專利名稱：一種抗植物青枯病基因及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物抗病領(lǐng)域，具體涉及一種抗植物青枯病基因及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
茄子作為中國栽培的主要蔬菜之一，2006年全國播種面積70. 27萬hm2，總產(chǎn)量 2247萬t。但是在茄子的生產(chǎn)過程中常由于病害的發(fā)生給廣大的菜農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失， 危害茄子的主要病害有黃萎病、青枯病、綿疫病、褐紋病等，例如茄子青枯病的發(fā)生一般會 減產(chǎn)20 30%，嚴(yán)重時損失達(dá)50 60%，已成為影響茄子高產(chǎn)的主要因素。而且這種病 很難根除，采取化學(xué)防治為主的綜合防治措施也只能收到40 50%的防治效果，用輪作可 起到一定的防治作用，但實(shí)施比較困難。要防治這些病害的經(jīng)濟(jì)，有效的主要對策就是選育 抗病茄子品種，既能提高茄子產(chǎn)量，又能減少農(nóng)藥的使用，防止環(huán)境污染，而想選育出抗病 性強(qiáng)的品種必須有比較理想的育種材料。目前各國開展茄子育種的所用資源遺傳基礎(chǔ)比較 狹窄，是制約茄子抗病育種取得突破性進(jìn)展的主要因素，野生的茄子材料由于存在生殖隔 離的問題，也難以將有利的抗病基因轉(zhuǎn)移到栽培種中。因此要選育優(yōu)良抗病品種，必須不斷 地發(fā)掘和創(chuàng)新抗病材料，才是解決問題的根本途徑。隨著植物基因工程的深入研究，分離植 物抗病基因已成為現(xiàn)實(shí)，將抗病基因?qū)氲绞荏w植物后既可增強(qiáng)植物的抗病性又能保持優(yōu) 良的經(jīng)濟(jì)性狀，從而為開展植物抗病育種成找到一條新的途徑。目前有關(guān)茄子抗青枯病基因工程研究比較落后，大多數(shù)主要集中在與抗青枯病性 狀相連鎖的分子標(biāo)記篩選研究，還沒有茄子抗青枯病基因分離的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有植物育種中存在的遺傳基礎(chǔ)狹窄、青枯病侵害問題嚴(yán) 重且農(nóng)藥的使用會對環(huán)境造成污染的問題，提供一種具有抗青枯病功能的基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述抗植物青枯病基因的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述抗植物青枯病基因的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO :1所示，該基因編碼的蛋白如 SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明抗植物青枯病基因是從半野生茄子E-31中擴(kuò)增得到的。本發(fā)明抗植物青枯病基因的制備方法是通過cDNA-AFLP差異顯示法及RACE法從 抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步驟如下(1)對E-31、E-32、Fl和F2茄子植株進(jìn)行人工抗青枯病鑒定，得到抗病植株和感 病植株；(2)分別提取上述抗病植株和感病植株的總RNA，合成cDNA ；(3)利用cDNA-AFLP差異顯示法進(jìn)行篩選，用序列如SEQ ID NO :3 4所述引物
