專利名稱：：具有抗癌性能的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并具有抗癌性能的化合物。技術(shù)背景本說明書中對于文獻(xiàn)、行為或知識的引用或討論并非承認(rèn)該文獻(xiàn)、行為或知識或其任意組合在優(yōu)先日時構(gòu)成公知的知識的一部分，或已知與本說明書涉及的問題的解決相關(guān)?，F(xiàn)在，數(shù)百萬人與癌癥相伴或己患癌癥。每年超過1百萬的人患有癌癥。任何人任何年齡都有可能患癌；不過，約77%的確診的患癌年齡一般在55歲以上。男人三種最常見的癌癥為前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌。女人易患的三種常見癌癥為乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌。癌癥發(fā)展時體內(nèi)部分細(xì)胞的生長失去控制。盡管有許多種癌癥，這些癌癥的發(fā)生都是由于異常細(xì)胞的生長失去了控制。正常的體細(xì)胞的生長、分裂或死亡是有順序的。在人生命的早期，正常的細(xì)胞分裂得很快，直至成年。之后，體內(nèi)大部分細(xì)胞的分裂只是為了替換老化或死亡的細(xì)胞，以及修復(fù)傷痕。由于癌細(xì)胞持續(xù)生長和分裂，這和正常的細(xì)胞不同。癌細(xì)胞不僅不死亡，而且它們比正常細(xì)胞的壽命長，并持續(xù)形成新的異常細(xì)胞。當(dāng)這些細(xì)胞妨礙重要器官的正常功能或遍布全身而破壞重要系統(tǒng)時，可以殺死這些細(xì)胞。越早發(fā)現(xiàn)癌癥并進(jìn)行治療，越容易延長壽命數(shù)年。由于DNA的破壞，癌細(xì)胞得到了發(fā)展?；鸲鄶?shù)情況下，DNA破壞時身體能夠修復(fù)。在癌細(xì)胞內(nèi)，破壞的DNA沒有被修復(fù)。人能夠遺傳受損的DNA，這就解釋了遺傳性的癌癥。很多時候，人的DNA在一些環(huán)境如吸煙的環(huán)境時受到破壞。改變?nèi)说纳罘绞娇梢越档痛蠖鄶?shù)癌癥的風(fēng)險，例如，戒煙和良好的飲食習(xí)慣。當(dāng)癌細(xì)胞生長和替換正常組織時，癌細(xì)胞經(jīng)常轉(zhuǎn)移到身體的其它部位。這種稱之為轉(zhuǎn)移的過程在癌細(xì)胞進(jìn)入身體血液或淋巴器官時發(fā)生。細(xì)胞擴(kuò)散到血液中的原位腫瘤細(xì)胞僅在一些特定的器官、而不是所有的器官生長。至少有200種不同的癌癥。這些癌癥幾乎可以在任何器官、流體或組織中發(fā)展。不同類型的癌癥表現(xiàn)差異很大。這就是癌癥患者為什么治療需要根據(jù)特定的癌癥進(jìn)行。治療癌癥主要的四種方法為外科手術(shù)、輻射、化療和生物療法。也有激素療法如三苯氧胺和器官移植如骨髓移植。根據(jù)癌癥的種類和不同階段，治療也不一樣。癌癥的階段指的是癌癥的進(jìn)展及腫瘤是否從原位擴(kuò)散。如果癌癥被限制在一個位置并沒有擴(kuò)散，治療的手段可以是手術(shù)治療。如果癌癥不能用手術(shù)除去，則治療的方法可以選擇輻射、化療或兩者。一些癌癥需要結(jié)合手術(shù)、輻射和化療。手術(shù)和輻射療法用于治療局部癌的治療，而化療用于治療癌細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)移(擴(kuò)散)到體內(nèi)其它部分的癌癥。根據(jù)癌癥的類型和發(fā)展階段，化療可以用于癌癥的治愈，以防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散，從而減慢癌癥的生長，以及用于殺死可能會擴(kuò)散到體內(nèi)其它部分的癌細(xì)胞，或者用于減輕癌癥癥狀?；煹母弊饔萌Q于藥物的類型、藥量和治療時間。最常見的副作用是惡心和嘔吐、脫發(fā)、感染機(jī)會增加，以及疲勞。這些副作用可能是不舒服的或者令人情緒煩躁。不過，大多數(shù)的副作用可以通過藥物、照料或改變治療計劃得到控制。不過，現(xiàn)實中仍然需要副作用較小的化療藥物用于治療癌癥以改進(jìn)現(xiàn)有的治療方法。番茄紅素番茄紅素，一種開鏈的不飽和類胡蘿卜素，沒有維他命A的活性，存在于許多水果和蔬菜中。番茄紅素為紅色、脂溶性的色素，可以使得西紅柿、番石榴、玫瑰果、西瓜和粉紅葡萄柚呈現(xiàn)紅色。番茄紅素證實為一種抗氧化劑。在身體內(nèi)，番茄紅素沉積在肝臟、肺、前列腺、結(jié)腸和皮膚上。體內(nèi)番茄紅素的濃度趨向高于所有其它類胡蘿卜素(其約占人體血清中所有類胡蘿卜素的50%)。研究表明，如果西紅柿加工成果醬、果汁、果泥和調(diào)味番茄醬，其中的番茄紅素更容易被體內(nèi)吸收。西紅柿中發(fā)現(xiàn)的番茄紅素的化學(xué)形式在加工時由于溫度的變化而發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而更容易被體內(nèi)吸收。在美國的飲食中，西紅柿是第四種最常用的新鮮蔬菜和最常消費(fèi)的罐裝蔬菜。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明增加西紅柿的消費(fèi)和降低心血管疾病和前列腺癌之間有關(guān)聯(lián)。