水平。因此，本發(fā)明的抗體能夠診斷地用于檢測組織中表 達(dá)CCR7受體的細(xì)胞的水平，其作為臨床檢查過程的一部分，例如為 了確定給定治療方案的效果。能夠通過耦合(即物理地連接)抗體與標(biāo) 記基團(tuán)輔助檢測。如下文所述，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠用于與諸如 細(xì)胞因子、止痛劑、免疫抑制劑和/或化療劑的另外的治療活性化合物 組合。聯(lián)合給藥包括使用分開的配方或單一藥物配方的共給藥和以任 何順序的連續(xù)給藥，其中優(yōu)選地存在兩種(或全部)活性劑同時發(fā)揮其 生物學(xué)活性的時間階段。在其它方面，本發(fā)明涉及用于對個體給藥的藥物組合物，有時稱 為本發(fā)明的藥物組合物，包括本發(fā)明的抗體或其藥物衍生物或前藥以 及藥物可接受的載體、佐劑或媒介物，所述本發(fā)明的抗體即結(jié)合CCR7 受體的抗體或其抗原結(jié)合片段。所述藥物組合物通過被給予患有癌癥 的個體能夠用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受 體的腫瘤細(xì)胞凋亡。本文所用的術(shù)語"個體"指被分類為哺乳動物的 所有動物，包括但不限于家畜或農(nóng)場動物、靈長類和人。該個體優(yōu)選 為任何年齡或種族的男性或女性人類。本文所用的術(shù)語"藥物可接受的載體"旨在包括與藥物給藥相容散介質(zhì)、包被物、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張 劑和吸收延遲劑等等。本領(lǐng)域公知將這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物 質(zhì)。除了與活性化合物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，預(yù)期其在組 合物中的使用?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑是在所用的劑量和濃 度下對受者無毒的，且包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如氯化十八烷基二 曱基苯基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、千索氯銨；苯酚、丁醇或卞醇； 對羥基苯甲酸烷基酯例如對羥基苯曱酸曱酯或?qū)αu基苯曱酸丙酯；兒茶 酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間曱酚)；小分子量(小于約10個殘 基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例 如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨 酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi) 的其它糖；螯合劑例如EDTA;糖類例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山 梨醇；成鹽抗衡離子例如鈉；金屬配合物(例如Zn-蛋白配合物)；和/ 或非離子表面活性劑例如TWEEN 、 PLURONICStm或聚乙二醇 (PEG)?？梢栽谕?一 制劑中給予本發(fā)明的抗體，或者可以在不同制劑中給 予本發(fā)明的抗體。給藥可以是同時的或順序的，并且可以在任意順序 下有效。還可以將補(bǔ)充活性成分摻入到本發(fā)明的藥物組合物中。因此，在 特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還可以根據(jù)接受治療的特定適應(yīng)癥 的需要含有多于 一種的活性化合物，優(yōu)選那些具有不負(fù)面相互影響的 補(bǔ)充活性的化合物。例如，可能期望進(jìn)一步提供化療劑、細(xì)胞因子、 止痛劑或免疫抑制劑。這些其它活性劑的有效量依賴于存在于藥物組 合物中的本發(fā)明的抗體的量、疾病或病癥的類型或治療方法及其它因 素等等。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與保護(hù)所述化合物不從身體中被快 速清除的載體一起制備，該載體例如控釋制劑，包括植入物和微包嚢 的遞送系統(tǒng)。能夠使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯 乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。還能夠從Alza Corporation 和Nova Pharmaceuticals, Inc購得材料。脂質(zhì)體混懸液(包括利用針對 病毒抗原的單克隆抗體被靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也能夠被用作藥 物可接受的載體。能夠根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備這些，例 如U.S. 4,522,811中所述。本發(fā)明的抗體(或其片段)的給藥途徑可以是口服、腸胃外、通過 吸入或局部的。本文所用的術(shù)語"腸胃外"包括靜脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直 腸或陰道給藥。皮下和肌內(nèi)形式的腸胃外給藥通常是優(yōu)選的。"吸入"指鼻內(nèi)和口腔吸入給藥。這些給藥的適合劑型，例如氣霧 制劑或定量吸入器，可以通過常規(guī)技術(shù)制備。此外，"局部的，，指非全身性給藥并包括向表皮外部、口腔應(yīng)用本 發(fā)明的抗體，以及向耳、眼和鼻中以及不顯著進(jìn)入血流的部位滴注抗體。 "全身性給藥"指口服、靜脈、腹膜內(nèi)和肌內(nèi)給藥。當(dāng)然，治療或預(yù)防 作用所需的抗體的量根據(jù)所選擇的抗體、接受治療的疾病狀態(tài)的性質(zhì)和 嚴(yán)重性以及患者而變化。此外，抗體可以通過脈動注射適當(dāng)?shù)亟o藥，例如使用逐漸減少劑 量的抗體。優(yōu)選地，通過注射給予制劑，最優(yōu)選靜脈或皮下注射，部 分依賴于給藥是短時的還是長期的。