專利名稱：：阿霉素與乳糖胺化白蛋白的軛合物的用途的制作方法阿霉素與乳糖胺化白蛋白的輒合物的用途本發(fā)明的目的是阿霉素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用于制備治療不表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的肝細胞癌(HCC)的藥物組合物的用途。該軛合物的制備和研究先前只用于治療表達ASGP-R的HCC,現(xiàn)在其意外的顯示出還具有治療沒有受體的HCC的有利用途的潛力。因此，含有該輒合物的組合物可以對所有的HCC施用，而不必經(jīng)過預(yù)先腫瘤組織活檢來證明受體存在與否。在之前的實驗中我們耦合阿霉素(DOXO)和乳糖胺化人白蛋白(L-HSA)以增強藥物的抗癌癥活性并降低其治療那些細胞表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的肝細胞癌的毒副反應(yīng)(DiStefanoG，etal.Doxorubicincoupledtolactosaminatedhumanalbumin...DigLiverDis2003;35;428隱433;FiumeL,etal.Doxorubicincoupledtolactosaminatedalbumin...JHepatol2005;43;645-652)。HCC是抗化療試劑的肺瘤；DOXO具有抗HCC活性，但是在有效劑量下顯示了嚴重的不良反應(yīng)(LlovetJM.Updatedtreatment...JGastroenterol2005;40:225-235)。DOXO的毒害效應(yīng)主要產(chǎn)生在心臟、骨髓和腸(MazueG，etal.Anthracydines:areview...IntJOncol1995;7:713-26)。ASGP-R僅存在于肝細胞的表面。其介導(dǎo)半乳糖基末端肽段的吞噬和溶酶體降解(AshwellGetal.Carbohydrate-specific…AnnuRevBiochem1982;51:531-534),并能用作載體來選擇性地將藥物傳遞到肝實質(zhì)細胞(FiumeL,etal.Livertargetingofantiviralnucleosideanalogsthroughtheasialoglycoproteinreceptor.JViralHep1997;4:363-370)。L-HSA是一種半乳糖基末端的擬糖蛋白，其已經(jīng)成功用作人體內(nèi)的肝耙向藥物載體(TorraniCerenziaMR,etal.Adeninearabinosidemonophosphate...Hepatology1996;23:657-661;ZarskiJP,etal.EfficacyandsafetyofL-HSA-ara-AMP...JHepatol2001;34:487-488)。DOXO通過酸敏感的腙鍵耦合到L-HSA,該鍵允許DOXO從包涵體和溶酶體內(nèi)的載體上月包內(nèi)釋》文出來(GreenfieldRS,etal.Evaluationinvitroofadriamycin...CancerRes1990;50:6600-6607)。(該共輒步驟由Bologna大學提交的一份專利覆蓋(PCT/IT2005/000257)。ASGP-R保持在大部分高分化(WD)的人HCC瘤細胞上，然而在大部分低分化(PD)HCC上卻并不表達(HyodoI,etal.Distributionofasialoglyc邵.rote.in.recepto:r…Liver1993;13:80-85;TrereD,etal.Theasialoglycoproteinreceptor...BrJCancer1999;81:404-408;Sawa.muraT,etal,"Hyperasialoglycoproteinemiainpatients..."Gastroenterology1984;87:1217-1221)。人HCC上的ASGP-R的存在與否可以通過針刺活檢或外科手術(shù)切除的腫瘤碎片進行免疫組化來測定。在二乙基亞硝胺誘發(fā)HCC的大鼠中，已經(jīng)在所有7種高分化腫瘤中發(fā)現(xiàn)了通過ASGP-R內(nèi)在化L-HSV的能力，在5種中度分化腫瘤中有4種具有該能力，而在5種低分化HCC中僅觀察到2種能捕獲L-HSA的低能力(DiStefanoG,etal.EnhanceduptakeoflactosaminatedL,LiverInt2005;25:854-860)。在放射性L-HSA-DOXO的HCC分布和大鼠器官分布實驗中，我們得到2個意外且相關(guān)的觀察結(jié)果1-PDHCC內(nèi)化輒合物的量是L-HSA的3倍2-在所有類型的HCC中，無論它們的分化程度，軛合物產(chǎn)生的高濃度DOXO是那些在腸和心臟中測定的5-8倍。材料和方法L[14C]HSA-DOXO的合成和表征人白蛋白(HSA)從Kedrion處獲得(Lucca,Italy),用SephacrylS-200HR(Sigma,StLouis,MO，USA)凝膠過濾并收集單體(>起始材料的90%)使用。HSA用["C]蔗糖標記。["C]蔗糖是一種放射性示蹤劑，其會保留在進入的細胞內(nèi)，從而允許準確測定組織中的蛋白攝取(PittmanRC,etal,"Radiolabeledsucrose..."JBiolChem.1979;254:6876-6879)。