專利名稱：Brsk2在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種神經(jīng)元分化相關(guān)基因，即BRSK2，的新用途。
背景技術(shù)：
BRSK2 (Brain Selective Kinase 2)蛋白激酶在2002年由Manning等人根據(jù) 激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸的保守性歸類到AMPK (AMP-activated Protein Kinase)激酶 亞家族。這個(gè)亞家族共有14個(gè)成員，包括AMPKal，AMPKo2，BRSKl/SAD-A， BRSK2/SAD-B， MARK1， MARK2， MARK3/Par-1A/C-TAK1， MARK4, NUAK1/ARK5, NUAK2/SNARI^ QSK SIK和MELK。在這些種內(nèi)同源激酶中，AMPK被認(rèn)為是一個(gè)監(jiān)控細(xì)胞能量狀態(tài)的探測(cè)器。 ATP的耗竭以及AMP濃度的上升，或者更準(zhǔn)確的說是AMP:ATP比率的上升可 導(dǎo)致AMPK的激活。AMPK激活后將關(guān)閉消耗ATP的合成代謝途徑并激活A(yù)TP 合成的分解代謝途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝水平。除了 AMPK以外，這個(gè)亞家族 的其它成員的功能最近幾年才開始有比較多的研究。BRSK2是AMPK激酶亞家族成員，對(duì)于該蛋白激酶的研究已有的報(bào)道主要 著重于BRSK2在腦中與神經(jīng)元極化相關(guān)的研究。小鼠中同源基因的敲除使得小 鼠顯示出很少的自主運(yùn)動(dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱，出生后兩小時(shí)死亡。熒光染料 染色顯示突變小鼠的神經(jīng)元軸突和樹突難以分辨。體外培養(yǎng)的突變小鼠的大腦皮 層和海馬神經(jīng)元不能形成明顯的軸突和樹突。最近的研究更是表明，BRSK2參 與了神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)。然而，到目前為止，尚未有人報(bào)道BRSK2對(duì)腦和神經(jīng)以外器官或者組織的 作用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)元分化相關(guān)基因，即BRSK2，的新用途，即其 在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2 (NCBI中核苷酸的序列號(hào)為 AF533880,核苷酸的序列號(hào)為AAP97727)在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的人BRSK2可以作為篩選和制備抗糖尿病藥物的藥耙。從而為尋找 有效的抗糖尿病藥物提供一種新的方法和途徑。本發(fā)明對(duì)于該基因的研究發(fā)現(xiàn)，BRSK2在胰腺中有很髙的表達(dá)量，甚至 超過在腦中的表達(dá)量。進(jìn)一步的免疫組化結(jié)果顯示，BRSK2主要在胰腺的胰島 中高表達(dá)。將BRSK2在小鼠的胰島P細(xì)胞(NTT)中過量表達(dá)，放射性免疫學(xué)方 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量，結(jié)果顯示，胰島素分泌減少；另一方面用 siRNA的方法干擾小鼠的胰島p細(xì)胞(NTT)中內(nèi)源BRSK2，同樣的放射性免疫 學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。由此認(rèn)為，BRSK2 可能與糖尿病的發(fā)生相關(guān)，并且可能是糖尿病治療的靶標(biāo)。 一方面，通過檢測(cè) BRSK2表達(dá)量及活性的變化可以預(yù)見胰島素分泌量的變化,即BRSK2活力越高， 胰島素分泌量越低；BRSK2活力越低，胰島素分泌量越高。另一方面，以BRSK2 為靶標(biāo)，篩選抑制BRSK2活力的物質(zhì)或者方法，可以用于增加胰島素分泌量， 從而達(dá)到治療或者緩解以胰島素分泌量下降為癥狀的糖尿病。本發(fā)明的一種試劑盒中,:包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2蛋白。該試劑盒 還可含有檢測(cè)蛋白活力所需的其他試劑，例如緩沖液、分子量標(biāo)記等及使用 說明。該試劑盒中還可以包含檢測(cè)蛋白活性所用的底物等試劑。本發(fā)明的BRSK2蛋白可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。如基因工程方法 或者人工合成方法等。例如，可將BRSK2基因表達(dá)為蛋白而得。本發(fā)明的BRSK2基因可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的BRSK2 基因序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò) 增法，可根據(jù)本發(fā)明的BRSK2核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員巳知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作 為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。在本發(fā)明中，術(shù)語"神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2"指編碼具有BRSK2蛋 白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列號(hào)為AAP97727的序列及其簡(jiǎn)并序 列。