專利名稱：病原真菌控制分生孢子產(chǎn)生的新基因MgCON3及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物基因工程和植物保護(hù)領(lǐng)域中影響真菌產(chǎn)生分生孢子的編碼基因及其相關(guān)蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
梨孢菌(Magnaporthe grisea)是子囊菌亞門的真菌，能侵染水稻、小麥、大麥、粟以及其它多種禾本科植物，導(dǎo)致瘟病。一般情況下，稻瘟病的危害可使水稻減產(chǎn)5-10％，重病田可導(dǎo)致水稻絕收。稻瘟病是我國(guó)水稻的主要病害之一，也是世界性的水稻病害，。
梨孢菌以分生孢子作為侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。梨孢菌的一部分菌絲在生長(zhǎng)過(guò)程中分化為分生孢子梗。分生孢子梗頂端細(xì)胞膨大形成第一個(gè)分生孢子，此后，頂端的極性向一邊偏移進(jìn)而依次產(chǎn)生另外的分生孢子。梨孢菌的分生孢子呈梨形，由三個(gè)細(xì)胞組成。一般5至9個(gè)分生孢子以合軸的方式從一個(gè)分生孢子梗的頂端產(chǎn)生。分生孢子釋放后，在分生孢子梗上留下屈膝狀的疤痕。釋放后的分生孢子吸附到葉片上，經(jīng)過(guò)萌發(fā)形成附著胞，成熟的附著胞內(nèi)產(chǎn)生與累積膨脹壓；然后，附著胞下產(chǎn)生侵染釘直接穿透植物表皮，并在植物細(xì)胞內(nèi)形成侵染性菌絲；最后侵染性菌絲在植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間擴(kuò)展、定植梨孢菌侵染感病寄主時(shí)，侵染性菌絲在植物組織內(nèi)擴(kuò)展形成直徑2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，這些病斑中的侵染菌絲穿透植物組織向空中分化形成分生孢子梗，進(jìn)一步形成分生孢子。分生孢子在風(fēng)、雨的沖刷下釋放、附著，重新引起植物的再侵染。梨孢菌從分生孢子附著到分生孢子再產(chǎn)生的周期一般所需時(shí)間為3-5天；在植物的生長(zhǎng)季節(jié)，如果條件適宜，能夠多次侵染，造成危害。從上面的敘述可知分生孢子的形成是梨孢菌侵染植物所必需的過(guò)程，稻瘟病的嚴(yán)重度與梨孢菌分生孢子的產(chǎn)生量呈正相關(guān)。如果能阻斷梨孢菌的分生孢子形成，就可以控制稻瘟病等的發(fā)生。因此，研究梨孢菌分生孢子形成和形態(tài)建成的分子遺傳不僅對(duì)于揭示梨孢菌、絲狀真菌產(chǎn)生分生孢子的分子機(jī)制具有重要的理論意義，而且對(duì)于稻瘟病的防治具有重要應(yīng)用價(jià)值。
植物病原真菌的分生孢子的形成及其形態(tài)構(gòu)建是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，可能有不少基因參與該過(guò)程。但是目前有關(guān)此方面的基因克隆與分子機(jī)理的報(bào)道非常缺少。
1993年，Shi和Leung報(bào)道了梨孢菌水稻分離物Guyll的con1-突變體(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis and rapid mapping of a sporulation mutationin Magnaporthe grisea，MPMI，Vol.7，No.1，1993，pp.113-120.)。該突變體在每一個(gè)分生孢子梗上只產(chǎn)生一個(gè)端生的伸長(zhǎng)的三個(gè)細(xì)胞的分生孢子，在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和分生孢子的形成分別只有野生型的73％和2.3％，在載玻片或洋蔥表皮上不能形成正常的附著胞，并且失去了對(duì)原來(lái)感病的水稻品種的致病性。之后，他們又運(yùn)用REMI(Restriction Enzyme-mediated Insertion)技術(shù)獲得了一系列與分生孢子形成有關(guān)的突變體con2-con7(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis ofsporulation in Magnaporthe grisea by chemical and insertional mutagenesis，MPMI，Vol.8，No.6，1995，pp.949-959.)。突變體con5-和con6-完全喪失了分生孢子形成能力；con1-、con2-、con4-和con7-作用于con5-和con6-的下游，影響產(chǎn)孢能力和分生孢子的發(fā)育；con4-和con7產(chǎn)孢量減少約35％。con1-和con7-不能形成附著胞，因而喪失了對(duì)水稻的致病性，con2-和con4-附著胞形成率明顯減少，因而致病性明顯減弱。盡管如此，這些基因目前還沒有得到克隆和證明。發(fā)明人小組此前鑒定并證明了控制梨孢菌分生孢子的產(chǎn)生及其形態(tài)建成的三個(gè)新基因MgCON1、MgCON2和MgCOM1(國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)柗謩e為200510109447.3、200510109446.9和200510074921.3)。其中，MgCON1可能編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其缺失導(dǎo)致梨孢菌不產(chǎn)生分生孢子且喪失了對(duì)感病水稻品種的致病力；MgCON2基因編碼一個(gè)核蛋白，可能參與基因轉(zhuǎn)錄物的剪切，其缺失導(dǎo)致次生分生孢子梗發(fā)育不成熟、產(chǎn)孢量下降、對(duì)感病水稻品種的致病力減弱；MgCOM1基因可能編碼一個(gè)核蛋白，其缺失導(dǎo)致分生孢子形態(tài)異常、對(duì)感病水稻品種的致病力減弱。
本發(fā)明通過(guò)插入突變途徑從梨孢菌中又克隆了一個(gè)調(diào)控分生子產(chǎn)生的基因MgCON3，該基因突變可使梨孢菌產(chǎn)生分生孢子的能力顯著下降。該基因不同于已克隆或鑒定的控制梨孢菌分生孢子產(chǎn)生及其形態(tài)建成的基因，為一新基因。此外，該基因在其它植物病原真菌如小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)等植物病原真菌中均存在與MGCON3在氨基酸序列一致性達(dá)40％以上的同源蛋白，它們可能具有與MGCON3相似的生物學(xué)功能。因而，MgCON3及其同源基因的表達(dá)與調(diào)控、MGCON3及其同源蛋白可作為靶標(biāo)用于抗真菌藥物的設(shè)計(jì)和篩選，并應(yīng)用于植物病原真菌病害的控制中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供調(diào)控真菌分生孢子產(chǎn)生的一個(gè)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的調(diào)控真菌分生孢子產(chǎn)生的蛋白在梨孢菌中稱為MGCON3。MGCON3是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；其序列由302個(gè)氨基酸殘基組成。
2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌分生孢子產(chǎn)生相關(guān)的蛋白質(zhì)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
MGCON3的編碼基因(MgCON3)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。MgCON3基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；序列表中的SEQ ID№1由4676個(gè)堿基組成，MgCON3編碼區(qū)位于SEQ ID №1的5′端第2241位至3434位堿基之間，5′端第1位至2240位堿基為啟動(dòng)子序列。
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
MgCON3基因的cDNA也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；序列表中的序列2由909個(gè)堿基組成，2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
利用MgCON3基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)序列構(gòu)建的表達(dá)載體以及通過(guò)該載體轉(zhuǎn)化獲得的細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
以MgCON3基因中任一區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)PCR擴(kuò)增用于檢測(cè)在化合物處理狀況下MgCON3基因的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