正在進(jìn)行的初始研究表明番茄紅素和降低黃斑變性疾病、血清脂質(zhì)氧化、以及肺、膀胱、子宮頸、皮膚、消化道、乳腺和前列腺癌的發(fā)生有關(guān)系。研究正在考查番茄紅素的其它潛在功效。生育酚磷酸酯維生素E被認(rèn)為具有改善健康的多種有益性能，包括抗氧化性能。一般認(rèn)為維生素E包括8種不同的形式ct、P、Y、S生育酚和ci、3、Y、S生育三烯酚。生育酚和生育三烯酚不同，因為生育酚有飽和的葉綠基側(cè)鏈，而不是不飽和的異戊二烯基側(cè)鏈。該四種形式和色原垸醇基團(tuán)(三種a、兩種p和Y、一種S)上的許多甲基不同。在國際專利申請WO03/026673中，其公開說明增加維生素的貯存水平，包括生育酚磷酸酯，對減輕或治療癌癥有好處，其中生育酚可以影響細(xì)胞黏附。不過，該專利申請沒有公開引起細(xì)胞死亡的生育酚磷酸酯，或者a生育酚和S、Y生育酚之間的活性差異。生育酚磷酸酯已經(jīng)在國際專利申請WO2004/064831公丌，該公丌認(rèn)為生育酚磷酸酯具有和抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增殖、光滑肌細(xì)胞的增殖、CD36受體表達(dá)和氧化LDL吸收相關(guān)的性能。實施例僅僅表明了對細(xì)胞生長的抑制，且沒有公開細(xì)胞死亡。而且，該申請沒有治療癌癥或a生育酚和S、Y生育酚之間的活性差異。國際專利申請WO00/16772和WO03/039461教導(dǎo)了自然生成的a、e、y、S生育酚和a、P、y、S生育三烯酚具有抗癌活性。不過，a生育酚沒有抗癌活性。而且，這些申請公開了生育酚類化合物的過磷酸酯衍生物可以用于治療癌癥。試圖關(guān)聯(lián)自由生育酚的吸收和癌癥發(fā)生之間的關(guān)系的人體試驗和考査通常是非決定性的，自由生育酚不是癌癥治療的臨床選擇?，F(xiàn)實仍需要癌癥的改進(jìn)治療方法。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)已令人驚異的發(fā)現(xiàn)，7，8-二甲基-6-羥基色原烷和8-甲基-6-羥基色原烷(S和Y羥基色原烷)的磷酸酯衍生物可以使得細(xì)胞凋亡，從而能夠用于治療癌癥，但是5，7，8-三甲基-6-羥基色原烷(ct羥基色原垸)沒有這種性能。已經(jīng)證實，將一種或多種抗癌試劑與7，8-二甲基-6-羥基色原烷和8-甲基-6-羥基色原烷(s和y羥基色原烷)的磷酸酯衍生物結(jié)合使用，使用較低濃度的抗癌試劑就能有效的殺死癌細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供了一種減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給已患有癌癥或可能患癌癥的患者服用含有一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物的有效量的藥物制劑，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。另一方面，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括給細(xì)胞投入含有--種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物的有效量的藥物制劑，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。再一方面，本發(fā)明提供了一種減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給已患有癌癥或可能患癌癥的患者投藥有效量的藥物制劑，其中該藥物制劑包括(a)—種或多種抗癌試劑；以及(b)—種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原垸選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原垸及其混合物。再一方面，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括給細(xì)胞投入含有一種或多種抗癌試劑和一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物的有效量的制劑，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。再一方面，本發(fā)明提供了一種增加番茄紅素功效的方法，該方法包括將番茄紅素和一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物聯(lián)合使用，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原垸及其混合物。再一方面，本發(fā)明包括一種藥物制劑，該制劑含有有效量的番茄紅素和有效量的一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原垸選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種增加抗癌試劑功效的方法，該方法包括將抗癌試劑和一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物聯(lián)合使用，其屮羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。