專利名稱:糖基神經(jīng)酰胺增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明提供了糖基神經(jīng)酰胺在增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。疫苗的基本目的是提供抗病理?xiàng)l件的持續(xù)免疫性。理論上,疫苗提供功能活化的 抗體、引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、并且激活具有高度特異反應(yīng)性和“記憶力”的T淋巴細(xì)胞和B淋 巴細(xì)胞,來提供對(duì)抗更多抗原入侵的保護(hù)作用。佐劑是非特異地放大免疫應(yīng)答的疫苗添加劑。佐劑增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的機(jī)制各不相 同。佐劑可以歸類為“免疫調(diào)節(jié)”或“抗原遞送”系統(tǒng)。免疫調(diào)節(jié)佐劑通過改變淋巴因子產(chǎn)生 而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的行為,來準(zhǔn)備啟動(dòng)免疫系統(tǒng)。另一方面,抗原遞送系統(tǒng)行使向適宜的免疫 細(xì)胞遞送抗原的功能。此外,佐劑可以增加應(yīng)答的速度和持續(xù)期、調(diào)節(jié)抗體親和力、特異性、 同型或亞類的分布、刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、促進(jìn)粘膜免疫、或在免疫學(xué)上未成熟個(gè)體或衰老 個(gè)體中增強(qiáng)免疫應(yīng)答。佐劑可以影響自然、體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,或它們的組合。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),一種特殊類別的合成糖脂,當(dāng)與疫苗聯(lián)合使用時(shí),能夠在向 受試者給藥時(shí)激活體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此,本發(fā)明提供了含有式I化合物的 組合物,其中式I如下所示
背景技術(shù):
其中,R1和R2獨(dú)立地選自-H或-OH ;x為18-26的整數(shù);11為10-15的整數(shù)。還提 供了含有式I的化合物和抗原的組合物。另一方面,本發(fā)明提供了一種方法,所述方法通過給藥含有式I的化合物和抗原 的組合物,增強(qiáng)了受試者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。增強(qiáng)了的免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答、 CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答或者抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的激活。受試者的免疫應(yīng)答相 對(duì)于合適的對(duì)照是被增強(qiáng)的。另一方面,本發(fā)明的組合物是肌內(nèi)注射的。
圖1為顯示了靜脈注射(IV)加入或不加卵白蛋白(Ova)的PBS-96、PBS-14或 PBS-Il的小鼠血液中,卵白蛋白特異(Ova-specific)的靶細(xì)胞的特異性裂解百分比的圖表。圖2為顯示了靜脈注射(IV)加入或不加卵白蛋白(Ova)的α GalCer、PBS-57、 PBS-96或PBS-14的小鼠血液中,卵白蛋白特異(Ova-specific)的靶細(xì)胞的特異性裂解百 分比的圖表。圖3為顯示了肌內(nèi)注射(IM)加入或不加卵白蛋白(Ova)的α GalCer、PBS-57、 PBS-96或PBS-14的小鼠血液中,卵白蛋白特異(Ova-specific)的靶細(xì)胞的特異性裂解的圖表。圖4A為顯示了接種不同濃度PBS-57后24小時(shí)內(nèi)小鼠血清中,IFN γ的積累的圖 表;圖4Β為顯示了接種不同濃度PBS-14后24小時(shí)內(nèi)小鼠血清中,IFNy的積累的圖表;圖 4C為顯示了接種不同濃度PBS-96后24小時(shí)內(nèi)小鼠血清中,IFNy的積累的圖表;圖4D為 顯示了接種不同濃度α GalCer后24小時(shí)內(nèi)小鼠血清中,IFNy的積累的圖表;圖5為比較了接種IOOng的PBS-57、PBS-96、PBS-14或PBS-Il后24小時(shí)內(nèi)小鼠 血清中IFNy的積累的圖表;圖6為顯示了靜脈注射(IV)加入或不加卵白蛋白(Ova)的PBS-11、PBS-57、 PBS-96或PBS-14的小鼠血液中,卵白蛋白特異(Ova-specific)的靶細(xì)胞的特異性裂解的 圖表;圖7為顯示了肌內(nèi)注射(IM) IOOng加入或不加卵白蛋白(Ova)的指示佐劑 (indicated adjuvant)的小鼠中,卵白蛋白特異(Ova-specific)的靶細(xì)胞的特異性裂解 的圖表;圖8為顯示了肌內(nèi)注射(IM)IOng加入或不加卵白蛋白(Ova)的指示佐劑的小鼠 中,卵白蛋白特異(Ova-specific)的靶細(xì)胞的特異性裂解的圖表;圖9為顯示了肌內(nèi)注射(IM)Iyg加入或不加卵白蛋白(Ova)的指示佐劑的小鼠 中,應(yīng)答于SIINFEKL五聚物的⑶8+T細(xì)胞的百分比的圖表;圖10為顯示了肌內(nèi)注射(IM) IOOng加入或不加卵白蛋白(Ova)的指示佐劑的小 鼠中,應(yīng)答于SIINFEKL五聚物的⑶8+T細(xì)胞的百分比的圖表;圖11為顯示了肌內(nèi)注射(IM) IOOng加入或不加卵白蛋白(Ova)的指示佐劑的小 鼠血液中,IgGl的效價(jià)(titer)的圖表;圖12為顯示了肌內(nèi)注射(IM) IOOng加入或不加卵白蛋白(Ova)的所指示佐劑的
5小鼠血液中,IgG2a的效價(jià)(titer)的圖表;圖 13 描述了 PBS-14、PBS-96、PBS-11、PBS_57 禾口 aGalCer 的結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式在疫苗制備中,佐劑通過多種方式增強(qiáng)抗原的免疫原性。有效的佐劑也能用于與 多種抗原聯(lián)合,來增強(qiáng)通過給藥抗原引起的免疫應(yīng)答。例如,對(duì)于毒素,需要良好的體液免 疫應(yīng)答。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,主要由細(xì)胞毒性的T細(xì)胞和Thl細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答,是重 要的。對(duì)于病毒性感染,體液免疫和細(xì)胞免疫都是控制感染的基礎(chǔ)。佐劑不僅具有能增強(qiáng) 體液免疫應(yīng)答的能力也具有能增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力,增加了發(fā)展為長(zhǎng)效免疫的 可能性。已經(jīng)研究了脂類的佐劑特性。一些天然或合成的脂類分子由抗原呈遞細(xì)胞 所加工,并被CDl分子呈遞至NKT細(xì)胞。用于體外和體內(nèi)研究NKT細(xì)胞激活的原型 化合物是KRN7000,一種源自海綿(Agelas mauritianus)的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺 (“aGalCer”)。如PCT申請(qǐng)PCT/US07/66250所述,在此通過參考將其公開的內(nèi)容引 入,新近鑒定了 一些其它的化合物,其中包括屬于內(nèi)源糖脂的異球三己糖苷神經(jīng)酰胺 (isoglobotrihexosylceramide,“iGB3”)和修飾的6 “氨基6”脫氧半乳糖苷神經(jīng)酰胺。