專利名稱：重組噬菌體流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流感疫苗，尤其涉及重組噬菌體流感疫苗，屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感病毒具有高度的傳染性，并能引起急性呼吸道疾病，它的流行特點(diǎn)是在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發(fā)流行及散發(fā)，發(fā)病率高并伴有一定的死亡率。造成流感反復(fù)流行的重要原因是(1)由于流感基因的節(jié)段性，高突變率和頻繁的基因重組造成免疫變異性大，特別是A型流感病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原的變異性大；(2)流感是人畜共患病，A型流感病毒在動(dòng)物中存在著多種亞型，會(huì)直接引起人類流感；(3)由于微小突變使病毒表面糖蛋白產(chǎn)生小的變化，引起抗原漂移；(4)A型流感病毒的基因組由8個(gè)節(jié)段組成，當(dāng)不同亞型同時(shí)感染時(shí)，會(huì)使病毒之間因基因重組而導(dǎo)致新亞型的出現(xiàn)。新亞型病毒出現(xiàn)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致世界范圍的大流行。
根據(jù)核蛋白和膜蛋白抗原差異，流感病毒分為A、B、C三型。A型流感病毒易感染人及禽、豬、馬等多種動(dòng)物，對(duì)人類威脅最大，曾引起人類歷史上4次大流行。雖然A型流感病毒具有多個(gè)亞型，但是在人群中廣泛流行的只有H1N1，H2N2和H3N2三個(gè)亞型；B型流感病毒主要感染人且致病力低，通常只造成局部流行；C型流感病毒僅引起人類上呼吸道輕微感染，很少造成流行。接種流感疫苗是預(yù)防流感及其并發(fā)癥的主要手段。目前使用的流感疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。按WHO建議，現(xiàn)有國(guó)際上批準(zhǔn)的疫苗有A型的2個(gè)亞型病毒H3N2、H1N1和1個(gè)B型病毒。
滅活疫苗主要是用雞胚生產(chǎn)，在發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)用廣泛，多年的臨床應(yīng)用表明，滅活疫苗的免疫效果基本上是肯定的，但存在以下幾個(gè)問(wèn)題(1)通過(guò)預(yù)測(cè)生產(chǎn)的疫苗株與當(dāng)前流行株不匹配；(2)流感疫苗的保護(hù)率與年齡相關(guān)，老年人免疫狀態(tài)較低；(3)流感病毒主要侵襲呼吸道，目前普遍采用肌肉注射疫苗進(jìn)行免疫，這種免疫方式不能有效誘導(dǎo)呼吸道粘膜的分泌，因而免疫效果不理想；(4)流感病毒在雞胚上傳代會(huì)發(fā)生抗原變異。此外，大部分雞體內(nèi)攜帶多種病毒，疫苗產(chǎn)品存在病毒污染的可能性。
流感病毒減毒活疫苗通過(guò)在25～26℃下雞胚中連續(xù)傳代得到減毒毒株，即冷適應(yīng)株，這種病毒只能在25℃左右復(fù)制，不能在37℃復(fù)制，因此其感染只局限于上呼吸道，臨床上無(wú)明顯的流感癥狀。流感病毒減毒活疫苗的免疫效果優(yōu)于滅活疫苗。但是冷適應(yīng)株的獲得需要較長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)其遺傳性是穩(wěn)定的，不會(huì)出現(xiàn)返祖，加上流感病毒不斷地發(fā)生抗原性變異，故常常尚未選用完冷適應(yīng)株，其抗原性已過(guò)時(shí)。因此流感病毒減毒活疫苗至今仍處于研制階段。
綜上，由于目前使用的流感滅活疫苗存在的缺陷，WHO建議繼續(xù)研究開(kāi)發(fā)針對(duì)病毒保守蛋白(如M2)的新型疫苗。M2由流感病毒的一個(gè)RNA片段翻譯而成，是一種包膜蛋白，位于病毒囊膜的表面并貫穿囊膜，其主要作用是構(gòu)成氫離子通道，為病毒HA與細(xì)胞的結(jié)合提供酸性環(huán)境。M2e是M2的胞外區(qū)，長(zhǎng)23個(gè)氨基酸殘基，在不同亞型的人類A型流感病毒間高度保守(Science，2006，312380-382)。英國(guó)的一家疫苗生產(chǎn)公司Acambis正在研制的廣譜流感疫苗采用的主要組分就是M2e，希望通過(guò)M2e誘導(dǎo)抗所有A型流感病毒株的保護(hù)性免疫應(yīng)答。美國(guó)專利(20060115489)將2～4個(gè)拷貝的M2e的編碼基因插入乙肝核心抗原(HBc)嵌和體(chimer)編碼基因的5’端，利用乙肝核心抗原形成病毒顆粒樣結(jié)構(gòu)的佐劑特性，增強(qiáng)M2e的免疫原性，提高抗M2e的抗體滴度。研究證實(shí)，M2蛋白能抵抗同一亞型或不同亞型流感病毒的攻擊(Vaccine，2006，24544-551)。