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以是適于口服 給藥的給藥形式，固體或液體。適于口服給藥的適合劑型可是是片劑、 膠嚢劑、糖漿劑或溶液，并且可以含有本領(lǐng)域已知的常規(guī)賦形劑，例 如結(jié)合劑例如糖漿、阿拉伯樹膠、明膠、山梨醇或聚乙烯吡咯烷酮； 填料，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸4丐、山梨醇或甘氨酸；壓片潤 滑劑，例如硬脂酸鎂；崩解劑，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥基乙 酸淀粉鈉或微晶纖維素；或藥物可接受潤濕劑例如十二烷基硫酸鈉。 可以通過混合、填充或壓片的常規(guī)方法制備固體口服組合物。可以使 用重復(fù)的混合操作使活性劑遍布使用大量填充劑的組合物中。這樣的 操作在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。例如通過濕法或干法成粒及任選地包被來 制備片劑，該包被根據(jù)通常制藥實(shí)踐中公知的方法，特別是使用腸溶27包衣。在另一實(shí)施方案中，可以使本發(fā)明的藥物組合物適合于腸胃外給 藥，例如適當(dāng)單位劑型的無菌溶液、混懸液或凍干產(chǎn)品。適于注射用 途的藥物組合物包括無菌水溶液(當(dāng)水適合時)或分散物以及用于無菌 注射溶液或分散物的當(dāng)場制備的無菌粉末。對于靜脈給藥，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorEM (BASF， Parsippany， N丄)或磷 酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的且流動性應(yīng) 達(dá)到容易注射的程度。組合物在生產(chǎn)和儲存條件中必須是穩(wěn)定的且使 其保存不受到例如細(xì)菌和真菌的微生物的污染。載體能夠是溶劑或分 散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇的 藥物可接受多元醇，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。例如能夠通過使用例如卵磷 脂的包衣和使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?，包衣的使用通過在 分散物的情況下保持需要的顆粒大小來保持流動性。對微生物作用的 防止能夠通過多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)，例如對羥基苯曱酸酯、 氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等。在許多情況下，優(yōu)選在組合物 中包括等張劑，例如糖、例如甘露糖醇、山梨醇的多元醇、氯化鈉。 能夠通過在組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的試劑來 達(dá)到注射組合物的延長吸收。能夠通過將需要量的活性化合物(例如多肽或抗體)并入適當(dāng)溶劑 中及隨后的過濾滅菌來制備無菌注射溶液，該適當(dāng)溶劑根據(jù)需要含有 上文列舉的成分中的一種或組合。通常，通過將活性化合物并入無菌 媒介物中來制備分散物，該無菌媒介物含有來自上文所列舉的基本分 散介質(zhì)和必需的其它成分。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況 下，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生來自之前無菌過 濾溶液的活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。在特定實(shí)施方案中，所述藥物組合物被通過靜脈(IV)或皮下(SC) 給藥?？梢允褂米銐虻馁x形劑例如填充劑、緩沖劑或表面活性劑。將 使用西班牙藥典和美國藥典以及類似參考文獻(xiàn)中描述或指出的標(biāo)準(zhǔn)方法制備上述制劑。將藥物組合物，即口服或腸胃外組合物組方為易于給藥和劑量一致的單位劑型是特別有利的。本文所用單位劑型指適于作為用于待治 療個體的單位劑量的物理上不連續(xù)的單位；每一單位含有與必需的藥物載體聯(lián)合的、經(jīng)計算產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本 發(fā)明的單位劑型的規(guī)格受到活性化合物的獨(dú)特特征和要達(dá)到的特定治 療效果以及復(fù)合這些活性化合物用于治療個體的領(lǐng)域中固有限制的控 制并直接依賴于這些因素。通常本發(fā)明抗體的有效給藥量取決于所選化合物的相對效力、接 受治療的疾病的嚴(yán)重性和患者的體重。然而，通常每日給予活性化合物一次或多次，例如每日1、 2、 3或4次，通常日總劑量為0.001 mg/kg 體重/日至1000 mg/kg體重/日，優(yōu)選約0.01 mg/kg體重/日至約100 mg/kg體重/日，最優(yōu)選約0.05 mg/kg體重/日至10 mg/kg體重/日。除了對患者給予抗體，本發(fā)明預(yù)期通過基因治療給予抗體。 WO96/07321涉及使用基因治療產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體。所述藥物組合物能夠與說明書一起被包括在容器、包裝或分配器 中用于給藥。本發(fā)明的抗體和藥物組合物可以與其它藥物聯(lián)用以提供聯(lián)合治 療。所述其它藥物可以組成同一組合物的一部分，或作為用于在同一 時間或不同時間給藥的分開的組合物。本發(fā)明的抗體和藥物組合物將會用于治療醫(yī)學(xué)狀態(tài)，例如與癌癥 相關(guān)的病癥或疾病，具體地，用于治療癌癥，所述癌癥的特征為腫瘤 細(xì)胞表達(dá)CCR7受體，更具體地，用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì) 胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡。對本發(fā)明的治療易感的、 肺瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的說明性非限制性癌癥包括慢性淋巴細(xì)胞白 血病(CLL)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、濾泡型淋巴瘤、大B細(xì)胞淋巴瘤、 AIDS相關(guān)淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B細(xì)胞急性 原始淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、霍奇金病、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤、蕈樣 肉芽腫病、慢性骨髓增生性疾病的暴發(fā)、骨髓增生異常綜合征的暴發(fā)、 乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、胃癌或頭頸的鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，對本發(fā)明的治療易感的癌癥包括乳腺癌、非小細(xì) 胞肺癌、黑素瘤、胃癌或頭頸的鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，對本發(fā)明的治療易感的癌癥包括濾泡型淋巴瘤、成人T細(xì) 胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性骨髓增生性疾病的暴發(fā)和骨髓 增生異常綜合征的暴發(fā)。在其它最優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明治 療的癌癥包括CLL和MCL。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與本文所述的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的 其它治療聯(lián)合，例如化療、放療、免疫療法或手術(shù)方法，包括烷基化 劑、抗代謝藥、抗激素、用于多種癥狀的治療劑，例如鎮(zhèn)痛劑、利尿 劑、抗利尿劑、抗病毒劑、抗生素、細(xì)胞因子、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、貧血治 療劑、凝血治療劑、骨治療劑、精神病學(xué)和心理學(xué)治療劑等等。為了實(shí)現(xiàn)自體骨髓或干細(xì)胞移植，可以在用抗CCR7抗體治療后 從所述患者收集骨髓或外周血干細(xì)胞。還可使用細(xì)胞因子治療患者，為了在給予本發(fā)明的抗體之前上調(diào) CCR7或癌性B細(xì)胞表面上的其它靶蛋白的表達(dá)。為了刺激免疫效應(yīng) 物功能，還可以在給予清除抗體或放射標(biāo)記的抗體的同時或之前或之 后給予細(xì)胞因子。在一個實(shí)施方案中，化療方案可用來補(bǔ)充本文公開的療法，且可 以與所述放射標(biāo)記的抗體同時或以任意順序來順序給藥?；煼桨缚?以選自CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星(也稱為羥基柔紅霉素)、長春新堿(也 稱為硫酸長春新堿)和潑尼松)、ICE (去甲氧基柔紅霉素、阿糖胞苷和 依托泊甙)、Mitozantrone、阿糖胞苷、DVP (柔紅霉素、長春新堿和潑 尼松)、ATRA(全反式視黃酸)、去曱氧基柔紅霉素、hoelzer化療方案、 La化療方案、ABVD (博來霉素、達(dá)卡巴嗪、多柔比星和長春新堿)、 CEOP(環(huán)磷酰胺、表柔吡星、長春新堿和潑尼松龍)、2-CdA(l氯脫氧 腺苷)、FLAG & IDA (氟拉達(dá)濱、阿糖胞苷、非格司亭和去曱氧基柔紅 霉素)、(有或沒有隨后的G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)治療)、VAD(長 春新堿、多柔比星和地塞米松)、M&P(左旋溶肉瘤素和潑尼松)、C(環(huán) 磷酰胺)-每周一次、ABCM(鹽酸阿霉素、博來霉素、環(huán)磷酰胺和絲裂霉 素-C)、 MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)和DHAP (地塞米 松、阿糖胞苷和順鉑)。優(yōu)選的化療方案是CHOP。因此，在其它方面，本發(fā)明涉及治療癌癥特別是肺瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的癌癥的方法，其包括對需要所述治療的個體給予治療有 效量的本發(fā)明抗體，即結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段，或 給予治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在特定實(shí)施方案中，所述癌 癥的特征為腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體。根據(jù)本發(fā)明治療的說明性非限 制性癌癥包括CLL、 MCL、濾泡型淋巴瘤、大B細(xì)胞淋巴瘤、AIDS 相關(guān)淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B細(xì)胞急性原始 淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、霍奇金病、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤、蕈樣肉芽 腫病、慢性骨髓增生性疾病的暴發(fā)、骨髓增生異常綜合征的暴發(fā)、乳 腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、胃癌或頭頸的鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明治療的癌癥包括乳腺癌、非小細(xì)胞肺 癌、黑素瘤、胃癌或頭頸的鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌。在最優(yōu)選的實(shí)施方 案中，根據(jù)本發(fā)明治療的癌癥包括濾泡型淋巴瘤、成人T細(xì)胞白血病 /淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性骨髓增生性疾病的暴發(fā)和骨髓增生異常 綜合征的暴發(fā)。