以MGCON3或與其有40％或以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)多肽，并制備抗體用于檢測(cè)在化合物處理狀況下MGCON3蛋白的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明證明MgCON3基因的缺失與突變導(dǎo)致梨孢菌產(chǎn)生分生孢子量顯著下降，并喪失了對(duì)水稻的侵染能力，說(shuō)明MgCON3基因是梨孢菌引起水稻稻瘟病所需的基因。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄物的剪切及其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位的化合物，可以有效控制梨孢菌分生孢子的產(chǎn)生和水稻稻瘟病的發(fā)生，可以作為新型殺菌劑的候選新藥物直接利用或改善之后加以。也就是說(shuō)，本發(fā)明所提供的MgCON3的一個(gè)重要用途是，該基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄物的剪切及其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位可以作為重要候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗梨孢菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。進(jìn)一步，解析該基因參與的分生孢子產(chǎn)生的信號(hào)傳遞途徑，從中也可以發(fā)現(xiàn)候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗梨孢菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。此外，也可以以該基因核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針或作為PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)在梨孢菌中再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。
本發(fā)明所提供的調(diào)控真菌分生孢子產(chǎn)生的蛋白在其它植物病原真菌如小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)等真菌中均存在同源蛋白。這些真菌中的同源蛋白與梨孢菌MGCON3在氨基酸序列上的一致性均高于40％，它們可能與梨孢菌MGCON3具有相同的生物學(xué)功能。因此，這些同源蛋白及其編碼基因的啟動(dòng)子也可作為靶位點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)和篩選抗這些真菌的藥物。
上述利用MGCON3及其同源蛋白的表達(dá)為靶標(biāo)、開展抗真菌藥劑的篩選和設(shè)計(jì)等用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
以下通過(guò)附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明


附圖1.野生型菌株P(guān)131及其突變體H4186產(chǎn)孢狀態(tài)的比較。將菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基(每升含150ml西紅柿汁、30-50克燕麥片煮沸30分鐘過(guò)濾取濾液、20克瓊脂)平板上，26℃-28℃培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見新生菌絲長(zhǎng)出培養(yǎng)基表面時(shí)，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，蓋上單層紗布，于26℃-28℃光照培養(yǎng)48小時(shí)后，顯微拍攝培養(yǎng)基表面產(chǎn)生的分生孢子，放大倍數(shù)100倍。
附圖2.野生型菌株P(guān)131及其突變體H4186的產(chǎn)孢量比較。采用同上的方法，將野生菌株與突變體菌株在培養(yǎng)皿(直徑6cm)內(nèi)產(chǎn)生的分生孢子用同樣體積水洗下，用血球記數(shù)板測(cè)定單位體積中所含有的分生孢子數(shù)。
附圖3.互補(bǔ)轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建示意圖。在PCR正向引物設(shè)計(jì)酶切EcoRI酶切位點(diǎn)5’-ATGAATTCCACTATACCCAGCA-3’，反向引物為5’-CGACACGACCTGTTTACATCTT-3’，從野生菌P131中擴(kuò)增出4949bp批包含編碼MGCON3的核苷酸序列，連接KN載體，構(gòu)成互補(bǔ)載體。
附圖4.野生型菌株P(guān)131與突變體H4186互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體產(chǎn)孢性狀比較。產(chǎn)孢方法同上，放大100倍顯微拍照。
附圖5.敲除轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建示意圖。左臂正向引物5’-CAACTAGTGAGTAACGCTGATGT-3’，其5’帶有SpeI酶切位點(diǎn)，反向引物為5’-ATGAAGCTTATCTGTATCTGTCCA-3’，其5’端帶有HindIII酶切位點(diǎn)；右臂正向引物5’-CATCCTCGAGAAGAAGAAGGTT-3’其5’帶有XhoI酶切位點(diǎn)，反向引物為5’-CGACACGACCTGTTTACATCTT-3’，用SpeI和HndIII、XhoI和右臂自身存在的KpnI酶切，分別連接KN載體，最后在SalI位點(diǎn)連接潮霉素基因，構(gòu)成敲除載體。
附圖6.野生型菌株P(guān)131與敲除轉(zhuǎn)化體產(chǎn)孢性狀比較。產(chǎn)孢方法同上，放大100倍，顯微拍照。
附圖7.野生型菌株P(guān)131與六個(gè)敲除轉(zhuǎn)化體PCR擴(kuò)增檢測(cè)。其中的第1、2、3、4、5、6、7個(gè)泳道顯示為敲除轉(zhuǎn)化體P2KNH-95、P2KNH-141、P2KNH-179、P2KNH-192、P2KNH-306、P2KNH-325和野生型菌株P(guān)131用正向引物5’-CCAAAGGGTTGACCTGAGG-3’和反向引物5’-GACAGACGTCGCGGTGAGTT-3’的擴(kuò)增片段。其正向引物為梨孢菌中序列，位于敲除轉(zhuǎn)化載體左臂序列的上游，反向引物為敲除轉(zhuǎn)化載體潮霉素基因上的序列。第8道為L(zhǎng)ambda DNA用HindIII的酶切marker。第9、10、11、12、13、14、15為P131與六個(gè)敲除轉(zhuǎn)化體用正向引物5’-CACAGAACCCACGGACAC-3’和反向引物5’-GACCCTCCAGATGCTCCA-3’的擴(kuò)增片斷。其引物為基因MGCON3上序列。
附圖8.MGCON3與其它植物病原真菌中同源蛋白的相似性比較。GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3分別為小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)中與MGCON3氨基酸序列一致性高于40％的蛋白質(zhì)。
附圖9.野生型菌株P(guān)131與MgCON3突變體H4186、互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體P2KN-17和敲除體P2KNH-95對(duì)水稻侵染能力的比較。將上述菌株分別在西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后，用手術(shù)刀切取相同大小3mm×3mm大小新鮮菌絲塊，接種于麗江新團(tuán)黑谷，28℃黑暗培養(yǎng)36小時(shí)，再見光培養(yǎng)72小時(shí)后拍照。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，以下通過(guò)實(shí)施例予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并非對(duì)本發(fā)明的限制。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、控制梨孢菌分生孢子產(chǎn)生的基因MgCON3的分離1、突變體的篩選與鑒定a、分生孢子的制備將梨孢菌菌株P(guān)131的各REMI轉(zhuǎn)化體的菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基(每升含150ml西紅柿汁、30-50克燕麥片煮沸30分鐘過(guò)濾取濾液、20克瓊脂)平板上，26℃-28℃培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見新生菌絲長(zhǎng)出培養(yǎng)基表面時(shí)，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，蓋上單層紗布，于26℃-28℃光照培養(yǎng)48小時(shí)后，在培養(yǎng)基表面即可見大量的梨孢菌孢子。