該簡(jiǎn)并序列是指該核酸序列開放閱讀框中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同 氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與該核 酸序列開放閱讀框序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出神經(jīng)元分化相 關(guān)基因BRSK2的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊 條件下，與AAP97727開放閱讀框序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與 AAP97727開放閱讀框序列的同源性至少70%,較佳地至少80%，更佳地至少 卯％的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼序列號(hào)為AF533880氨基酸序列的核苷酸序列變異形 式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為l-卯個(gè)，較佳地l-60個(gè)， 更佳地l-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或 3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最 佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。獲得了 BRSK2基因序列后，就可以將BRSK2基因序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載 體，以獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。--旦獲得了含有BRSK2基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒， 就可將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)。在本發(fā)明中，術(shù)語"BRSK2蛋白"指可影響胰島素分泌的BRSK2多肽。 該術(shù)語還包括可影響胰島素分泌的BRSK2變異形式。這些變異形式包括(但并不 限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10 個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通 常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為IO個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本 領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。 又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的 功能。該術(shù)語還包括人BRSK2蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突 變體、誘導(dǎo)突變體、在髙或低的嚴(yán)緊度條件下能與人BRSK2DNA雜交的DNA
所編碼的蛋白、以及利用抗人BRSK2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明 還提供了其他多肽，如包含人BRSK2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng) 的多肽外，本發(fā)明還包括了人BRSK2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人 BRSK2多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較 佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氣基酸，最佳地至少約 100個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供人BRSK2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人BRSK2 多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差 異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通 過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘 變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、 Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如 乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一歩加 工歩驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖 基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷 酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修 飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明中，術(shù)語"活力"是指單位體積中，BRSK2抑制胰島素分泌的能力， 亦可理解為單位體積BRSK2表達(dá)量與活性的乘積。本發(fā)明的另一種試劑盒中，包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2的擴(kuò)增引物。 它含有特異性擴(kuò)增人BRSK2的引物對(duì)和使用說明。該試劑盒還可含有將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自BRSK2 的序列，長(zhǎng)度為15-35。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測(cè)樣品中 是否含有BRSK2的核酸序列及其數(shù)量。該試劑盒還可含有進(jìn)行PCR反應(yīng)所 需的其他試劑，例如緩沖液等。此外，較佳地，至少一個(gè)所用的引物跨越了兩個(gè)外顯子，因?yàn)榇藭r(shí)對(duì)應(yīng)