這 些化合物在體外激活NKT細(xì)胞,并上調(diào)細(xì)胞因子應(yīng)答。但是,在體內(nèi)接種疫苗的背景下,關(guān) 于這些化合物的脂質(zhì)佐劑有效性尚不清楚。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),含有氨基基團(tuán)和飽和脂肪酸鏈的式I的鞘糖脂,出乎意料 地,在體內(nèi)具有刺激細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的能力。此外,式I的化合物可以刺 激抗較弱的標(biāo)稱抗原(weak nominal antigen)的免疫應(yīng)答來產(chǎn)生抗體,并同時(shí)提供對(duì)表達(dá) 特異表面抗原的細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的裂解。已表明,命名為PBS-96和PBS-14的兩種式I的化 合物,在體內(nèi)刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。這些化合物也可以刺激抗較弱的 標(biāo)稱抗原(weak nominal antigen)的免疫應(yīng)答來產(chǎn)生抗體,并同時(shí)引起細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。 此外,已發(fā)現(xiàn),這些化合物與其它鞘糖脂(如PBS-57和aGalCer)相比,在肌內(nèi)注射時(shí),能 夠刺激更強(qiáng)的應(yīng)答或需要更低的劑量。在一種實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了含有式I的化合物的組合物,其中式I為 其中,R1和R2獨(dú)立地選自-H或-OH ;x為18-26的整數(shù);11為10-15的整數(shù)。適宜 地,式I的化合物在半乳糖或葡萄糖分子的C6位置上具有氨基基團(tuán),并且在該化合物的神 經(jīng)酰胺部分具有飽和的酰基鏈。該組合物可以進(jìn)一步含有生理上可接受的載體。“生理上 可接受”的載體為適合于體內(nèi)給藥(如經(jīng)口服、經(jīng)皮給藥或注射給藥)或體外使用(如細(xì)胞培養(yǎng))的任何載體。適用 于體內(nèi)給藥的生理上可接受的載體包括水、緩沖液和葡萄糖溶液,以及其他載體。除了所 述的生理上可接受的載體以外,該組合物的其他成分可以包括賦形劑(如穩(wěn)定劑)、防腐 劑、稀釋劑、乳化劑或潤(rùn)滑劑。合適的賦形劑包括,但不限于吐溫20、二甲基亞砜(DMSO)、 蔴糖、L-組氨酸(histadine)、聚山梨醇酯20和血清。適宜地,式I的化合物配置在脂質(zhì)體 中。適宜地,該脂質(zhì)體為一種小型單層泡(SUV),含有比例為8微摩爾/2微摩爾/5微摩爾 /1毫克的磷脂酰膽堿(PC)/磷脂酰甘油(PG)/膽固醇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠知道,式I 的化合物可以制成多種劑型,以用于受試者。在另一種實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了通過給藥含有抗原和式I的化合物的組合物 以在受試者中增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法。此處所指的受試者為哺乳動(dòng)物,如小鼠,或更 適合為人。“增強(qiáng)免疫應(yīng)答”指的是相對(duì)于合適的對(duì)照,該化合物增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的體液 免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答的能力。增加的抗原呈遞細(xì)胞的激活也包括在對(duì)受試 者增強(qiáng)的免疫應(yīng)答中。為確定免疫應(yīng)答相對(duì)于對(duì)照是否增強(qiáng),可以將接種抗原和該化合物 的受試者的樣本的信號(hào)和只接種抗原的受試者的樣本的信號(hào),進(jìn)行定量比較。對(duì)抗原的免 疫應(yīng)答可以用多種方法檢測(cè),所述檢測(cè)方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。舉例說,免疫 應(yīng)答可用細(xì)胞毒特異的細(xì)胞裂解分析、五聚體結(jié)合分析、或酶聯(lián)免疫應(yīng)答(ELISA)分析的 檢測(cè)方法來檢測(cè),所述檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。在具體實(shí)施例中,相對(duì)于合適的對(duì)照,免疫應(yīng)答增強(qiáng)至少25%、至少30%、至少 50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少100%、至少150%、至少200%、至少400%、至少500%、至少750%、或至少 1000%。合適的對(duì)照為給藥抗原但不使用本發(fā)明所述組合物的受試者??梢园匆韵鹿接?jì) 算百分率的增強(qiáng)
[(用含有式I化合物的組合物處理后受試者的免疫應(yīng)答值)_(對(duì)照的免疫應(yīng)答 值)/(用含有式I化合物的組合物處理后受試者的免疫應(yīng)答值)]X100。此處所指的“給藥”、“共給藥”和“共給予”指佐劑和抗原聯(lián)用,也就是,在時(shí)間上 同時(shí),或循序(也就是,在給藥佐劑后給藥抗原,或在給藥抗原后給藥佐劑)。在給藥佐劑或 抗原后,另一組分可大致上在其后立即給藥,或者在其后一段有效時(shí)期后給藥;所述有效時(shí) 期為實(shí)現(xiàn)組分給藥的最大收益而給定的時(shí)間量。作為另一種選擇,佐劑和抗原可以共制劑。所述的抗原可以是多肽、多核苷酸、或碳水化合物部分、或它們的組合,如糖蛋 白。所述抗原適宜地來自傳染原(如病原微生物)、腫瘤或內(nèi)源分子(如“自身”分子),或 者,以研究為目的的,標(biāo)稱抗原(nominal antigen),如卵白蛋白(此處所指的“OVA”)。適 宜地,所述抗原包含在疫苗中。疫苗組合物適宜地制成包含式I的化合物的形式。“疫苗”指 一種組合物,在給予受試者時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答。本發(fā)明的藥物組合物適 宜地含有式I的化合物和疫苗。在一些具體實(shí)施方式
中,本發(fā)明的藥物組合物含有PBS-96 和抗原,或PBS-14和抗原。PBS-96和PBS-14的結(jié)構(gòu)如圖13所示。PBS-96和PBS-14在體 內(nèi)和體外激活NKT細(xì)胞。PBS-96和PBS-14都在半乳糖的C6位置上具有氨基基團(tuán),且在該 化合物的神經(jīng)酰胺部分具有飽和的?;?。在體內(nèi),PBS-96和PBS-14增強(qiáng)⑶8+T細(xì)胞對(duì) 抗原的應(yīng)答,并且PBS-96和PBS-14介導(dǎo)IFN-Y的釋放。此外,在低濃度使用時(shí),以及肌內(nèi) 注射時(shí),PBS-96和PBS-14意想不到地優(yōu)于其他鞘糖酯。含有式I化合物的組合物可用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的制備方法和非活性成 分來配置(Remington的藥學(xué)科學(xué),Mack出版公司,2000,在此合并為參考文獻(xiàn))。本發(fā)明的 組合物也可以含有合適的抗原遞送系統(tǒng),以將抗原靶向至免疫細(xì)胞??乖f送系統(tǒng)為本領(lǐng) 域公知,包括但不限于修飾的安卡拉病毒(MVA)、腺病毒、慢病毒(Ientivirus)、百日咳或 志賀毒素的易位亞單位、或封有抗原的脂質(zhì)體。在疫苗組合物中,式I的化合物的有效劑量 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定,雖然有效劑量可以典型地為每千克體重約1000微克或略少, 但典型的范圍可以是每千克體重約1納克到約10000微克。在一些具體實(shí)施方式