與高度變異的HA、NA抗原的作用機(jī)制不同，M2e不會(huì)誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，針對(duì)M2e的抗體通過(guò)與感染細(xì)胞結(jié)合促進(jìn)其清除，但是不會(huì)阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞，因而不會(huì)預(yù)防疾病的發(fā)生，M2e的免疫者仍然會(huì)感染流感病毒，體重會(huì)下降，但是存活率會(huì)顯著提高(Nature Medicine，1999，5(10)1157-1163)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有流感病毒變異率極高，流感疫苗存在的病毒污染、抗原性容易過(guò)時(shí)、免疫效果不理想等不足，本發(fā)明提供一種免疫力高，安全可靠的重組噬菌體流感疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種重組噬菌體流感疫苗，其特征在于它由重組噬菌體制得，其中重組噬菌體由下列組分構(gòu)建而成將含有編碼基因?yàn)閍tgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc的通用輔助性T細(xì)胞表位，編碼基因?yàn)閍tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg的A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e的1～15氨基酸殘基，編碼基因?yàn)間gtccgggtccgggt的間隔子GPGPG以及編碼基因?yàn)閍tgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg的B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸殘基的融合蛋白插入T7噬菌體衣殼蛋白10B的C端，使融合蛋白展示在T7噬菌體的表面，融合蛋白的氨基酸序列為Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met。
本發(fā)明提供的重組噬菌體流感疫苗通過(guò)下列方法制得A、構(gòu)建重組噬菌體(1)由商業(yè)公司合成一段DNA序列，DNA序列已裝在pGEM-T載體上，DNA序列的5’端含有酶切位點(diǎn)EcoRI，3’端含有酶切位點(diǎn)EcoRV，各DNA序列編碼如下通用輔助性T細(xì)胞表位，編碼基因?yàn)閍tgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc；A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e的1～15氨基酸殘基，編碼基因?yàn)閍tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg；間隔子GPGPG編碼基因?yàn)間gtccgggtccgggt；B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸殘基，編碼基因?yàn)閍tgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttat cagctctccatttcatg；即該段DNA序列編碼Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白；(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、EcoRV將上述DNA序列從pGEM-T載體上切下后，插入T7噬菌體載體多克隆位點(diǎn)的EcoRI和EcoRV之間，正好位于T7噬菌體10B基因的3’端，得到重組噬菌體；
(3)用T7包裝抽提物包裝重組噬菌體，包裝產(chǎn)物用平板擴(kuò)增，用PCR的方法篩選陽(yáng)性重組噬菌體，重組噬菌體表達(dá)10B-Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白，其中，Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1-21)融合蛋白的氨基酸序列為Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met；B、重組噬菌體的制備甘油凍存的E.coli BLT5403菌株在LB固體培養(yǎng)基(ampr)平板上劃線接種，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；從平板上挑取單菌落，接種50ml M9TB培養(yǎng)基，37℃、250轉(zhuǎn)/分振蕩過(guò)夜；取2.5ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種500ml LB液體培養(yǎng)基(ampr)，培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8。