于BRSK2的基因組序列將不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的另一種試劑盒中，包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2的反義核酸。 該試劑盒還可含有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑及使用說明。上述反義核酸可以是指一種用作探針的核酸分子，該分子通常具有人 BRSK2多肽編碼序列互補(bǔ)序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針 可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人BRSK2的核酸分子。用于檢測(cè)人BRSK2核 苷酸序列時(shí)，具體歩驟包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā) 生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人 BRSK2多肽的編碼序列互補(bǔ)序列，并可位于該編碼序列互補(bǔ)序列的兩側(cè)或中間。 引物長(zhǎng)度--般為15-50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的BRSK2可以作為耙標(biāo)，篩選抑制BRSK2活力的物質(zhì)或者方法。 篩選方法包括以下步驟A選擇候選化合物；B提供檢測(cè)BRSK2表達(dá)或者活 性的體系；C用BRSK2的檢測(cè)體系選擇候選化合物；D確定BRSK2表達(dá)量或 者活性在候選化合物的影響下的改變。所述候選化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括 DNA、 RNA等，可以是siRNA、反義寡核苷酸、核酶或者與BRSK2核苷酸序列 互補(bǔ)的其它核酸分子；氨基酸包括肽、抗體、互作蛋白等；小分子化合物則包括 天然和人工的合成的。作為靶標(biāo)的除了 BRSK2蛋白，還可以是BRSK2基因、BRSK2的mRNA、 BRSK2的表達(dá)產(chǎn)物及其前述三者的特異性片斷。所述"特異性片斷"是指可以區(qū) 別本發(fā)明的BRSK2與其它基因的片斷。利用本發(fā)明的BRSK2，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與其發(fā)生相互作用 的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。這些與BRSK2發(fā)生相互作用或者抑制其活 性的物質(zhì)可以是核酸、氨基酸、化合物等。本發(fā)明的BRSK2及其抑制劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)， 可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6，8,盡管pH值可 隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通 過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的人BRSK2蛋白的抑制劑為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受 的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或 賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人BRSK2可以被制成針劑 形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制 備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物 如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效 量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的BRSK2 還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的人BRSK2蛋白抑制劑被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該抑 制劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且 在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素， 這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明中，所述的抗糖尿病藥物是由含有效治療量的BRSK2抑制劑和藥學(xué) 上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。 其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發(fā)明的另一種試劑盒中，包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2的抗體。該試 劑盒還可含有緩沖液、抗原抗體反應(yīng)相關(guān)的其它試劑及使用說明。該試劑盒 用于直接檢測(cè)樣品中BRSK2蛋白的數(shù)量以及含有BRSK2蛋白的活性。該試劑盒中含有BRSR2的特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單 克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于人BRSK2基因產(chǎn)物或片段。較 佳地，指那些能與人BRSK2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān) 抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人BRSK2蛋白活性的 分子，也包括那些并不影響人BRSK2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與 修飾或未經(jīng)修飾形式的人BR3K2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的