3擴(kuò)增出與抗病基因連鎖的抗病基因片段，序列如SEQ ID N0:5所示；(4)利用RACE法擴(kuò)增抗青枯病基因片段的全長序列根據(jù)步驟(3)所得抗病基因 片段設(shè)計引物，擴(kuò)增5’端序列，如SEQ ID NO :6所示；所述引物序列如SEQ ID N0:7 8所 示；(5)根據(jù)步驟(3)所得抗病基因片段設(shè)計引物，擴(kuò)增3’端序列，如SEQID NO 9所 示；所述引物序列如SEQ ID NO 10 11所示；(6)根據(jù)擴(kuò)增出的5’端序列和3’端序列進(jìn)行連接，得到抗青枯病基因的全長序 列。本發(fā)明從半野生茄子E-31分離到一個茄子抗青枯病基因，通過轉(zhuǎn)基因把該基因 導(dǎo)入到表現(xiàn)優(yōu)良的感病品種中，可以提高茄子的抗病性，從而可以快速培育出新的茄子抗 病品種。具體方法如下將抗植物青枯病基因序列構(gòu)建到克隆載體上，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn) 行雙酶切，獲得目的基因片段，利用內(nèi)切酶雙酶切植物正義表達(dá)載體，把酶切獲得的基因片 段和正義表達(dá)載體通過連接酶進(jìn)行連接，將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，利用 農(nóng)桿菌導(dǎo)入法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過篩選，得到具有抗青枯病能力的轉(zhuǎn)基因植株。其中，所述克隆 載體優(yōu)選為PMD19-T;所述限制性內(nèi)切酶優(yōu)選為sma I和sac I。本發(fā)明抗青枯病基因還可用于其它抗青枯病資源比較缺乏的植物，如番茄的基因 工程育種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明從半野生茄子E-31中分離出抗青枯病基因，將該基因倒入到受體植物后 既可增強(qiáng)植物的抗病性又能保持優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀，改良了植物品種；通過本發(fā)明將基因?qū)?入植物中以提高植物的抗青枯病能力，既能提高植物的產(chǎn)量，還可以減少農(nóng)藥的使用，防止 環(huán)境污染，適合在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)行推廣。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1抗病基因的制備1.對所用的材料(E-31，E_32及其F1、F2代植株)用灌根法進(jìn)行人工抗青枯病抗 性鑒定，確定抗病材料與感病材料。2.抗病材料E-31，感病材料E-32及它們F1、F2代抗病植株，感病植株的總RNA分 離提取，采用Trizol法。3. cDNA 的合成雙鏈cDNA 合成方案參照 CL0NTECH 公司 SMART cDNA Library constructionkit Manual。 其中 Powerscript Reverse Transcriptase 購于 Invitrogen 公司，而 50 X advantage 2 polymerase Mix 購置于 CL0NTECH 公司。cDNA Synthesis (CDS)、SMART Π 引物及5' -PCR primer由上海生工合成，SMARTn序列如SEQ ID NO 12所示，CDS序列如 SEQ ID NO 13 所示，PCR Primer 序列如 SEQ ID NO 14 所示。第一鏈cDNA的合成(1)在一無菌的0. 5mL的微量離心管中加入下列試劑
應(yīng)產(chǎn)物

RNA (0. 025 0. 5 μ g 的 poly A+RNA 或 0. 05 1 μ g 的 total RNA) 1 3 μ g cDNA Synthesis(CDS)Primer(IOyM)1 μ L
SMART Π Oligonucleotide(10 μ Μ)1 μ L
加入DEPC處理水至總體積為5yL
(2)混合樣品，短暫離心；
(3)70°C保溫2min ；
(4)短暫離心收集樣品于管底，保持試管于室溫；
(5)加入下列試劑于反應(yīng)管中 5X First-Strand Buffer DTT(20mM) dNTP Mix(IOmM)
Powerscript Reverse Transcriptase
2μ L 1 μ L
1 μ L 1 μ L.