合適的抗癌試劑的例子為三苯氧胺。再-'方面，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物制劑，該制劑含有一種或多種抗癌試劑和一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種用于減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的藥物制劑，該制劑含有一種或多種抗癌試劑和一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原垸及其混合物。進(jìn)--步，本發(fā)明提供了一種或多種抗癌試劑和一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物與合適的載體或稀釋劑在制備減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的藥物制劑中的應(yīng)用，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。再一方面，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有有效量的一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原垸選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-e-羥基色原垸及其混合物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了有效量的一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物與合適的載體或稀釋劑在制備減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的藥物制劑中的應(yīng)用，其中羥基色原垸選自7，8-二甲基-6-羥基色原垸、8-甲基_6-羥基色原烷及其混合物?？拱┋煼ń?jīng)常包括使用細(xì)胞毒素試劑的雞尾酒。劑型中可以含有其它藥物化合物，該藥物化合物不影響羥基色原烷磷酸酯衍生物的活性。在一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物給藥前、給藥時或給藥后，可以服用其它的藥物化合物。這種合適的其它的藥物化合物的例子包括紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、三苯氧胺和鏈霉菌。此處使用的術(shù)語"有效量"指的是足以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該知道適合本發(fā)明的抗癌試劑。此處使用的術(shù)語"抗癌試劑"包括但不限于所有的促凋亡化合物，以及烷基化物試劑、抗代謝試劑、免疫試劑、影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化合物和其它的化療試劑。優(yōu)選的，一種或多種抗癌試劑為番茄紅素或三苯氧胺。此處使用的術(shù)語"羥基色原烷"指的是色原垸的羥基衍生物。和本發(fā)明相關(guān)的羥基色原烷衍生物為7，8-二甲基-6-羥基色原烷和8-甲基-6-羥基色原垸，包括對映異構(gòu)體或外消旋體。更加優(yōu)選的，羥基色原烷選自s和y母育酚及其混合物。母育酚包括6-羥基-2-甲基色原烷(參考下述結(jié)構(gòu)式)衍生物的s和y異構(gòu)體，其中r1、r2和r3可以是氫或甲基，即y-7，8-二甲基和5-8-甲基衍生物。在牛育酚中，R4被4，8，12-三甲基十三烷基取代，2、4和8位(參看*)可以是R或S活性或外消旋的立體異構(gòu)體。在生育三烯酚中，R4被4，8，12-三甲基十三垸基-3，7，11-三烯取代，2位可以是R或S立體活性的或外消旋的。此處使用的術(shù)語"磷酸酯衍生物"指的是磷酸化的電子轉(zhuǎn)移試劑的酸性形式，磷酸酯包括金屬鹽如鈉、鎂、鉀和鈣，以及其它任何衍生物，其中磷酸酯質(zhì)子被其它取代基如乙基或甲基或磷脂?；〈?。不過，該術(shù)語不包括過磷酸酯。術(shù)語包括磷酸酯的衍生物，特別是磷酸化反應(yīng)得到的衍生物，以及每個單獨的磷酸酯衍生物。例如，該術(shù)語包括單-生育酚磷酸酯(TP)和雙-生育酚磷酸酯(T2P)的混合物，以及單獨的TP和T2P。國家專利申請PCT/AU01/01475公開了合適的混合物。優(yōu)選的，一種或多種電子轉(zhuǎn)移試劑的一種或多種磷酸酯衍生物選自單-生育酚磷酸酯、雙-生育酚磷酸酯、單-生育三烯酚磷酸酯、雙-生育三烯酚磷酸酯及其混合物。特別優(yōu)選的，一種或多種電子轉(zhuǎn)移試劑的一種或多種磷酸酯衍生物選自一種或多種單-生育酚磷酸酯、雙-生育酚磷酸酯、單-生育三烯酚磷酸酯、雙-生育三烯酚磷酸酯的混合物。在一些情況下，有必要使用具有其它性能如增加的水溶性的磷酸酯衍生物，如磷脂。