c、分生孢子產(chǎn)孢量相關(guān)突變體的篩選將各REMI轉(zhuǎn)化體通過(guò)上述方法制備的分生孢子用30ml水洗、收集，利用血球記數(shù)板在顯微鏡下測(cè)定其分生孢子數(shù)；并以野生型菌株P(guān)131為對(duì)比，篩選產(chǎn)孢量有顯著差異的菌，結(jié)果獲得一個(gè)產(chǎn)孢量顯著降低的突變體H4186。對(duì)野生型菌株和突變體H4186各6皿進(jìn)行產(chǎn)孢量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體H4186的產(chǎn)孢量顯著降低，只有野生型菌株的1/1000(表1、附圖1、2)。
2、突變體表型變化與插入標(biāo)記共分離分析將突變體H4186分別與不具有潮霉素抗性、產(chǎn)孢正常的且交配型相反的梨孢菌菌株S1528在西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。首先于25℃培養(yǎng)至菌落邊緣即將接觸，然后將其移至20℃光照培養(yǎng)，約16天左右在菌落的交界處形成黑色突起的子囊殼。挑取成熟的子囊殼，于無(wú)菌水中輕輕擠破，釋放殼內(nèi)的子囊，將子囊懸浮液涂在水瓊脂平板上，24小時(shí)后挑取子囊中子囊孢子萌發(fā)的單根菌絲到西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)這些子囊孢子后代的潮霉素抗性和分生孢子產(chǎn)生情況，結(jié)果如表2所示。從該結(jié)果可知，在測(cè)定的子囊孢子后代中，對(duì)潮霉素敏感的后代都能正常野生表型，抗潮霉素的后代產(chǎn)孢量都為突變表型，說(shuō)明此突變體的失去產(chǎn)孢能力的表型與插入標(biāo)記潮霉素抗性基因是共分離的。
表1.突變體與野生型菌分生孢子產(chǎn)量的區(qū)別

表2.S1528與突變體雜交后代的潮霉素抗性與突變性狀分析

3、MgCON3基因的克隆通過(guò)對(duì)突變體H4186中插入質(zhì)粒的拯救，獲得了相應(yīng)的插入位點(diǎn)側(cè)端的基因組序列，并確定了突變體中質(zhì)粒的插入位置。具體方法如下選取插入質(zhì)粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophusby restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)中沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶XhoI完全消解突變體的基因組，乙醇沉淀精制后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞JM109。提取轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，還含有部分插入位點(diǎn)側(cè)端的基因組的序列。對(duì)鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，分析插入位點(diǎn)附近的基因的范圍和可能的外顯子。結(jié)果表明在突變體H4186中，質(zhì)粒的插入引起基因組中5449bp片段的缺失。將獲得的側(cè)端序列與國(guó)際稻瘟菌基因組協(xié)會(huì)的官方網(wǎng)站(http://www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比較，質(zhì)粒插入在第II號(hào)染色體的supercontig5.186。預(yù)測(cè)該插入位點(diǎn)所破壞的基因具有一個(gè)含909個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼302個(gè)氨基酸。據(jù)此，設(shè)計(jì)PCR引物，從野生菌中擴(kuò)增出4949bp，并克隆到pMD19-T載體中，得到克隆載體P2T。該克隆片段在第3到第8個(gè)堿基為EcoRI酶切位點(diǎn)。用EcoRI酶切后，該片段含MgCON3起始密碼子前2240bp及終止密碼子后1515bp的序列，包含了功能性MgCON3的全長(zhǎng)序列。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及到的限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體和T4DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說(shuō)明書使用。
實(shí)施例2、MgCON3梨孢菌分生孢子產(chǎn)生中作用的證明本發(fā)明采用基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和基因置換實(shí)驗(yàn)來(lái)證明MgCON3梨孢菌分生孢子產(chǎn)生中作用。在這部分內(nèi)容中包括互補(bǔ)載體和基因置換載體的構(gòu)建以及將上述兩類載體導(dǎo)入梨孢菌中，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體并測(cè)定其產(chǎn)孢量?；パa(bǔ)載體的構(gòu)建是指將包含MgCON3的全長(zhǎng)功能性序列的DNA片斷與一個(gè)帶有新霉素抗性基因的載體相連?；パa(bǔ)載體所導(dǎo)入的梨孢菌受體菌株是突變體菌株。在這里新霉素抗性基因并不是對(duì)本發(fā)明的限制，其他能導(dǎo)致抗生素抗性的基因，即新霉素抗性基因之外的導(dǎo)致真菌抗性的基因都可以達(dá)到同樣的效果?；蛑脫Q載體的構(gòu)建是指將位于MgCON3的兩側(cè)各一段DNA序列連入一個(gè)載體中，兩者之間用潮霉素抗性基因隔開。基因置換載體通過(guò)基因兩側(cè)的側(cè)翼序列與野生型菌株基因組的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組，從而將基因組中相應(yīng)位點(diǎn)MgCON3的基因組基因序列與潮霉素基因置換?；蛑脫Q載體所導(dǎo)入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌P131。
1、互補(bǔ)載體和敲除載體的構(gòu)建a.互補(bǔ)載體的構(gòu)建首先合成帶有限制性內(nèi)切酶XbaI識(shí)別序列的引物從克隆質(zhì)粒載體pS65T-C1(gi1019893)中擴(kuò)增出新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因連入pBlueScriptKS(+)的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)XbaI間，得到的質(zhì)粒載體命名為KN。然后，將實(shí)施例1.3中獲得的克隆載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI(pMD19-T載體上含另外一個(gè)EcoRI位點(diǎn))酶切后，回收包含目標(biāo)基因的片段，連入KN，得到包含有功能性MgCON3全長(zhǎng)基因和選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的互補(bǔ)載體P2KN(圖4A)。
構(gòu)建過(guò)程中涉及到的克隆載體、限制性內(nèi)切酶和連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說(shuō)明書使用。
b.敲除載體(基因置換載體)的構(gòu)建。
參照本實(shí)施例中通過(guò)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的MgCON3全長(zhǎng)基因的基因組序列，設(shè)計(jì)PCR引物，分別擴(kuò)增左臂和右臂片斷，左臂用SpeI和HindIII酶切，右臂XhoI和KpnI酶切后得到位于MgCON3起始密碼子上游的序列片段(supercontig5.186的第501794位的核苷酸至第502780位的核苷酸之間的序列)和位于MgCON3終止密碼子下游的序列片段(從supercontig5.186的第505028位的核苷酸至第506507位的核苷酸之間的序列)。這兩段序列分別連接KN載體，另一方面用限制性內(nèi)切酶SalI從質(zhì)粒載體pUCATPH中切下潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因與同樣限制性內(nèi)切酶切連入，得到基因置換載體P2KNH(圖4B)。利用同源重組的原理，將P2KNH用限制性內(nèi)切酶NotI線性化后轉(zhuǎn)化野生梨孢菌P131，MgCON3基因中包含編碼區(qū)在內(nèi)的2248bp片段就被潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因所代替，在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的兩側(cè)分別留下993bp和1475bp的MgCON3的基因組基因的側(cè)端序列。
