專(zhuān)利名稱(chēng)：包含α-半乳糖基神經(jīng)酰胺作為佐劑的用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物，其包含OC-半乳糖基神經(jīng)酰胺(a-GalCer)作為佐劑。
背景技術(shù)：
到目前為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于治療各種贅生性和傳染性疾病的新疫 苗。與使用活的減毒或非-復(fù)制滅活病原體的常規(guī)疫苗不同，當(dāng)前疫苗由 合成的、重組的或純化的亞基抗原組成。不管通過(guò)使用人免疫系統(tǒng)的免疫治療法治療癌癥的各種研究，但是由 于人癌癥細(xì)胞不是抗原呈遞細(xì)胞，所以沒(méi)有誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)目贵w免疫應(yīng)答，或 者沒(méi)有正確地激活腫瘤特異的細(xì)胞毒性T-細(xì)胞。疫苗已經(jīng)被用作減少住院機(jī)會(huì)以及患有病毒感染諸如流感病毒感染 的患者的死亡率的主要工具。但是，RNA病毒，諸如流感病毒，特征在 于連續(xù)地抗原變異，這使得用于所述病毒的疫苗的研發(fā)變得困難。然而， 由于它們引起世界烕脅性的傳染疾病，所以已經(jīng)努力研發(fā)用于病毒諸如流 感病毒、SARS等的恰當(dāng)?shù)囊呙??？乖闹饕肭滞緩绞强谇弧⒈乔?、喉、小腸、大腸、生殖器和肛門(mén)， 并且黏膜系統(tǒng)是致病抗原的主要防御線，形成黏膜免疫系統(tǒng)，其為兩種主 要免疫系統(tǒng)之一 (另一種是全身免疫系統(tǒng))。因此，大部分開(kāi)發(fā)疫苗的研 究集中在開(kāi)發(fā)能夠誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答的疫苗組合物上(Czerkinsky 等，Immunol. Rev.(免疫學(xué)綜述)，170: 197， 1999; Belyakov等，Proc, Natl. Acad. SciU.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，95: 1709, 1998; Berzofsky等，Nat. Rev. Immunol.(國(guó)家免疫學(xué)綜述),1: 209， 2001; Kozlofsky等,Curr. Mol. Med.(當(dāng)代分子醫(yī)學(xué)),3:217,2003)。
疫苗可以以各種制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)?？紤]到患者的并發(fā)癥、劑量、施用容 易性以及副作用的發(fā)生率，最理想的制劑是鼻內(nèi)疫苗。由于在可能參與感染危險(xiǎn)的注射區(qū)域引起疼痛，所以用針注射疫苗減 少患者的順應(yīng)性。同時(shí)，黏膜接種，例如鼻接種，避免用針注射。因此， 黏膜免疫是比常規(guī)注射接種容易得多并且更加便利的方式。并且，與常規(guī)口服接種相比，由于鼻內(nèi)施用避免肝一傳作用(hepatic first pass effect) 和所施用的抗原在胃腸道中的降解，這帶來(lái)高生物利用度、成本-減少和 由于最低的劑量的低副作用發(fā)生率，所以鼻內(nèi)接種具有一些優(yōu)點(diǎn)(Remeo 等，Adv. Drug Deliv. Rev.(高級(jí)藥物遞送綜述),29:89,1998)。只包含抗原的黏膜疫苗誘導(dǎo)免疫耐受性，而不是免疫應(yīng)答，所以與佐 劑共同-施用很重要(Yuki等，Rev. Med. Virol.(醫(yī)學(xué)病毒學(xué)綜述)，13: 293， 2003)。但是，盡管急需誘導(dǎo)黏膜免疫的佐劑，還沒(méi)報(bào)道用于誘導(dǎo)黏膜免 疫性的臨床可用的佐劑。'佐劑'意指促進(jìn)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的特異階段從而最終增強(qiáng)免疫應(yīng)答 的任何化合物。單獨(dú)佐劑的施用不影響免疫性，但是與疫苗抗原共同-施 用可以提高并且維持針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答。佐劑典型的例子為油乳液 (弗氏佐劑)、皂角苷、鋁或鈣鹽(明礬)、非離子嵌段聚合物表面活性 劑、脂多糖、分枝桿菌(mycobacteria)和破傷風(fēng)類(lèi)毒素。a-半乳糖基神經(jīng)酰胺(a-GalCer)是一種來(lái)自于海綿體Jgeto mm^//"m 的糖脂，其作用為NKT (天然殺傷T)細(xì)胞的Val4+ T細(xì)胞受 體(TCR)的配體，并且由抗原呈遞細(xì)胞(APC)的CDld呈遞(Kawano等, Science(科學(xué))，278: 1626, 1997)。NKT細(xì)胞的激活導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-丫和IL-4, 這為特異的疾病或感染提供調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的機(jī)會(huì)(Chen等，J. Immunol.(免 疫學(xué)雜志),159: 2240, 1997; Wilson等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美國(guó) 國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，100: 10913,2003)。在先前的研究中，檢驗(yàn)了 aGalCer作為系統(tǒng)接種的佐劑的作用和效 果。結(jié)果，證實(shí)aGalCer作用為 一 種有效佐劑用于治療感染 (Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院 學(xué)報(bào)),97: 8461 ，2000; Gonzalez-Asegui廳lza等，J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué) 雜志),195:615,2002)，自體-免疫疾病(Laloux等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜
志)，166: 3749,2001: Teige等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)，172: 186,2004) 和癌癥(Hermans等，J. Immunol,(免疫學(xué)雜志)，171: 5140， 2003; Fujii等, J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，199: 1607, 2003; Hayakawa等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，100:9464,2003)。按照WO 2003/009812，當(dāng)通過(guò)腹膜內(nèi)注射、肌內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射 而施用cxGalCer作為佐劑時(shí)，它增強(qiáng)抗原特異性Thl-型應(yīng)答，特別是CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答。韓國(guó)專(zhuān)利公布No. 2003-0017733還描述當(dāng)將腫瘤溶解產(chǎn)物與 aGalCer共同注射到腹腔中時(shí)，刺激NKT細(xì)胞，增加用于T細(xì)胞激活的 輔因子的表達(dá)，這導(dǎo)致對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。然而，上述文件只證明aGalCer作為佐劑通過(guò)全身施用而誘導(dǎo)細(xì)胞介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且沒(méi)有提及ctGalCer作為用于鼻接種的佐劑的功能。由于不同淋巴器官中免疫細(xì)胞的免疫學(xué)微環(huán)境和動(dòng)力學(xué)不同，所以在 免疫學(xué)方面，不能接受通過(guò)全身途徑而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的某種佐劑還可以用 作鼻疫苗佐劑，或者反之亦然。特別地，在體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答方面，鼻疫苗和肌內(nèi)或皮下疫苗可以誘導(dǎo)不同的免疫應(yīng)答。因此， 需要徹底的檢查，以驗(yàn)證用于肌內(nèi)疫苗的佐劑是否可以用作用于鼻疫苗的 佐劑。例如，明礬是通過(guò)肌內(nèi)注射用于臨床應(yīng)用的唯一一種疫苗佐劑，但 是不能被用作用于鼻疫苗的佐劑?；魜y毒素是鼻疫苗佐劑的一種有前途的 候選，但是不是關(guān)于肌內(nèi)疫苗佐劑的研究目標(biāo)。針對(duì)通過(guò)黏膜入侵的病原 體的最重要的免疫應(yīng)答是分泌型IgA的產(chǎn)生，其只通過(guò)黏膜接種而誘導(dǎo)。 