中,有效 劑量的范圍是每千克體重約10納克到約1000微克。在另一實(shí)施方式中,有效劑量的范圍 是每千克體重約100納克到約500微克。在另一實(shí)施方式中,有效劑量的范圍是每千克體 重約1微克到約250微克。為了研究目的,根據(jù)給藥的途徑,對(duì)小鼠的劑量是每100微升劑 量1納克到1微克式I的組合物。例如,約100納克的劑量適合于小鼠靜脈注射,小至10 納克的劑量也表明在肌內(nèi)注射下有效。含有式I的化合物的組合物可以單次劑量來給藥, 或者分為數(shù)周或數(shù)月的多次劑量。在組合物中可以含有一種或多種抗原,或者單獨(dú)地制備。此處所指的“抗原”指當(dāng) 給藥于受試者時(shí)刺激免疫應(yīng)答的分子。容易得到,抗原的劑量依賴于具體的抗原、受試者的 年齡和免疫狀態(tài)、以及其它可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定的相關(guān)因素。整體微生物或微生物的部分(如膜血影(menbrane ghosts)、天然的膜制品 (crude membrane pr印aration)、裂解液或其它微生物制品)可以用做抗原。適宜地,抗原 來自弱化的或滅活的感染原??乖蓙碜缘母腥驹ǖ幌抻诓≡w或微生物,如細(xì) 菌、寄生蟲和病毒。在一些環(huán)境中,合適的抗原取自或來自與人類疾病有關(guān)的病毒性病原 體包括但不限于HIV//AIDS(逆轉(zhuǎn)錄病毒科Retroviridae,如,gpl20分子之于HIV-1和 HIV-2種群、HTLV-I,HTLV-II)、流感病毒(正粘病毒科Orthomyxoviridae,如A型、B型和C型)、皰疹(如,單純性皰疹病毒,HSV-I和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH)、輪狀病毒感染(呼腸 病毒科Reoviridae)、呼吸感染(副流感病毒和呼吸道合胞病毒)、脊髓灰質(zhì)炎(小核糖核 酸病毒科Picornaviridae,如脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、麻疹和流行性腮腺炎(副黏液病 毒科Paramyxoviridae)、風(fēng)疹(披膜病毒科Togaviridae,如風(fēng)疹病毒),肝炎(如肝炎病毒 A、B、C、D、E和/或G)、巨細(xì)胞病毒(如gB和gH)、腸胃炎(杯狀病毒科Caliciviridae)、 黃熱和西尼羅熱(黃病毒科Flaviviridae)、狂犬病(彈狀病毒科Rhabdoviridae)、朝鮮 出血熱(布尼雅病毒科Bunyaviridae)、委內(nèi)瑞拉出血熱(沙粒病毒科Arenaviridae)、 疣(乳頭瘤病毒)、猿猴免疫缺損病毒、腦炎病毒、水痘帶狀皰狀病毒、愛潑斯坦_巴爾二氐 (Epstein-Barr)病毒、和其它病毒科,包括冠狀病毒科(Coronaviridae)、雙核糖核酸病毒 禾斗(Birnaviridae)禾口線狀病毒(Filoviridae)。合適的細(xì)菌抗原和寄生蟲抗原也能取自或來自已知的致病體,并可以用在抗疾病 疫苗組合物中,所述疾病包括但不限于白喉、百日咳、破傷風(fēng)、結(jié)核病、細(xì)菌性或真菌性肺 炎、中耳炎、淋病、霍亂、傷寒、腦膜炎、單核細(xì)胞增多癥、瘟疫、志賀氏菌病(shigellosis) 或沙門氏菌病、軍團(tuán)菌病(Legionnaires,disease)、萊姆病(Lyme disease)、麻風(fēng)病、皰 疾、十二指腸病、盤尾絲蟲病、血吸蟲病、錐體蟲病、利什曼病(leishmaniasis)、賈第蟲病 (giardiases)、阿米巴病(amoebiasis)、絲蟲病(filariasis)、包柔氏螺旋體(Borrelia) 和旋毛蟲病。抗原還能取自或來自其它非常規(guī)的病原體,比如庫(kù)魯病(kuru)、克勞伊登病 (CJD)、癢病(scrapie)、貂傳染性腦病(transmissible mink encephalopathy)和慢性消耗 病(chronic wasting diseases)的病原體;或取自或來自傳染性蛋白顆粒,如與瘋牛病相 關(guān)的朊病毒。更加詳細(xì)地,可用于抗原的特殊病原體包括結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、 衣原體(Chlamydia)、淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae),志賀氏桿菌(Shigella)、沙門氏 菌(Salmonella)、霍舌L 弧菌(Vibrio cholera),蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、 假單胞菌(Pseudomonas)、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、布魯氏菌(Brucella)、 土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、鉤 端螺旋體(Leptospirainterrogans)、嗜月市軍團(tuán)菌(Legionel lapneumophi la)、鼠疫菌 (Yersinia pestis)、鏈球菌(Streptococcus (Α型和B型))、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌、 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza,b 型)、弓形蟲(Toxoplasma gondii)、卡他莫 拉菌(Moraxella catarrhalis)、杜諾凡病、以及放線菌;真菌病原體,包括念珠菌和曲霉 ??;寄生病原體,包括絳蟲(Taenia)、吸蟲(flukes)、蛔蟲、阿米巴病(amebiasis)、賈第 蟲病(giardiasis)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、血吸蟲(Schistosoma)、肺卡氏肺囊 蟲(Pneumocystis carinii)、滴蟲病(trichomoniasis)禾口方寵毛蟲病(trichinosis)。本 發(fā)明還可以用來對(duì)多種動(dòng)物疾病提供合適的免疫應(yīng)答,所述疾病如口蹄疫,冠狀病毒, 多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、螺桿菌(Helicobacter)、普通圓形線蟲 (Strongylusvulgaris)、放線桿菌月匈月莫月市炎(Actinobacillus pleuropneumonia)、牛病毒 性腹瀉病毒(BVDV),克雷伯肺炎鏈球菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(E. coli)、百 日咳桿菌(Bordetellapertussis)、副百日咳(parapertussis)和支氣管膿毒博德氏菌 (brochiseptica)。在其他實(shí)施方式中,包含在可以用于本發(fā)明的組合物中的抗原為腫瘤來源的抗原或自體或異體的腫瘤全細(xì)胞。適宜地,腫瘤抗原是腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)性抗 原(TAA)。若干種腫瘤抗原及其表達(dá)模式為本領(lǐng)域公知,并能基于腫瘤治療類型進(jìn)行選擇。 