2、梨孢菌的轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，梨孢菌的轉(zhuǎn)化選用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體的方法，原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法如下a.原生質(zhì)體的制備500毫升三角瓶裝入150毫升液體CM培養(yǎng)基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸鈣0.1％，磷酸二氫鉀0.02％，硫酸鎂0.025％，氯化鈉0.015％)，分別接入所需梨孢菌菌株的適量菌絲、孢子混和體，在26-28℃、100轉(zhuǎn)/分條件下?lián)u培30-32小時(shí)，三層滅菌擦鏡紙過(guò)濾收集菌絲體，菌絲體用0.7M氯化鈉溶液洗滌后轉(zhuǎn)移至滅菌的50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用0.7M氯化鈉配制)，26-28℃、100轉(zhuǎn)/分條件下酶解3-4小時(shí)后，用0.7 M氯化鈉洗滌菌絲體，經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過(guò)濾，收集原生質(zhì)體，4,000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mMTris-Cl，pH7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質(zhì)體一次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質(zhì)體濃度調(diào)至0.5-1×108個(gè)/毫升。
b.梨孢菌轉(zhuǎn)化分別將梨孢菌P131或H4186原生質(zhì)體分裝于滅菌的50毫升離心管中，每管150微升，分別加入等體積的線性化的載體(約2微克，梨孢菌P131的離心管中加入用限制性內(nèi)切酶NotI線性化的基因置換載體P2KNH，梨孢菌H4186的離心管中分別加用限制性內(nèi)切酶NotI線性化的互補(bǔ)載體P2KN)和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mMTris-pH7.5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000轉(zhuǎn)/分、4℃離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養(yǎng)基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室溫靜置培養(yǎng)12-13小時(shí)后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入12毫升冷卻至50℃的SR(LR+1.6％瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7％上層瓊脂(冷卻至50℃，含400微克/毫升的新霉素(互補(bǔ)實(shí)驗(yàn))或300微克/毫升的潮霉素(美國(guó)Roche公司生產(chǎn)，基因置換試驗(yàn))。28℃培養(yǎng)4-6天，將出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體(突變體H4186的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體分別為P2KN-2、P2KN-17和P2KN20；梨孢菌P131的基因置換轉(zhuǎn)化體P2KNH-95、P2KNH-141、P2KNH-179、P2KNH-192、，P2KNH-306、P2KNH-325)轉(zhuǎn)至固體CM培養(yǎng)基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％瓊脂)(含400微克/毫升的新霉素(互補(bǔ)實(shí)驗(yàn))或250微克/毫升的潮霉素(基因置換試驗(yàn))上，二次篩選后將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入燕麥片番茄培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進(jìn)行單孢分離。
互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明互補(bǔ)載體在梨孢菌突變體H4186基因組中的異位整合使突變體恢復(fù)了分生孢子的產(chǎn)生能力。突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體的分生孢子產(chǎn)生量與野生型菌P131相當(dāng)，兩者的比較結(jié)果如表3所示?；パa(bǔ)載體構(gòu)建如附圖3所示，突變體H4186的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體P2KN-17和野生型菌P131的分生孢子產(chǎn)生情況如附圖4所示。
表3.P2KN-17互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體與野生型菌分生孢子產(chǎn)量的比較

敲除實(shí)驗(yàn)表明，潮霉素基因置換MgCON3后，6個(gè)敲除轉(zhuǎn)化體都喪失了產(chǎn)孢能力，表現(xiàn)出與突變體一樣的性狀，野生菌P131與敲除轉(zhuǎn)化體產(chǎn)孢量比較如表4所示。敲除載體構(gòu)建如圖5所示，野生菌P131和敲除轉(zhuǎn)化體分生孢子產(chǎn)生情況如附圖6所示。
表4.MgCON3敲除轉(zhuǎn)化體與野生型菌分生孢子產(chǎn)量的比較

實(shí)施例3、MGCON3與其它病原真菌中同源蛋白的生物信息學(xué)分析為獲得MGCON3在其它植物病原真菌如小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)中的同源蛋白，對(duì)MGCON3的氨基酸序列在上述真菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行tblastn(蛋白質(zhì)對(duì)核苷酸)查詢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述基因組中均具有與MGCON3同源的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步，提取上述基因組中的核苷酸序列在http:∥sun1.softberry.com網(wǎng)站上進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到對(duì)應(yīng)的同源蛋白質(zhì)，將其分別命名為GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3。GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3分別含有305、302、302、294、325和306個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)的序列如序列表中SEQ ID NO5、6、7、8、9所示。這些同源蛋白與MGCON3在氨基酸序列上的一致性分別為76.24、76.90、68.20、57.98和41％。MGCON3與GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3的同源性關(guān)系如附圖8所示。
實(shí)施例4、野生型菌株、突變體、互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體與敲除體對(duì)水稻侵染能力的比較為驗(yàn)證MgCON3基因在對(duì)水稻侵染能力中的作用，將野生型菌株P(guān)131、互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體P2KN-17、敲除體P2KNH-95與突變體H4186分別在西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，接種麗江新團(tuán)黑谷。取完全展開的第五片水稻葉片的中間部分，剪成長(zhǎng)約5cm的片斷，一部分葉片用細(xì)針劃傷表面接種，其余葉片不劃傷接種。用手術(shù)刀切取西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基上相同大小(3mm×3mm)的新鮮菌絲塊，1cm間距接種在水稻葉片上。0.025％的吐溫噴于葉片表面保濕，28℃黑暗培養(yǎng)36小時(shí)，再見光保濕培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果表明野生型菌株P(guān)131和互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體P2KN-17在劃傷和不劃傷的水稻葉片上均能形成病斑；而突變體H4186和敲除體P2KNH-95僅在劃傷的水稻葉片上形成病斑，在不劃傷的水稻葉片上不能形成病斑。說(shuō)明MgCON3基因的缺失導(dǎo)致稻瘟菌對(duì)水稻侵染能力明顯減弱，如附圖9所示。