總體積為IOyL
(6)輕輕地渦旋且短暫離心試管；
(7)42°C溫浴lh。如用PCR儀保溫，樣品上要加一滴礦物油；
⑶通過補(bǔ)充適合體積的TE緩沖液(IOmM Tris [pH7. 6]，ImM EDTA)稀釋第一鏈反
若用總RNA作為開始材料，補(bǔ)充40 μ L的TE緩沖液； 若用多于0. 2 μ g poly A+RNA作為開始材料，補(bǔ)充450 μ L TE緩沖液； 若用少于0. 2 μ g poly A+RNA作為開始材料，補(bǔ)90 μ L TE緩沖液；
(9)加熱試管72°C，7min;
(10)如不進(jìn)行第二鏈的反應(yīng)，第一鏈的cDNA存于-20°C可保存3個月
4. cDNA的LD-PCR擴(kuò)增每個樣品準(zhǔn)備3個管。
(1)預(yù)熱PCR儀到95°C；
(2)加入下列試劑于反應(yīng)管中 IOXadvantage 2PCR buffer 5' -PCR primer(10 μ Μ) dNTP Mix(IOmM)
50 X advantage 2polymerase Mix 第一鏈cDNA
ddH20
5 μ L 2μ L 1 μ L 1 μ L 8μ L
33 μ L
總體積為50 μ L
(3)混合樣品，短暫離心收集樣品于管底；
(4)加兩滴礦物油于反應(yīng)液上，將反應(yīng)管置于預(yù)熱好的PCR儀上
(5)PCR反應(yīng)程序如下
95 0C預(yù)變性Imin ；
95 "C15s65 °C15s68 °C6min循環(huán)次數(shù)全部先進(jìn)行15個循環(huán)，加入1 μ L 0. 5Μ EDTA到各自的反應(yīng)中，終止反 應(yīng)，4°C保存；

5. cDNA酶切和連接酶切取合成好的cDNA酶切進(jìn)行，先用Taq I進(jìn)行酶切，酶切溫度為65°C，時間 3h。酶切體系為cDNA (約 IOOng)8μ L Taq I(IOU) 1 μ L 10XNEB buffer 3 2μ L10XBSA 0. 2μ LddH90 9μ L總體積為 20μ l
Ase I酶切在上述酶切體系中加入下列成分
Taq I酶切體系20 μ LAse I(IOU)1 μ LIOXAse I buffer 31 μ LddH208 μ L_總體積為30 μ L溫度為37°C，時間3h。雙酶切結(jié)束后，取8 μ L體積的酶切產(chǎn)物進(jìn)行1. 2%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測。Taq I和Ase I接頭的配制取25 μ g T1和22 μ g T2混合后水定容到100 μ L，此 為5pM Taq I的接頭。另取2. 6 μ g A1和2 μ g A2混合后水定容到100 μ L，此為終濃度為 5pM Ase I的接頭。
連接16°c恒溫槽下進(jìn)行，連接過夜。取5 μ L于1. 0%電泳，檢測連接結(jié)果t雙酶切后的產(chǎn)物22 μ LTaq I 接頭IyLAse I 接頭IyLT4Ligation buffer3 μ LT4DNA連接酶1 μ L補(bǔ)充ddH20總體積為30 μ L連接后產(chǎn)物稀釋20倍最適宜用于模板的預(yù)擴(kuò)增。 6.模板的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系稀釋的連接產(chǎn)物5 μ L，引物T3(K)Ong/ μ μ L，引物A3(K)Ong/μ L) IyL, IOX PCR Buffer (含 Mg2+ (25mM)) 2· 5 μ L，Mg2+25ml) 1 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L, Taq酶(5U) 0. 4 μ L，補(bǔ)充ddH20至總體積為25 μ L。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性Imin ;94°C 30s，退火溫度分別對56 °C 30s, 72 °C lmin,30個的循環(huán)次數(shù)，PCR產(chǎn)物取10μ L，在1. 5%瓊脂糖膠上電泳比較。PCR產(chǎn)物稀釋到 約Ing/ μ L (稀釋20倍)，用于選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增體系13.8yL ddH20,2. 5μ L PCR buffer(含 Mg2+(25mM))， Mg2+(25mM) 1· 0 μ L，0· 5 μ L dNTP，1 μ L 弓丨物 T，1 μ L 弓丨物 A，5 μ L 預(yù)擴(kuò)稀釋產(chǎn)物，0· 2 μ L Tag 聚合酶，總體積25 μ L0 94°C, 5min ；94°C，30s，65°C，30s，72°C，Imin，以后每輪擴(kuò)增溫度遞 減 0. 