在其它最優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明治療的癌癥 包括CLL和MCL。在其它方面，本發(fā)明涉及殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo) 表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的方法，其包括將所述細(xì)胞接觸本發(fā) 明的抗體，即結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段。在特定實(shí)施 方案中，所述腫瘤細(xì)胞是表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞，例如CLL和 MCL細(xì)胞。在其它方面，本發(fā)明涉及在需要所述治療的個體中殺傷表達(dá) CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的方法， 其包括對所述個體給予治療有效量的本發(fā)明的抗體，即結(jié)合CCR7受 體的抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它方面，本發(fā)明涉及減弱表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞向次級 淋巴組織遷移和/或阻斷腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次級淋巴組織的方法，其包 括將所述腫瘤細(xì)胞接觸本發(fā)明的抗體，即結(jié)合CCR7受體的抗體或其 抗原結(jié)合片段。在其它方面，本發(fā)明涉及在需要所述治療的個體中減弱表達(dá) CCR7受體的肺瘤細(xì)胞向次級淋巴組織遷移和/或阻斷肺瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次級淋巴組織的方法，其包括對所述個體給予治療有效量的結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于易于用本發(fā)明方法治療的表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞、抗體、 給藥方案和劑量的信息在前文已述及。在特定實(shí)施方案中，易于用上 述方法治療的表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞是CLL或MCL細(xì)胞。在所有情況下，短語"治療有效量"指如前所述定義的對治療癌 癥有效的量；所述量能夠是足以實(shí)現(xiàn)期望反應(yīng)或改善例如轉(zhuǎn)移或原發(fā) 腫瘤進(jìn)展、大小或生長的癥狀或指征的量。針對特定個體的治療有效 量可以根據(jù)例如接受治療的疾病狀態(tài)、個體的整體健康狀況、給藥方 法、途徑和劑量以及副作用的嚴(yán)重程度等因素變化。例如，效果會導(dǎo) 致定量上至少約10%，優(yōu)選至少20%、 30%、 50%、 70%或甚至90% 或更多的變化。當(dāng)在組合中時，治療有效量是相對組分組合的比例且 效果不限于單一組分。治療有效量通常將調(diào)節(jié)癥狀至少約10%;通常至少約20%;優(yōu)選 至少約30%;或更優(yōu)選至少約50%?；蛘撸w移的調(diào)節(jié)指多種細(xì)胞類 型的遷移或運(yùn)行受到影響。這些將導(dǎo)致例如受影響細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計學(xué) 顯著的和可定量的變化。這可能是在一段時間內(nèi)或靶區(qū)域內(nèi)受影響的 靶細(xì)胞數(shù)目的減少。還可以監(jiān)測原發(fā)腫瘤進(jìn)展的速度、大小、擴(kuò)散或 生長。上述任何治療方法可用在需要這些治療的任何個體中，例如包括 諸如犬、貓、牛、馬、兔、猴，且最優(yōu)選人的哺乳動物。在其它方面，本發(fā)明涉及鑒定用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì) 胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物的方法，其包括a) 將表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞與偶聯(lián)至抗CCR7抗體或其片段的候 選化合物接觸，以及b) 確定所述候選化合物是否殺傷表達(dá)CCR7受體的所述細(xì)胞， 其中殺傷表達(dá)CCR7受體的所述細(xì)胞的化合物是潛在可用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物。事實(shí)上，任何表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞， 均能夠用于進(jìn)行上述方法。在特定實(shí)施方案中，所述表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞是CLL或MCL細(xì)胞。能夠通過任何常規(guī)方法測定表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞的死亡，例如 根據(jù)此說明書中實(shí)施例所公開的方法。以下實(shí)施例用來i兌明本發(fā)明。實(shí)施例針對CCR7的抗體作為治療CLL的工具 I.材料和方法樣品、試劑和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)在告知同意后獲得來自CLL (慢性淋巴細(xì)胞白血病)和MCL (套細(xì) 胞淋巴瘤)患者和健康供者的外周血樣品。通過標(biāo)準(zhǔn)四色FCM進(jìn)行全 血細(xì)胞的最初免疫表型表征，該標(biāo)準(zhǔn)四色FC1VM吏用針對下列人表面抗 原的單克隆抗體(mAbs): CD45、 CD19、 k輕鏈、入輕鏈、CD20、 CD23、 CD5和CD3 (全部購自BD Biosciences, San Jose， CA)。棄去單核亞群 中CLL或MCL細(xì)胞少于60%的樣本。隨后在電子設(shè)門的腫瘤B細(xì)胞 或正常T和B淋巴細(xì)胞中進(jìn)行CCR7表達(dá)分析。藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)的小鼠抗人CCR7購自R&D Systems (McKinley Place, MN)。在所有情況中均包括適當(dāng)?shù)耐N型對照。在 FACScalibur流式細(xì)胞儀上使用CellQuest軟件(BD Biosciences)分析免 疫熒光染色。通過聚蔗糖(Ficoll)密度梯度離心(Histopaque-1077， Sigma-Aldrich， Madrid, Spain)分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。純化的鼠抗人CCR7mAbs(此后稱為"抗CCR7 mAbs")是從BD Biosciences (150503克隆，IgG2a同種型)和R&D Systems (2H4克隆， IgM同種型)獲得。在細(xì)胞周期分析和細(xì)胞存活力測定中使用的DNA 染料7-氨基》文線菌素D (7-AAD)得自BD Biosciences,重組人趨化因 子CCL19和CXCL12購自R&D Systems 。受體胞吞測定為了研究抗CCR7 mAbs的結(jié)合是否造成趨化因子受體(CCR7)的 內(nèi)化，用2/ig/mL的抗CCR7mAbs在37。C、5。/oC02空氣下釁育5 x 105 CLL細(xì)胞不同時間(從30秒至1小時)。CCR7的生理配體之一且造成 其內(nèi)吞的CCL19被用作陽性對照。在使用酸洗(O.l M甘氨酸、0.15M NaCl、 pH-2.5)清除結(jié)合的mAb或CCL19之后，如上所述通過FCM 分析測定CLL細(xì)胞上的CCR7表達(dá)。補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(CDC)將含有105細(xì)胞的50 gL PBMC懸浮物和0.5 mg/mL至16 mg/mL 的所需濃度的純化抗CCR7 mAbs或同種型對照(IC)接種在96圓底孔 板中。在37。C孵育30分鐘后，離心并洗滌細(xì)胞。然后，加入在RPMI 1640培養(yǎng)基中稀釋到25。/。的幼兔補(bǔ)體(Serotec， Oxford, UK)。 37°C下 1-2小時后，用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗CD 19、別藻藍(lán)蛋白 (APC)偶聯(lián)的抗CD5 mAb和7- AAD對細(xì)胞進(jìn)行染色。兩種表面標(biāo)志 物均允許FCM分辨CLL細(xì)胞、MCL細(xì)胞和T細(xì)胞群，且7-AAD用 作存活力排除染料。在每一群中分別測量非存活細(xì)胞的百分比，且使 用熱滅活補(bǔ)體的溶解百分比根據(jù)公式[l]計算特異溶解#縣銅=100 x [ 1 ]其中A:使用補(bǔ)體的死亡細(xì)胞％B:使用滅活補(bǔ)體的死亡細(xì)胞％抗體依賴的、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)自然殺傷(NK)細(xì)胞分離自從血沉棕黃層(buffy coats)獲得的后的使用抗PE耦合的孩(珠(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany)的磁性細(xì)胞分選進(jìn)行。通過FCM測量的NK細(xì)胞的純度為 95%至98°/。。在使用NK細(xì)胞(作為細(xì)胞溶解的效應(yīng)物)、在5至40之 間的不同效-靶(E/T)比下、在存在或不存在抗CCR7 mAb或其同種型對照下孵育CLL細(xì)胞(耙細(xì)胞)4小時后，用FCM測量抗CCR7依賴 的、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒。然后，用FITC偶聯(lián)抗CD19 mAb、 PE偶聯(lián) 抗CD56 mAb和7-AAD對細(xì)胞進(jìn)4亍染色以分辨CLL細(xì)胞和效應(yīng)NK 細(xì)胞，并分析CLL細(xì)胞的存活力。孵育中未使用NK細(xì)胞的CLL細(xì) 胞用作自發(fā)死亡的對照，并且如CDC測定計算特異溶解。趨化作用測定之前使用2 /ig/mL抗CCR7 mAbs孵育30分鐘的CLL和MCL細(xì) 胞響應(yīng)CCL19、 CCL21和CXCR4的配體CXCL12的趨化作用在 Transwell(跨井)細(xì)胞培養(yǎng)室(直徑6.5 mm、厚度10 /mi、孔直徑5 /mi， Costar, Cambridge, MA)中測定。對于趨化作用測定，將5乂105腫瘤 細(xì)胞懸浮在100 pi的含0.5% BSA的RPM1 1640中，凈皮加入到培養(yǎng)室 的上部隔室中且趨化因子以最適濃度(對于CXCL12為100 ng/mL且 對于CCL 19和CCL21為1 /ig/mL)被加入到下部小室中的600pl相同 培養(yǎng)基中。允許遷移在37。C、 5% C02空氣下進(jìn)行4小時。從下部隔 室中回收遷移的細(xì)胞，用FITC偶聯(lián)的抗CD19 mAb染色，并且在用 Trucount管(BD Biosciences)校準(zhǔn)流速后用FCM計數(shù)60秒。在設(shè)門的 B細(xì)胞群中分析事件并與細(xì)胞的初始懸浮物中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行比較， 以計算輸入的百分比(100 x遷移細(xì)胞的數(shù)目/在初始懸浮物中計數(shù)的 細(xì)胞數(shù)目)。每一樣品重復(fù)測量兩次。凋亡和細(xì)胞周期分析在某些實(shí)驗(yàn)中，將抗CCR7 mAbs以2 pig/mL稀釋在50 pL含有105 CLL細(xì);!包的培養(yǎng)懸浮物中。在其它實(shí)驗(yàn)中，通過在RPMI 1640中孵育 過夜使抗CCR7mAbs附著到96平底孔板中。然后，洗滌該板并加入 105 CLL細(xì)胞。在兩種情況下，細(xì)胞均在37。C下孵育最長48小時。 細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，用FITC偶聯(lián)的抗CD 19 mAb 染色，重懸在0.5 mL PBS中并稀釋在5mL冰冷的70%乙醇中用于在 -20。C下固定過夜。