序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>病原真菌控制分生孢子產(chǎn)生的新基因MgCON3及其用途<160>9<210>1<211>4946<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1AATTCCACTA TACCCAGCAT GAATCAGAAT CAAGTCTGGC GAGGACTGTG GCGTCGCAGA60AATGAGTCGG GCAGATTTGA AATGGATGGA TCAAGCCTAC ATCAATGGCT ACTGTCTGTG120CGACGAATAG TTCCTGGGGT TTTAAGGGGG ATCTAGAGCG TTTGGGAAAA TCACGTCTCG180AGTAACGCTG ATGTGCGTCA GCTTGCAGAT AGTACATGGT GCAGGTCGCC AGTGCTTCAC240AGCTGACAAT CAGCGCCTTG GGAGCGAGTT CGGATTGCTG CAACTCACAT ATTGCTTACA300ACCATGCTTT TCTACATATG CAGTGTCTGA TGTGTTTTCG ATCAGACAAT CAACCCATCT360GCCAGGCACA AACCTGGAGA ACTGTCTGTA AAGTGTGGCC TGATGTCCTA GTCAGCTTCT420AGGGCAGTTA GGCATCTGCA ATAAAAGAAA GAGATCATGC CTATTTTGTC CTCTGATCAT480AGATTGGACG ACGTTAAATT GGGCCCGGCC CGTAGCCGCC AACACATACA CGGCGCCGAT540TCGGCCTGTC GGCAACGGTA CAGCTCGGCT GGGCTTACTC AGTTCGGGCA TCTGGGCGGC600GTCATGATGA ATGCCAACAG CCACCTGTCC TGTCACCTTG GAAGAAAAAA AAGTGTGAGA660AAACTGAGCC TTGATGGCGG TGTTTTTCTT ATGTGGCAGC GCTGCTTACA CAAGATGCAT720TCTTGTCTTG CCTGTGTATG TTTTGGCGCC GAGAAATGCA GGCAGCAAAT AATCAACCTT780CACACCCAAC CTTAGATGCA TCTTTAGATC TGGGAGTTTG TTGAGGCTCG TTTCATGACT840TGGCAACACA AAAAAACACA CTGGCTCACG AATCCGTGGC TTATGATAGG CCGGCTATTT900CGGGAATTGG GGCGGGCCTC TTGTGGTTTT GGGGGCTGCG CCCGCCGGGA CGCCCGGGGT960CTGTTTTGTT GCCTCGGGTC AGTCTCCATT TCTTCAGTAA TACTGCCACG ATAGGTAATT1020ACGAAGTACT GCATTTAACG GATTTTTTAT TCTTCGCAAT TGACAAAAGG ACTCGACACT1080GTATGGCACA CCATCAAGAT CCGAAGTAAT CTTCTGTCTT GTGATTACCT TAGCCCAATG1140CATGCGCCCG GTGGACAGAT ACAGATGTCA ACCATACTCG AGTGGGAATC GTCTATCCAA1200GAAATTGAAT CGGCATTGGC TTTCCGAGCT ATTAGTACGC ATAACTAAGA CTAACGGCAA1260AAATTGCAAC TCAGAAGAAA TGTCGTCACT GAGAACAGAT CGTCAGATGA ATACAGTACT1320TCACTCGAGA TCCACCAGGG GGCGTATAAG AAAAGTCGTA TAAATAAACT CTCGAGATCA1380AAATAACTCG TTTGCATTAA TTGTACAACT AGCATCCTGA TAACTATGGA TTGATCGACT1440GTGTTGCTTG TCATACTCTA TTTTCTCGAC ACCATAATAG TAATATTTCG AGCCCTGTCC1500AATTTGTCGG GTCCATTTTT TTCTCTTTCT TTTCTTCAGA CTGCTTCTTC GACTTTTTTT1560
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GAGGAGAAGG ACCGCAAGAT GTACTTCCAG CTTGCCGGCC GTGTTCTGCT CATCTTCCTC600TTCATCGGCT TTGTGTTCGC TGGCGAGTGG AGCATCTGGA GGGTCATGGT CTCCATCGTC660GGCCTGGTTG CCTGCATCAT GGTTGTTGTT GGATTCAAGG CCAAGTTCAG CGCCACTCTC720CTAGTCGTCA TCTTGAGCAT CTTCAACCTC TTTGTCAACA ACTTCTGGAC TCTTCACGAG780CACCACCCCC ACAAGGACTT TGCCAAGTAC GACTTCTTCC AGATCCTCTC GATCGTCGGT840GGCCTGCTTC TGCTCGTCAA CAGCGGTCCT GGCCAGTTCA GCATCGACGA GAAGAAGAAG900GTTTACTAA909<210>3<211>302<212>PRT<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>3Met Ser Gln Arg Gly Pro Ser Gly Tyr Gly Ile Pro Asn Ala Pro Asn1 5 10 15Pro Phe Gly Gly Pro Ser Ser Gln Pro Asp Gly Gln Gly Ser Ala Leu20 25 30Asp Ala Ile Arg Glu Gln Thr Ser Lys Ile Glu Asp Met Leu Asp Ser35 40 45Val Ser Glu Pro Ile Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Phe Leu50 55 60Ile Val Val Thr Phe Ile Glu Asp Ala Leu Arg Ile Leu Thr Gln Trp65 70 75 80Ser Asp Gln Val Tyr Tyr Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Phe Pro Arg Gly85 90 95Phe Pro Gln Leu Phe Leu Ile Ile Asn Val Val Ala Met Val Val Cys100 105 110Ser Gly Met Val Ile Thr Arg Arg Phe Ser Glu Tyr Ala Val Gly Gly115 120 125Leu Ile Ala Val Val Ile Thr Gln Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ile Phe130 135 140Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Met Gly Gly Leu Ile145 150 155 160Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Thr Val Asn Phe Ala Gly165 170 175Leu Pro Gln Leu Glu Glu Lys Asp Arg Lys Met Tyr Phe Gln Leu Ala
180 185 190Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Ile Gly Phe Val Phe Ala Gly195 200 205Glu Trp Ser Ile Trp Arg Val Met Val Ser Ile Val Gly Leu Val Ala210 215 220Cys Ile Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Phe Ser Ala Thr Leu225 230 235 240Leu Val Val Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Phe Val Asn Asn Phe Trp245 250 255Thr Leu His Glu His His Pro His Lys Asp Phe Ala Lys Tyr Asp Phe260 265 270Phe Gln Ile Leu Ser Ile Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Ser275 280 285Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ile Asp Glu Lys Lys Lys Val Tyr290 295 300<210>4<211>2240<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>4AATTCCACTA TACCCAGCAT GAATCAGAAT CAAGTCTGGC