[14C]蔗糖(500mCi/mmol,Amersham,Buckinghamshire,UK)稀釋至特異活性3.2xl05dpm/嗎。根據(jù)PittmanRC等("Radiolabeledsucrose..."JBiolChe亂1979;254:6876-6879)，將["C]蔗糖耦合到HSA上。因為該方法會引起蛋白寡聚，因此對標記的HSA進行SephacrylS200HR柱凝膠層析，同時收集單體(制備的70%)。根據(jù)LowryOH等("Proteinmeasurement..."JBiolChem.951;193:265-275),通過放射活性計數(shù)以及測定蛋白來測定["C]蔗糖/HSA的摩爾比，結(jié)果是0.2。通過還原胺化反應(yīng)(WilsonG."Effectof■reductivelactosamination…"JBiolChem1978;253:2070-2072)將a-享L糖(Sigma)耦合到["C]HSA上。根據(jù)DuboisM等人("Colorimetricmethodfordetermination..."AnalChem1956;28:350-356)的方法測定4唐來確定乳糖/["C]HSA的摩爾比，結(jié)果是26。采用藥物(DOXO-EMCH)的(6-馬來酰亞胺己酰)腙衍生物將DOXO耦合到L-[14C]HSA上，依據(jù)WillnerD等人的方法("(6-maleimidoca:proyl)hydrazonederivative..."BioconjChem1993;4:521-527)合成。根據(jù)DiStefanoG等人("Anovelmethodforcoupling..."EurJPharmSci2004;23:393-397)的方法耦合DOXO-EMCH和L-["C]HSA，這里附上供參考，但是使混合物在20。C反應(yīng)。根據(jù)LowryOH等(Proteinmeasurement...JBiolChem1951;193:265-275),測定蛋白濃度以及以X495的吸光度表示的DOXO[DOXO-EMCH的s495(pH7.4)=9250M"cm"]來計算DOXO/L-["C]HSA的摩爾比，結(jié)果是5.8(24mg軛合物中含有1mgDOXO;24mg軛合物中含有22.5mgL-HSA)。大鼠的HCC誘發(fā)；腫瘤和器官中軛合物和DOXO濃度的分布采用雄性Wistar大鼠，從HarlanItaly(Udine,Italy)處獲得，并在Bologna的實驗病理系的動物實驗室飼養(yǎng)。實驗方案通過Bologna大學倫理委員會的批準。持續(xù)8周在飲用水中加入二乙基亞硝胺(DENA)(100mg/L)以誘發(fā)HCC。在最后一天DENA施用后的6-8周，對動物進行靜脈注射以下化合物L-["C]HSA(22.5嗎/g)、L-["C]HSA-DOXO(24嗎/g,對應(yīng)于22.5(ig/gL-["C]HSA和1pg/gDOXO)和游離的DOXO(1fig/g)。在異氟烷麻醉下，化合物從陰莖背靜脈注射，注射量為10fil/10g體重。每種化合物使用4只大鼠。動物注射4小時后異氟烷麻醉下使大鼠致死。迅速轉(zhuǎn)移器官并冷凍，同時從肝周圍精確地將瘤結(jié)節(jié)分離出來。冷凍每種瘤結(jié)節(jié)的一部分；其他部分用10%的福爾馬林固定用于組織學處理。冷凍的器官和瘤結(jié)節(jié)樣品用于放射活性計數(shù)和測定DOXO水平。根據(jù)BotsAM等(Analysisofadriamycin…JChromatogr1983;272:421—127)的方法及其》務(wù)正方法(DiStefan.oG,etal.Doxorubicincoupledtolactosarninated…DigLiverDis2003;35:428-433)測定了DOXO。結(jié)果大鼠中，DENA誘發(fā)了高分化、中度分化和低分化形式的HCC(分別是WD、MD、PDHCC)。它們顯示與人HCC相吻合的組織特征。如DiStefanoG等("Enhanceduptakeoflactosaminated..."LiverInt2005;25:854-860)所描述的，WDHCC瘤性肝細胞與嗜酸性細胞質(zhì)是同形的；它們與其非瘤性的對應(yīng)部分形似，都具有帶梁的圖案和介入的血管空間。在PDHCC中，腫瘤組織顯示固體外形；瘤細胞呈嗜堿性細胞質(zhì)多態(tài)狀。MDHCC顯示的組織外形介于WD和PDHCC之間。表1顯示了HCC、心臟和腸中的L-["C]HSA和L-["C]HSA-DOXO的分布。與DiStefanoG等("Enhanceduptakeoflactosaminated..."LiverInt:2005;25:854-860)相一致，在6個檢查的PDHCC中，有4個的L-["C]HSA濃度比不表達ASGP-R(dpm/g/SA=9.1±0.1)的器官心臟和腸中測定的低。PDHCC內(nèi)在化軛合物L-["C]HSA-DOXO的量比L-["C]HSA高4倍(p=0.004，根據(jù)Student'st檢驗)，并且軛合物進入到所有7個檢查的PDHCC中，其量至少是心臟和腸中攝取的7倍。一個重要的發(fā)現(xiàn)是注射扼合物的動物中，DOXO的濃度比心臟和腸中測定的分別高8倍和5倍(p=0.006)。