單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片 段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利 No. 4,946,778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性伹仍保留來自人的抗體部 分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如， 純化的人BRSK2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多 克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)BRSK2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用 來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可 以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256;495, 1975; Kohler等人， Eur丄Immunol. 6:511, 1976; K。hler等人，Eur丄Imm咖l. 6:292， 1976j Hammerling 等人.In Monoclonal Antibodies and T Cell Hvbridomas. Elsevier. N.Y.. 1981、。本發(fā) 明的抗體包括能阻斷人BRSK2功能的抗體以及不影響人BRSK2功能的抗體。 本發(fā)明的各類抗體可以利用人BRSK2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫 技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與 人BRSK2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如五.Co/Z)中生 產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷 酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來 免疫動(dòng)物而獲得。通過檢測(cè)BRSK2活力的變化可以預(yù)見胰島素分泌量的變化，即BRSK2活 力越高，胰島素分泌量越低;BRSK2活力越低，胰島素分泌量越高。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床 綜合征。因胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足以及耙組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要標(biāo)志， 久病可引起多個(gè)系統(tǒng)損害。病情嚴(yán)懲或應(yīng)激時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。糖尿病主要臨床類型胰島素依賴型糖尿病(IDDM, I型)可發(fā)生在任何年 齡，但多發(fā)生于青幼年。臨床特點(diǎn)是起病急，多食、多尿、多飲、體重減輕等癥 狀較明顯，有發(fā)生酮癥酸中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。起病初期
血中胰島細(xì)胞自身抗體陽性率髙。口服葡萄糖胰島釋放試驗(yàn)可見基礎(chǔ)胰島素水平 低于正常，葡萄糖刺激后胰島素分泌曲線低平，顯示胰島素缺乏。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM， II型)也可發(fā)生在任何年齡，但多見于 40歲以后中、老年。大多數(shù)病人起病緩慢，臨床癥狀相對(duì)較輕或缺如。無酮癥酸 中毒傾向，但在一定誘因作用下，也可發(fā)生酮癥酸中毒或髙滲性昏迷。依賴胰島 素，但在飲食和口服降糖藥治療效果欠佳時(shí)，或因并發(fā)癥和伴發(fā)病的存在，有時(shí) 亦需要用胰島素控制髙血糖。胰島細(xì)胞自身抗體陽性?？崭寡獫{胰島素水平可正 常、輕度降低或高于正常。胰島素對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)可稍低、基本正?；蚋哂?正常，分泌高峰延遲。一方面，BRSK2在小鼠的胰島P細(xì)胞(NIT)中過量表達(dá)，將導(dǎo)致胰島素分 泌減少；另一方面，干擾小鼠的胰島p細(xì)胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2的表達(dá)及活性， 細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。因此認(rèn)為，BRSK2有抑制胰島素分泌的功 能，可以作為新的抗糖尿病藥物或者藥靶進(jìn)行開發(fā)，為檢測(cè)和治療糖尿病提供了 一種新的途徑和手段。


圖1為BRSK2的Northern雜交圖?？梢?，BRSK2主要在腦和胰腺中表達(dá)， 尤其以胰腺中的表達(dá)量為最髙。圖2為BRSK2的Western雜交圖。可見，western的結(jié)果與前面Northern 的結(jié)果一致，BRSK2在小鼠中也主要在腦和胰腺表達(dá)。圖3為BRSK2在小鼠胰腺組織中的定位圖。圖4為BRSK2過量表達(dá)對(duì)胰島素分泌的影響圖。該圖中，從左到右的柱狀 圖依次為胰島素測(cè)定濃度、細(xì)胞數(shù)和相對(duì)胰島素分泌值對(duì)空白對(duì)照與加入BRSK2 后對(duì)細(xì)胞的影響。從相對(duì)胰島素分泌值圖和最右側(cè)的western圖可見，BRSK2過 量表達(dá)將導(dǎo)致胰島素分泌降低。圖5為BRSK2被內(nèi)源干擾后對(duì)胰島素分泌的影響圖。該圖中，從左到右的 柱狀圖依次為胰島素測(cè)定濃度、細(xì)胞數(shù)和相對(duì)胰島素分泌值對(duì)空白對(duì)照與加入 siRNA (llil、 3ul、 5ul)后對(duì)細(xì)胞的影響。從相對(duì)胰島素分泌值圖和最右側(cè)的 western圖可見，BRSK2被內(nèi)源干擾后將導(dǎo)致胰島素分泌升高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 BRSK2在胰腺中Northern雜交表達(dá) 的具體步驟是1.1 cDNA探針制備與純化(1) 用BRSK2基因的特異的引物從構(gòu)建好并已經(jīng)測(cè)序的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到 PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒純化后，用GeneQuant II型紫 外分光光度計(jì)測(cè)定純化后DNA的濃度。(2) DNA模板經(jīng)100X:熱變性2min后，用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒以隨機(jī)引物 標(biāo)記法摻入a -32PdCTP。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，加入EDTA至終濃度20 mmol/L 中止反應(yīng)，10(n:熱變性5min，置于冰上。(3) 將探針用MicroSpinG-25純化柱純化。純化前后分別取樣lfil稀釋100 倍，取3pl稀釋液點(diǎn)樣在Whatman DE81濾紙上，用Monitor卯0型放射性檢測(cè) 儀測(cè)定其放射強(qiáng)度(cps)。將純化后的放射性強(qiáng)度除以純化前的放射性強(qiáng)度記為 摻入率，摻入率大于30%則認(rèn)為探針制備合格。1.2 Northern印跡膜雜交(1) 將雜交膜用2XSSC液潤(rùn)濕后將膜帶RNA的一面朝上放入雜交管中， 每10cm2膜面積加入lml甲酰胺預(yù)雜交液，預(yù)雜交液含50%甲酰胺，5XSSPE， 10XDenhardt試劑，2%SDS lOOOmg/L小牛胸腺DNA。