磷脂酰衍生物為有機(jī)磷酸酯的氨甲基衍生物。這些衍生物可以通過具有R1R2N(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的胺制備，其中n為l到6的整數(shù)，R1和R2為氫或碳數(shù)為3或更少的短烷基鏈。R1和R2可以相同或不同。磷脂酰衍生物是這樣制備的用磷酸酯實體替換電子轉(zhuǎn)移試劑的羥基質(zhì)子，然后用胺取代磷酸酯實體，從而得到電子轉(zhuǎn)移試劑的磷脂酰衍生物，其中的胺選自如乙醇胺或N，N'二甲基乙醇胺。磷脂酰衍生物的一種制備方法是使用堿性溶劑如吡啶或三乙胺和磷的氯氧化物制備中堅產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物然后和胺的羥基反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的磷脂酰衍生物，如P膽酰P生育酚二氫磷酸酯。在一些情況下，可以使用電子轉(zhuǎn)移試劑的磷酸酯衍生物的絡(luò)合物的附加性能，如改進(jìn)的穩(wěn)定性或輸送能力。術(shù)語"磷酸酯衍生物的絡(luò)合物"指的是一種或多種電子轉(zhuǎn)移試劑的磷酸酯衍生物和一種或多種絡(luò)合劑的反應(yīng)產(chǎn)物，其中絡(luò)合劑選自兩性表面活性劑、陽離子表面活性劑、具有氮官能團(tuán)的氨基酸和國際專利申請PCT/AUOl/01476(并入本申請作為參考)中公開的富含這些氨基酸的蛋白質(zhì)。富含這些氨基酸的蛋白質(zhì)例如含有至少l/62精氨酸、1/83組氨酸或l/65賴氨酸，各種形式的酪蛋白就屬于這類蛋白質(zhì)。其它的實例包括胰島素、副甲狀腺激素(PTH)、胰高血糖素、降血鈣素、促腎上腺腺皮質(zhì)激素(ACTH)、泌乳刺激素、抗干擾素-a、-p和，，促黃體生成激素(LH)(也稱之為促性腺釋放激素)、卵泡刺激素(FSH)和落刺激因子(CSF)。氨基酸成分的大部分實例列在下表中。蛋白質(zhì)中的氨基酸胰島素arghislys氨基酸110522占整個氨基酸的比例1/221/551/55PTHarghislys845051/1701/17胰髙血糖素180arg161/11his41/45lys101/18降血鈣素93arg61/16his31/31]ys5]/19蛋白質(zhì)中的氨基酸氨基酸占整個氨基酸的比例促腎上腺皮質(zhì)激素41arg31/14his11/41lys41/10泌乳刺激素220arg121/18his91/13lys111/11干擾素-a和0133arg71/19his21/83lys71/19干擾素-Y166arg81/21his21/83lys211/8LH92arg51/18his21/46lys71/13FSH129arg51/26his21/65lys91/14CSF144arg61/24蛋白質(zhì)中的氨基酸氨基酸占整個氨基酸的比例his31/48lys61/24GH域A0D960416arg21/8優(yōu)選的絡(luò)合劑選自精氨酸、賴氨酸和三取代胺，分子式例如為-NRfR3其中，W選自直鏈或支鏈C6-C22混合烷基及其羰基衍生物；R2和R3各選自H、CH2C00X、CH2CH0HCH2S03X、CH2CH0HCH20P03X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2S03X或CH2CH2CHOHCH2OPO:,X，如果R2和RS不都是H，則X是H、Na、K或鏈烷醇胺；以及R1是RCO時，則W可為CH3，W可以是(CH2CH2)N(C2H40H)-H2CHOP03，或者R2和R3都可以是N(CH2)2N(C孔OH)CH2COO-。優(yōu)選的絡(luò)合劑包括精氨酸、賴氨酸或亞氨基二丙酸月桂酯，其中堿性氮中心和磷酸酯絡(luò)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。羥基色原烷的磷酸酯衍生物可以通過多種劑型給人或動物投藥，這些劑型如補(bǔ)充物、腸進(jìn)料、腸胃外劑型、栓劑、口服劑型、氣霧劑、眼劑、肺和鼻的給藥劑型、皮膚給藥如皮膚貼和膏劑。例如，羥基色原烷的磷酸酯衍生物可以通過口服或腸胃外給藥的劑型給藥。這些劑型包括藥片、粉末、咀嚼片、膠囊、口服懸浮液、懸浮液、乳液或流體、兒童劑型和腸進(jìn)料。劑型可以進(jìn)一步包括在劑型制備中常用的添加劑，如淀粉或聚合物粘結(jié)劑、甜味劑、著色劑、乳化劑、包衣和類似物。其它合適的添加劑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。在一實施例中，劑型的腸衣和國際專利申請PCT/AU01/01206中公開的一樣，該專利申請的內(nèi)容并入此作為參考。在另一實施例中，劑型為口服劑型，和國際專利申請PCT/AU02/01003中公開的一樣，該專利申請的內(nèi)容并入此作為參考。優(yōu)選的，治療對象為動物。特別優(yōu)選的，治療對象為哺乳動物。最優(yōu)選的的，哺乳動物為人。本發(fā)明不同實施例/技術(shù)方案可以參考下述，其中圖1顯示的是實例1的結(jié)果。圖2顯示的是實例2中對前列腺癌細(xì)胞學(xué)(DU-145)的效果。圖3顯示的是實例3中對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的效果。