非限制性的腫瘤抗原的實(shí)例包括cdk4(黑色素瘤)、β -連環(huán)蛋白(黑色素瘤)、半胱天冬 酶_8 (鱗狀細(xì)胞癌)、MAGE-I和MAGE-3 (黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤)、酪氨酸酶(黑色素 瘤)、獨(dú)特型表面免疫球蛋白(如BCR)(淋巴癌)、Her-2/neU(乳腺癌、卵巢癌),MUC-I (乳 腺癌、胰腺癌)和HPVE6和E7 (子宮頸癌)。其他合適的腫瘤抗原包括前列腺特異性抗原 (PSA)、唾液酸Tn (STn)、熱激蛋白和相關(guān)的腫瘤肽(如gp96)、神經(jīng)節(jié)苷脂分子(如GM2、⑶2 和⑶3)、癌胚抗原(CEA)和MART-1。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的,藥物組合物適宜地制備成適用于給予途徑的形式。 合適的給予途徑的實(shí)例包括注射,包括靜脈注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射;口服 (比如吸入);腸內(nèi)給予;皮膚(局部)給予;經(jīng)粘膜給予和經(jīng)直腸給予。如實(shí)施例中所示, 化合物I在肌內(nèi)注射后顯示,提供了意料之外免疫應(yīng)答的穩(wěn)定增強(qiáng)。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是刺激對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答的方法。如上所述,該方 法包括向受試者共給予式I的化合物和抗原。此處所指的“體液免疫應(yīng)答”指通過B細(xì)胞 產(chǎn)生抗體,以及相伴的其他附屬過程,包括但不限于如Th2的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、生 發(fā)中心(germinal center)的形成和同型轉(zhuǎn)換、親和成熟的產(chǎn)生(affinity maturation production)和記憶細(xì)胞的產(chǎn)生。為了確定體液免疫應(yīng)答是否激活,可以將接種抗原和該化 合物的受試者的樣本的信號(hào)和只接種抗原的受試者的樣本的信號(hào),進(jìn)行定量比較。體液免 疫應(yīng)答可以通過檢測(cè)抗體效果功能來衡量,所述功能包括病原體或毒素的中和作用、經(jīng)典 的互補(bǔ)激活作用、以及吞噬作用和病原體消除的親菌素(opsonin)促進(jìn)。由共給予式I化 合物和抗原誘發(fā)產(chǎn)生的抗體可以是任何類型,比如IgM、IgA、或IgG(如IgGl或IgG2)。體 液免疫應(yīng)答可以通過本領(lǐng)域公知的任何定量方法進(jìn)行化驗(yàn),比如ELISA、單放射性免疫擴(kuò)散 分析(SRID)、酶免疫分析(EIA)或血凝抑制試驗(yàn)(HAI)。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是激活受試者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的方法。如本領(lǐng)域所公 知,⑶4+T細(xì)胞,或“T輔助細(xì)胞”,是識(shí)別由抗原呈遞細(xì)胞表面上的II型主要組織相容性標(biāo) 記(MHC)呈遞的抗原的細(xì)胞,該細(xì)胞分泌淋巴因子以刺激細(xì)胞介導(dǎo)的和抗體介導(dǎo)的支路免 疫系統(tǒng)。CD4+T細(xì)胞的激活促進(jìn)了淋巴因子的分泌、免疫球蛋白的同型轉(zhuǎn)換、抗體應(yīng)答的親 和成熟、巨噬細(xì)胞的激活和天然殺傷(NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性T (CTL)細(xì)胞的增強(qiáng)活性。淋巴因 子是由淋巴細(xì)胞分泌的蛋白,可以影響他們自己的活性和/或其它細(xì)胞的活性。淋巴因子 包括但不限于白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子,如IL-2、IL-4、IL-5、IL_6、IL-I0、IL-12或IFN γ。 為了確定CD4+T細(xì)胞是否激活,可以將接種抗原和該化合物的受試者的樣本的信號(hào)和只接 種抗原的受試者的樣本的信號(hào),進(jìn)行定量比較。CD4+T細(xì)胞激活的分析方法是本領(lǐng)域公知 的。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是激活受試者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的方法。CD8+T細(xì)胞能夠 識(shí)別由MHC I型分子呈遞的抗原(呈遞在所有有核細(xì)胞表面上)。MHC I型多肽復(fù)合體的 形成,導(dǎo)致裂解顆粒向靶細(xì)胞的傳遞,引起靶細(xì)胞的裂解。CD8+T細(xì)胞激活的所用的分析方 法為本領(lǐng)域公知,包括但不限于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISP0T)、ELISA、分析四聚體/五聚 體結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)。可供替代選擇地,小鼠模型可以通過使 用熒光試驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,以用于監(jiān)測(cè)CD8+T細(xì)胞的激活,如Hermans等的描
10述,2004,免疫學(xué)方法雜志,285 :25-40,在此整體引入作為參考)所述。在該分析中,小鼠 在第0天分別用加入測(cè)試化合物和未加測(cè)試化合物的疫苗進(jìn)行免疫。同源靶細(xì)胞通過從第 二組小鼠中分離脾細(xì)胞得到,并用兩種獨(dú)立的細(xì)胞標(biāo)記熒光染料或高低的濃度單一熒光染 料,標(biāo)記所述細(xì)胞,比如CFSE或CMTMR。一組靶細(xì)胞加載抗體特異肽段,同時(shí)第二組靶細(xì)胞 加載無關(guān)肽段。將兩種靶細(xì)胞群等量混合后,注射到免疫過的小鼠中。24小時(shí)后,處死小 鼠,取得脾細(xì)胞和血液樣品。每組靶細(xì)胞的水平用流式細(xì)胞儀分析。CD8+T細(xì)胞的激活是通 過對(duì)接種抗原和測(cè)試化合物的樣本中的靶細(xì)胞數(shù)目和只接種抗原的樣本中的靶細(xì)胞數(shù)目, 進(jìn)行定量比較而確定的。參考以下非限制性的實(shí)施例和附圖,對(duì)本發(fā)明的其他方面進(jìn)行詳細(xì)的說明。 實(shí)施例實(shí)施例1 在小鼠模型中檢測(cè)靜脈注射PBS-96、PBS_14和PBS-11對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng) 答的增強(qiáng)作用用小鼠模型來檢測(cè)通過測(cè)試佐劑化合物和抗體經(jīng)靜脈注射引起的體內(nèi)特異性細(xì) 胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(⑶8+)。8組(每組3只)小鼠在第0天用加和不加佐劑的抗原(卵白 蛋白,Ova,級(jí)別VII,西格瑪,圣路易斯,MO)、單獨(dú)佐劑、或單獨(dú)載體(對(duì)照),在100微升總 體積的PBS中,經(jīng)靜脈(尾側(cè)靜脈)免疫。測(cè)試佐劑化合物為加或不加50微克的卵白蛋白 (OVA)抗原的 1 微克 PBS-96U 微克 PBS_14、1 微克 PBS-Il0同系基因型的靶細(xì)胞通過以下方式制備從第二組C57/B1/6J⑶45. 