7°C，擴(kuò)增 12 個循環(huán)后；940C，30s, 56°C，30s, 72°C，Imin,共 28 個循環(huán)；72°C延伸 7min。cDNA-AFLP的引物和接頭由上海生工生物程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，Taq I、Ase I接頭和選擴(kuò)的引物見表1。表1引物和接頭序列表Table 1 Adaptor and primer sequence of Tag I and Ase I 7.變性選擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積的甲酰胺上樣緩沖液，95°C變性5min后迅速放置冰 上2min，-2(TC貯藏備用。甲酰胺上樣緩沖液的配制二甲苯青l(xiāng)mg，溴酚藍(lán)lmg，0. 5M EDTA溶于去離子甲酰胺。8.測序膠電泳(1)洗板用洗衣粉洗凈有機(jī)玻璃板和玻璃板的雙面，再用ddH20沖洗干凈，注意玻 璃板不要有劃痕；(2)涂板洗凈的玻璃板及有機(jī)玻璃板，晾干后用Eppendorf槍均勻的在板的上部 點(diǎn)灑ImL無水乙醇擦拭，注意擦拭朝同一方向進(jìn)行，不要在板上來回劃，重復(fù)擦3次，晾干； 玻璃板用ImL稀釋的親和硅烷(100 μ L親和硅烷+900 μ L ddH20)均勻涂抹；有機(jī)玻璃板用 ImL的剝離硅烷均勻涂抹一遍。5min后各用無水乙醇均勻涂抹3次；(3)制板晾干后，將兩塊板組裝，梳子斜向倒插，兩邊用夾緊，注意受力均勻；(4)凝膠配制尿素 21g，10XTBE 2. 5mL，40 % Arc :Bis 貯液 7. 5mL，重蒸水 26mL， 400 μ L 10%的過硫酸氨(Ammonium persulfate)，用磁力攪拌機(jī)攪拌溶解，加水定容至 50mL。灌膠前加入40 μ L TEMED ；10ΧΤΒΕ :108g Tris+55g 硼酸+3. 72gEDTA，定容 IL ；40%測序膠貯存液(40% Arc :Bis) :38g丙烯酰胺+2g N-甲叉雙丙烯酰胺溶于 60mL水中，37°C助溶，定容至IOOmL;10%過硫酸氨，4°C可貯數(shù)周；(5)灌膠將固定好的板一方傾斜放置，將凝膠通過注射器從下至上快速注入，注意 排除氣泡，保證膠面通過毛細(xì)作用左右方呈直線水平前進(jìn)，當(dāng)膠填滿底部后，將斜向倒插的 梳子小心插入兩夾板間，凝固3h以上；(6)電泳待膠凝固好后，拔出注射器，將膠板組裝好，清洗板表面和上部點(diǎn)樣孔附 近的膠，將梳子齒向下插入，稍微接觸膠面，形成點(diǎn)樣孔。首先在IXTBE中，50W預(yù)電泳 30min,使電泳槽溫度達(dá)到45°C。取8 μ L變性的選擴(kuò)PCR產(chǎn)物上樣。45°C，50W恒功率電泳 90min，至二甲苯青指示帶距底部約IOcm處。9.銀染方法銀染液按照下列配方配制固定/終止液(900mL ddH20+5mL冰醋酸+IOOmL無水 乙醇)；染色液(2g AgNO3+固定液)；顯色液(20g NaOH+IOOOmL ddH20+5mL甲醛)；(1)固定在托盤A中加入固定/終止液，將在膠的短板放入托盤，輕搖20min或直 到指示劑顏色消失為止。也可在溶液中浸泡過夜(不搖動)。將溶液回收留用，清洗托盤；(2)洗膠在托盤B中用ddH20漂洗凝膠3次，每次2min，在將玻璃板取出時，讓玻 板豎直滴干10 20s ；(3)染色在長盤A中加入IL染色液，將有膠的玻板放入托盤，輕搖30min ；(4)顯色準(zhǔn)備完全配制好顯色液，將IL預(yù)冷的顯色液置于托盤B中剩下產(chǎn)溶液仍 置于冰上，將膠從染色液中拿出放在一邊；(5)洗膠將膠浸入裝有ddH20的托盤中，拿出滴干水，立即將膠置于預(yù)冷的顯色液 中。注意，從將膠置于水中到將其放入顯色液中，時間不超過5 10s。如洗膠時間過長，重 復(fù)染色過程；(6)顯色輕搖顯色液，至膠上條帶出現(xiàn)(或第一條條帶出現(xiàn))后，將膠移入剩余的 IL預(yù)冷顯色液繼續(xù)顯色2 3min或直到所有條帶都出現(xiàn)；(7)固定將IL固定液加入到顯色液中，終止顯色反應(yīng)；
8