圖4顯示的是實例4中不同Y生育酚磷酸酯的相關(guān)活性。具體實施方式本發(fā)明不同實施例/技術(shù)方案可以參考下述非限制性的實例進(jìn)行說明。實例1本研究將不同形式的生育酚(a，e和Y)和它們的磷酸化的化合物通過ADM和BASF對比抑制鼠大動脈光滑肌細(xì)胞(朋5￥0增殖的功效或性能。腿，96孔板(MTS活細(xì)胞試驗)，6孔板(真實細(xì)胞計數(shù)試驗)DMEM/F12培養(yǎng)基-GIBC0/生命技術(shù)，磷酸鹽緩沖液(PBS),肽牛血清(FBS)，鼠大動脈光滑肌細(xì)胞(RASMCs)p:6-8細(xì)胞應(yīng)用有限公司巻細(xì)胞濃度測定96單水溶液(MTS)-Promega,胰島素/EDTA溶液(R-001-100)-Chemicon,胰島素中和溶液(R-002-100)-Chemicon，乙醇*血球計,臺盼藍(lán)(在PBS中為0.5免w/v)a、e、Y生育酚磷酸酯異構(gòu)體的混合物(單-生育酚磷酸酯和雙-生育酚磷酸酯)旌鼠大動脈光滑肌細(xì)胞增殖-MTS試驗a、P、Y生育酚和其磷酸化對應(yīng)物的效果在RASMC中進(jìn)行評價。每個化合物總共進(jìn)行三種濃度的測試，即100、500和1，000ug/ml。鼠大動脈光滑肌細(xì)胞(RASMC)在96孔板(5，000細(xì)胞/孔)中的生長培養(yǎng)基中接種，并保持在37°C，59&C02中。24小時后，除去生長培養(yǎng)基，用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換。為了同步細(xì)胞，細(xì)胞為饑餓48小時的血清。然后用生長培養(yǎng)基及多種方法替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再持續(xù)4天。然后在100%乙醇(用于a-T、a-TP、Y-T和S-T)或100%乙酸(用于Y-TP和5-TP)中制成貯存液，然后稀釋為最終濃度，最終乙醇濃度不超過0.1%，最終的乙酸濃度不超過0.02%。在這些試驗條件下，這些載體的濃度沒有大幅度的改變RASMC的增殖。每個試驗重復(fù)8次。在試驗?zāi)┢冢?0ul的MTS試劑加入到每個孔中，在37。C，5%。02中培養(yǎng)近1小時后，讀取490nm處的吸光率。CellTiter96Aqueous增殖試驗是增殖試驗中測定活細(xì)胞數(shù)目的色度方法。CellTiter96Aqueous由新型的四唑化合物(3_(4，5-二甲基噻唑-2-基)_5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽；MTS)溶液和電子偶聯(lián)劑(硫酸酚嗪甲酯；PMS)組成。MTS由細(xì)胞生物還原成lll休aorinazan)產(chǎn)品，該產(chǎn)品溶于組織培養(yǎng)基中。Formazan在490rnn處的吸光率寬裕通過96孔板直接測定，吸光率和細(xì)胞數(shù)目成比例(即吸光率較大，活細(xì)胞數(shù)目較大)。結(jié)果和結(jié)論圖1顯示了由真實細(xì)胞計數(shù)評價的RASMC增殖在S和y-生育酚及其磷酸化對應(yīng)物上的抑制百分比。結(jié)果證實，y和S-生育酚磷酸酯混合物誘導(dǎo)了RASMC模型(僅有10%的細(xì)胞和染色劑結(jié)合說明90%的細(xì)胞凋亡了)中的凋亡(細(xì)胞死亡)。而且，該結(jié)果表明y和S-生育酚磷酸酯混合物誘導(dǎo)了主要的細(xì)胞凋亡，而非磷酸化的形式?jīng)]有誘導(dǎo)。和其它測試的類似物相比，ADM和BASF兩者中的S-生育酚磷酸酯具有最大的功效。效果也是依賴于劑量的。對于在RASMC中沒有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的a-生育酚磷酸酯，其效果也是不同的，其通過控制的機(jī)理防止了過量細(xì)胞的增殖。通過a-生育酚磷酸酯，RASMCs沒有繁殖，所有的細(xì)胞是健康和活的(通過染色劑吸收觀察到的)。不過，在y和S-生育酚磷酸酯的情況下，RASMCs沒有繁殖，剩下的細(xì)胞不是活的。這表明作用的機(jī)理不同。實例2本研究分別和一起對照了番茄紅素和y-生育酚磷酸酯混合物對前列腺癌細(xì)胞的效果。材料和方法i^存潘應(yīng)游薦養(yǎng)。DU-145前列腺癌細(xì)胞從AmericanTypeCultureCollection(Manassas,Virginia,USA)購買。jit存細(xì)胞在Dulbecco，s改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和的補(bǔ)充5%FBS(肽牛血清，GibcoBRL，GrandIslandNY)(GibcoBRL，GrandIslandNY)中培養(yǎng)，條件為潮濕的空氣中含有5%C02、溫度為37°C。細(xì)胞一周進(jìn)行1-2次的次培養(yǎng)。^^f仝長試1^。通過用胰島素/維爾烯處理，細(xì)胞在貯存板中胰蛋白酶化，加入等體積的無酚紅RPMI-1640(GibcoBRL，GmndIslandNY)及補(bǔ)充的5%右旋糖酐活性碳處理的肽牛血清(DCFCS)。