挑取平板上的單個(gè)噬斑，接種于OD600＝0.6～0.8的LB液體培養(yǎng)基(ampr)，37℃、50轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)1～3小時(shí)至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；按常規(guī)方法用PEG沉淀噬菌體；用噬菌體稀釋液抽提沉淀，4℃、10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集上清。按常規(guī)方法測(cè)定噬菌體滴度，噬菌體滴度按pfu/ml計(jì)數(shù)，數(shù)值上等于“噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10”。用噬菌體稀釋液調(diào)整重組噬菌體濃度為1014pfu/ml，按照1∶4000比例加入甲醛，37℃ 100轉(zhuǎn)/分滅活4天后檢測(cè)滴度為0，按1ml噬菌體溶液加入100μl NaHSO3的比例中和殘余甲醛；C、制備重組噬菌體微球疫苗用蒸餾水配制1％殼聚糖，110℃高壓滅菌15分鐘，使用時(shí)用高壓滅菌的蒸餾水稀釋成0.1％，在渦旋振蕩下，按100μl 0.1％殼聚糖/1ml滅活重組噬菌體的比例將二者高速混合20秒～1分鐘，逐滴加入檸檬酸三鈉，使其成乳液狀，計(jì)算噬菌體微球疫苗的濃度，用滅菌蒸餾水調(diào)整濃度為5×1013pfu/ml，得重組噬菌體微球疫苗。
所述編碼基因?yàn)閍tgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc的通用輔助性T細(xì)胞表位為現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)表在(J Immunol，2001，166(1)481-489)。
所述編碼基因?yàn)閍tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg的A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e的1～15氨基酸殘基為現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)表在(Journal of Virology，2005，79(11)6644-6654)。
所述編碼基因?yàn)間gtccgggtccgggt的間隔子GPGPG為現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)表在(J Immunol，2002，168(11)5499-5506)。
所述編碼基因?yàn)閍tgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg的B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸殘基為現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)表在(GenBank AJ783395)。
所述限制性內(nèi)切酶EcoRI、EcoRV購(gòu)自大連寶生物工程公司。
所述T7噬菌體載體購(gòu)自Novagen公司。
所述T7包裝抽提物購(gòu)自Novagen公司。
所述甘油凍存的E.coli BLT5403購(gòu)自Novagen公司。
本發(fā)明解決的技術(shù)難點(diǎn)是A、如何克服A型流感高突變率和因頻繁的基因重組而造成免疫變異性大的難點(diǎn)，研制開(kāi)發(fā)針對(duì)病毒保守蛋白的新型疫苗。由于A型流感病毒的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e具有的高度保守性，B型流感病毒之間的BM2蛋白同樣具有高度保守性，并且與A型流感病毒的M2蛋白之間沒(méi)有明顯的同源性，兩種蛋白均為跨膜蛋白，在感染細(xì)胞膜上大量存在，因此用這兩種蛋白作為疫苗進(jìn)行接種可有效抵抗所有流感病毒株。B、由于噬菌體展示技術(shù)具有下列獨(dú)特優(yōu)勢(shì)(1)噬菌體作為表達(dá)產(chǎn)物的載體展示的是生物體自身翻譯機(jī)制產(chǎn)生的天然構(gòu)象產(chǎn)物，能很好的誘發(fā)機(jī)體的抗原-抗體免疫反應(yīng)；(2)噬菌體有強(qiáng)的免疫原性，是天然的免疫佐劑，在噬菌體表面表達(dá)的多肽易于接近抗體，容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別；(3)噬菌體可以募集T輔助細(xì)胞，而且噬菌體顆粒的不對(duì)稱性有利于引發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)。(4)由于噬菌體顆粒是由感染的細(xì)菌細(xì)胞分泌，噬菌體顆?？梢苑奖愕拇笠?guī)模生產(chǎn)疫苗用抗原表位，還可以在同一噬菌體上展示多個(gè)具有保護(hù)性作用的抗原決定簇，構(gòu)建多價(jià)疫苗；(5)純化簡(jiǎn)單、花費(fèi)少；(6)噬菌體顆粒穩(wěn)定，對(duì)理化因素的抵抗力強(qiáng)。