2雌性小鼠 中分離脾細(xì)胞,并用低濃度(0.6微摩爾,8分鐘,37°C)或高濃度(6微摩爾,8分鐘,37°C) 的CFSE(熒光染料)標(biāo)記分離的脾細(xì)胞。用高濃度CFSE標(biāo)記的組,用5微摩爾SIINFEKL 肽段(卵白蛋白特異肽段,NeoMPS,有限公司,圣地亞哥,CA)預(yù)加載(60分鐘,37°C)。用低 濃度CFSE標(biāo)記的組,用5微升LCMV gp33_41肽段(卵白蛋白非特異肽段,NeoMPS,有限公 司,圣地亞哥,CA)預(yù)加載(60分鐘,37°C)。靶細(xì)胞以低濃度CFSE加載細(xì)胞與高濃度CFSE 加載細(xì)胞之間的比例為47/53的終比例混合(每100微升共2 X IO7個(gè)細(xì)胞),在第10天 時(shí)靜脈注射到每只免疫過的小鼠體中。第11天時(shí)處死小鼠,收集脾細(xì)胞和眼靜脈竇血液樣 本。通過流式細(xì)胞儀分析,計(jì)算相對(duì)于對(duì)照組的肽段脈沖的靶細(xì)胞的平均存活率(高濃度 CFSE標(biāo)記)。細(xì)胞毒性活性用特異裂解百分率表示(100減去肽段脈沖靶細(xì)胞的平均存活 百分率)。圖1描述了免疫小鼠血液中靶細(xì)胞的特異裂解百分比。只有給藥Ova和PBS-96 或PBS-14導(dǎo)致了 Ova特異靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性裂解。相反,給藥PBS-Il沒有導(dǎo)致細(xì)胞的特 異裂解。實(shí)施例2 在小鼠模型中比較靜脈注射和肌內(nèi)注射PBS-96、PBS-14、PBS-IU PBS-57和α GalCer對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)作用為了確定測(cè)試佐劑化合物與抗原結(jié)合給藥時(shí),介導(dǎo)特異性體內(nèi)細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答 (CD8+)的能力,測(cè)試佐劑化合物用實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)一步分析。在第0天分別靜脈 免疫(第1-9組,每組3只)或肌內(nèi)免疫(第10-18組,每組3只)的18組小鼠為組1 :400微克Ova溶于100微升PBS中,靜脈注射組2 1微克α GalCer溶于100微升PBS中,靜脈注射組3 1微克PBS-57溶于100微升PBS中,靜脈注射
11
組4 1微克PBS-14溶于100微升PBS中靜脈注射組5 1微克PBS-96溶于100微升PBS中靜脈注射組6 400微克Ova+Ι微克α GalCer溶于100微升PBS中,靜脈注射組7 400微克Ova+Ι微克PBS-57溶于100微升PBS中,靜脈注射組8 400微克Ova+Ι微克PBS-14溶于100微升PBS中,靜脈注射組9 400微克Ova+Ι微克PBS-96溶于100微升PBS中,靜脈注射組10 400微克Ova溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組11 :1微克α GalCer溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組12 :1微克PBS-57溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組13 :1微克PBS-14溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組14 1微克PBS-96溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組15 400微克Ova+Ι微克α GalCer溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組16 400微克Ova+Ι微克PBS-57溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組17 400微克Ova+Ι微克PBS-14溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射組18 400微克Ova+Ι微克PBS-96溶于50微升PBS中,肌內(nèi)注射靶細(xì)胞以低濃度CFSE加載的細(xì)胞與高濃度CFSE加載的細(xì)胞之間的比例為50/50 的終比例混合(各濃度1XIO7個(gè)細(xì)胞,每100微升共2 X IO7個(gè)細(xì)胞),在第10天時(shí)靜脈注 射到每只免疫過的小鼠體中。第11天時(shí)處死小鼠,收集脾細(xì)胞和眼靜脈竇血液樣本。OVA 特異性靶細(xì)胞的細(xì)胞裂解,用外周血細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)。特異性細(xì)胞裂解按如上所 述的方法確定。圖2展示了靜脈注射小鼠的結(jié)果。單獨(dú)用Ova處理的小鼠的平均的Ova特異的細(xì) 胞毒性應(yīng)答為11. 8 士 14. 4 %,Ova和α GalCer為79. 9 士. 8 %,在用Ova和PBS-57處理的小 鼠中為88. 1 士6. 2%,在用Ova和PBS-14處理的小鼠中為83. 3士6. 1%,在用Ova和PBS-96 處理的小鼠中為89. 2士 10. 3%。結(jié)果表明PBS-14和PBS-96與PBS-57在介導(dǎo)體內(nèi)OVA特
異的細(xì)胞毒性應(yīng)答中效果一致。圖3展示了肌內(nèi)注射小鼠的結(jié)果。單獨(dú)用Ova處理的小鼠的平均的Ova特異的 細(xì)胞毒性應(yīng)答為1. 60士 14. 33%,在用Ova和α GalCer處理的小鼠中為-5. 85士 11. 01 %, 在用Ova和PBS-57處理的小鼠中為56. 11 士 13. 34%,在用Ova和PBS-14處理的小鼠中為 52. 07士29. 56%,在用Ova和PBS-96處理的小鼠中為50. 29士42. 6%。結(jié)果證明PBS-14 和PBS-96都與PBS-57在靜脈注射和肌內(nèi)注射中引起免疫應(yīng)答中效果一致,并且PBS-14、 PBS-96和PBS-57在肌內(nèi)注射后比α GalCer有效得多。實(shí)施例3 通過佐劑檢測(cè)化合物在體內(nèi)刺激IFN γ為了測(cè)試佐劑檢測(cè)化合物(adjuvant test conpounds)在體內(nèi)刺激細(xì)胞因子釋 放的能力,C57BL/6小鼠通過靜脈給予不同濃度的化合物,24小時(shí)后用ELISA檢測(cè)血清中 IFNy的生產(chǎn)量。每組3只小鼠,按如下所述在第0天靜脈(尾靜脈)接種組1 單獨(dú)的100微升PBS組2 1微克α GalCer溶于100微升PBS中組3 100納克α GalCer溶于100微升PBS中組4 1納克α GalCer溶于100微升PBS中
組5
組6
組7
組8
組9
組10
組11
組12
組13
組14
組15
組16
組17
組18
組19
組20
組21
接種
0. 1納克PBS-57溶于100微升PBS中 100內(nèi)克PBS-57+400微克Ova溶于100微升PBS中 1微克PBS-14溶于100微升PBS中 100納克PBS-14溶于100微升PBS中 1納克PBS-14溶于100微升PBS中 0. 1納克PBS-14溶于100微升PBS中 100內(nèi)克PBS-14和400微克Ova溶于100微升PBS中 1微克PBS-96溶于100微升PBS中 100內(nèi)克PBS-96溶于100微升PBS中 1納克PBS-96溶于100微升PBS中 0. 1納克PBS-96溶于100微升PBS中 100納克PBS-96和400微克Ova溶于100微升PBS中。 接種24小時(shí)后,收集小鼠血液樣品,IFNy水平用ELISA試劑盒來檢測(cè)。使 用了兩個(gè)ELISA試劑盒,Quantikine小鼠IFN Y (RD系統(tǒng))用于檢測(cè)所有的組,而 ELISAmIFNy (Diaclone)用于檢測(cè)組 1、2、3、6、7、8、11、12、13、16、17、18 和 21。所有的血清 在用于ELISA前按如下所述進(jìn)行稀釋