通過血球計，細(xì)胞重懸浮的細(xì)胞計數(shù)為0.1xl05細(xì)胞/m1,并平鋪成單層，以0.5ml的整數(shù)倍放置在24孔的塑料培養(yǎng)基皿(Costar，CorningUSA)中。24小時后，細(xì)胞用合適濃度(參考表格)的y-牛育酚磷酸酯混合物(Y-TP)(VitalHealth)和番茄紅素(Sigma)處理，或用番茄紅素和無酚紅RPMI培養(yǎng)基1640稀釋的Y-TP及補(bǔ)充的5%DCFCS聯(lián)合處理。培養(yǎng)基每隔3-4天更換。聯(lián)合處理中含有的番茄紅素和Y-TP的比例為1:l分子量/質(zhì)量，其中番茄紅素的變化范圍為5ug/ml-40ug/ml。^^虜^#"。細(xì)胞用0.9%NaCl清洗兩次，除去非黏附的死細(xì)胞，然后細(xì)胞用5-15分鐘溶于0.5ml的2.5mMH印es緩沖液/1.5M的MgCl2，力i]兩滴zap-oglobinII細(xì)胞溶解試劑(BeckmanCoulter,CoulterCorpUSA)。釋放的細(xì)胞核懸浮在isotonIII(BeckmanCoulter,CoulterCorp，USA)，用Coulter計數(shù)器計數(shù)，顆粒尺寸設(shè)置為〉5um。所有細(xì)胞數(shù)分成三份。結(jié)果用平均士標(biāo)準(zhǔn)誤差計算。P-值用單獨的樣品T-測試(通過標(biāo)準(zhǔn)軟件包SPSS)測定。結(jié)果結(jié)果列在下表及相應(yīng)的附圖中。表l:從12天的Y-生育酚磷酸酯混合物得到的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2:從12天的番茄紅素得到的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:從8天的番茄紅素和Y-生育酚磷酸酯混合物得到的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>圖2顯示的是從上述三個表格(T"TP混合物(GTP-0805)、番茄紅素(2pg/ml)及其組合在前列腺癌細(xì)胞系(DU-145))上得到的、以活細(xì)胞減少的百分比表示的結(jié)果。繼結(jié)果表明，番茄紅素和Y-生育酚磷酸酯混合物的組合僅僅在8天內(nèi)對于殺死前列腺癌細(xì)胞有效。而且，結(jié)果顯示，在組合中非常低的濃度的番茄紅素比單獨的番茄紅素更有效的殺死前列腺癌細(xì)胞。結(jié)果也表明Y-生育酚磷酸酯混合物是有效的細(xì)胞凋亡試劑。實例3考査了Y-TP混合物、該混合物與三苯氧胺、常用的抗癌藥物的組合對乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞系的體外效果。旌^存:^^0^;^^0MCF-7人體乳腺癌細(xì)胞由K.Osborne博士提供的，傳代數(shù)為390。貯存細(xì)胞在Dulbecco's改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(GibcoBRL，GrandIslandNY)、補(bǔ)充的5XFBS(肽牛血清，GibcoBRL，GrandIslandNY)(GibcoBRL，GrandIslandNY)和10-8M雌二醇的單層培養(yǎng)基中生長，條件為潮濕的空氣中含有5%C02、溫度為37°C。17-e雌二醇(細(xì)胞周期激活劑)溶于乙醇中，并在培養(yǎng)基中稀釋1:10，000。細(xì)胞通過懸浮在0.069&胰島素/0.02%EDTA(PH7.3)中每周進(jìn)行次培養(yǎng)。^^T主長^^。通過用胰島素/維爾烯處理，細(xì)胞懸浮在貯存板中，加入等體積的無酚紅RPMI-1640(GibcoBRL,GrandIslandNY)及補(bǔ)充的596右旋糖酐活性碳處理的FCS(DCFCS)。通過血球計，細(xì)胞重懸浮的細(xì)胞計數(shù)為0.1xl05細(xì)胞/ml，并平鋪成單層，以0.5ml的整數(shù)倍放置在24孔的塑料培養(yǎng)基皿(Costar，CorningUSA)中。24小時后，細(xì)胞用合適濃度三苯氧胺、番茄紅素Y-TP混合物、T(VitalHealth)或其組合進(jìn)行處理，含有或不含有用無酚紅RPMI培養(yǎng)基1640及補(bǔ)充的5%DCFCS稀釋的雌二醇。培養(yǎng)基每隔3-4天更換。聯(lián)合處理中含有的番茄紅素和Y-TP的比例為1:1分子量/質(zhì)量，其中番茄紅素的變化范圍為5ug/ml-40ug/ml。潘應(yīng)#教。細(xì)胞用0.9%NaCl清洗兩次，除去非黏附的死細(xì)胞，然后細(xì)胞用5-15分鐘溶于0.5ml的2.5raMH印es緩沖液/l.5M的MgCl2，加兩滴zap-oglobinII細(xì)胞溶解試劑(BeckmanCoulter,CoulterCorpUSA)。釋放的細(xì)胞核懸浮在isotonIII(BeckmanCoulter,CoulterCorp,USA),用Coulter計數(shù)器計數(shù)，顆粒尺寸設(shè)置為〉5um。所有細(xì)胞數(shù)分成三份。結(jié)果用平均士標(biāo)準(zhǔn)誤差計算。P-值用單獨的樣品T-測試(通過標(biāo)準(zhǔn)軟件包SPSS)測定。