因此，由于應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)研究基因工程疫苗具有以上的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)疫苗和其它基因工程疫苗產(chǎn)量不高、純化復(fù)雜等缺陷。使M2e(1～15)和BM2(1～21)展示在T7噬菌體的表面，進(jìn)一步制備重組噬菌體微球疫苗，利用T7噬菌體具有的病毒樣顆粒的佐劑特性，有效增強(qiáng)M2e、BM2特異性的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果(1)本發(fā)明利用噬菌體具有的病毒樣顆粒的佐劑特性，用T7噬菌體作載體制備的重組噬菌體流感疫苗能同時(shí)提供對(duì)人類A型流感病毒不同亞型和B型流感病毒的保護(hù)作用，具有普適性，因而應(yīng)用范圍更廣；(2)由于T7噬菌體易于生產(chǎn)、便于純化，用于生產(chǎn)基因工程疫苗具有多種優(yōu)勢(shì)，因此，本發(fā)明制備的重組噬菌體流感疫苗便于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低廉。
本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，其結(jié)果如下1、重組噬菌體微球疫苗免疫豚鼠流感疫苗的研究多采用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但最新的研究發(fā)現(xiàn)(PNAS，2006，103(26)9988-9992)，與小鼠不同，流感病毒能在豚鼠的上呼吸道以及下呼吸道復(fù)制，在豚鼠的鼻腔分泌物中檢測(cè)到大量流感病毒，說(shuō)明豚鼠更加敏感，是研究流感疫苗保護(hù)效果的更理想的動(dòng)物模型?；诖?，本發(fā)明的發(fā)明人采用豚鼠進(jìn)行以下的重組噬菌體微球疫苗鼻腔免疫實(shí)驗(yàn)。豚鼠分組，每組5只。豚鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，滴鼻免疫重組噬菌體流感微球疫苗作為疫苗組，對(duì)照組滴鼻免疫T7噬菌體空載體，免疫劑量均為0.5×1013pfu/次，體積是400μl/只。隔周免疫1次，共免疫3次。
2、攻毒及疫苗保護(hù)效果檢測(cè)末次免疫后2周，用WHO推薦的流感疫苗組分即H1N1 A型流感病毒、H3N2A型流感病毒和1個(gè)型別B型流感病毒進(jìn)行攻擊。攻擊途徑都是滴鼻，劑量采用文獻(xiàn)報(bào)道的豚鼠的感染劑量103pfu(PNAS，2006，103(26)9988-9992)。
攻擊后隔天給豚鼠稱重并檢測(cè)豚鼠鼻腔、肺部的病毒滴度。鼻腔病毒滴度檢測(cè)的具體作法是在豚鼠鼻腔中滴加1ml PBS緩沖液，用平皿收集鼻腔清洗液，轉(zhuǎn)到1.5ml Eppendorf管中，4℃ 2,000g離心5分鐘，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度檢測(cè)。肺部病毒滴度檢測(cè)的具體作法是處死豚鼠，打開(kāi)胸腔，摘取全肺，分別將各小鼠肺置勻漿器中加生理鹽水，肺重(g)∶生理鹽水(ml)＝1∶9，研磨制成勻漿，4℃12,000g離心10分鐘，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度檢測(cè)。病毒滴度檢測(cè)是通過(guò)10倍系列稀釋把病毒接種于MDCK細(xì)胞，進(jìn)行噬斑檢測(cè)。


圖1為感染H1N1后豚鼠的體重變化。
圖2為感染H1N1后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。
圖3為感染H3N2后豚鼠的體重變化。
圖4為感染H3N2后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。
圖5為感染B型流感病毒后豚鼠的體重變化。
圖6感染B型流感病毒后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。
本發(fā)明解決了流感病毒變異率極高，現(xiàn)有流感疫苗效果不理想的問(wèn)題，本發(fā)明制備的重組噬菌體流感疫苗能同時(shí)提供對(duì)人類A型流感病毒不同亞型(H1N1、H3N2)以及B型流感病毒的保護(hù)作用，其結(jié)果如下(附圖中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)均采用幾何平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.0軟件)(一)重組噬菌體流感疫苗對(duì)感染A型流感病毒H1N1的豚鼠的保護(hù)效果1、感染A型流感病毒H1N1后豚鼠的體重變化從圖1可以看出，感染A型流感病毒H1N1后，免疫重組噬菌體流感微球疫苗的豚鼠(疫苗組)和免疫噬菌體空載體的豚鼠(對(duì)照組)體重均逐漸上升，并且兩組在同一天檢測(cè)的體重沒(méi)有顯著差異，P＞0.05。這一結(jié)果說(shuō)明，豚鼠的體重變化不受流感病毒感染的影響，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的一致(PNAS，2006，103(26)9988-9992)。