42"預(yù)雜交2-4小時(shí)。(2) 預(yù)雜交結(jié)束后，將純化后的標(biāo)記探針加入剩余的預(yù)雜交液中。42C雜交 48小時(shí)。(3) 雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交液棄去，加入雜交洗脫液1 (2XSSC， 0.05% SDS)室溫洗滌3次，每次30 min，其間不?；蝿?dòng)膜。然后加入雜交洗脫液2 (0.1 XSSC, 0.1% SDS)， 50r洗滌2次，每次30 min。用Monitor 900型放射性檢 測(cè)儀測(cè)定整張膜上的放射強(qiáng)度。如果背景的放射強(qiáng)度過高，可以適當(dāng)提高洗膜溫 度再次洗滌。(4) 將洗滌完畢的膜放入保鮮袋中封口，進(jìn)行放射自顯影。從Northern的結(jié)果中我們可以看到，BRSK2主要在腦和胰腺中表達(dá)，尤其 以胰腺中的表達(dá)量為最髙。
實(shí)施例2制備抗體BRSK2蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法 進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠 中切下，并用等體積的完全Fre皿d's佐劑乳化。用50-100" g/0.2ml乳化過的蛋 白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund's佐劑乳化的同樣抗原， 對(duì)小鼠以50-100ti g/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一 次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次，獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人 BRSK2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋 白特異性地發(fā)生沉淀。實(shí)施例3 BRSK2在胰腺中Western雜交實(shí)驗(yàn) 3.1小鼠各組織蛋白的抽提(1) 切除的各種組織都立即速凍到液氮罐中，儲(chǔ)存在-80r。(2) 取50-100 mg的組織樣品，加400 jil的細(xì)胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑)。(3) 用研磨器研磨上述組織樣品直至成為懸濁液。(4) 在400 nl的懸濁液中加入100 nl的5X蛋白上樣緩沖液，IO(TC煮沸 lOmitio(5) 4X:，12，000ipm離心5min，上清即可用于上樣。 3.2 Western檢測(cè)小鼠各組織中BRSK2的內(nèi)源表達(dá)(1) 配制SDS-PAGE分離膠和積層膠。(2) 凝膠的灌注(流程如下)灌注分離膠-—加無水乙醇去氣泡-—室溫放置等待聚合-—倒去無水乙醇-一 用蒸餾水洗干凈凝膠頂部，吸干-—灌注積層膠馬上在積層膠溶液中插入梳 子_—等待聚合完全，拔出梳子-—將凝膠固定于電泳裝置上，上下電極中加入電泳緩沖液。(3) 將準(zhǔn)備好的樣品上樣。(4) 室溫150V電壓下進(jìn)行電泳,至蛋白Marker內(nèi)的染料前沿到達(dá)凝膠底部。(5) 卸膠，用轉(zhuǎn)移緩沖液平衡凝膠和硝酸纖維素膜20分鐘。(6) 在4t:下用濕式電轉(zhuǎn)移儀恒壓IOOV， 1小時(shí)，每塊凝膠兩側(cè)各墊3層 Whatman濾紙。(7) 硝酸纖維素膜在37'C下浸在55^脫脂奶粉溶液中緩慢搖動(dòng)，封閉1小時(shí)。(8) 加入 一抗，37TC溫育1-2小時(shí)。(9) 將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中輕輕搖動(dòng)，洗滌10分鐘，這樣再重復(fù)兩次。(10) 加入二抗，371C溫育1小時(shí)。(11) 同歩驟9洗膜三次。(12) 用ECL系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光。(13) 暗室壓片、顯影、定影。Western的結(jié)果與前面Northern的結(jié)果一致，BRSK2在小鼠中也主要在腦 和胰腺表達(dá)。實(shí)施例4免疫組化分析BRSK2在小鼠胰腺組織中的定位 (1)載玻片處理酸泡過夜，自來水清洗干凈。酒精浸泡30分鐘，烘干 后多聚賴氨酸處理。(2)成年小鼠胰腺的石蠟切片(切片厚度4阿)的脫水。(3) 蒸餾水新鮮配置3%11202,室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。(4) 0.01MPBS洗3次，每次5分鐘。(5) 加正常血清封閉液，37" 15分鐘。甩去多余的液體，不洗。(6) 分別加免疫前血清，1: 400稀釋的BRSK2多克隆抗體，4C過夜。0.01M PBS (PH7.2)洗3次，每次5分鐘。(7) 滴加生物素化羊抗兔的IgG， 37匸30分鐘。0.01MPBS (PH7.2)洗3 次，每次5分鐘。(8) 滴加試劑SABC， 37" 20分鐘。0.01MPBS洗3次，每次5分鐘。(9) DAB顯色使用DAB顯色試劑盒。取1毫升蒸餾水，依次加入A， B， C，各一滴?；靹蚝蠹拥角衅?，室溫顯色，鏡下控制顯色反應(yīng)，顯色好后蒸餾 水沖洗。(10) 蘇木素復(fù)染。脫水，透明，封片。(11)觀察，拍照。從免疫組化的結(jié)果中看出，BRSK2主要在胰腺組織的胰島中表達(dá)。 實(shí)施例5 BRSK2過量表達(dá)對(duì)胰島素分泌的影響(1) 將NIT細(xì)胞以lxl()S個(gè)/孔的密度接種在24孔板上，將細(xì)胞放入C02培 養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)18-24小時(shí)，使細(xì)胞豐度達(dá)到70-80%。(2) 用Invitrogen lipofectamine 2000真核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染 Pcmv-Myc空載體和Pcmv-Myc-BRSK2兩種質(zhì)粒，每種質(zhì)粒按照200ng/孔的濃 度各轉(zhuǎn)染4個(gè)孔。