組1 組4 組7 組10 組13 組16 組19
1/1 1/20 1/50 1/10
50 50 20
組2 組5 組8 組11 組14 組17 組20
1/50 1/10 1/50 1/50
20 50 10
組3 組6 組9 組12 組15 組18 組21
1/50 1/50 1/20 1/50
10 50 50
結(jié)果以血清中IFNy濃度(皮克/毫升)表示,并考慮到稀釋比例。圖4描述了 用RD系統(tǒng)的Quantikine小鼠IFN γ試劑盒得到的結(jié)果。圖4Α描述了接種PBS-57小鼠血 清中,IFNy水平的結(jié)果;圖4Β描述了接種PBS-14小鼠血清中,IFNY水平的結(jié)果;圖4C 描述了接種PBS-96小鼠血清中,IFNy水平的結(jié)果;圖4D描述了接種α GalCer小鼠血清 中,IFNy水平的結(jié)果。在0. 1納克處,所有的佐劑候選物都誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放,但是接種 α GalCer的小鼠產(chǎn)生的IFN γ是接種PBS_57、PBS_14或PBS-96的三分之一到四分之一(分 別為 1540. 57士397. 53 皮克 / 毫升,4398. 05士880. 86 皮克 / 毫升,6669. 31 士 1231. 82 皮克 /毫升,5823. 33士720. 69皮克/毫升)。在使用1納克測(cè)試佐劑化合物時(shí),PBS_57、PBS_14 或PBS-96(平均值分別是11425. 98士833. 04皮克/毫升,7481. 15士3454. 03皮克/毫升, 6271. 95 士 3737. 53皮克/毫升)表現(xiàn)出比α GalCer更強(qiáng)的應(yīng)答(平均值3802. 99 士 586. 02 皮克/毫升)。在使用100納克測(cè)試佐劑化合物時(shí),PBS-57、PBS-14和PBS-96產(chǎn)生了比α GalCer高的IFNy水平(平均值分別是PBS-57的21432. 76士4312. 76皮克/毫升, PBS-96 的 19679. 89士 1443. 48 皮克 / 毫升,PBS-14 的 19582. 18士3421. 20 皮克 / 毫升, α GalCer的7714. 37士3529. 07皮克/毫升)。在1使用微克測(cè)試化合物時(shí),與100納克的 劑量(21432. 76士4312. 76皮克/毫升)相比,PBS-57表現(xiàn)出較低的應(yīng)答(3353. 45士867. 57 皮克/毫升),同時(shí),與100納克劑量相比(應(yīng)答分別是19582. 18士3421. 20皮克/毫升和 19679. 89士 1443. 48皮克/毫升),PBS_14或PBS-96仍然表現(xiàn)出較低但是穩(wěn)定的應(yīng)答(分 別是 16392. 53士5957. 70 皮克 / 毫升和 17720. 11 士2869. 97 皮克 / 毫升)。另外一組小鼠用于通過上述方法比較佐劑化合物在體內(nèi)刺激細(xì)胞因子釋放的能 力。5組C57BL/6小鼠靜脈給予在100微升PBS中的100納克的PBS-57、PBS-14、PBS-96、 或PBS-11,或者單獨(dú)給予100微升PBS。24小時(shí)后用ELISA測(cè)定小鼠血清中IFNy的產(chǎn)生 量。圖5描述了接種IOOng的PBS-11、PBS-96、PBS-14和PBS-57的小鼠的結(jié)果。總之,使用PBS-14和PBS-96具有與使用PBS-57相似的IFN γ應(yīng)答,并且與使用 PBS-Il相比,具有意想不到的較強(qiáng)的應(yīng)答。實(shí)施例4 :PBS-96、PBS-14、PBS-Il和PBS-57對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)的比較為了確定測(cè)試佐劑化合物結(jié)合抗原誘導(dǎo)體內(nèi)特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(CD8+)的 能力,該測(cè)試化合物按實(shí)施例1中的方法進(jìn)行測(cè)試。9組小鼠按如下所述在第0天經(jīng)靜脈 (IV)免疫組1 :400微克Ova溶于100微升PBS中;組2 :1微克PBS-Il溶于100微升PBS中;組3 1微克新式PBS-57溶于100微升PBS中;組4 1微克PBS-14溶于100微升PBS中;組5 1微克PBS-96溶于100微升PBS中;組6 400微克Ova+Ι微克PBS-11溶于100微升PBS中;組7 400微克Ova+Ι微克新式PBS-57溶于100微升PBS中;組8 400微克Ova+Ι微克PBS-14溶于100微升PBS中;組9 400微克Ova+Ι微克PBS-96溶于100微升PBS中。靶細(xì)胞,以低濃度CFSE加載的細(xì)胞/高濃度CFSE加載的細(xì)胞為50/50的終比例 混合(各濃度1 X IO7細(xì)胞,每100微升共2 X IO7細(xì)胞),在第10天時(shí)靜脈注射到每只免疫 過的小鼠體中。第11天時(shí)處死小鼠,收集脾細(xì)胞和眼靜脈竇血液樣本。OVA特異靶細(xì)胞的 細(xì)胞裂解,通過外周血細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)。特異細(xì)胞裂解按如上所述的方法確定。 結(jié)果見圖6。單獨(dú)用Ova處理的小鼠的平均Ova特異細(xì)胞裂解為11. 8士 14. 4%,用Ova和 PBS-Il處理的小鼠為32. 3士2. 5%,用Ova和PBS-57處理的小鼠為88. 1 士6. 2%,用Ova和 PBS-14處理的小鼠為83. 3士6. 1 %,用Ova和PBS-96處理的小鼠為89. 2士 10. 3%。這些結(jié) 果證明在與抗原結(jié)合經(jīng)靜脈給予后,PBS-14和PBS-96介導(dǎo)的體內(nèi)細(xì)胞毒性應(yīng)答與PBS-57 一樣有效。實(shí)施例5 通過減少肌內(nèi)注射佐劑數(shù)量比較CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)為了確定測(cè)試佐劑化合物增強(qiáng)免疫應(yīng)答的相對(duì)能力,進(jìn)行了與實(shí)施例2相似的實(shí) 驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中,小鼠用減少量的佐劑(分別是10納克和100納克)與50微克OVA抗原, 在第0天,按如下安排進(jìn)行靜脈注射。0121]實(shí)驗(yàn)A:
0122]組1 :50微克Ova溶于100微升PBS中
0123]組2 100 納克 α GalCer ;
0124]組3 :100 納克 PBS-Il
0125]組4 :100 納克 PBS-14
0126]組5 :100 納克 PBS-57
0127]組6 :100 納克 PBS-96
0128]組7 50 微克 0va+100 納克 α GalCer ;
0129]組8 :50 微克 0va+100 納克 PBS-Il ;
0130]組9 :50 微克 0va+100 納克 PBS-14 ;
0131]組10 :50 微克 0va+100 納克 PBS-57 ;
0132]組11 :50 微克 0va+100 納克 PBS-96 ;
0133]實(shí)驗(yàn)B:
0134]組1 :50微克Ova溶于100微升PBS中
0135]組2 :10 納克 α GalCer ;
0136]組3 :10 納克 PBS-Il
0137]組4 :10 納克 PBS-14