2、感染A型流感病毒H1N1后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度從圖2可以看出，感染A型流感病毒H1N1后，免疫重組噬菌體流感微球疫苗的豚鼠(疫苗組)與免疫噬菌體空載體的豚鼠(對(duì)照組)鼻腔清洗液的病毒滴度均在第3天時(shí)達(dá)到最高，分別為5.39±0.86、6.27±0.49，兩組之間差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明重組噬菌體流感微球疫苗有效保護(hù)了免疫豚鼠，使A型流感病毒H1N1在上呼吸道的增殖減弱。3天后鼻腔清洗液的病毒滴度逐漸下降，在第11天時(shí)兩組均檢測(cè)不到病毒。
感染A型流感病毒H1N1后，疫苗組肺勻漿與對(duì)照組肺勻漿的病毒滴度在第1天時(shí)分別為2.18±0.31、3.09±0.5，兩組之間差異顯著，P＜0.05；并且兩組在第3天時(shí)均達(dá)到最高，分別為3.58±0.64、4.28±0.65，兩組之間差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明重組噬菌體流感微球疫苗有效保護(hù)了免疫豚鼠，使A型流感病毒H1N1在肺部的增殖減弱。在第5天時(shí)兩組均檢測(cè)不到病毒。
(二)重組噬菌體流感疫苗對(duì)感染A型流感病毒H3N2的豚鼠的保護(hù)效果1、感染A型流感病毒H3N2后豚鼠的體重變化從圖3可以看出，感染A型流感病毒H3N2后，免疫重組噬菌體流感微球疫苗的豚鼠(疫苗組)和免疫噬菌體空載體的豚鼠(對(duì)照組)體重均逐漸上升，并且兩組在同一天檢測(cè)的體重沒(méi)有顯著差異，P＞0.05。
2、感染A型流感病毒H3N2后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度從圖4可以看出，感染A型流感病毒H3N2后，免疫重組噬菌體流感微球疫苗的豚鼠(疫苗組)與免疫噬菌體空載體的豚鼠(對(duì)照組)鼻腔清洗液的病毒滴度在第1天時(shí)分別為4.04±0.66、5.35±0.44，兩組之間差異顯著，P＜0.05；并且兩組在第3天時(shí)均達(dá)到最高，分別為4.77±0.58、5.82±0.51，兩組之間差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明重組噬菌體流感微球疫苗有效保護(hù)了免疫豚鼠，使A型流感病毒H3N2在上呼吸道的增殖減弱。3天后鼻腔清洗液的病毒滴度逐漸下降，在第11天時(shí)兩組均檢測(cè)不到病毒。
感染A型流感病毒H3N2后，疫苗組肺勻漿與對(duì)照組肺勻漿的病毒滴度在第1天時(shí)分別為2.25±0.41、3.43±0.66，兩組之間差異顯著，P＜0.05；并且兩組在第3天時(shí)均達(dá)到最高，分別為4.11±0.74、4.79±0.82，兩組之間差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明重組噬菌體流感微球疫苗有效保護(hù)了免疫豚鼠，使A型流感病毒H3N2在肺部的增殖減弱。在第5天時(shí)兩組均檢測(cè)不到病毒。
(三)重組噬菌體流感疫苗對(duì)感染B型流感病毒的豚鼠的保護(hù)效果1、感染B型流感病毒后豚鼠的體重變化從圖5可以看出，感染B型流感病毒后，免疫重組噬菌體流感微球疫苗的豚鼠(疫苗組)和免疫噬菌體空載體的豚鼠(對(duì)照組)體重均逐漸上升，并且兩組在同一天檢測(cè)的體重沒(méi)有顯著差異，P＞0.05。
2、感染B型流感病毒后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度從圖6可以看出，感染B型流感病毒后，免疫重組噬菌體流感微球疫苗的豚鼠(疫苗組)與免疫噬菌體空載體的豚鼠(對(duì)照組)鼻腔清洗液的病毒滴度在第1天時(shí)分別為4.07±0.31、4.62±0.52，兩組之間差異顯著，P＜0.05；并且兩組在第3天時(shí)均達(dá)到最高，分別為4.94±0.46、6±0.41，兩組之間差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明重組噬菌體流感微球疫苗有效保護(hù)了免疫豚鼠，使B型流感病毒在上呼吸道的增殖減弱。3天后鼻腔清洗液的病毒滴度逐漸下降，在第11天時(shí)兩組均檢測(cè)不到病毒。