此外，黏膜接種可以誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答和全身免疫應(yīng)答，以致它不但通過(guò) 黏膜而且通過(guò)其它途徑誘導(dǎo)針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答。因此，用于肌內(nèi)疫苗 或全身施用的疫苗的佐劑不同被用作鼻內(nèi)施用的疫苗的佐劑。為了應(yīng)用用 于不同施用方法的佐劑，它必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)和臨床檢驗(yàn)(Infectious Disease Review(傳染病綜述)3:2, 2001; Nature Immunology(自然免疫學(xué))6:507， 2005; Reviews in Medical Virology (醫(yī)學(xué)病毒學(xué)綜述)，2003， 13:293-310; Nature Reviews Immunology (自然免疫學(xué)綜述)，1: 20, 2001)。本發(fā)明人將腫瘤-相關(guān)抗原或病毒抗原與ocGalCer共同施用到小鼠鼻 腔，并且證實(shí)共同-治療的aGalCer不但誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤-相關(guān)的或病毒抗原
的體液免疫應(yīng)答還誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。并且本發(fā)明人通過(guò)進(jìn)一步證實(shí)aGalCer可以用作鼻疫苗組合物的佐劑而完成本發(fā)明。內(nèi)容 技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防和治療病毒感染和癌癥的組合物， 所述組合物包含aGalCer作為佐劑用于鼻疫苗組合物，本發(fā)明人已證實(shí)其 誘導(dǎo)針對(duì)施用到小鼠鼻腔的腫瘤-相關(guān)抗原或病毒抗原的體液免疫應(yīng)答和 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。技術(shù)方案本發(fā)明提供一種鼻疫苗組合物，其包含抗原和有效劑量的作為佐劑 的a-半乳糖基神經(jīng)酰胺。本發(fā)明還提供同時(shí)增強(qiáng)針對(duì)與a-半乳糖基神經(jīng)酰胺一起共同施用至 鼻腔的抗原的全身(systemic)免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明還提供通過(guò)鼻內(nèi)施用所述疫苗組合物而增強(qiáng)Thl和Th2免疫 應(yīng)答的方法。本發(fā)明還提供通過(guò)鼻內(nèi)施用所述疫苗組合物而增強(qiáng)分泌型IgA在黏 膜區(qū)室中的產(chǎn)生和IgG在系統(tǒng)區(qū)室中的產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供一種用于鼻內(nèi)施用的包含(x-半乳糖基神經(jīng)酰胺的疫苗 佐劑。在下文中，詳細(xì)地描述本發(fā)明。(x-半乳糖基神經(jīng)酰胺(a-GalCer)是一種來(lái)自于海綿體的糖脂，其作用 為NKT(天然殺傷T)細(xì)胞的Val4+T細(xì)胞受體(TCR)的配體，并且由抗原 呈遞細(xì)胞(APC)的CDld分子呈遞(Kawano等，Science (科學(xué))，278: 1626, 1997)。 NKT細(xì)胞的激活導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-Y和IL-4，這為特異的疾病或感染 提供調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的機(jī)會(huì)(Chen等,J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)，159:2240, 1997; Wilson等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)),100: 10913,2003)。按照一些先前的報(bào)道，激活的NKT細(xì)胞可以誘導(dǎo)Th2免疫 應(yīng)答(Yoshmoto等，Science (科學(xué))，270: 1845, 1995; Singh等，J.Immunol.(免疫學(xué)雜志)163: 2373, 1999; Laloux 等 ， J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)，166: 3749)。但是，其它報(bào)道認(rèn)為激活的NKT 細(xì)胞誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答(Hermans等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)，171: 5140， 2003; Stober等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志),170: 2540, 2003)。按照 目前的報(bào)道，aGalCer和OVA的共同-治療誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞(DC)的完全成熟， 并且由此誘導(dǎo)抗原-特異的Thl CD4+T細(xì)胞和具有針對(duì)OVA表達(dá)腫瘤的 抗性的CTL (Fujii等，J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，198: 267, 2003; Fujii等J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志),199: 1607,2004)。另夕卜，本發(fā)明人在體外成功地抑制由高量和低量抗原誘導(dǎo)的口服耐受性，這通過(guò)在全身施 用aGalCer和口服施用OVA后誘導(dǎo)腸系膜淋巴結(jié)中的DC完全成熟和T 細(xì)胞分化而實(shí)現(xiàn)(Chung等，Eur. J, Immunol.(歐洲免疫學(xué)雜志)，34:2471， 2004)。結(jié)果表明aGalCer可以用作各種黏膜疫苗的有效佐劑，并且誘導(dǎo) Thl和CTL或Th2免疫應(yīng)答。本發(fā)明人還證實(shí)，OVA與aGalCer —起的鼻內(nèi)施用在C57BL/6和 Balb/c兩種小鼠中誘導(dǎo)OVA-特異的黏膜S-IgA和全身IgG抗體應(yīng)答、Thl 和Th2細(xì)胞因子應(yīng)答以及很強(qiáng)的CTL應(yīng)答。為了研究aGalCer作為佐劑在黏膜中的活性，將需要量的aGalCer和 100嗎OVA或單獨(dú)的100嗎OVA用PBS稀釋?zhuān)瞥?0 pi溶液(IO嗎1/ 鼻孔)，將其施用給6-8周齡的C57BL/6小鼠或Balb/c小鼠(Charles River 實(shí)驗(yàn)室，東方有限公司(Orient Co.， Ltd.)，韓國(guó))，以一周的時(shí)間間隔施 用3次。aGalCer由Snaghee Kim博士 (Seoul National University(首爾國(guó)立大 學(xué))，韓國(guó))提供，其通過(guò)將植物鞘氨醇與二十六烷酸連接，并且然后按照 常規(guī)技術(shù)進(jìn)行保護(hù)/去保護(hù)和半乳糖苷化而制備(Takikawa等，Tetrahedron (四面體)，54: 3141， 1998)。將aGalCer溶解在含有0.5%吐溫20的PBS 中。含有0.5%吐溫20的PBS用作本文的每一實(shí)驗(yàn)的賦形劑。從在C57BL/6小鼠中關(guān)于針對(duì)OVA的體液免疫應(yīng)答的研究，證實(shí) oiGalCer提高抗原-特異性的黏膜S-IgA (分泌型IgA)的水平(參見(jiàn)圖l)以及 OVA-特異性的Th2型IgGl和Thl型IgG2a的水平，這間接地表明aGalCer 誘導(dǎo)Thl和Th2兩種免疫應(yīng)答(參見(jiàn)圖2和圖3)。在脾和CLN中的Thl
型細(xì)胞因子IFN-y和Th2型細(xì)胞因子IL-4的水平被aGalCer顯著提高， 這直接表明aGalCer誘導(dǎo)Thl和Th2兩種免疫應(yīng)答(參見(jiàn)圖4)。上述結(jié)果表明aGalCer是一種有力的黏膜疫苗佐劑，其能夠誘導(dǎo)抗原 -特異的黏膜S-IgA (分泌型IgA)和全身IgG抗體應(yīng)答，并且在C57BL/6 小鼠中誘導(dǎo)Thl和Th2兩種免疫應(yīng)答。己經(jīng)充分確定，當(dāng)靜脈內(nèi)或口服施用時(shí)，aGalCer誘導(dǎo)CTL應(yīng)答(Fujii 等，J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，198: 267, 2003: Silk等，J. Clin. Invest.(臨床研究雜志)，114: 1800,2004)。因此，還研究當(dāng)它與OVA—起施用 到鼻腔時(shí)，aGalCer是否能在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。結(jié)果，所 有用aGalCer處理的組在黏膜(CLN)和系統(tǒng)(脾和MLN)區(qū)室中表現(xiàn)出劑 量一依賴(lài)型細(xì)胞溶解活性和細(xì)胞毒性活性(參見(jiàn)圖5和圖6)。上述結(jié)果 表明aGalCer是一種能夠在黏膜和全身免疫系統(tǒng)中都誘導(dǎo)CTL的有力的 鼻疫苗佐劑。在Balb/c小鼠中關(guān)于aGalCer活性的研究結(jié)果與上述結(jié)果一 致，這表明aGalCer的作用不限于C57BL/6小鼠(參見(jiàn)圖7—