第二天，離心固定的細(xì)胞，洗滌并用20/xg/mL的 7-AAD染色用于DNA含量分析。獲得最少10,000個總事件并用Cell-Quest Pro軟件(BD Bioscences)分析。簡而言之，使用7-AAD焚 光的脈沖區(qū)域和脈沖寬度對CD 19陽性事件設(shè)門并棄去雙重譜線。在 7-AAD熒光柱狀圖中分析作為凋亡細(xì)胞的亞Gi峰的百分比。增殖測定從健康供者分離PBMC并在事先用抗CCR7mAbs及其相應(yīng)的同 種型對照包被的96孔板中培養(yǎng)72小時。還包括例如抗CD3加IL2的 陽性對照。所有的測量均重復(fù)三次。在培養(yǎng)的最后16小時中用每孔1 gCi的[3H]-胸脊(Amersham Biosciences GmbH， Freiburg, Germany)才示i己 細(xì)胞。然后收集細(xì)胞并進(jìn)行閃爍計數(shù)。統(tǒng)計分析所有的統(tǒng)計檢驗(yàn)均在SPSS version 8.0進(jìn)行。Wilcoxon和Kendall's W非參數(shù)檢驗(yàn)用于比較大多數(shù)測定中不同處理的結(jié)果。對于[311]-胸苷 增殖測定，進(jìn)行ANOVA用于組間比較。計算Pearson相關(guān)系數(shù)以研 究CCR7平均熒光強(qiáng)度(MFI)和CDC中溶解百分比之間的關(guān)系。II.結(jié)果抗CCR7 mAbs不誘導(dǎo)其標(biāo)乾的內(nèi)化使用非偶聯(lián)形式的治療性mAbs不僅需要高密度的靶抗原，還需 要在細(xì)胞表面存在抗原-抗體復(fù)合物以活化補(bǔ)體或結(jié)合細(xì)胞毒細(xì)胞的 Fc受體，即mAb與抗原的結(jié)合不誘導(dǎo)其內(nèi)化是重要的，因?yàn)檫@可能 降低mAb的治療效果。就此方面，已經(jīng)暗示了抗體與某些趨化因子受 體的結(jié)合能夠?qū)е率荏w的胞吞及隨后在抗體降解后受體的蛋白水解或 再表達(dá)。發(fā)明人分析了 mAbs與CCR7的結(jié)合是否產(chǎn)生其在CLL細(xì)胞 的內(nèi)吞。CLL細(xì)胞表面的CCR7表達(dá)在CLL細(xì)胞中比在正常B細(xì)胞 或T細(xì)胞中高2-4倍(圖IA)且在與抗CCR7 mAbs —起孵育長至60分 鐘的不同時間不下降(圖1B)。相反，其在與1 pg/mL作為陽性對照的 CCL19一起孵育，前5分鐘下降了約60%。36在體外抗CCR7 mAbs介導(dǎo)CLL和MCL細(xì)胞的強(qiáng)烈和特異的CDC由補(bǔ)體蛋白(CDC)或例如NK細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞(ADCC)的募集介導(dǎo) 的細(xì)胞毒是所提出的通過非偶聯(lián)治療性mAbs體內(nèi)清除腫瘤細(xì)胞的主 要機(jī)制。因此，用來自不同患者的CLL和MCL樣本測試了抗CCR7 mAbs介導(dǎo)CDC的效能。非常高比例的用抗CCR7 IgM mAb預(yù)孵育的 CLL細(xì)胞在用兔補(bǔ)體處理1小時后被殺傷(圖2A)。類似地，IgG同種 型的抗CCR7 mAb也介導(dǎo)顯著的CDC (圖2B)。與CLL相似，MCL細(xì)胞也表達(dá)顯著水平的CCR7 (圖3A)，并且 CDC實(shí)驗(yàn)顯示兩種抗CCR7 mAbs均有效地殺傷CCR7陽性MCL細(xì)胞 (圖3B)。當(dāng)使用同樣同種型的無關(guān)免疫球蛋白時沒有觀察到顯著的 CDC(圖2A、圖2B和圖3B)。盡管IgG同種型的抗CCR7 mAb造成CDC的效能相對較低，但 動力學(xué)測定證明其補(bǔ)體活化能力能夠通過延長與補(bǔ)體源孵育的時間而 顯著提高(數(shù)據(jù)未顯示)。這可能是由于IgG2a同種型的mAb對補(bǔ)體級 聯(lián)的活化較慢。CCR7并不限于CLL或MCL細(xì)胞，還表達(dá)在某些正常淋巴亞群， 主要是幼稚B細(xì)胞和幼稚T細(xì)胞中，其可能對由抗CCR7 mAbs介導(dǎo) 的細(xì)胞毒易感。有趣的是，由抗CCR7mAbs介導(dǎo)的CDC在CLL細(xì)胞 中比在來自同一患者的T細(xì)胞中顯著增高(對于IgMmAbs， P=0.001， 對于IgGmAbs， P=0.016)。類似地，當(dāng)用與上述相同的實(shí)驗(yàn)條件處理 時，甚至在用更高劑量的兩種抗CCR7 mAbs處理時，來自健康供者 的B細(xì)胞和T細(xì)J包對補(bǔ)體活性耐受，如劑量-效應(yīng)測定所證明(圖4A 和4B)。對于來自CLL患者的幾乎不遭受溶解的T細(xì)胞更是如此(圖 4A和4B)，可能由于在這些樣品中存在的CLL細(xì)胞對補(bǔ)體的高和快的 消耗。另 一方面，濃度低至1 pg/mL的兩種抗CCR7 mAbs均足以介導(dǎo) CLL細(xì)胞的CDC (圖4A和4B)。一種可能的解釋是存在對CDC活性的不同敏感性，由于CCR7 在正常T和B細(xì)胞中的表達(dá)比在CLL細(xì)胞中要低得多(圖1A)。事實(shí) 上，CCR7在CLL細(xì)胞中的表達(dá)水平與不同樣品對CDC的敏感性(圖5)顯著(F 0.602， P=0.025, n-ll)相關(guān)，證實(shí)了抗原密度在選擇免疫治療 的靶標(biāo)中的重要性。此外，看起來CDC活性的差異不與例如CD55或CD59的補(bǔ)體調(diào) 節(jié)蛋白的差異表達(dá)有關(guān)，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)水平在不同的CLL樣本之間 以及在來自這些患者的CLL細(xì)胞和T細(xì)胞之間非常相似(數(shù)據(jù)未顯示)。CIX細(xì)胞的體夕卜ADCC介導(dǎo)治療性mAbs的有益作用的其它主要機(jī)制是由細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒(ADCC)。因此，發(fā)明人測試了 NK細(xì)胞造成用抗CCR7IgGmAb 預(yù)先處理的CLL細(xì)胞溶解的能力。在用5至40的E/T比進(jìn)^f亍的6個 實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)與相同同種型的無關(guān)免疫球蛋白相比(平均溶解=12% ±5， n=6)，在此抗CCR7 mAb的存在下(平均溶解=13% ±1， n-6)未觀察到 顯著的ADCC(圖6)。