感染B型流感病毒后，疫苗組肺勻漿與對(duì)照組肺勻漿的病毒滴度在第1天時(shí)分別為2.22±0.36、3.52±0.69，兩組之間差異顯著，P＜0.05；并且兩組在第3天時(shí)均達(dá)到最高，分別為3.66±0.62、4.89±0.44，兩組之間差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明重組噬菌體流感微球疫苗有效保護(hù)了免疫豚鼠，使B型流感病毒在肺部的增殖減弱。在第5天時(shí)兩組均檢測(cè)不到病毒。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明之內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1A、構(gòu)建重組噬菌體由商業(yè)公司合成一段DNA序列，DNA序列已裝在pGEM-T載體上，DNA序列的5’端含有酶切位點(diǎn)EcoRI，3’端含有酶切位點(diǎn)EcoRV，DNA序列編碼以下的多肽通用輔助性T細(xì)胞表位，編碼基因?yàn)閍tgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc；A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e的1～15氨基酸殘基，編碼基因?yàn)閍tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg；間隔子GPGPG，編碼基因?yàn)間gtccgggtccgggt；以及B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸殘基，編碼基因?yàn)閍tgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg；即該段DNA序列編碼Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白。
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和EcoR V處理重組的pGEM-T載體，得到含有EcoRI和EcoRV粘性末端的上述DNA序列；將DNA序列插入T7噬菌體載體T7 Select 10-3b載體多克隆位點(diǎn)的EcoRI和EcoRV之間，正好位于T7噬菌體10B基因的3’端，得到重組噬菌體。
重組pGEM-T載體雙酶切體系10×H Buffer 10μlEcoRI5μl
EcoR V5μl重組pGEM-T載體80μl
總體積100μl37℃水浴60分鐘，1％瓊脂糖凝膠電泳、用小量膠回收試劑盒(購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司)回收目的片段。
T7噬菌體載體雙酶切體系10×H Buffer 2μlEcoR I 1μlEcoR V 1μlT7 Select 10-3b5μlddH2O 11μl
總體積 20μl37℃水浴60分鐘，用小量膠回收試劑盒，按DNA片段純化的操作回收載體。
連接反應(yīng)體系T7 Select 10-3b的回收產(chǎn)物 0.5μlDNA片段的回收產(chǎn)物 2μlSolution I(購(gòu)自大連寶生物工程公司)2.5μl
總體積5μl室溫連接過(guò)夜。
重組噬菌體的包裝連接產(chǎn)物 5μlT7 Packaging Extracts 25μl
總體積30μl室溫包裝2小時(shí)后在反應(yīng)體系中加入270μl LB培養(yǎng)基終止。
包裝產(chǎn)物的平板擴(kuò)增100μl包裝反應(yīng)物與250μl新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的BLT5403菌液(OD600＝1.0)混勻后，迅速與5ml融化后42℃溫浴的上層瓊脂混合均勻并鋪平板，平板靜置至上層瓊脂凝固后，37℃培養(yǎng)至形成噬斑。
挑取噬斑，用PCR篩選陽(yáng)性重組噬菌體。重組噬菌體表達(dá)10B-Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白。
B、重組噬菌體的大量制備甘油凍存的E.coli BLT5403菌株在LB固體培養(yǎng)基(ampr)平板上劃線接種，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；從平板上挑取單菌落，接種50ml M9TB培養(yǎng)基，37℃、250轉(zhuǎn)/分振蕩過(guò)夜；取2.5ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種500ml LB液體培養(yǎng)基(ampr)，培養(yǎng)至OD600＝0.6。挑取平板上的單個(gè)噬斑，接種于OD600＝0.6的LB液體培養(yǎng)基(ampr)，37℃、50轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2小時(shí)至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；按常規(guī)方法用PEG沉淀噬菌體；用噬菌體稀釋液抽提沉淀，4℃、10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集上清。按常規(guī)方法測(cè)定噬菌體滴度，噬菌體滴度按pfu/ml計(jì)數(shù)，數(shù)值上等于“噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10”。用噬菌體稀釋液調(diào)整重組噬菌體濃度為1014pfu/ml，按照1∶4000比例加入甲醛，37℃100轉(zhuǎn)/分滅活4天后檢測(cè)滴度為0，按1ml噬菌體溶液加入100μl NaHSO3的比例中和殘余甲醛。