GAGGACTGTG GCGTCGCAGA60AATGAGTCGG GCAGATTTGA AATGGATGGA TCAAGCCTAC ATCAATGGCT ACTGTCTGTG120CGACGAATAG TTCCTGGGGT TTTAAGGGGG ATCTAGAGCG TTTGGGAAAA TCACGTCTCG180AGTAACGCTG ATGTGCGTCA GCTTGCAGAT AGTACATGGT GCAGGTCGCC AGTGCTTCAC240AGCTGACAAT CAGCGCCTTG GGAGCGAGTT CGGATTGCTG CAACTCACAT ATTGCTTACA300ACCATGCTTT TCTACATATG CAGTGTCTGA TGTGTTTTCG ATCAGACAAT CAACCCATCT360GCCAGGCACA AACCTGGAGA ACTGTCTGTA AAGTGTGGCC TGATGTCCTA GTCAGCTTCT420AGGGCAGTTA GGCATCTGCA ATAAAAGAAA GAGATCATGC CTATTTTGTC CTCTGATCAT480AGATTGGACG ACGTTAAATT GGGCCCGGCC CGTAGCCGCC AACACATACA CGGCGCCGAT540TCGGCCTGTC GGCAACGGTA CAGCTCGGCT GGGCTTACTC AGTTCGGGCA TCTGGGCGGC600GTCATGATGA ATGCCAACAG CCACCTGTCC TGTCACCTTG GAAGAAAAAA AAGTGTGAGA660AAACTGAGCC TTGATGGCGG TGTTTTTCTT ATGTGGCAGC GCTGCTTACA CAAGATGCAT720TCTTGTCTTG CCTGTGTATG TTTTGGCGCC GAGAAATGCA GGCAGCAAAT AATCAACCTT780CACACCCAAC CTTAGATGCA TCTTTAGATC TGGGAGTTTG TTGAGGCTCG TTTCATGACT840TGGCAACACA AAAAAACACA CTGGCTCACG AATCCGTGGC TTATGATAGG CCGGCTATTT900
CGGGAATTGG GGCGGGCCTC TTGTGGTTTT GGGGGCTGCG CCCGCCGGGA CGCCCGGGGT960CTGTTTTGTT GCCTCGGGTC AGTCTCCATT TCTTCAGTAA TACTGCCACG ATAGGTAATT1020ACGAAGTACT GCATTTAACG GATTTTTTAT TCTTCGCAAT TGACAAAAGG ACTCGACACT1080GTATGGCACA CCATCAAGAT CCGAAGTAAT CTTCTGTCTT GTGATTACCT TAGCCCAATG1140CATGCGCCCG GTGGACAGAT ACAGATGTCA ACCATACTCG AGTGGGAATC GTCTATCCAA1200GAAATTGAAT CGGCATTGGC TTTCCGAGCT ATTAGTACGC ATAACTAAGA CTAACGGCAA1260AAATTGCAAC TCAGAAGAAA TGTCGTCACT GAGAACAGAT CGTCAGATGA ATACAGTACT1320TCACTCGAGA TCCACCAGGG GGCGTATAAG AAAAGTCGTA TAAATAAACT CTCGAGATCA1380AAATAACTCG TTTGCATTAA TTGTACAACT AGCATCCTGA TAACTATGGA TTGATCGACT1440GTGTTGCTTG TCATACTCTA TTTTCTCGAC ACCATAATAG TAATATTTCG AGCCCTGTCC1500AATTTGTCGG GTCCATTTTT TTCTCTTTCT TTTCTTCAGA CTGCTTCTTC GACTTTTTTT1560CCCCCCTTAG TTCAGCTCCA GCGGACCTCC CAGTTGCCTG CAAGGTACCA CACCACCCAC1620ACCTTTCGCG GGGTACAGTG TATTAAGTGA GACTGTGGGC TAATTCAGGT ATCCTACCTA1680TTCAGCCACA GAACCCACGG ACACTGCCGG GCTCTTGTCA GAACCCCGGT CTCCACTGGT1740CGTCGCGCTT ATCCACACTC CACCTGTCGA AGCTTGGGAA AAAGGACACA GTTGTTTTAT1800CTAAGCTTCT AGCCCCCGTG TAGGTTTGAG AGCTCCCCTC TATTGTAAAA AGCCTCTATC1860CCAATCTAGC TCTCCGGGAA GTCGTTTTTA GTCTTTTATT ATTTTCCATT TTCCACTGCA1920CTACGTTATT TCGTACATTC CTAGAGAGAA AACAACGAAA CACCACGTTG GTTTTGTTTT1980CGCATTCACT GATCAGACTC GACCGCCTTT TTCGATTACA ACAGAAACTT GGCCCACCGA2040CAGCCTCGCC GCTGCATTCC CCATAAGTTT GTCCACGCAC ACTAGCGAAG GATACGGCTC2100GAATCCGCGT TACACGCAGA AGCGCTCGAC CACCTTGTAT TTTTTTGTGT GCGCTTGGCC2160GGCAACAAAG GACAAGCGAT ACAAATCTCC CGCTTGATAC AACAACCCGC TTGCACAAAC2220TCCGGGTAGA GCTAGCAACA2240<210>5<211>302<212>PRT<213>小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)<400>5Met Ser Asn Arg Phe Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Pro Ala Pro1 5 10 15Tyr Gly Gly Ser Gln Ala Ala Glu Pro Gln Gln Gly Glu Gly Phe Leu20 25 30Glu Gln Ile Arg Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Glu Asp Ala Leu Asp Thr35 40 45Ile Ser Glu Pro Val Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Phe Leu
50 55 60Ile Val Val Thr Phe Phe Glu Asp Ala Leu Arg Ile Val Thr Gln Trp65 70 75 80Ser Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Lys Asp Tyr Arg His Ile Pro Ser Gly85 90 95Ile Thr His Leu Phe Leu Leu Val Asn Ile Ile Ala Met Phe Ser Cys100 105 110Ser Thr Leu Val Ile Ile Arg Lys His Ser Asp Tyr Ala Val Ala Gly115 120 125Leu Met Gly Val Val Val Thr Gln Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ile Phe130 135 140Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Ile Gly Gly Leu Val145 150 155 160Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Thr Gln Val Phe Ala Gly165 170 175Leu Pro Gln Ile Asp Glu Lys Asp Arg Lys Met Tyr Phe Gln Leu Ala180 185 190Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Ile Gly Phe Val Phe Ser Gly195 200 205Glu Trp Ser Leu Trp Arg Val Ile Val Ser Ser Leu Gly Gly Ile Ser210 215 220Cys Val Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Tyr Ser Ala Thr Leu225 230 235 240Leu Val Val Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Asn Phe Trp245 250 255Thr Leu His Glu His His Pro His Lys Asp Phe Ala Lys Tyr Asp Phe260 265 270Phe Gln Ile Leu Ser Ile Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Ser275 280 285Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ile Asp Glu Lys Lys Lys Val Tyr290 295 300<210>6<211>302<212>PRT<213>棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)