圖11)。aGalCer具有能夠誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答特別是針對(duì)流感病毒 A/PR/8/34感染的免疫應(yīng)答的鼻疫苗佐劑活性。為了研究黏膜受到針對(duì)病 毒感染的aGalCer的多少保護(hù)，將Balb/c小鼠用aGalCer和PR8 HA抗原 免疫，以一周的時(shí)間間隔鼻內(nèi)施用3次進(jìn)行。在最后的免疫后兩周，通過(guò) 鼻途徑用20 LDs。流感病毒刺激。3天后，在鼻洗液、肺洗液和血液血清 中檢測(cè)PR8HA-特異性抗體應(yīng)答。結(jié)果，在所有cxGalCer-處理的組的鼻洗 液、肺洗液和血液血清中檢測(cè)到高水平的PR8 HA-特異性IgA抗體(參見(jiàn) 圖12)，并且還在所有用aGalCer共同免疫的小鼠的血液血清中檢測(cè)到 高水平的PR8HA-特異性IgG抗體(參見(jiàn)圖13)。因此，這證實(shí)aGalCer 是一種不但誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的全身IgG而且誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的黏膜 S-IgA的有力的鼻疫苗佐劑。在只用抗原免疫的小鼠中，發(fā)病機(jī)理比用抗 原和aGalCer共同免疫的那些小鼠嚴(yán)重得多(參見(jiàn)圖14)。所有只用賦 形劑處理的小鼠在10天內(nèi)死亡，并且只用PR8 HA處理的小鼠有57%在 感染病毒后14天內(nèi)死亡。相反，通過(guò)鼻內(nèi)途徑用(xGalCer和PR8 HA共 同免疫的小鼠在存活率和體重減少以及快速體重減少恢復(fù)速率中沒(méi)有表 現(xiàn)出任何顯著的減少(參見(jiàn)圖14)。因此，證實(shí)aGalCer是一種能夠誘 導(dǎo)針對(duì)病毒感染的強(qiáng)抵御機(jī)制和黏膜S-IgA抗體以及全身IgG抗體的有力 的鼻疫苗佐劑。通過(guò)鼻內(nèi)途徑用0.125嗎aGalCer和攜帶(3-半乳糖酶基因的復(fù)制_缺 陷型腺病毒(Ad-LacZ)(Viromed,韓國(guó))免疫Balb/c小鼠，而進(jìn)一步研究由 (xGalCer鼻疫苗佐劑誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。結(jié)果，aGalCer有效地誘導(dǎo)針對(duì)攜 帶(3-半乳糖酶基因的復(fù)制一缺陷型腺病毒的細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫應(yīng)答 (參見(jiàn)圖15—圖17)。進(jìn)一步證實(shí)aGalCer具有誘導(dǎo)針對(duì)EG7腫瘤的抗癌免疫應(yīng)答的鼻疫 苗佐劑活性。通過(guò)以一周的時(shí)間間隔鼻內(nèi)施用3次而將C57BL/6小鼠用 OVA和aGalCer—起免疫。最后免疫后兩周，在免疫小鼠的左脅皮下接 種3xW個(gè)EG7腫瘤細(xì)胞。接種后14天，將小鼠處死，并且將可觸摸的 腫瘤切離，并且檢測(cè)重量。結(jié)果，在通過(guò)鼻內(nèi)途徑用0.5嗎和2.0 pg的 cxGalCer和OVA共同免疫的小鼠中，腫瘤形成完全得到抑制(參見(jiàn)圖18)。 這些結(jié)果表明(xGalCer可以用作誘導(dǎo)抗癌免疫應(yīng)答的有力的鼻疫苗佐劑。為了研究由a—GalCer鼻疫苗佐劑誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否受CDld分子 調(diào)控，將CDlcW-C57BL/6小鼠，其中CDld分子缺失并且因此缺失NKT 細(xì)胞，用單獨(dú)的OVA或與a-GalCer —起以一周的時(shí)間間隔鼻內(nèi)免疫3次。 一周后，在野生型和CDld-/- C57BL/6兩種小鼠中研究血清中的全身IgG 應(yīng)答和體內(nèi)CTL活性。結(jié)果，在CDld-A小鼠中的全身IgG抗體應(yīng)答被顯 著地抑制(參見(jiàn)圖19)，并且還在001(1-/-小鼠的排泄淋巴結(jié)(draining lymph node)和全身淋巴器官中抑制CTL細(xì)胞溶解活性(參見(jiàn)圖20)。 上述結(jié)果表明由a-GalCer鼻疫苗佐劑誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答專(zhuān)一地受CDld分子 調(diào)控。aGalCer的鼻內(nèi)施用誘導(dǎo)先天T細(xì)胞的激活，并且因此將這些細(xì)胞分 化成為效應(yīng)器細(xì)胞。為了再次證實(shí)aGalCer對(duì)先天T細(xì)胞激活的作用，將 CFSE-標(biāo)記的OTl細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到同系基因小鼠(syngenicmice)。在過(guò) 繼轉(zhuǎn)移的第二天，對(duì)所述小鼠鼻內(nèi)施用單獨(dú)的OVA或與2.0 )ig aGalCer 一起的OVA。 48小時(shí)后，研究CD25在CLN中的表達(dá)。結(jié)果，在用OVA 和aGalCer共同處理的小鼠中，表達(dá)CD25的OT1細(xì)胞的水平高于只用 OVA處理的那些小鼠，這意味著aGalCer鼻佐劑誘導(dǎo)先天T細(xì)胞的活化 (參見(jiàn)圖21)。為了證實(shí)激活的T細(xì)胞是否成功地分化成高度功能性的CTL，將這些細(xì)胞進(jìn)一步用OVA257.264肽刺激6小時(shí)，然后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-2 和IFN-y水平。結(jié)果，在用OVA與aGalCer—起通過(guò)鼻內(nèi)途徑免疫的小 鼠中，由OT1細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2和IFN-y水平高于只用OVA處理的那些 小鼠(參見(jiàn)圖22)。結(jié)果表明鼻內(nèi)施用的aGalCer誘導(dǎo)先天T細(xì)胞的活 化，并且促使活化的T細(xì)胞分化成為效應(yīng)T細(xì)胞。甚至在用殺死的PR8病毒作為抗原的情形中，ocGalCer誘導(dǎo)針對(duì)流感 感染的可信的和有力的免疫應(yīng)答。具體地，將Balb/c小鼠用殺死的PR8 病毒和aGalCer以?xún)芍艿臅r(shí)間間隔通過(guò)鼻內(nèi)途徑免疫兩次。結(jié)果，aGalCer 鼻疫苗佐劑提高血清中IgG的水平(參見(jiàn)圖23)和黏膜區(qū)室中S-IgA的 水平(參見(jiàn)圖24) 。 ctGalCer鼻疫苗佐劑還顯著地提高免疫細(xì)胞的增殖(參 見(jiàn)圖25)以及IFN-y和IL-4的產(chǎn)生(參見(jiàn)圖26)。證明由aGalCer鼻疫苗 佐劑激活的細(xì)胞毒性T細(xì)胞具有強(qiáng)細(xì)胞溶解活性(參見(jiàn)圖27)和保護(hù)性 免疫性(參見(jiàn)圖28)。上述結(jié)果表明，當(dāng)通過(guò)鼻內(nèi)途徑與甚至殺死的病 毒抗原共同處理時(shí)，aGalCer誘導(dǎo)針對(duì)活病毒感染的有力的體液免疫應(yīng)答 和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，以及強(qiáng)和可信的保護(hù)性免疫應(yīng)答。上述結(jié)果還表明aGalCer可以用作誘導(dǎo)抗-感染和抗癌免疫應(yīng)答的有 效的鼻疫苗佐劑。因此，本發(fā)明提供包含有效劑量的ot-半乳糖基神經(jīng)酰胺佐劑和抗原的 疫苗組合物。在本文中術(shù)語(yǔ)"有效劑量的佐劑"表示能夠引發(fā)針對(duì)通過(guò)鼻內(nèi)途徑施 用的抗原的免疫應(yīng)答的aGalCer的量，其還被本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員很好 地理解。更精確地，佐劑的有效劑量意指，與只用抗原免疫的小鼠相比， 能夠?qū)?lái)自用抗原和aGalCer共同免疫的小鼠的鼻洗液中的S-IgA水平 提高大于5%、更優(yōu)選地25%和最優(yōu)選地大于50%的量。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含低于0.5 w/v%的 oi-半乳糖基神經(jīng)酰胺。"抗原"意指當(dāng)其入侵宿主時(shí)，能夠通過(guò)被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別而誘導(dǎo) 免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)(例如，蛋白、肽、癌癥細(xì)胞、糖蛋白、糖脂、活病 毒、殺死的病毒、DNA等)。