(3) 轉(zhuǎn)染后16小時(shí)，換成完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+15o/。胎牛血清) 繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(4) 重新更換完全培養(yǎng)基(糖濃度為25mM)，培養(yǎng)20分鐘后收集培養(yǎng)上清液。(5) 采用放射免疫分析法測(cè)定培養(yǎng)上清中胰島素的濃度，檢測(cè)試劑盒由上海 市生物制品研究所提供，測(cè)定值批內(nèi)CV<4.2%,批間cv〈.6y。。(6) 培養(yǎng)板上的細(xì)胞胰酶消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。(7) 收集計(jì)數(shù)后的細(xì)胞做Western blot檢測(cè)BRSK2-Myc的表達(dá)。(8) 處理分析數(shù)據(jù)。過量表達(dá)的結(jié)果顯示，小鼠胰島Beta細(xì)胞NIT中過量表達(dá)BRSK2以后， 胰島素相對(duì)分泌量減少。實(shí)施例6 siRNA干擾內(nèi)源BRSK2表達(dá)以后對(duì)胰島素分泌的影響(1) 將NIT細(xì)胞以lxl()5個(gè)/孔的密度接種在24孔板上，將細(xì)胞放入C02培 養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)18-24小時(shí)，使細(xì)胞豐度達(dá)到70-80%。(2) 用Invi加gen lipofectamine 2000真核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染 Nonsilence 5jil (siRNA干擾的陰性對(duì)照)，siRNA-5 lpl、 3^1和5nl (每pl的濃 度為20pM)。每種轉(zhuǎn)染重復(fù)4個(gè)孔。(3) 轉(zhuǎn)染后16小時(shí)，換成完全培養(yǎng)基(DMEM髙糖培養(yǎng)基+15n/。胎牛血清) 繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(4) 重新更換完全培養(yǎng)基(糖濃度為25mM)，培養(yǎng)20分鐘后收集培養(yǎng)上清液。(5) 采用放射免疫分析法測(cè)定培養(yǎng)上清中胰島素的濃度，檢測(cè)試劑盒由上海 市生物制品研究所提供，測(cè)定值批內(nèi)CV<4.2%,批間CV〈7.6。/0。(6) 培養(yǎng)板上的細(xì)胞胰酶消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。(7) 收集計(jì)數(shù)后的細(xì)胞做Westernblot檢測(cè)內(nèi)源BRSK2的表達(dá)。(8) 處理分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，用siRNA的方法干擾小鼠的胰島p細(xì)胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2， 同樣的放射性免疫學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。實(shí)施例7試劑盒的制備 試劑盒1:該試劑盒中，包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2的蛋白。該試劑盒還可含 有檢測(cè)蛋白表達(dá)量及其活性所需的其他試劑，例如緩沖液、分子量標(biāo)記、底 物等及使用說明。該試劑盒用于篩選抑制BRSK2表達(dá)的物質(zhì)。篩選方法如下首先，選擇候 選化合物；其次，設(shè)定陽性及陰性對(duì)照；用該試劑盒檢測(cè)BRSK2表達(dá)量或者活 性在候選化合物的影響下的改變。如果候選化合物使BRSK2表達(dá)量、活性顯著 降低或者使體系中胰島素的分泌量明顯增加，則認(rèn)為該候選化合物可以作為候選 的抗糖尿病藥劑。試劑盒2:該試劑盒含有針對(duì)人BRSK2的特異性的抗體(例如實(shí)施例2中制備的多 克隆抗體，或者用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗BRSK2的單克隆抗體)，和使 用說明。該試劑盒用于直接檢測(cè)樣品中BRSK2蛋白的數(shù)量以及含有BRSK2 蛋白的活性。先通過特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用常規(guī)技術(shù)檢測(cè) 免疫復(fù)合物。如果候選化合物或者候選方法使BRSK2表達(dá)量、活性顯著降低或 者使體系中胰島素的分泌量明顯增加，則認(rèn)為該候選化合物或者候選方法可以用 于治療或者緩解糖尿病。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，BRSK2是篩選和制備抗糖尿病藥物的藥耙。
3. —種試劑盒，其特征是，該試劑盒中包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2的蛋白。
4. 一種試劑盒，其特征是，該試劑盒中包括神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2 的抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種神經(jīng)元分化相關(guān)基因，即BRSK2，在制備抗糖尿病藥物中的新用途。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合征。臨床以高血糖為主要標(biāo)志，久病可引起多個(gè)系統(tǒng)損害。本發(fā)明的BRSK2有抑制胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物和藥靶進(jìn)行開發(fā)。本發(fā)明的BRSK2及其拮抗劑用于制備抗糖尿病藥物，將為治療和檢測(cè)糖尿病提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101130090SQ200610030258
公開日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2006年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月22日
發(fā)明者龍 余, 唐麗莎, 湯文文, 健 袁, 郭澤坤 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)