C、制備重組噬菌體微球疫苗用蒸餾水配制1％殼聚糖，110℃高壓滅菌15分鐘，使用時(shí)用高壓滅菌的蒸餾水稀釋成0.1％。在渦旋振蕩下，按100μl 0.1％殼聚糖/1ml滅活重組噬菌體的比例將二者高速混合40秒，逐滴加入檸檬酸三鈉，使其成乳液狀。計(jì)算噬菌體微球疫苗的濃度，用滅菌蒸餾水調(diào)整濃度為5×1013pfu/ml。
D、重組噬菌體微球疫苗免疫豚鼠豚鼠分組，每組5只。豚鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，取15組滴鼻免疫重組噬菌體流感微球疫苗作為疫苗組，另外15組滴鼻免疫T7噬菌體空載體作為對(duì)照組，免疫劑量均為0.5×1013pfu/次，體積是400μl/只。隔周免疫1次，共免疫3次。
E、攻毒及疫苗保護(hù)效果檢測(cè)末次免疫后2周，用WHO推薦的流感疫苗組分即H1N1 A型流感病毒、H3N2A型流感病毒和1個(gè)型別B型流感病毒進(jìn)行攻擊。所有豚鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，疫苗組取5組用H1N1流感病毒攻擊，5組用H3N2流感病毒攻擊，5組用B型流感病毒攻擊；同樣，對(duì)照組取5組用H1N1流感病毒攻擊，5組用H3N2流感病毒攻擊，5組豚鼠用B型流感病毒攻擊。攻擊途徑都是滴鼻，劑量采用豚鼠的感染劑量103pfu。
攻擊后隔天給豚鼠稱重并檢測(cè)豚鼠鼻腔、肺部的病毒滴度。鼻腔病毒滴度檢測(cè)的具體作法是在豚鼠鼻腔中滴加1ml PBS緩沖液，用平皿收集鼻腔清洗液，轉(zhuǎn)到1.5ml Eppendorf管中，4℃ 2,000g離心5分鐘，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度檢測(cè)。肺部病毒滴度檢測(cè)的具體作法是處死豚鼠，打開(kāi)胸腔，摘取全肺，分別將各小鼠肺置勻漿器中加生理鹽水，肺重(g)∶生理鹽水(ml)＝1∶9，研磨制成勻漿，4℃ 12,000g離心10分鐘，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度檢測(cè)。病毒滴度檢測(cè)是通過(guò)10倍系列稀釋把病毒接種于MDCK細(xì)胞，進(jìn)行噬斑檢測(cè)。
噬菌體展示的廣譜流感疫苗表達(dá)的Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白的氨基酸序列如下Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met通用輔助性T細(xì)胞表位的編碼基因atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactcA型流感病毒M2e的1～15氨基酸殘基的編碼基因atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg間隔子GPGPG的編碼基因ggtccgggtccgggtB型流感病毒BM2的1～21氨基酸殘基的編碼基因atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttc 60atg 6權(quán)利要求
1.一種重組噬菌體流感疫苗，其特征在于它由重組噬菌體制得，其中重組噬菌體由下列組分構(gòu)建而成將含有編碼基因?yàn)閍tgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc的通用輔助性T細(xì)胞表位，編碼基因?yàn)閍tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg的A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e的1～15氨基酸殘基，編碼基因?yàn)間gtccgggtccgggt的間隔子GPGPG以及編碼基因?yàn)閍tgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg的B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸殘基的融合蛋白插入T7噬菌體衣殼蛋白10B的C端，使融合蛋白展示在T7噬菌體的表面，融合蛋白的氨基酸序列為Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組噬菌體流感疫苗，其特征在于通過(guò)下列方法制得A、構(gòu)建重組噬菌體(1)由商業(yè)公司合成一段DNA序列，DNA序列已裝在pGEM-T載體上，DNA序列的5’端含有酶切位點(diǎn)EcoR I，3’端含有酶切位點(diǎn)EcoR