抗原可以作為純化的形式或未-純化的形式提供，但是優(yōu)選純化的形 式。 .本發(fā)明可以用于各種抗原，包括病原體的蛋白、重組蛋白、肽、多糖、 糖蛋白、糖脂和DNA (多聚核苷酸)、癌細(xì)胞、活病毒以及殺死的病毒。提供下列抗原作為本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的參考，但是不限于此 流感病毒抗原(血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶抗原)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原(百日咳毒素，絲狀血細(xì)胞凝集素，pertactin),人 乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原，Helicobacterpylori抗原(血清組A, B, C， Y和 W-135的莢膜多糖)，破傷風(fēng)類(lèi)毒素，白喉抗原(白喉類(lèi)毒素)，肺炎球菌 (pneumococcal)抗原(月巿炎鏈球菌(Streptococcus pnemoniae) 3型莢膜多 糖)，結(jié)核(tuberculosis)抗原，人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120， GP-160): 霍亂抗原(霍亂毒素B亞基)，葡萄球菌(staphylococcal)抗原(葡萄球菌腸 毒素B)，志賀氏菌(shigella)抗原(志賀氏菌多糖)，皰疹性口炎病毒抗原 (皰疹性口炎病毒糖蛋白)，巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirustigen) (CMV)抗 原，肝炎抗原(甲型肝炎(HAV)，乙型(HBV)，丙型(HCV), 丁型(HDV)和庚 型(HGV)抗原),呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，單純皰疹抗原或它們的組合 (不包括，白喉、百日咳和破傷風(fēng)、DPT)。本發(fā)明的鼻疫苗組合物可以配制成液體或粉末形式的組合物，特別是 按照施用方法的氣溶膠、滴劑、吸入劑或吹入劑，并且優(yōu)選粉劑或小球體。用于滴鼻劑的組合物可以包括一種或多種可用的賦形劑，諸如防腐 劑、粘性調(diào)節(jié)劑、滲透性調(diào)節(jié)劑和緩沖劑。疫苗的施用量確定為能夠有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量。例如，對(duì)于人疫苗 的施用頻率是每天一次到幾次，并且劑量是l-250嗎，并且優(yōu)選2-50 嗎。在嚙齒動(dòng)物和猿類(lèi)中，a-半乳糖基神經(jīng)酰胺似乎不誘導(dǎo)毒性(Nakata 等，Cancer Res.(癌癥研究),58: 1202-1207, 1998)。并且，在用2200 |ig/Kg aGalCer處理的小鼠中沒(méi)有報(bào)道過(guò)副作用，并且，證明aGalCer是一種不 引起劑量-限制性毒性(50-4800 ng/m、的安全物質(zhì)，并且在劑量增加的研 究中具有抗性(Giaccone等，Clin. Cancer Res,(臨床癌癥研究),8: 3702， 2002)。 本發(fā)明還提供增強(qiáng)針對(duì)與ccGalCer —起通過(guò)鼻內(nèi)途徑施用的抗原的 免疫應(yīng)答的方法。上文提及的抗原與aGalCer —起同時(shí)施用至鼻腔內(nèi)優(yōu)選地通過(guò)配發(fā) 裝置(dispensing device)進(jìn)行，并且更優(yōu)選地使用氣溶膠遞送系統(tǒng)。本發(fā)明還提供通過(guò)將抗原與cxGalCer —起同時(shí)施用至鼻腔內(nèi)而增強(qiáng) Thl和Th2免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明還提供通過(guò)將抗原與(xGalCer —起同時(shí)施用至鼻腔內(nèi)而增強(qiáng) IgA黏膜免疫應(yīng)答和IgG全身免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明提供一種包含aGalCer作為有力的鼻疫苗佐劑的鼻疫苗組合物。附圖描述參考附圖，更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，其中 圖l-圖4舉例說(shuō)明在C57BL/6小鼠中共同-施用OVA和aGalCer誘導(dǎo) OVA-特異性S-IgA和全身IgG應(yīng)答以及Thl和Th2細(xì)胞因子分泌。圖1 是顯示在用OVA單獨(dú)或與aGalCer —起通過(guò)鼻內(nèi)途徑以一周的時(shí)間間隔 免疫3次的最后一次免疫之后一周小鼠鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中 OVA-特異性S-IgA效價(jià)的一組圖表。圖2是顯示在血清中的OVA-特異性 全身IgG效價(jià)的圖表，并且圖3是顯示在血清中OVA-特異性IgG同種型 效價(jià)的圖表。圖4是顯示在來(lái)自脾和子宮頸淋巴結(jié)(CLN)的OVA和單細(xì) 胞培養(yǎng)4天后獲得的培養(yǎng)物上層清液中IFN-Y和IL-4生產(chǎn)水平的一組圖 表，其通過(guò)夾層ELISA進(jìn)行檢驗(yàn)。圖5和圖6舉例說(shuō)明在C57BL/6小鼠體內(nèi)aGalCer誘導(dǎo)強(qiáng)CTL應(yīng)答。 圖5是舉例說(shuō)明通過(guò)FACS分析的脾細(xì)胞的特異性裂解的一組圖表。具體 地，將來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠的等數(shù)目OVA257.264肽脈沖的 CFSE胃脾細(xì)胞(靶點(diǎn)細(xì)胞)和未脈沖的CFSE^脾細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)靜脈 內(nèi)注射至免疫的小鼠。24小時(shí)后，將小鼠處死，并且檢測(cè)靶點(diǎn)細(xì)胞在脾、 MLN和CLN中的比例。圖6是以百分?jǐn)?shù)表示圖5中檢測(cè)的CTL活性的 一組圖表。
圖7-圖11舉例說(shuō)明通過(guò)鼻內(nèi)途徑共同-施用OVA和aGalCer在Balb/c 小鼠中誘導(dǎo)OVA-特異性抗體應(yīng)答、Thl和Th2細(xì)胞因子分泌和CTL活性。 圖7是顯示在最后一次免疫后一周的鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中的 OVA-特異性S-IgA效價(jià)的一組圖表。圖8是顯示血清中OVA-特異性全身 IgG效價(jià)的圖表。圖9是顯示在血清中IgG同種型效價(jià)的圖表。圖10是 顯示在來(lái)自脾和子宮頸淋巴結(jié)(CLN)的OVA和單細(xì)胞培養(yǎng)4天后獲得的 培養(yǎng)物上層清液中IFN-y和IL-4生產(chǎn)水平的一組圖表，其通過(guò)夾層ELISA 進(jìn)行檢驗(yàn)。圖11舉例說(shuō)明在將脾細(xì)胞和OVA培養(yǎng)4天后并且通過(guò)細(xì)胞內(nèi) 細(xì)胞因子染色(ICS)檢驗(yàn)的生產(chǎn)IFN-y-的CD8+T細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生。圖12-圖14舉例說(shuō)明在Balb/c小鼠中由aGalCer鼻疫苗佐劑誘導(dǎo)的針 對(duì)流感病毒A/PR/8/34感染的強(qiáng)保護(hù)性免疫應(yīng)答。圖12是顯示在鼻洗液 (NW)、肺洗液(LW)和血清中PR8 HA-特異性S-IgA效價(jià)的一組圖表。特 別地，將Balb/c小鼠用單獨(dú)的PR8 HA或與aGalCer —起通過(guò)鼻內(nèi)途徑以 一周的時(shí)間間隔免疫3次。2周后，將小鼠通過(guò)鼻內(nèi)途徑用20 LDso活的 流感病毒A/PR/8/34感染。然后，檢測(cè)在鼻洗液(NW)、肺洗液(LW)和血 清中PR8 HA-特異性S-IgA效價(jià)。圖13是顯示血清中PR8 HA-特異性IgG 效價(jià)的圖表。圖14是顯示在病毒感染后每隔一天檢測(cè)的小鼠存活率和體 重減少的一組圖表。圖15-圖17舉例說(shuō)明鼻內(nèi)施用的aGalCer在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)黏膜 S-IgA和全身IgG應(yīng)答以及CTL應(yīng)答，這確定針對(duì)復(fù)制-缺陷型活的腺病 毒感染的強(qiáng)免疫性。圖15是顯示，在用單獨(dú)的復(fù)制-缺陷型活的腺病毒或 與aGalCer —起通過(guò)鼻內(nèi)途徑以2周的時(shí)間間隔2次免疫Balb/c小鼠后一 周檢測(cè)在鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中p-半乳糖酶-特異性S-IgA效價(jià)的一 組圖表。圖16是顯示血清中(3-半乳糖酶-特異性IgG效價(jià)的圖表。圖17 是顯示在用(3-半乳糖酶刺激脾細(xì)胞后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)的 IFN個(gè)生產(chǎn)CD8+T細(xì)胞的水平的圖表。圖18是舉例說(shuō)明通過(guò)C57BL/6小鼠的鼻腔共同-施用OVA和aGalCer 可以誘導(dǎo)針對(duì)EG7腫瘤的強(qiáng)保護(hù)性的圖表。具體地，從最后一次免疫2 周后，將3 x 106個(gè)EG7腫瘤細(xì)胞皮下接種到免疫的小鼠的左脅。14天后， 研究可觸摸的腫瘤的重量和腫瘤的發(fā)生率。