(8)洗滌用ddH20洗凝膠兩次，每次2min ；(9)干膠室溫下自然晾干。10.差異片斷的回收和二次PCR擴(kuò)增(1)差異條帶的回收先用少量ddH20浸潤差異表達(dá)的條帶，然后用手術(shù)刀在酒精燈 上滅菌后沿條帶邊緣小心切下條帶，溶解在50 μ L ddH20中，4°C冰箱浸泡過夜，100°C煮沸 15min，其間用槍頭或牙簽小心搗碎凝膠，12000rpm室溫離心lOmin，取上清液可以用作二 次PCR反應(yīng)的模板。(2)差異片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件利用與回收條帶相匹配的引物進(jìn) 行 二 次 PCR, 25uL 擴(kuò)增體系中含有10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L, Mg2+ (25mM) 1 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物 A (50ng/ μ L) 1 μ L，引物 T (50ng/ μ L) 1 μ L, Taq 酶(5U) O. 2 μ L，回 收模板 5 μ L，力口 ddH20 M 25 μ L0 PCR 條件為94°C變性 2min ；94°C變性 30s, 56°C退火 30s， 72°C延伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin終止反應(yīng)。(3)差異片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化差異條帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測 后，若只有一條亮帶，則該產(chǎn)物可直接用于后續(xù)的連接反應(yīng)，若有兩條或更多的條帶則需經(jīng) 辨別后，從膠上回收目的條帶(用于回收PCR反應(yīng)體系增加到50 μ L)11.目的片段的測序經(jīng)過差異篩選后，發(fā)現(xiàn)Τ3/Α8的引物組合得到與抗病材料緊密連鎖的片段，經(jīng)過 測序后得到序列如SEQ ID NO 5所示。12.利用RACE擴(kuò)增出該基因片段的全長序列(1)所有錨定引物均由上海生工合成，用于3’和5’ RACE第一鏈cDNA合成的引物 序列如下3' -CDS(12yM)如 SEQ ID NO :13 所示，其中 N = A，C，G，or T ;V = A，G，or C5' -CDS (12 μ Μ) 5' -(T)25V Ν_3' (N = Α，C，G，or T ;V = Α，G，or C)，如 SEQ IDNO 37 所示；用于3’和5’ RACE PCR擴(kuò)增的錨定引物序列如下IOXuniversal Primer A Mix(UPM)Long (0. 4 μ M)如 SEQ ID NO 38 所示；Short (2 μ Μ)如 SEQ ID NO 39 所示。Nested universal Primer A(NUP ； 10μΜ)女口 SEQ ID N0:40 所示。擴(kuò)增5端序列所用的特異引物如SEQ ID NO :7 8所示；擴(kuò)增3端序列所用的特異引物如SEQ ID NO 10 11所示。PCR反應(yīng)的體系IyL cDNA 模板，2.5yL 10XPCR buffer(含 25mM Mg2+), Mg2+(25mM)0. 5 μ L，0. 5 μ L dNTP，1 μ L錨定引物，1 μ L 特異引物，0. 25 μ L Tag聚合酶(5U)， 加18. 25 μ L ddH20使總體積為25μ L。PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性2min ；94°C 30s，退火溫度 600C 30s, 72°C延伸2min，30個循環(huán)，72°C再延伸7min。套式PCR的退火溫度提高到62°C。 PCR產(chǎn)物回收、連接和克隆等，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。擴(kuò)增3端的PCR反應(yīng)為94°C預(yù)變性3min -MV 30s，退火溫度52°C 50s，72°C延 伸2. 5min, 30個循環(huán)，72°C再延伸IOmin0把擴(kuò)增出來的片段克隆到pMD19-T載體上，進(jìn)行測序。
得至IJ 5端序列如SEQ ID NO 6所示，得到3端序列如SEQ ID NO 9所示。13RE_bw全長序列的連接與擴(kuò)增根據(jù)5端序列與3端序列的測序結(jié)果，進(jìn)行連接得到全長序列如SEQ IDNO 1所 示；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。提取抗病材料“E-31”的總RNA，而后合成cDNA。根據(jù)抗病基因序列SEQ ID NO :1設(shè)計引物P3和P4，序列如SEQ IDNO :41 42所示；以“E-31 ”的cDNA為模板，按照以下PCR反應(yīng)體系進(jìn)行2. 