V，各DNA序列編碼如下通用輔助性T細(xì)胞表位，編碼基因?yàn)閍tgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc；A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e的1～15氨基酸殘基，編碼基因?yàn)閍tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg；間隔子GPGPG，編碼基因?yàn)間gtccgggtccgggt；B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的l～21氨基酸殘基，編碼基因?yàn)閍tgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg；即該段DNA序列編碼Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白；(2)用限制性內(nèi)切酶EcoR I、EcoR V將上述DNA序列從pGEM-T載體上切下后，插入T7噬菌體載體多克隆位點(diǎn)的EcoR I和EcoR V之間，正好位于T7噬菌體10B基因的3’端，得到重組噬菌體；(3)用T7包裝抽提物包裝重組噬菌體，包裝產(chǎn)物用平板擴(kuò)增，用PCR的方法篩選陽(yáng)性重組噬菌體，重組噬菌體表達(dá)10B-Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白，其中，Th-M2e(1～15)-間隔子-BM2(1～21)融合蛋白的氨基酸序列為Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met；B、重組噬菌體的制備甘油凍存的E.coli BLT5403菌株在LB固體培養(yǎng)基(ampr)平板上劃線接種，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；從平板上挑取單菌落，接種50ml M9TB培養(yǎng)基，37℃、250轉(zhuǎn)/分振蕩過(guò)夜；取2.5ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種500ml LB液體培養(yǎng)基(ampr)，培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8。挑取平板上的單個(gè)噬斑，接種于OD600＝0.6～0.8的LB液體培養(yǎng)基(ampr)，37℃、50轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)1～3小時(shí)至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；按常規(guī)方法用PEG沉淀噬菌體；用噬菌體稀釋液抽提沉淀，4℃、10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集上清。按常規(guī)方法測(cè)定噬菌體滴度，噬菌體滴度按pfu/ml計(jì)數(shù)，數(shù)值上等于“噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10”。用噬菌體稀釋液調(diào)整重組噬菌體濃度為1014pfu/ml，按照1∶4000比例加入甲醛，37℃100轉(zhuǎn)/分滅活4天后檢測(cè)滴度為0，按1ml噬菌體溶液加入100μl NaHSO3的比例中和殘余甲醛；C、制備重組噬菌體微球疫苗用蒸餾水配制1％殼聚糖，110℃高壓滅菌15分鐘，使用時(shí)用高壓滅菌的蒸餾水稀釋成0.1％，在渦旋振蕩下，按100μl 0.1％殼聚糖/1ml滅活重組噬菌體的比例將二者高速混合20秒～1分鐘，逐滴加入檸檬酸三鈉，使其成乳液狀，計(jì)算噬菌體微球疫苗的濃度，用滅菌蒸餾水調(diào)整濃度為5×1013pfu/ml，得重組噬菌體微球疫苗。
3.權(quán)利要求1所述的重組噬菌體流感疫苗，其特征在于所述的T7噬菌體載體，T7噬菌體載體為T(mén)7 Select 10-3b。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、疫苗學(xué)領(lǐng)域，是一種噬菌體展示的廣譜流感疫苗，并進(jìn)一步涉及噬菌體展示的廣譜流感疫苗的制備方法。由于流感病毒高度變異，現(xiàn)有的流感疫苗不能提供針對(duì)不同型別的流感病毒的保護(hù)。本發(fā)明將高度保守的A型流感病毒包膜蛋白M的胞外區(qū)M2e編碼基因和B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的部分編碼基因插入T7噬菌體，構(gòu)建成普適性的重組噬菌體流感疫苗，進(jìn)一步制備成重組噬菌體流感微球疫苗。本疫苗經(jīng)預(yù)防接種后，能同時(shí)提供對(duì)A型流感病毒不同亞型和B型流感病毒攻擊的保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101015691SQ20061004881
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2006年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日
發(fā)明者胡云章, 胡凝珠, 瞿素 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所