圖19和圖20舉例說(shuō)明aGalCer作為佐劑的活性受CDld調(diào)控。圖19 是顯示在野生型和CDld-/-C57BL/6 (0)1(1-/-)小鼠血清中OVA-特異性IgG 效價(jià)的圖表。簡(jiǎn)要地，將野生型和CDld-/- C57BL/6小鼠用OVA和aGalCer一起以一周的時(shí)間間隔免疫3次。最后一次免疫后一周，將等數(shù)目的 OVA257.264脈沖的CFSE *脾細(xì)胞(革巴點(diǎn)細(xì)胞)和未脈沖的CFSE ^脾細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)過(guò)繼轉(zhuǎn)移到免疫的小鼠。l天后，通過(guò)EILSA檢測(cè)血清中OVA-特異 的IgG效價(jià)，并且顯示在圖19中，通過(guò)FACS檢驗(yàn)靶點(diǎn)細(xì)胞的比例并顯 示在圖20中。圖21和圖22舉例說(shuō)明通過(guò)鼻內(nèi)途徑共同-施用OVA和aGalCer激活 先天CD8+T細(xì)胞，并且因此誘導(dǎo)它們分化成效應(yīng)T細(xì)胞。圖21是顯示 通過(guò)aGalCer鼻疫苗佐劑激活先天T細(xì)胞的一組圖表。將CFSE-標(biāo)記的 OT-1細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到同系基因的小鼠。1天后，將所述小鼠用OVA與 aGalCer—起鼻內(nèi)免疫。1天后，通過(guò)FACS分析來(lái)自CLN的淋巴細(xì)胞的 CD25的表面表達(dá)。圖22是顯示aGalCer鼻疫苗佐劑促使活化的T細(xì)胞分化成為效應(yīng)T細(xì)胞的一組圖表。在將細(xì)胞用OVA257—264肽和GolgiPhlg(BD Pharmingen)刺激6小時(shí)后，通過(guò)FACS進(jìn)一步檢驗(yàn)如在圖21中獲得 的淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)IL-2和IFN-y的生產(chǎn)。圖23-圖28舉例說(shuō)明通過(guò)鼻內(nèi)途徑用福爾馬林(formaline)-滅活的 PR8病毒與aGalCer —起免疫誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和 保護(hù)性免疫應(yīng)答。將Balb/c小鼠用滅活的PR8病毒與aGalCer —起通過(guò) 鼻內(nèi)途徑以?xún)芍艿臅r(shí)間間隔免疫兩次。在最后一次免疫后兩周，將小鼠處 死，并且獲得鼻洗液和肺洗液。檢測(cè)IgG(圖23)和黏膜S-IgA(圖24)在其 中的生產(chǎn)。圖25顯示在從脾和CLN分離的單細(xì)胞中的免疫細(xì)胞的增殖。 圖26是顯示Thl和Th2細(xì)胞因子的生產(chǎn)的一組圖表。圖27是顯示檢測(cè) CTL活性的"Cr釋放檢測(cè)的結(jié)果的圖表。圖28是示例將免疫的小鼠用活 PR8病毒感染并且然后通過(guò)蝕斑測(cè)定檢測(cè)肺洗液中的病毒數(shù)目以研究保 護(hù)性免疫應(yīng)答的圖表。發(fā)明的方式 本發(fā)明的實(shí)施和目前優(yōu)選的實(shí)施方案如下述實(shí)施例所示進(jìn)行舉例說(shuō)明。然而，應(yīng)該理解，考慮到本公開(kāi)，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可以在本 發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行改進(jìn)和改善。實(shí)施例1:對(duì)C57BL/6小鼠通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用抗原和aGalCer而誘導(dǎo)的 OVA-特異的黏膜S-IgA和全身IgG抗體應(yīng)答將6只8周齡的C57BL/c小鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，東方有限公司 (Orient Co.， Ltd.),韓國(guó))用100嗎單獨(dú)的OVA或與指定量的aGalCer (0.125, 0.5， 2.0 pg)以一周的時(shí)間間隔免疫3次，其中OVA禾n aGalCer用 PBS稀釋?zhuān)⑶抑瞥?0iil溶液(10nl/鼻孔)。aGalCer由Sanghee Kim博士(首爾國(guó)立大學(xué)，韓國(guó))提供，其通過(guò)將 植物鞘氨醇與二十六垸酸連接，并且然后按照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行保護(hù)/去保護(hù) 和半乳糖苷化而制備(Takikawa等，Tetrahedron (四面體)，54: 3141, 1998)。 將aGalCer溶解在含有0.5%吐溫20的PBS中。含有0.5%吐溫20的PBS 用作本文的每一實(shí)驗(yàn)的賦形劑。在最后免疫后一周，將小鼠處死。通過(guò)ELISA檢測(cè)OVA-特異性抗體 應(yīng)答。鼻洗液通過(guò)用100pl滅菌PBS洗滌鼻通道(nasal passage)而獲得 (Yamamoto等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志),161:4115,1998)，還通過(guò)如所 述相同的方式獲得支氣管小泡灌洗流體，以制備肺洗液(Chimg等，免疫學(xué) 206: 408,2002)。檢測(cè)在所述鼻洗液和肺洗液中的OVA-特異性IgG效價(jià)(Chung等，免 疫學(xué)206: 408, 2002)。為了檢測(cè)IgA、 IgGl和IgG2a效價(jià)，使用兩倍連續(xù) 稀釋的樣品。為了確定IgA效價(jià)，使用辣根-過(guò)氧化物酶-綴合的山羊抗-小鼠IgA (SIGMA， USA)、過(guò)氧化物酶底物和TMB (西格瑪(SIGMA), 美國(guó))，并且向其中加入0.5N-HCL終止顯色。然后，檢測(cè)OD4so。為了確 定IgG、 IgGl和IgG2a效價(jià)，使用堿性磷酸酶-綴合的山羊抗-小鼠IgG、 IgGl和lgG2a(南方生物技術(shù)(SouthernBiotech)，美國(guó))和堿性磷酸酶底 物、對(duì)-硝基苯基磷酸(西格瑪)。
如在圖1中所示，在用2.0pgaGalCer共同免疫的小鼠中，鼻洗液和 肺洗液中的OVA-特異性IgA應(yīng)答顯著高于只用賦形劑或只用OVA免疫 的那些小鼠中的應(yīng)答。如在圖2中所示，與只用賦形劑或只用OVA免疫的那些小鼠相比， 在用不同濃度的aGalCer (0.125， 0.5， 2.0嗎)共同免疫的小鼠的血清中檢測(cè) 到更高的OVA-特異性IgG水平。為了評(píng)估由(xGalCer鼻疫苗佐劑間接誘導(dǎo)的對(duì)Thl或Th2免疫應(yīng)答的 免疫偏愛(ài)性，確定血清中的IgG同種型，并且計(jì)算IgGl與IgG2a的比例。如在圖3中所示，共同-施用aGalCer和OVA導(dǎo)致OVA-特異性的Th2 型IgGl和Thl型IgG2a水平的顯著增加，這表明aGalCer鼻疫苗佐劑沒(méi) 有使免疫應(yīng)答偏向Thl或Th2免疫應(yīng)答，并且誘導(dǎo)Thl和Th2兩種免疫 應(yīng)答。從上述結(jié)果，證實(shí)aGalCer是一種能夠在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)抗原-特異性黏膜S-IgA (分泌型IgA)和全身IgG抗體應(yīng)答并且可以誘導(dǎo)Thl和 Th2兩種免疫應(yīng)答的強(qiáng)黏膜佐劑。實(shí)施例2:對(duì)C57BL/6小鼠通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用抗原和aGalCer而誘導(dǎo)TM 和Th2細(xì)胞因子的分泌直接研究aGalCer鼻疫苗佐劑是否使得免疫應(yīng)答偏向Thl或Th2免疫 應(yīng)答。為了檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌，在最后免疫后一周從脾和子宮頸淋巴結(jié) (CLN)獲得細(xì)胞。將所述細(xì)胞(5 x 106個(gè)細(xì)胞/1111)用500嗎/ml OVA培養(yǎng)4 天。通過(guò)使用小鼠IFN-y和IL-4 OptELA set ELISA試劑盒(BD Pharmigen) 按照制造者的用法說(shuō)明而檢測(cè)培養(yǎng)物上層清液中的IFN-y和IL-4的分泌。如在圖4中所示，IFN-y和IL-4在脾和CLN中的分泌顯著增加。高 濃度的aGalCer誘導(dǎo)更多的IFN-y分泌，并且IL-4在CLN中的分泌也與 aGalCer濃度成比例增加。從上述結(jié)果，證實(shí)aGalCer的鼻內(nèi)施用在全身(脾)和黏膜(CLN) 區(qū)室中誘導(dǎo)Thl (IFN-力和Th2 (IL-4)兩種免疫應(yīng)答。