驢圖3顯示的是不同劑量的三苯氧胺(Tam)、Y-T(y_TOC)、單獨的Y一TP(Y_TP混合物)和y-TP混合物與三苯氧胺(10、)對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的效果，不含雌二醇(-E)。和最高劑量的三苯氧胺相比，Y-TP混合物和最低劑量的三苯氧胺(10-^)的組合有較大的抑制效果，這表明有協(xié)調(diào)效果。繼體外結(jié)果表明，y-生育酚磷酸酯混合物單獨使用或與試劑如三苯氧胺組合，都對抗增殖和促凋亡活性。而且，結(jié)果顯示，在組合中非常低的濃度的番茄紅素比單獨的番茄紅素更有效的殺死前列腺癌細(xì)胞。結(jié)果也表明y-生育酚磷酸酯混合物是有效的細(xì)胞凋亡試劑。y-生育酚磷酸酯混合物對乳腺癌MCF-7細(xì)胞系很有效。對于乳腺癌相比，y-生育酚磷酸酯混合物較低的濃度就和三苯氧胺一樣有效。和三苯氧胺(低劑量)一起有協(xié)同效應(yīng)。此外，y-生育酚磷酸酯混合物以劑量依賴的方式抑制了癌細(xì)胞的生長。實例4在本實例中，考査了y-生育酚磷酸酯(y-T、y-TP、y-T2P和y-TPM)對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的體外活性。7教嚴(yán)虜潘應(yīng)^長姿斧.*細(xì)胞在附加有10%FBS的Du〗becco，s改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、75ci^的塑料組織細(xì)胞燒瓶中生成單層，條件為含有5%C02和95X空氣的潮濕空氣，溫度為37°C。細(xì)胞通過懸浮在0.06%胰島素/0.02%EDTA(pH7.3)中每兩周進(jìn)行次培養(yǎng)。My-7教蘼蘑潘蘑,潛遭試避^75試避入細(xì)胞在DMEM中胰蛋白酶化(在次培養(yǎng)時進(jìn)行)，補(bǔ)充10先FBS。通過血球計，細(xì)胞重懸浮細(xì)胞數(shù)至0.1xl()5細(xì)胞/ml。細(xì)胞在l，OOO細(xì)胞/孔接種，或通過向96-孔細(xì)胞培養(yǎng)基板中加入100ul的細(xì)胞懸浮液接種。在開始試驗前，細(xì)胞過夜，然后進(jìn)行同步(用饑餓24小時的血清)。細(xì)胞同步后，用在100%乙醇(2、5、10、15、20、30&50pg/ml)中制備的合適濃度的試劑處理細(xì)胞，加入到RPMI培養(yǎng)基1640中，補(bǔ)充10X右旋糖酐活性碳處理的肽牛血清(DCFCS)。暴露于細(xì)胞的最終乙醇濃度不超過1%。72小時后，孔板用MTS試劑(如實例1所述)培養(yǎng)1小時?？装逵梅止夤舛扔嬙?90nm處讀板。每個測試的化合物重復(fù)8次(不同濃度如下所示)試劑縮寫GT:Y-生育酚；GTP二Y-生育酚磷酸酯；GT2P=Y-雙-生育酚磷酸酯；GTPM=Y-生育酚磷酸酯混合物(GTP和GT2P的組合)。請注意0ug/ml表示使用對照載體(即1%乙醇)。進(jìn)行如下試驗-單獨的GT(noE)，濃度為O，2，5，10，15,20，30&50ug/ml-單獨的GTP(noE)，濃度為0，2，5，10，15，20,30&50ug/ml-單獨的GT2P(noE)，濃度為0，2，5，10，15，20，30&50lig/ml-單獨的GTPM(noE)，濃度為0，2，5，10，15，20，30&50ug/ml驢結(jié)果列入下述表格和圖4中。試劑0125GT0-6.10415.68536.36GTP07.325.6244.807GT2P07.2834.9131.07GTPM00.92724.92923.11濃度1068.68925.10239.47152.0681556.8243.51253.12673.2172079.76664.71964.55798.113082.74381-8198.43112,1975062,622109.928126.506127.996齟結(jié)果表明，GTPM是最有效的抗癌試劑，接著是GT2P、GTP，GT的效果最差，活性有限。結(jié)果表明，用Y-生育酚磷酸酯處理細(xì)胞時，癌細(xì)胞有極大的降低，這表明GTP、GT2P和GTPM可以治療或減慢癌癥的進(jìn)展和形成。本發(fā)明中使用的詞語"組成"不限制本發(fā)明聲明排除其它任何改變或添加物。對本發(fā)明的改變和改進(jìn)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些改變和改進(jìn)包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給已患有癌癥或可能患癌癥的患者服用含有有效量的一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物的藥物制劑，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷(δ)、8-甲基-6-羥基色原烷(γ)及其混合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的--種或多種羥基色原烷的磷酸酯衍生物選自單-生育酚磷酸酯、雙-生育酚磷酸酯、單-生育三烯酚磷酸酯、雙-生育三烯酚磷酸酯及其混合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的羥基色原烷的磷酸酯衍生物為單-生育酚磷酸酯和雙-生育酚磷酸酯的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的羥基色原垸的磷酸酯衍生物為單-8-甲基-6-羥基生育酚磷酸酯(Y)與雙-8-甲基-6-羥基生育酚磷酸酯(Y)的混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包括服用一種或多種其它藥物化合物的步驟，該其它藥物化合物對羥基色原烷的磷酸酯衍生物的活性沒有負(fù)面影響。