5 μ 1 10XPCR buffer(Takara, Bio USA)，0· 5 μ 1 IOmmol I-IdNTPs(Takara, BioUSA)，0· 5 μ 1(20 μ Μ)引 物(Ρ1+Ρ2)，0· 25 μ 1 5U/ μ L Taq 酶(Takara, Bio USA)，20 μ 1 ddH20 and 1 μ 1 (20_50ng) 的cDNA模板，放置在PCR儀上，按照程序94°C下預(yù)變性5分鐘，而后94°C 1分鐘，55°C 1 分鐘，72°C 2分鐘，循環(huán)35次，72°C放置10分鐘，在1. 2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在成像 系統(tǒng)(Bio-Rad, sub-celImodel 192，USA)下分離出目的基因片段。利用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(Takara，Bio USA)進(jìn)行目的基因的回收，使用 Takara pMD-19 Ligation Kit進(jìn)行即連接反應(yīng)體系pMD19_T載體0. 5 μ L，回收純化產(chǎn)物 4. 5yL, Solution I 5 μ L，總體積為10 μ L，16°C反應(yīng)12h。即可以把抗病基因連接到克隆 載體PMD19-T上。將含有目的基因的克隆載體可以通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，在液體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，添加15 %的甘油，可在-80V長期保存。實(shí)施例2將基因?qū)胫参镏械姆椒▽⒑心康幕虻腜MD19-T用sma I和sac I雙酶切，切下目的基因，而后同樣用 sma I和sac I雙酶切pBI121的⑶S基因，用T4連接酶把抗病基因與酶切后的pBI121進(jìn) 行16°C連接12h，即可得到抗病基因的正義植物表達(dá)載體pBI121-RE-bw，用凍融法將構(gòu)建 好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105或LBA4404，即可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。以感病茄子自交系“E-32”為轉(zhuǎn)化材料，介紹用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具體的遺傳轉(zhuǎn)化方 法。具體的操作方法為培養(yǎng)茄子無菌幼苗，切下7d苗齡的上胚軸，浸泡于濃度為0D_0. 5 的農(nóng)桿菌菌液中13分鐘，用濾紙吸干上胚軸外植體，而后在培養(yǎng)基MS+6-BA(2. Omg. U1)+IAA(0. lmg. L"1)+ZT(2. Omg. L-1)+ 蔗糖(30g. L-1)+ 瓊脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8上預(yù)培 養(yǎng) 2d，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基[MS+6-BA (2. Omg. Γ1) +IAA (0. Img. Γ1) +ZT (2. Omg. Γ1) +Km (50mg. L-1) +Cb (500mg. L-1) + 蔗糖(30g. L-1) + 瓊脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8上進(jìn)行篩選，25 天后， 有抗性芽分化出現(xiàn)，對獲得的抗性芽在培養(yǎng)基上[MS+6-BA (2. Omg. L-1) +IAA (0. Img. Ι^)+ΖΤ(2. Omg. L—1) + 蔗糖(30g. L—1) + 瓊脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8進(jìn)行 2-3 代的快繁，可以得到 大量的不定芽。對獲得的抗性芽進(jìn)行Southern雜交鑒定，有雜交信號的為轉(zhuǎn)基因抗性 芽，沒有雜交信號出現(xiàn)的為加陽性不定芽，對獲得的轉(zhuǎn)基因不定芽在生根培養(yǎng)基上 [1/2MS+NAA(0. lmg. L—1) +蔗糖(30g. L—1)+瓊脂(6. 5g. L-1)進(jìn)行生根，即可得到轉(zhuǎn)基因植 株。實(shí)施例3所得到的轉(zhuǎn)基因植株的抗病性評價轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株，定植于田間，發(fā)病率低于20%，發(fā)病植株的發(fā)病癥狀表現(xiàn)為1-2 級(即整個植株有1 3片枯萎)，而對照(為轉(zhuǎn)化植株)發(fā)病率超過80%，發(fā)病植株的癥狀表現(xiàn)為4-5級(即整個植株葉片枯萎，甚至死亡)；轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行人工接種青枯病鑒 定，發(fā)病時間較對照植株推遲15天，而對照植株在接種7天后即表現(xiàn)感病癥狀。轉(zhuǎn)基因植 株病情指數(shù)為8. 74，群體抗性表現(xiàn)為抗，而對照植株病情指數(shù)為76. 68，群體抗性表現(xiàn)為高感。