<400>6Met Ser Gln Arg Phe Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Pro Ala Pro1 5 10 15Tyr Gly Gly Ser Gln Ala Ala Asp Pro Gln Gln Gly Glu Gly Phe Leu20 25 30Glu Gln Ile Arg Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Glu Asp Ala Leu Asp Thr35 40 45Ile Ser Glu Pro Ile Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Phe Leu50 55 60Ile Val Val Thr Phe Phe Glu Asp Ala Leu Arg Ile Val Thr Gln Trp65 70 75 80Ser Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Lys Asp Tyr Arg His Ile Pro Ser Gly85 90 95Ile Thr His Leu Phe Leu Leu Val Asn Ile Ile Ala Met Phe Ser Cys100 105 110Ser Thr Leu Val Ile Ile Arg Lys His Ser Asp Tyr Ala Val Ala Gly115 120 125Leu Met Gly Val Val Val Thr Gln Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ile Phe130 135 140Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Ile Gly Gly Leu Val145 150 155 160Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Thr Gln Val Phe Ala Gly165 170 175Leu Pro Gln Ile Asp Glu Lys Asp Arg Lys Met Tyr Phe Gln Leu Ala180 185 190Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Ile Gly Phe Val Phe Ser Gly195 200 205Glu Trp Ser Leu Trp Arg Val Ile Val Ser Ser Leu Gly Gly Ile Ser210 215 220Cys Val Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Tyr Ser Ala Thr Leu225 230 235 240Leu Val Val Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Asn Phe Trp245 250 255Thr Leu His Glu His His Pro His Lys Asp Phe Ala Lys Tyr Asp Phe260 265 270Phe Gln Ile Leu Ser Ile Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Ser
275 280 285Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ile Asp Glu Lys Lys Lys Val Tyr290 295 300<210>7<211>294<212>PRT<213>小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)<400>7Met Ala Gln Ile Arg Gly Thr Ala Gly Tyr His Leu Gly Asn Gln Ser1 5 10 15Pro Phe Gly Asn Ala Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Asn Asp Pro Ser20 25 30Pro Leu Asp Gln Leu Arg Ala Gln Thr Ser Lys Ile Glu Asp Met Leu35 40 45Asp Thr Leu Ser Asp Pro Ile Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg50 55 60Phe Leu Ile Val Val Thr Phe Leu Glu Asp Ala Leu Arg Ile Ile Thr65 70 75 80Gln Trp Arg Asp Gln Leu Thr Tyr Leu His Asp Tyr Arg His Ile Trp85 90 95Asn Gly Val Thr His Leu Phe Leu Ile Val Asn Val Ile Val Met Thr100 105 110Gly Ala Ser Ile Met Val Ile Ala Arg Lys His Ser Glu Tyr Ala Val115 120 125Ala Gly Leu Met Gly Val Val Val Leu Gln Gly Ile Gly Tyr Gly Leu130 135 140Val Phe Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Met Gly Gly145 150 155 160Leu Leu Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Lys Phe Ala Pro165 170 175Ala Gly Leu Pro Thr Leu Asp Glu Lys Asp Lys Lys Met Tyr Phe Gln180 185 190Leu Ala Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Val Gly Phe Val Phe195 200 205Arg Gly Glu Trp Gly Phe Trp Arg Ile Val Ala Ser Leu Leu Gly Leu
210 215 220Val Ala Cys Ile Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Phe Ser Ala225 230 235 240Ile Met Leu Val Leu Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Tyr Val Asn Asn245 250 255Phe Trp Lys Leu His Pro His His Pro His Lys Asp Phe Ala Asn Gly260 265 270Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Met Gly Pro Gly Gln Phe Ser Val Asp275 280 285Glu Lys Lys Lys Val Tyr290<210>8<211>325<212>PRT<213>玉米黑粉病病(Ustilago maydis)<400>8Met Ala Ala Arg Leu Gly Phe Asn Thr His Asp Ser Ser Ser Ala Ser1 5 10 15Thr Ala Cys Phe Ala Arg Ser Asn Cys Ile Ala Ala Ser Gly Tyr Ser20 25 30Thr Met Ala Ser Tyr Gly Ala Ser Pro Tyr Ala Ser Thr Ser Thr Ser35 40 45Ser His Ala Glu Ser Pro Leu Asp Lys Val Arg Glu Tyr Thr Ser Lys50 55 60Val Glu Asp Leu Ile Asp Gln Tyr Thr Gln Pro Ile Lys Pro His Leu65 70 75 80Pro Ala Leu Gly Arg Phe Leu Ile Val Val Thr Phe Leu Glu Asp Ala85 90 95Leu Arg Ile Met Thr Gln Trp Ser Asp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gln Arg100 105 110His Arg Gly Phe Pro Trp Gly Ile Ser His Ile Phe Leu Leu Ala Asn115 120 125Val Val Val Met Cys Ala Gly Ser Ala Ala Val Ile Leu Arg Lys Tyr130 135 140Pro Glu Ile Ser Val Gly Ala Leu Phe Gly Val Val Val Val Gln Gly