這可能與人Fc受體對鼠mAbs的低親和性有關(guān)。 相反，利妥昔單抗， 一種公知的嵌合抗CD20mAb， IgGl同種型，介 導(dǎo)針對CLL細(xì)胞的ADCC，其平均溶解=34%±2(n=6)( 6)。未測 試抗CCR7IgMmAb存在下的ADCC，因?yàn)榇送N型不有效介導(dǎo)這種 類型的細(xì)胞毒。響應(yīng)抗CCR7 mAbs的凋亡和增殖不斷增加的證據(jù)表明治療性mAbs的很大部分的有益反應(yīng)是由于 對細(xì)胞周期或靶細(xì)胞存活的直接作用。通過細(xì)胞DNA的7-AAD染色 和亞G,峰分析來研究抗CCR7mAbs對CLL細(xì)胞的凋亡的作用。用可 溶抗CCR7 IgM mAb處理24小時的CLL細(xì)胞的凋亡速率與用IC處理 的CLL細(xì)胞的凋亡沒有顯著不同(數(shù)據(jù)未顯示)。類似地，通過施加抗 CCR7 mAbs的結(jié)合至48小時所產(chǎn)生的CCR7的交聯(lián)未誘導(dǎo)凋亡(數(shù)據(jù) 未顯示)。為了研究細(xì)胞響應(yīng)抗CCR7 mAbs的增殖，用來自健康供者的 PBMC進(jìn)行了的經(jīng)典pH]-胸苷攝取增殖測定，因?yàn)镃LL細(xì)胞在孵育 48-72小時后具有高自發(fā)凋亡速率。這些測定揭示了在用IgM同種型的抗CCR7mAb孵育后，[3司-胸香向細(xì)胞中的摻入中度增加，這與用 IgMIC得到的結(jié)果無顯著不同。相反，IgG同種型的抗CCR7mAb或 其IC均不誘導(dǎo)增殖(圖7)。作為陽性對照，PBMC響應(yīng)使用抗CD3 mAb 加IL2的孵育增殖?？笴CR7 mAbs抑制CLL和MCL細(xì)胞的體外遷移CCR7不僅在幼稚淋巴細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞的生理歸巢中起主 要作用，還在表達(dá)其的腫瘤(癌)細(xì)胞特別是CLL和MCL細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 性遷移中起主要作用。為了阻斷這些疾病向淋巴組織擴(kuò)散，中和此趨 化因子受體的功能可能是CLL和MCL患者中感興趣的。就此方面， 發(fā)明人分析了抗CCR7 mAbs中和CLL和MCL細(xì)胞響應(yīng)CCL19或 CCL21的體外遷移。IgG同種型的抗CCR7mAb非常有效地阻斷這些 細(xì)胞向CCL19或CCL21的遷移，而IgM同種型的抗CCR7 mAb略微 減少遷移(圖8A-B)。在這些測定中，CLL細(xì)胞響應(yīng)CXCL12 (趨化因子受體CXCR4的 配體)的遷移不受到所使用的兩種mAbs的影響。III.討論來自發(fā)明人的前述數(shù)據(jù)顯示B細(xì)胞淋巴組織增生性病癥中的趨化 因子受體CCR7、 CXCR4和CXCR5的表達(dá)水平根據(jù)組織學(xué)亞型是非 常異質(zhì)的，并且與淋巴結(jié)(LN)參與顯著相關(guān)，因?yàn)檫@些分子介導(dǎo)淋巴 細(xì)胞向次級淋巴組織的進(jìn)入和定位。CCR7的表達(dá)在CLL和套細(xì)胞淋 巴瘤中特別高，解釋了這些疾病入侵LNs的高傾向。類似地，近期的 研究報道了 CCR7在來自其它血液腫瘤或非血液實(shí)體瘤的惡性細(xì)胞上 的表達(dá)，該血液腫瘤例如霍奇金病、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤和蕈樣 肉芽腫病，該非血液實(shí)體瘤例如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、胃 癌或頭頸的鱗狀細(xì)胞癌或結(jié)腸癌。有趣的是，在所有情況下，此表達(dá) 與向淋巴組織的遷移和轉(zhuǎn)移的特征性模式相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明使用CCR7作為免疫治療中的治療靶標(biāo)的可能性，不僅因?yàn)槠湓谀承盒约?xì)胞中的高密度及其在正常組織中的有限表 達(dá)，還因?yàn)槠湓诩膊∵M(jìn)展和致病性中的關(guān)鍵作用。已經(jīng)接受CDC為當(dāng)靶抗原高度表達(dá)時非偶聯(lián)治療性mAb作用的 主要機(jī)制，因?yàn)橄嘈臗DC比ADCC需要多約IO倍的表面抗原密度。 因此，發(fā)明人分析了抗CCR7 mAbs固定補(bǔ)體和介導(dǎo)抗來自CLL患者 的CLL細(xì)胞、MCL細(xì)胞和正常T細(xì)胞的細(xì)胞毒的能力。他們的結(jié)果 顯示CLL和MCL細(xì)胞的重要溶解是由于補(bǔ)體固定造成的，而幾乎無 T細(xì)胞破壞，甚至在飽和濃度的抗CCR7mAbs和補(bǔ)體的條件下。這可 能是由于與CLL細(xì)胞相比，CCR7在T細(xì)胞上的表達(dá)較低。就此方面， 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在相同實(shí)驗(yàn)條件下，CLL細(xì)胞表面的CCR7密度和溶解 細(xì)胞的百分比緊密相關(guān)^=0.025, r=0.602)。重要的是，這些結(jié)果表明 用抗CCR7mAbs治療CLL或MCL，甚至在j氐濃度下，可能導(dǎo)致有效 清除腫瘤細(xì)胞而不溶解表達(dá)該分子(CCR7)的正常淋巴細(xì)胞。有可能假 設(shè)由于抗CCR7mAbs治療的次級免疫缺陷不會非常重要，因?yàn)镃CR7 陰性效應(yīng)淋巴細(xì)胞保持不被擾亂。對作為從CCR7缺陷小鼠到用抗 CCR7 mAbs治療的CLL或MCL患者的特征的免疫缺陷的推斷在某種 方式上是困難的，因?yàn)檫@些個體已經(jīng)發(fā)展出了在CCR7敲除中缺乏的 免疫記憶。與關(guān)于CDC的發(fā)現(xiàn)不同，IgG同種型的抗CCR7 mAb不是ACDD 的活化物，可能由于其鼠來源。盡管如此，公知分子工程技術(shù)使得開 發(fā)嵌合或人源化抗體以提高臨床特點(diǎn)是可能的，該臨床特點(diǎn)例如mAb 介導(dǎo)通過單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的Fc受體的細(xì)胞毒的能力。 