實(shí)施例3:對(duì)C57BL/6小鼠通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用抗原和aGalCer而誘導(dǎo)的 強(qiáng)CTL應(yīng)答已經(jīng)公知靜脈內(nèi)或口服施用aGalCer誘導(dǎo)CTL應(yīng)答(Fuji等，J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，198:267，2003:Silk等，J. Clin. Invest.(臨床研究雜 志)，114: 1800， 2004)。在此處，研究鼻內(nèi)施用aGalCer是否能夠誘導(dǎo)CTL 應(yīng)答。將脾細(xì)胞從首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠分離，將其用1 OVA257—264在37"脈沖90分鐘。將脈沖的細(xì)胞用20 (iM CFSE (分子探針 (Molecular Probes),美國(guó))在37。C標(biāo)記15分鐘，形成OVA257.264脈沖的 CFSE^細(xì)胞。同時(shí)，將未脈沖的細(xì)胞用2 CFSE (分子探針，美國(guó))在 37。C標(biāo)記15分鐘，形成OVA257.264未脈沖的CFSE^細(xì)胞。將等數(shù)目的肽-脈沖的CFSE ^細(xì)胞和未脈沖的CFSE ^細(xì)胞混和，將其在最后免疫后一周 以2x 107個(gè)細(xì)胞的數(shù)目靜脈內(nèi)注射到小鼠。24小時(shí)后，在脾、腸系膜淋 巴結(jié)(MLN)和子宮頸淋巴結(jié)(CLN)中通過(guò)FACS而研究肽-脈沖的CFSE s 細(xì)胞的特異性裂解。如在圖5和圖6中所示，與只用賦形劑或只用OVA免疫的那些組相 比較，所有用aGalCer鼻疫苗佐劑共同免疫的組在脾、MLN和CLN中表 現(xiàn)出劑量-依賴(lài)方式的更高的細(xì)胞毒性。上述結(jié)果表明cxGalCer是一種能夠在局部和系統(tǒng)淋巴器官中都誘導(dǎo) CTL的強(qiáng)鼻疫苗佐劑。實(shí)施例4:對(duì)Balb/c小鼠通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用抗原和aGalCer而誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答<4-1>抗體和細(xì)胞因子的檢測(cè)(體液免疫性)為了研究aGalCer是否可以在Balb/c小鼠中用作鼻疫苗的強(qiáng)佐劑，通 過(guò)如實(shí)施例1中所述相同的方式對(duì)Balb/c小鼠鼻內(nèi)施用不同量的 aGalCer(0.15, 0.5, 2.0嗎)和100 ng OVA，接著檢測(cè)血清中OVA-特異性 IgG、 OVA-特異性IgGl和IgG2a，以及鼻洗液和肺洗液中的OVA-特異性 IgA應(yīng)答。
如在圖7和圖8中所示，與只用賦形劑或只用OVA處理的小鼠中的那些相比較，對(duì)Balb/c小鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，東方有限公司，韓國(guó)) 鼻內(nèi)施用cxGalCer和OVA誘導(dǎo)血清中更高的OVA-特異性IgG應(yīng)答和鼻 洗液與肺洗液中更高的OVA-特異性IgA應(yīng)答。如在圖9中所示，鼻內(nèi)施用aGalCer和OVA導(dǎo)致OVA-特異性IgGl 和IgG2a效價(jià)的增加。如在實(shí)施例2中所述，對(duì)Balb/c小鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，東方有 限公司，韓國(guó))鼻內(nèi)施用不同量的aGalCer (0.125, 0.5, 2.0嗎)和OVA，接 著檢測(cè)脾和CLN中的IFN-y和IL-4水平。如在圖10中所示，所有用aGalCer共同免疫的組表現(xiàn)出IFN-y和IL-4 生產(chǎn)的顯著增加。有趣地，當(dāng)鼻內(nèi)施用0.5ngaGalCer時(shí)，在血清中檢測(cè) 到最高的IgG抗體水平，并且在脾中檢測(cè)到最高的IL-4水平。此外，肺 洗液中黏膜IgA水平和CLN中IL-4的生產(chǎn)與ocGalCer的量成反比。總之，高濃度的aGalCer可以在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)針對(duì)共同施用的抗 原的耐受性。<4-2>細(xì)胞毒性的檢測(cè)(細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性)在Balb/c小鼠中，OVA劑量不包括與I類(lèi)MHC分子結(jié)合的表位肽。 因此，為了研究由aGalCer佐劑在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性，檢 測(cè)IFN-y-生產(chǎn)CD8+T細(xì)胞的數(shù)目(圖ll)。具體地，將所述細(xì)胞(2x106 個(gè)細(xì)胞/ml)用500 pg /ml OVA培養(yǎng)4天，在終止培養(yǎng)前6小時(shí)向其中加入 l|al/ml GolgiPug (BD Pharmigen,美國(guó))。然后，通過(guò)使用FITC-綴合的 CD3 mAb (克隆145-2C11, Biolegend Inc，美國(guó))，PE-綴合的CD8 mAb (克 隆53-6.7, Biolegend Inc,美國(guó))和APC-綴合的IFN-y mAb (克隆XMG1,2, Biolegend Inc,美國(guó))進(jìn)行染色。使用BD Cytofix/Cytoperm Plus (BD Pharmigen,美國(guó))按照制造者的用法說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，并且將染色的 細(xì)胞用FACSCalibur (BD Bioscience,美國(guó))和CellQuest軟件(BD Bioscience,美國(guó))分析。如在圖11中所示，IFN個(gè)生產(chǎn)CD8+ T細(xì)胞的數(shù)目隨著(xGalCer濃度 增加而減少。在圖10中，通過(guò)夾層ELISA檢測(cè)的IFN-y數(shù)目不依賴(lài)于aGalCer的濃度，但是產(chǎn)生IFN-y-的CTL數(shù)目與oiGalCer濃度成反比例。 上述結(jié)果歸因于這樣的事實(shí)，即，通過(guò)夾層ELISA檢測(cè)的IFN-y數(shù)目包 括由不同細(xì)胞包括CD4+、 CD8+ T細(xì)胞或APC分泌的所有的IFN-y，而 通過(guò)FACS檢測(cè)的CTL數(shù)目只是由CD8+ T細(xì)胞分泌的。因此，上述結(jié)果表明aGalCer在Balb/c小鼠中具有強(qiáng)的鼻疫苗佐劑活性。實(shí)施例5:通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用ocGalCer和病毒抗原蛋白而誘導(dǎo)的抗-病毒 免疫應(yīng)答為了檢測(cè)cxGalCer防止病毒感染的黏膜保護(hù)程度，將Balb/c小鼠用單 獨(dú)的PR8 HA抗原(Shin-Ichi Tamura博士，大阪大學(xué)，日本，其通過(guò) Davenport, J. Lab. Clin. Med.(實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志)，63:5， 1964的方法制 備)或與aGalCer—起以一周的時(shí)間間隔免疫3次。最后免疫后2周，將 小鼠通過(guò)鼻腔用20LDso活的流感病毒A7PR78/34感染。病毒感染后3天， 制備鼻洗液、肺洗液和血清，并且通過(guò)如在實(shí)施例1中所述相同的方式檢 測(cè)其中的PR8HA-特異性抗體應(yīng)答。另外，每隔一天觀察被感染的小鼠的 體重減少和存活率，持續(xù)14天。如在圖12中所示，在從用(xGalCer共同免疫的所有組分離的鼻洗液 和肺洗液以及血清中檢測(cè)到高水平的PR8 HA-特異性S-IgA抗體。如在圖 13中所示，還在用aGalCer共同免疫的組的血清中檢測(cè)到高水平的PR8 HA-特異的IgG抗體。上述結(jié)果表明，aGalCer可以用作能夠誘導(dǎo)針對(duì)病毒抗原的黏膜S-IgA 抗體和全身IgG抗體應(yīng)答的強(qiáng)的鼻疫苗佐劑。如在圖14中所述，以用抗原和aGalCer共同-處理的那些小鼠相比較， 在不用aGalCer免疫的小鼠中觀察到更嚴(yán)重的發(fā)病機(jī)理，這于檢測(cè)存活 率、體重減少和體重恢復(fù)時(shí)間的結(jié)果一致。在只用賦形劑處理的組中，所 有小鼠在病毒感染后IO天內(nèi)死亡。在只用PR8 HA處理的組內(nèi)，57%的 小鼠在感染病毒后14天內(nèi)死亡。然而，通過(guò)鼻腔共同-施用PR8 HA和 aGalCer的組在存活率上沒(méi)有表現(xiàn)出任何顯著的減少。