145 150 155 160Phe Gly Tyr Gly Leu Ile Phe Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu165 170 175Ser Val Val Gly Gly Leu Leu Met Val Leu Ser Asp Ser Phe Ala Ala180 185 190Lys Lys Asn Ile Phe Ala Gly Leu Pro Ser Leu Ser Glu Thr Asp Arg195 200 205Lys Ile Tyr Phe Gln Leu Ala Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe210 215 220Ile Gly Phe Ile Ile Gln Gly Glu Trp Ser Val Ala Arg Val Leu Val225 230 235 240Ser Val Leu Gly Leu Gly Ala Cys Val Met Val Val Val Gly Phe Lys245 250 255Ala Arg Trp Ser Ala Ser Phe Leu Val Leu Ile Leu Ser Val Phe Asn260 265 270Val Phe Val Asn Asn Phe Trp Thr Val His Ser Ala His Pro Ser Arg275 280 285Asp Phe Leu Arg Tyr Asp Phe Phe Gln Thr Leu Ser Ile Val Gly Gly290 295 300Leu Leu Leu Leu Val Asn Met Gly Pro Gly Gly Leu Ser Val Asp Glu305 310 315 320Arg Lys Lys Val Thr325<210>9<211>306<212>PRT<213>棉病囊菌(Ashbya gossypii)<400>9Met Ser Tyr Arg Gly His Asn Tyr Asn Ala Met Ala Pro Gly Gly Gln1 5 10 15Thr Phe Ser Asn Ser Pro Tyr Thr Ser Asn Met Gly Ser Thr Gly Ala20 25 30Arg Gly Arg Ser Ser Glu Leu Phe Gln Lys Phe Glu Arg Phe Ala Lys35 40 45Arg Ile Glu Asp Val Thr Asp His Pro Leu Val Gln Arg Phe Val Pro
50 55 60Tyr Thr Pro Leu Ile Ala Arg Phe Phe Ile Val Ala Thr Phe Tyr Glu65 70 75 80Asp Ser Ile Arg Ile Leu Ser Gln Trp Pro Glu Gln Val Ser Phe Leu85 90 95Ser Tyr Tyr Arg Arg Tyr Pro Arg Val Phe Val Val Leu Phe Leu Met100 105 110Val Val Ala Val Leu Met Met Val Gly Ala Thr Met Ile Leu Leu Arg115 120 125Lys Gln Gln Leu Tyr Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ala Cys Ile Ile Ser130 135 140Gln Gly Phe Val Tyr Gly Leu Phe Ser Gly Thr Ser Phe Val Leu Arg145 150 155 1G0Asn Phe Ser Val Ile Gly Gly Leu Leu Ile Thr Phe Gly Asp Ser Ile165 170 175Val Gln Lys Arg Ile Thr Phe Gly Met Leu Pro Glu Leu Thr Ser Arg180 185 190Asp Gly Arg Thr Lys Gly Tyr Ile Leu Leu Ala Gly Arg Ile Leu Ile195 200 205Val Leu Met Phe Val Thr Phe Thr Phe Gly Lys Ser Trp Leu Thr Val210 215 220Phe Leu Thr Ile Ala Gly Thr Val Cys Ile Ala Val Gly Tyr Lys Thr225 230 235 240Lys Phe Ala Ser Ile Ile Leu Cys Leu Ile Leu Thr Phe Tyr Asn Val245 250 255Thr Leu Asn Asn Tyr Trp Leu Tyr Gly Tyr Ala Lys Arg Asp Phe Leu260 265 270Lys Tyr Glu Phe Tyr Gln Asn Leu Asn Ile Ile Gly Gly Leu Leu Leu275 280 285Val Leu Asn Thr Gly Ala Gly Thr Ile Ser Phe Asp Glu Lys Lys Lys290 295 300Ile Tyr30權(quán)利要求
1.真菌中一種控制分生孢子產(chǎn)生的蛋白，該蛋白在梨孢菌中為MGCON3。MGCON3是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且為真菌影響分生孢子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，在其它病原真菌小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)中、與序列表中的SEQ ID №3具有一致性高于40％的的同源蛋白質(zhì)，分別命名為GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3，其特征為分別具有如序列表中SEQ ID №5，6，7，8，9所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的梨孢菌影響分生孢子產(chǎn)生的蛋白MGCON3的編碼基因MgCON3，其特征在于具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列或與其一致性高于40％的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述梨孢菌影響分生孢子產(chǎn)生的蛋白的編碼基因，其特征在于編碼區(qū)位于序列表中的SEQ ID №1的5′端第2241位至3434位堿基之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述梨孢菌影響分生孢子產(chǎn)生的蛋白的編碼基因的eDNA，其特征在于可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼蛋白質(zhì)的序列為自序列2的5′端第1位至909位堿基；3)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
6.利用權(quán)利要求1所述的梨孢菌分生孢子產(chǎn)生所必需蛋白的編碼基因構(gòu)建的表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)化所獲得的細(xì)胞系和宿主菌。
7.梨孢菌影響分生孢子產(chǎn)生的蛋白MGCON3的編碼基因的啟動(dòng)子，具有序列表中的SEQ ID №4的5′端第1位至2240位堿基的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求1所述的梨孢菌影響分生孢子產(chǎn)生的蛋白MGCON3的表達(dá)、或修飾、或剪切作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的利用。
9.權(quán)利要求8所述的基因啟動(dòng)子及其結(jié)合蛋白作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的利用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8、9所述的抗真菌藥物包括抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)及小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了病原真菌中控制分生孢子產(chǎn)生的一個(gè)新基因MgCON3。該基因及其cDNA、編碼的蛋白質(zhì)和啟動(dòng)子分別具有序列表中SEQ ID №1、№2、№3和№4的核苷酸或氨基酸序列。MGCON3蛋白在其它真菌如小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、小麥穎枯病菌、玉米黑粉病、棉病囊菌中均具有氨基酸序列一致性在40％以上的同源蛋白。MgCON3基因的敲除導(dǎo)致梨孢菌產(chǎn)生的分生孢子量為野生型菌株的1/800至1/1000，同時(shí)減弱對(duì)水稻葉片的侵染能力。MgCON3及其相似基因在上述真菌中的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄物的剪切以及它們編碼蛋白的表達(dá)、修飾與剪切可作為重要候選靶標(biāo)，用于設(shè)計(jì)和篩選抗真菌的新型藥劑。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101020711SQ20061010366
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者彭友良, 劉靜宇, 趙文生, 張?jiān)＞? 張凱, 時(shí)濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)