在任何情況下，目前都在討論ADCC在CLL的免疫治療中的重要性， 由于這些患者中惡性細(xì)胞的強(qiáng)烈擴(kuò)增和T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能缺陷。 就此方面，最近發(fā)表了若干方法以擴(kuò)增和活化來自健康供者或CLL患 者的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞以利用該治療性mAbs的作用機(jī)制。阻斷靶抗原的功能組成了治療性mAbs的另一作用機(jī)制。在本發(fā) 明中，阻斷性抗CCR7 mAbs可能具有另外的優(yōu)勢抑制涉及淋巴腫 瘤和表達(dá)其的其它非血液腫瘤的可能的主要分子的功能。就此方面， 公知利妥昔單抗(rituximab)或阿來組單抗(alemtuzumab)均不能非常有效地在CLL患者中減少淋巴結(jié)病。這些結(jié)果為阻斷性抗CCR7 mAbs可以減弱向LN遷移并因此除通 過CDC或ADCC殺傷細(xì)胞外還阻斷肺瘤擴(kuò)散的那些病理學(xué)開辟了新 的治療機(jī)會。
權(quán)利要求
1. 結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述腫瘤細(xì)胞是慢性淋 巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞或套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一權(quán)利要求所述的用途，其中結(jié)合 CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段與另外的治療活性化合物聯(lián)合使 用。
4. 用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的 胂瘤細(xì)胞凋亡的方法，其包括將所述細(xì)胞接觸結(jié)合所述CCR7受體的 抗體或其抗原結(jié)合片段。
5. 用于在需要所述治療的個體中殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞 或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的方法，其包括對所述個體給 予治療有效量的結(jié)合所述CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是慢性淋 巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞或套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)細(xì)胞。
7. 用于減弱表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞向次級淋巴組織遷移和/ 或阻斷紳瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次級淋巴組織的方法，其包括將所述肺瘤細(xì) 胞接觸結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段。
8. 用于在需要所述治療的個體中減弱表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞 向次級淋巴組織遷移和/或阻斷腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入次級淋巴組織的方法，其包括對所述個體給予治療有效量的結(jié)合CCR7受體的抗體或其 抗原結(jié)合片段。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是慢性淋 巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞或套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)細(xì)胞。
10. 鑒定用于殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)表達(dá)CCR7 受體的腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物的方法，其包括a) 將表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞接觸與抗CCR7抗體或其片段偶聯(lián)的 候選化合物，以及b) 測定所述候選化合物是否殺傷所述表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞， 其中殺傷所述表達(dá)CCR7受體的細(xì)胞的化合物是潛在可用于殺傷腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述細(xì)胞是慢性淋巴細(xì)胞 白血病(CLL)細(xì)胞或套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)合CCR7受體的抗體或其抗原結(jié)合片段能夠選擇性殺傷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞、減弱表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞的遷移和/或阻斷表達(dá)CCR7受體的腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。公開了所述抗體用于殺傷或誘導(dǎo)所述腫瘤的凋亡的用途，因此提供用于治療其腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCR7受體的癌癥的可選療法。
文檔編號A61K39/395GK101257923SQ200680032303
公開日2008年9月3日 申請日期2006年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者塞西莉亞·穆尼奧斯卡列哈, 曼努埃爾·赫蘇斯·阿方索佩雷斯, 索尼亞·洛佩斯希拉爾 申請人:馬德里自治大學(xué)