上述結(jié)果表明，cxGalCer可以用作能夠誘導(dǎo)致針對(duì)病毒感染的保護(hù)的 黏膜S-IgA抗體以及全身IgG抗體應(yīng)答的強(qiáng)鼻疫苗佐劑。實(shí)施例6:通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用aGalCer和活病毒而誘導(dǎo)的抗-病毒免疫應(yīng) 答將Balb/c小鼠用單獨(dú)的106 pfli攜帶(3-半乳糖酶基因的復(fù)制_缺陷型 活的腺病毒(Ad-LacZ) (Viromed，韓國(guó))或與0.125 pg aGalCer—起通過(guò)鼻 內(nèi)施用以?xún)芍艿臅r(shí)間間隔免疫兩次。最后免疫后一周，通過(guò)如實(shí)施例1中 所述相同的方式，制備鼻洗液、肺洗液和血清，以檢測(cè){3-半乳糖酶-特異 的抗體應(yīng)答。另外，為了檢測(cè)CTL活性，將脾細(xì)胞用2.5 ^g/mL |3-半乳糖酶 刺激5天，并且按照如實(shí)施例<4-2>中所述的方法通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染 色檢驗(yàn)產(chǎn)生IFN個(gè)的CD8+ T細(xì)胞。如在圖15和圖16中所示，與只用賦形劑或只用Ad-LacZ免疫的組 的那些相比較，在通過(guò)同時(shí)鼻內(nèi)施用而用Ad-LacZ和cxGaICer共同免疫的 組的鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)以及血清中分別檢測(cè)到更高水平的 卩-半乳糖酶-特異的S-IgA抗體和p-半乳糖酶-特異的IgG抗體。如在圖17中所示，在通過(guò)同時(shí)鼻內(nèi)施用而用抗原和aGalCer共同免 疫的組中，證實(shí)產(chǎn)生IFN-y-的CD8+ T細(xì)胞數(shù)目的顯著的增加。上述結(jié)果表明aGalCer是一種針對(duì)復(fù)制-缺陷型活病毒的有效的鼻疫 苗佐劑。實(shí)施例7:通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用抗原和aGalCer而誘導(dǎo)的針對(duì)EG7腫瘤的 抗癌免疫應(yīng)答為了證實(shí)ctGalCer是否可以用作誘導(dǎo)抗癌活性的鼻疫苗佐劑，將 C57BL/6小鼠用單獨(dú)的100嗎OVA或與aGalCer (0.125， 0.5, 2.0 pg)—起 通過(guò)鼻內(nèi)施用以一周的時(shí)間間隔免疫3次。最后免疫后2周，將3 x 106 個(gè)EG7腫瘤細(xì)胞皮下接種到免疫的小鼠的左脅。在接種的第14天，將小 鼠處死，并且稱(chēng)重可觸摸的腫瘤。如在圖18中所示，在只用賦形劑或只用OVA共同免疫的所有小鼠 中以及用0.125嗎aGalCer處理的1/3小鼠中發(fā)現(xiàn)腫瘤塊(tumor masses)。
與只用賦形劑處理的小鼠的腫瘤相比，通過(guò)鼻腔只用OVA處理的小鼠的腫瘤顯著重(p < 0.05)。有趣地，在通過(guò)鼻腔用0.5pg和2.0pg aGalCer與 OVA—起處理的小鼠中，腫瘤形成被完全抑制。從所述結(jié)果，證實(shí)aGalCer可以用作誘導(dǎo)抗癌免疫應(yīng)答的有效并且強(qiáng) 的鼻疫苗佐劑。實(shí)施例8: aGalCer的CDld調(diào)控的鼻內(nèi)佐劑活性為了研究由aGalCer誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否受CDld調(diào)控，將NKT缺 陷型(由缺乏CDld導(dǎo)致)CDld-/- C57BL/6小鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，東 方有限公司，韓國(guó))用于本實(shí)驗(yàn)(Park等，J. Exp. Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)， 193: 893, 2001)。在最后鼻內(nèi)施用的第一周，通過(guò)如實(shí)施例1和實(shí)施例3 所述相同的方法在野生型和CDld-/- C57BL/6小鼠中檢測(cè)血清中全身IgG 水平和體內(nèi)CTL活性。如在圖19中所示，在CDld-A小鼠中全身IgG抗體應(yīng)答明顯被抑制。 如在圖20中所示，在CD 1 d-A小鼠的排泄淋巴結(jié)(draining lymph node) 和全身淋巴器官中抑制CTL細(xì)胞溶解活性。上述結(jié)果表明由本發(fā)明的 aGalCer誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答專(zhuān)一地受CDld和KNT細(xì)胞調(diào)控。實(shí)施例9:通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用抗原和aGalCer而激活先天T細(xì)胞并且將活 化的T細(xì)胞分化成為效應(yīng)細(xì)胞為了研究aGalCer對(duì)T細(xì)胞激活的作用，檢測(cè)CD25在過(guò)繼轉(zhuǎn)移到同 系基因的小鼠中的CFSE-標(biāo)記的OT1細(xì)胞(OVA特異的CD8+ T細(xì)胞)中 的表面表達(dá)。通過(guò)使用CD8a (Ly-2)磁珠(Mitenyl Biotech)將OT1細(xì)胞從 OTl小鼠分離，將其用10pMCFSE在37。C標(biāo)記15分鐘，然后靜脈內(nèi)轉(zhuǎn) 移到同系基因的小鼠中。過(guò)繼轉(zhuǎn)移后1天，對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)的100 jig OVA 或與2.0pgaGalCer—起的鼻內(nèi)施用。48小時(shí)后，使用FACS研究CD25 在CLN中的表達(dá)。如在圖21中所示，在同時(shí)施用OVA和aGalCer的小鼠中，表達(dá)CD25 的OT1細(xì)胞的水平高于只用OVA處理的那些小鼠，這表明aGalCer鼻佐 劑誘導(dǎo)先天T細(xì)胞的活化。
為了證實(shí)活化的T-細(xì)胞是否分化成為完全功能性的CTL，通過(guò)如在實(shí)施例4中所述相同的方法，將2 x 106/ml細(xì)胞進(jìn)一步用5 pM OVA257_264 肽刺激6小時(shí)，并且然后通過(guò)使用APC-綴合的IL-2 (克隆JES6-5H4， Biolegend Inc.,美國(guó))和APC-綴合的IFN-y mAb (克隆XMG1.2 Biolegend Inc.,美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的IL-2和IFN-y水平。如在圖22中所示，在同時(shí)施用OVA禾n aGalCer的小鼠中，分泌IL-2 和IFN-y的OT1細(xì)胞水平高于只用OVA處理的那些小鼠。上述結(jié)果表明，鼻內(nèi)施用aGalCer誘導(dǎo)先天T細(xì)胞的激活，以及這些 活化的T-細(xì)胞向強(qiáng)的效應(yīng)T細(xì)胞的分化。實(shí)施例1.0:通過(guò)鼻內(nèi)共同-施用otGalCer和殺死的病毒而誘導(dǎo)的抗-病毒免疫應(yīng)答為了檢驗(yàn)aGalCer作為殺死的病毒的佐劑的作用，將用福爾馬林滅活 的流感病毒A/PR78/34 (PR8)用作檢驗(yàn)所述抗-病毒免疫應(yīng)答的抗原。將 Balb/c小鼠用指定量的(l jig, 10 ng)單獨(dú)的PR8或與aGalCer—起通過(guò)鼻 內(nèi)施用以?xún)芍艿臅r(shí)間間隔免疫兩次。最后免疫后兩周，將小鼠處死，并且 進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。<10-1>研究體液免疫應(yīng)答從處死的小鼠分離鼻洗液、肺洗液和血清，并且通過(guò)如實(shí)施例1所述 相同分方法觀察其中抗體的生產(chǎn)。如在圖23中所示，在用單獨(dú)的滅活的 PR8處理的小鼠組和用相同量的滅活的PR8和aGalCer—起同時(shí)處理的小 鼠組之間進(jìn)行比較。結(jié)果，在同時(shí)施用滅活的PR8和aGalCer的小鼠中， 抗原-特異的全身IgG水平顯著高于只有滅活的PR8處理的小鼠。如在圖 24中所示，在同時(shí)施用滅活的PR8和aGalCer的組中，鼻洗液和肺洗液 中的黏膜S-IgA水平顯著地升高。上述結(jié)果證實(shí)，同時(shí)鼻內(nèi)施用aGalCer和殺死的病毒強(qiáng)烈地誘導(dǎo)有力 的體液免疫應(yīng)答。<10-2>研究免疫細(xì)胞增殖