權(quán)利要求
一種抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的蛋白如SEQ ID NO2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗植物青枯病基因，其特征在于所述基因是從半野生茄子 E-31中擴(kuò)增得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗植物青枯病基因，其特征在于所述植物為茄子。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的抗植物青枯病基因的制備方法，其特征在于通過 cDNA-AFLP差異顯示法及RACE法從抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步驟如下(1)對E-31、E-32、Fl和F2茄子植株進(jìn)行人工抗青枯病鑒定，得到抗病植株和感病植株；(2)分別提取上述抗病植株和感病植株的總RNA，合成cDNA；(3)利用cDNA-AFLP差異顯示法進(jìn)行篩選，用序列如SEQID NO :3 4所述引物擴(kuò)增 出與抗病基因連鎖的抗病基因片段，序列如SEQ ID N0:5所示；(4)利用RACE法擴(kuò)增抗青枯病基因片段的全長序列根據(jù)步驟(3)所得抗病基因片段 設(shè)計引物，擴(kuò)增5，端序列，如SEQ ID NO 6所示；所述引物序列如SEQ ID NO :7 8所示；(5)根據(jù)步驟(3)所得抗病基因片段設(shè)計引物，擴(kuò)增3’端序列，如SEQIDNO 9所示； 所述引物序列如SEQ ID NO 10 11所示；(6)根據(jù)擴(kuò)增出的5’端序列和3’端序列進(jìn)行連接，得到抗青枯病基因的全長序列。
5.權(quán)利要求1或2所述的抗植物青枯病基因在制備抗青枯病轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗植物青枯病基因在制備抗青枯病轉(zhuǎn)基因茄子中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗植物青枯病基因的應(yīng)用，其特征在于將抗植物青枯病基因 序列構(gòu)建到克隆載體上，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因片段，利用內(nèi)切酶雙 酶切植物正義表達(dá)載體，把酶切獲得的基因片段和正義表達(dá)載體通過連接酶進(jìn)行連接，將 構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過篩選，得到具有 抗青枯病能力的轉(zhuǎn)基因植株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗植物青枯病基因的應(yīng)用，其特征在于所述克隆載體為 PMD19-T。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗植物青枯病基因的應(yīng)用，其特征在于所述限制性內(nèi)切酶為 sma I 禾口 sac 10全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗植物青枯病基因及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明抗植物青枯病基因是從半野生茄子E-31中得到的，其DNA序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的蛋白如SEQ ID NO2所示。將本發(fā)明抗植物青枯病基因轉(zhuǎn)入植株中，通過篩選可得到具有抗青枯病能力的轉(zhuǎn)基因植株，增強(qiáng)了植株的抗病性，改良了植物品種，可廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。
文檔編號C07K14/415GK101880672SQ20101019150
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者曹必好, 曾國平, 柯劍, 王勇, 陳國菊, 陳清華, 雷建軍 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)