0138]組5 :10 納克 PBS-57
0139]組6 :10 納克 PBS-96
0140]組7 50 微克 Ova+10 納克 α GalCer ;
0141]組8 :50 微克 0va+10 納克 PBS-Il ;
0142]組9 :50 微克 0va+10 納克 PBS-14 ;
0143]組10 :50 微克 0va+10 納克 PBS-57 ;
0144]組11 :50 微克 0va+10 納克 PBS-96 ;
0145]靶細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)的第10天給藥,第11天收集血液。圖7表示用100微克每種佐劑實(shí) 驗(yàn)A的結(jié)果。圖8表示實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果。圖7和圖8證明,以低劑量以肌內(nèi)給藥時(shí),與其它佐 劑相比,PBS-14和PBS-96在增強(qiáng)對(duì)抗原的⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答上具有意料不到的好效果。事實(shí) 上,在肌內(nèi)給藥OVA和只給藥10納克的PBS-14或PBS-96后,通過⑶8+T細(xì)胞的靶細(xì)胞的 特異裂解百分率仍然高于60%,同時(shí),給藥OVA和相同數(shù)量的PBS-57、PBS-Il或α GalCer 后,靶細(xì)胞的特異裂解百分率與對(duì)照無差別。實(shí)施例6 肌內(nèi)注射后通過減少佐劑的量比較CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)為了驗(yàn)證用如上實(shí)施例中描述的體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)得到的結(jié)果,進(jìn)行了相似的實(shí) 驗(yàn),通過用五聚體試驗(yàn),檢測(cè)OVA特異的⑶8+Τ細(xì)胞的百分比來確定⑶8+Τ細(xì)胞的活化。簡(jiǎn) 要說,小鼠用所述OVA和測(cè)試佐劑化合物,分別以1微克或100納克,在第0天進(jìn)行肌內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)Α:組1:100 微升 PBS組2 :50微克Ova溶于100微升PBS中組3 :50 微克 Ova+Ι 微克 α GalCer
組4 :50 微克 Ova+Ι 微克 PBS-Il組5 :50 微克 Ova+Ι 微克 PBS-14組6 :50 微克 Ova+Ι 微克 PBS-57組7 :50 微克 Ova+Ι 微克 PBS-96實(shí)驗(yàn)B:組1:100 微升 PBS組2 :50微克Ova溶于100微升PBS中組3 50 微克 0va+100 納克 α GalCer組4 :50 微克 0va+100 納克 PBS-Il組5 :50 微克 0va+100 納克 PBS-14組6 50 微克 0va+100 納克 PBS-57組7 50 微克 0va+100 納克 PBS-96第二次注射在第14天對(duì)小鼠實(shí)施,血液在第21天收集。收集淋巴細(xì)胞并在FACS 上用H-2Kb SIINFEKL五聚體和⑶8抗體分析,以檢測(cè)對(duì)OVA發(fā)生應(yīng)答的⑶8+T細(xì)胞。圖9 表示實(shí)驗(yàn)A的結(jié)果,圖10表示實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果。圖9證明了在接種后,給藥1微克PBS-14、 PBS-96和PBS-57增強(qiáng)了 OVA特異的CD8+T細(xì)胞的百分率,而PBS-Il和α GalCer并不同樣 有效。圖10證明了在100納克的低濃度下,PBS14和PBS-96在增強(qiáng)⑶8+Τ細(xì)胞對(duì)抗原應(yīng) 答上意想不到地好于PBS-57、PBS-Il和α GalCer0實(shí)施例7 肌內(nèi)注射佐劑和抗原后體液應(yīng)答增強(qiáng)的比較。為了衡量體液免疫應(yīng)答和CD4+T輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答,通過給藥測(cè)試佐劑和抗原是 否也增強(qiáng),在用加入有OVA和未加入有OVA的測(cè)試佐劑接種的小鼠中,檢測(cè)了 IgGl和IgG2a 抗體應(yīng)答。按如下設(shè)計(jì),單獨(dú)使用50微克OVA或與100納克的所述佐劑的結(jié)合(弗氏佐劑 用做陽(yáng)性對(duì)照)肌內(nèi)注射小鼠(每組6只)組1 :500 微克 Ova+CFA/IFA (陽(yáng)性對(duì)照)組2:50 微克 Ova組3 50 微克 Ova 十 100 納克 α GalCer組4 :50 微克 0va+100 納克 PBS-Il組5 :50 微克 0va+100 納克 PBS-14組6 50 微克 0va+100 納克 PBS-57組7 50 微克 0va+100 納克 PBS-96注射后14天,收集血液樣本,用OVA同型IgGl或IgG2a特異的鼠單克隆抗體,進(jìn)行 IgGl和IgG2a的ELISA。以外周血中抗體(納克/毫升)的效價(jià)表示結(jié)果。圖11描述了 IgGl的結(jié)果,圖12描述了 IgG2a的結(jié)果。如圖11所示,與單獨(dú)接種OVA或OVA與PBS-Il 或α GalCer結(jié)合相比,PBS-14,PBS-96和PBS-57都能引起IgGl的穩(wěn)定效價(jià),并增強(qiáng)了 OVA 特異的IgGl效價(jià)。出乎意料地,PBS-14和PBS-96增強(qiáng)了 OVA特異的IgG2效價(jià)的效果,大 致與弗氏佐劑相同,但好于PBS-57。雖然在示例性的實(shí)施方式中描述了本發(fā)明的組合物和方法,但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言,在不背離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍的情況下,顯而易見的是,在本組合物和方法、以及 在所述方法的步驟或者步驟的順序,可以進(jìn)行多種改變。更詳細(xì)地說,顯而易見的是,在化學(xué)上和生理上相關(guān)的特定的藥劑可以替代此處所述的藥劑,從而達(dá)到相同或相近的結(jié)果。 所有這種對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的相似的替代物和修飾物,在本發(fā)明的精神、范圍和 內(nèi)容以內(nèi)。此外,此處列出和描述的所有專利和出版物都的全文引入作為參考。如本說明書和附加的權(quán)利要求所描述的,除了在內(nèi)容中特別說明以外,單數(shù)形式 “一個(gè)”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)指示對(duì)象。因此,例如,參照一種含有“一種多核苷酸”的組合物, 包括兩種或兩種以上的多核苷酸的組合物的混合物。還需指出的是,除了在內(nèi)容中特別說 明以外,術(shù)語(yǔ)“或”通常包括“和/或”的意思。本說明書中所有參考的出版物、專利和專利 申請(qǐng)書是為說明本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平。所有的出版物、專利和專利申 請(qǐng)書在此明確地全文引入作為參考,就如同每個(gè)相同內(nèi)容的單獨(dú)出版物或?qū)@暾?qǐng)被詳細(xì) 地和獨(dú)立地以參考文獻(xiàn)展示一樣。如果本發(fā)明與引入的出版物、專利和專利申請(qǐng)書發(fā)生抵 觸,以本發(fā)明的公開為準(zhǔn)。需要詳細(xì)了解的是,在此敘述的所有數(shù)值包括從低值到高值的所有數(shù)值,也就是 所有在最低值和最高值之間的數(shù)值組合,都在本申請(qǐng)中的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種含有式I所示化合物的組合物其中,R1為H或 OH;R2為H或 OH;x為18 26的整數(shù);n為10 15的整數(shù)。FSB00000218785400011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中,χ為23。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物,其中,χ為21。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)所述的組合物,其中,η為13。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的組合物,其中,該組合物還含有抗原。