將從處死的小鼠的脾和CLN分離的單細(xì)胞用滅活的PR8培養(yǎng)3天， 并且加入[3司-胸苷，并且繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)，通過(guò)LSC檢 測(cè)結(jié)合的[3司-胸苷的水平。如在圖25中所示，在同時(shí)施用aGalCer的小 鼠中，免疫細(xì)胞的增殖顯著提高。上述結(jié)果表明，鼻內(nèi)施用cxGalCer和殺死的病毒強(qiáng)烈地誘導(dǎo)免疫細(xì)胞 增殖。<10-3〉由aGalCer誘導(dǎo)的IFN-y和IL-4的生產(chǎn)將從處死的小鼠的脾和CLN分離的單細(xì)胞用滅活的PR8培養(yǎng)5天。 獲得上層清液，并且通過(guò)如實(shí)施例2所述相同的方法檢測(cè)其中的IFN-y和 IL-4水平。如在圖26中所示，在同時(shí)施用aGalCer的小鼠的脾和CLN中， Thl細(xì)胞因子IFN-丫和Th2細(xì)胞因子IL-4的水平顯著提高。上述結(jié)果表明，用aGalCer和殺死的病毒鼻內(nèi)免疫同時(shí)誘導(dǎo)Thl和 Th2免疫應(yīng)答。<10-4〉研究細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答將從處死的小鼠的脾分離的單細(xì)胞用刺激細(xì)胞培養(yǎng)5天。為了獲得刺 激細(xì)胞，單細(xì)胞取自首次用于實(shí)驗(yàn)的Balb/c小鼠的脾，將所述細(xì)胞用y-射線照射，導(dǎo)致細(xì)胞的滅活。然后，將滅活的細(xì)胞用活的PR8病毒感染。 在將脾細(xì)胞用刺激細(xì)胞培養(yǎng)5天后，將效應(yīng)細(xì)胞連續(xù)稀釋3倍，接著與51Cr-標(biāo)記的靶點(diǎn)細(xì)胞一起繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。然后，檢測(cè)培養(yǎng)物上層清液中殘留 的"Cr的量。通過(guò)用活PR8病毒感染P815腫瘤細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)并且 用"Cr標(biāo)記而制備靶點(diǎn)細(xì)胞。如在圖27中所示，只在同時(shí)用aGalCer處 理的小鼠中觀察到耙點(diǎn)細(xì)胞-特異的細(xì)胞溶解活性。上述結(jié)果表明，同時(shí)鼻內(nèi)施用aGalCer和殺死的病毒誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答。<10-5>研究保護(hù)性免疫應(yīng)答 如前文所述，同時(shí)鼻內(nèi)施用aGalCer和殺死的病毒誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫 應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。接著進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)當(dāng)活病毒侵入時(shí)，所 述免疫應(yīng)答是否能夠激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。將免疫的小鼠用20LDs?；畹腜R8病毒感染，并且3天后處死，以獲 得肺洗液。通過(guò)蝕斑測(cè)定而檢測(cè)肺洗液中活的PR8的量。具體地，將MDCK 細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)以95 — 100%的密度培養(yǎng)在6孔平板中。通過(guò)使用培養(yǎng) 基將所述肺洗液連續(xù)稀釋10倍，將其添加到平板上，接著感染1個(gè)小時(shí)。 然后，除去肺洗液。向其中加入包含瓊脂糖的培養(yǎng)基，接著在C02培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。用肉眼計(jì)數(shù)其中形成的蝕斑的數(shù)目。如圖28中所示， 在用10 pg滅活的PR8和aGalCer同時(shí)免疫的小鼠中，沒(méi)有觀察到蝕斑， 這表明誘導(dǎo)了可信的保護(hù)性免疫應(yīng)答。上述結(jié)果證實(shí)，同時(shí)鼻內(nèi)施用殺死的病毒和(xGalCer誘導(dǎo)強(qiáng)保護(hù)性免 疫應(yīng)答。工業(yè)適用性如前文所解釋?zhuān)景l(fā)明證實(shí)，用aGalCer和腫瘤-相關(guān)的抗原或病毒 抗原同時(shí)鼻內(nèi)免疫不但有效地誘導(dǎo)針對(duì)侵入的腫瘤細(xì)胞或病毒的體液免 疫應(yīng)答，還誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的aGalCer可以有效 地用作鼻疫苗佐劑，用于預(yù)防和治療病毒感染與癌癥。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，在前述描述中公開(kāi)的觀念和具體的 實(shí)施方案可以容易地用作改進(jìn)或設(shè)計(jì)實(shí)行本發(fā)明的相同目的的其它實(shí)施 方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員還應(yīng)該理解，這樣的等價(jià)實(shí)施方案沒(méi) 有背離在后附的權(quán)利要求中提出的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物，其包含抗原和作為佐劑的有效劑量的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(αGalCer)。
2. 按照權(quán)利1的用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物，其中所述抗原選自由 病原體的蛋白、重組蛋白、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖和多聚核苷酸組成 的組。
3. 按照權(quán)利1的用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物，其中所述抗原是細(xì)胞 或病毒。
4. 按照權(quán)利1的用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物，其中包含少于0.5 w/v% 的所述a-半乳糖基神經(jīng)酰胺作為佐劑。
5. 按照權(quán)利1的用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物，其中所述組合物配制 成液體、粉劑或小球體形式。
6. —種增強(qiáng)針對(duì)所注射的抗原的全身免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答的方 法，其通過(guò)同時(shí)鼻內(nèi)施用抗原與a-半乳糖基神經(jīng)酰胺而實(shí)施。
7. 按照權(quán)利要求6的增強(qiáng)針對(duì)注射的抗原的免疫應(yīng)答的方法，其中 所述抗原和a-半乳糖基神經(jīng)酰胺通過(guò)配發(fā)裝置進(jìn)行鼻內(nèi)注射。
8. 按照權(quán)利要求7的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，其中所述配發(fā)裝置是氣 溶膠或滴劑遞送系統(tǒng)的形式。
9. 一種增強(qiáng)Thl和Th2兩種免疫應(yīng)答的方法，其通過(guò)鼻內(nèi)施用權(quán)利 要求1的疫苗組合物而實(shí)施。
10. —種增強(qiáng)IgA黏膜免疫應(yīng)答和IgG全身免疫應(yīng)答的方法，其通 過(guò)鼻內(nèi)施用權(quán)利要求1的疫苗組合物而實(shí)施。
11. 一種用于鼻內(nèi)施用的疫苗佐劑，其包含a-半乳糖基神經(jīng)酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(αGalCer)作為佐劑的用于鼻內(nèi)施用的疫苗組合物。本發(fā)明人將αGalCer與腫瘤細(xì)胞抗原或病毒抗原一起施用至小鼠的鼻腔，并且然后證實(shí)αGalCer不但有效地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，還誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，所述αGalCer可以有效地用作通過(guò)鼻內(nèi)施用的疫苗的佐劑，用于預(yù)防和治療病毒感染與癌癥。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101212983SQ200680024197
公開(kāi)日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者姜昌律, 高圣悅 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)