相反，注射游離藥物的動物中，心臟和腸中測定的DOXO濃度比HCC中測定的要高(表2)?？傊?，對比沒有輒合的DOXO,L-HSA-DOXO出現(xiàn)在所有類型的HCC中，其中的藥物濃度高于DOXO毒害效應(yīng)的靶向器官心臟和腸，并且獨立于腫瘤的分化程度和內(nèi)在化L-HSA的能力。因此，此前在治療保持內(nèi)在化暴露半乳糖基的蛋白質(zhì)的能力的HCC中，通過制備輒合物用于增強抗瘤效應(yīng)和減少DOXO毒性，而在本觀察結(jié)果的基礎(chǔ)上，該軛合物顯示了提高DOXO治療所有類型HCC的化療指數(shù)的潛力，包括低分化類型，其在肝外組織中顯示沒有或者^艮低的累積L-HSA的能力。因此，本發(fā)明的目的是L-SA-DOXO，且尤其是L-HSA-DOXO在治療所有HCC中的用途，無論其細胞是否表達ASGP-R。因此，授權(quán)的專利要求L-SA-DOXO軛合物在HCC化療中的用途，該用途不需要預(yù)先研究ASGP-R存在與否，從而避免進行腫瘤活4全和相應(yīng)的風險。而且，本專利要求保護L-SA-DOXO軛合物在不表達ASGP-R的HCC化療中的用途的權(quán)利。表1L-["C]HSA和L-[14C].HSA-DOXO在不同等級的H.CC、心臟和腸內(nèi)的分布化合物dpm/g/SAa)wdhccmdhccpdhcc心臟腸:l-[14c]hsab'178.3±12.485.6±4.432.6±14.98.7±0.98.9±1.5(6)d)(5)(6)l-[14c]hsa-180.9±27.8135.5±19.3124.8±20.29.0±0.89.8±0.8dox(:)c(10)m試驗的細節(jié)描述在材料和方法中。在靜脈注射化合物后4小時，殺死大鼠。對每一種化合物來說，使用4只動物。數(shù)據(jù)是平均值土標準誤差。a)SA=特異活性b)以22.5嗎/g的劑量注射L-[14C]HSA。c)以24|ig/g的劑量(24嗎含有22.5|igL-[14C]HSA和1嗎DOXO的軛合物)注射L-[14C]HSA-DOXO。d)檢驗的HCC的數(shù)目。表2在施用L-["C].H.SA-DOXO和游離的DOXO之后，在不同等級的HCC、心臟和腸內(nèi)測得的DOXO濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗的細節(jié)描述在材料和方法中。數(shù)據(jù)是平均值士標準誤差。a)在注射了軛合的DOXO的動物體內(nèi)測量了游離藥物，即從細胞內(nèi)的載體L-HSA釋放的。b)以24pg/g的劑量(24嗎含有1jigDOXO的軛合物)注射L-[14C]HSA-DOXO。c)以1ug/g的劑量注射DOXO。d)檢驗的HCC的數(shù)目。權(quán)利要求1.阿霉素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用于制備治療肝細胞癌的藥物組合物的用途，其中所述方法并不包括預(yù)先證明腫瘤細胞內(nèi)是否存在去唾液酸糖蛋白的受體。2.阿霉素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用于制備治療不表達去唾液酸糖蛋白受體的肝細胞癌的藥物組合物的用途。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于施用所述軛合物并不包括預(yù)先證明所述肺瘤細胞內(nèi)是否存在去唾液酸糖蛋白的受體。4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于所述乳糖胺化白蛋白是乳糖胺化人白蛋白。5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于所述藥物組合物通過非腸道途徑施用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述藥物組合物通過靜脈注射途徑、通過推注或通過輸注施用。7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于所述藥物組合物是水溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述水溶液含有賦形劑和/或藥學上可接受的輔佐劑。全文摘要本發(fā)明涉及阿霉素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用于制備治療不表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的肝細胞癌(HCC)的藥物組合物的用途。該軛合物的制備和研究先前只用于治療表達ASGP-R的HCC，現(xiàn)在其顯示出具有治療沒有受體的HCC的有利用途的潛力。因此，含有軛合物的組合物可以施用所有的HCC治療，而不必經(jīng)過預(yù)先腫瘤組織活檢來證明受體存在與否。文檔編號A61K47/48GK101267842SQ200680034375公開日2008年9月17日申請日期2006年9月19日優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日發(fā)明者朱賽平娜·狄·史蒂凡諾,路奇·費歐密申請人:博洛尼亞大學病理學研究學院