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的其它藥物化合物選自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、三苯氧胺、鏈霉菌和其混合物。7.—種減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給已患有癌癥或可能患癌癥的患者服用有效量的藥物制劑，該藥物制劑包括(a)—種或多種抗癌試劑；以及(b)—種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物的藥物制劑，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原垸及其混合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的抗癌試劑為番茄紅素或三苯氧胺。9.一種增加番茄紅素功效的方法，該方法包括將番茄紅素和一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物聯(lián)合使用，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原垸及其混合物。10.—種增加抗癌試劑功效的方法，該方法包括將抗癌試劑和一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物聯(lián)合使用，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。11.一種藥物制劑，含有有效量的番茄紅素和有效量的一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原垸、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。12.有效量的一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物及其混合物和合適的載體或稀釋劑在制備減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。13.有效量的抗癌試劑、一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物及其混合物和合適的載體或稀釋劑在制備減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。14.一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其中該組合物含有有效量的一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。15.—種用于減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的藥物制劑，其中該制劑含有一種或多種抗癌試劑與有效量的一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原垸及其混合物。16.—種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括服用有效量的一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原垸選自7，8-二甲基-6-羥基色原垸、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。17.—種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括服用一種或多種抗癌試劑和一種或多種羥基色原垸的一種或多種磷酸酯衍生物，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種減輕癥狀、治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給已患有癌癥或可能患癌癥的患者服用有效量的藥物制劑，該藥物制劑含有一種或多種羥基色原烷的一種或多種磷酸酯衍生物的藥物制劑，其中羥基色原烷選自7，8-二甲基-6-羥基色原烷、8-甲基-6-羥基色原烷及其混合物。文檔編號A61K31/352GK101232879SQ200680006930公開日2008年7月30日申請日期2006年3月3日優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日發(fā)明者E·奧古,R·吉安內(nèi)羅,S·M·韋斯特申請人:生命健康科學(xué)有限公司