6.一種藥物組合物,其中,該藥物組合物含有抗原和權(quán)利要求1所述的組合物。
7.一種增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法,其中,該方法包括對(duì)受試者給藥抗原 和權(quán)利要求1所述的組合物,其中,與對(duì)照對(duì)抗原的免疫應(yīng)答相比,所述受試者對(duì)抗原的免 疫應(yīng)答增強(qiáng)。
8.一種增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法,其中,該方法包括對(duì)受試者肌內(nèi)給藥 抗原和權(quán)利要求1所述的組合物,其中,與對(duì)照對(duì)抗原的免疫應(yīng)答相比,所述受試者對(duì)抗原 的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法,其中,與對(duì)照相比,所述受試者的免疫應(yīng)答增強(qiáng)了 至少50%。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法,其中,與對(duì)照相比,所述受試者的免疫應(yīng)答增強(qiáng)了 至少100%。
11.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法,其中,與對(duì)照相比,所述受試者的免疫應(yīng)答增強(qiáng)了 至少1000% O
12.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法,其中,所述抗原和權(quán)利要求1所述的組合物聯(lián)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12中的任意一項(xiàng)所述的方法,其中,所述組合物的給藥方式選自 由以下方式組成的組中經(jīng)靜脈、經(jīng)肌肉、經(jīng)皮下、經(jīng)皮內(nèi)、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)鼻內(nèi)和經(jīng)吸入。
14.一種增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答的方法,其中,該方法包括對(duì)受試者給藥 抗原和權(quán)利要求1所述的組合物,其中,與對(duì)照對(duì)抗原的免疫應(yīng)答相比,所述受試者對(duì)抗原 的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中,所述體液免疫應(yīng)答包括IgG抗體的產(chǎn)生。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中,所述體液免疫應(yīng)答包括IgA抗體的產(chǎn)生。
17.一種增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的方法,其中,該方法包括對(duì)受試者給 藥抗原和權(quán)利要求1所述的組合物,其中,與對(duì)照對(duì)抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答相比,所述的受 試者對(duì)抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,其中,增強(qiáng)的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答包括CD4+T淋巴細(xì)胞的 激活。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中,CD4+T淋巴細(xì)胞的激活包括Thl免疫應(yīng)答的增加。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中,CD4+T淋巴細(xì)胞的激活包括Th2免疫應(yīng)答的增加。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中CD4+T淋巴細(xì)胞的激活包括Thl免疫應(yīng)答和Th2 免疫應(yīng)答的增加。
22.一種增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法,其中,該方法包括對(duì)受試者給藥 抗原和權(quán)利要求1所述的組合物,其中,與對(duì)照對(duì)抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答相比,所述受試者 對(duì)抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中,增強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答包括CD8+T淋巴細(xì)胞的激活。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法,其中,CD8+T淋巴細(xì)胞的激活包括細(xì)胞毒性應(yīng)答的增加。
25.一種增強(qiáng)受試者的抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的激活的方法,其中,該方法包括對(duì)受試者 給藥抗原和權(quán)利要求1所述的組合物,其中,與對(duì)照的呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的激活相比,所述受 試者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
全文摘要
在此提供了一種含有式I化合物的組合物。還提供了一種通過給藥抗原和所述組合物來增強(qiáng)受試者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法。增強(qiáng)了的免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答、CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答、或者導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞的激活。還提供了通過肌內(nèi)注射抗原和含有式I所述化合物的組合物來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)C07H5/06GK101917985SQ200880119602
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
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