專利名稱：涉及嘧啶合成抑制劑的組合物和方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求要求以2004年5月21日提交的美國臨時(shí)申請No.60/573,558作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)，該臨時(shí)申請通過引用的方式全文納入本說明書。
致謝本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)No.RR17626，HL31197，HL075540，HL51173，HL72817資助款的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(RSV)是引起世界范圍內(nèi)嬰兒和兒童下呼吸道(LRT)疾病的最常見的病因，它也可能是診斷不足的成人社區(qū)獲得性LRT感染的病因。
1980-1996年間，5歲以下兒童中因發(fā)生細(xì)支氣管炎而住院治療的估計(jì)有一百六十五萬例，由此產(chǎn)生七百萬個(gè)住院日(inpatient day)。57％的上述的住院治療發(fā)生于6個(gè)月以下的兒童，81％發(fā)生于一歲以下的兒童。一歲以下兒童中，年細(xì)支氣管炎住院率從1980年的12.9‰至1996年的31.2‰增長了2.4倍。一歲以下兒童中，與細(xì)支氣管炎有關(guān)的因下呼吸道疾病的住院治療的比例從1980年的22.2％增長至1996年的47.4％；在總的住院治療中，這個(gè)比例從5.4％增長至16.4％。一歲以下兒童中，年細(xì)支氣管炎住院治療中估計(jì)有51,240至81,985例與RSV感染相關(guān)。如果還考慮到伴有肺炎的細(xì)支氣管炎住院治療，僅在美國每年就有最高達(dá)126,000例住院治療是由于RSV感染。現(xiàn)在對于RSV還沒有有效療法。
鼻漏、肺充血和低氧血癥是包括RSV感染在內(nèi)的多數(shù)呼吸道感染的重要組成部分，但對這些疾病中改變的肺部液體動(dòng)力學(xué)所暗含的機(jī)制仍知之甚少。另外，流行病學(xué)研究表明嬰兒中呼吸道合胞病毒(RSV)誘發(fā)的嚴(yán)重細(xì)支氣管炎和變應(yīng)性疾病關(guān)系密切。RSV感染對于牛也尤為重要，牛的這種感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病。
本領(lǐng)域中所需要的是預(yù)防和治療包括RSV感染在內(nèi)的呼吸道感染的改進(jìn)的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種包含嘧啶合成抑制劑和可藥用載體的組合物。該組合物適于向受試者的肺上皮細(xì)胞局部給藥。本發(fā)明還提供一種包含至少一份定量劑量的包含治療量嘧啶合成抑制劑的組合物的裝置。每份定量劑量包括治療受試者肺部疾病的嘧啶合成抑制劑的治療量或治療量的一部分。
本發(fā)明還提供使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體清除率增加的方法，治療受試者的肺部疾病的方法，減少受試者的一種或多種呼吸道合胞病毒感染癥狀或體征的方法，鑒別具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者并向該受試者給予包含有效量嘧啶合成抑制劑的組合物的方法，鑒別患有呼吸道合胞病毒感染的受試者并向該受試者給予包含可有效使受試者Na+依賴性肺泡液體減少的量的嘧啶合成抑制劑的組合物的方法，以及篩選使肺上皮細(xì)胞增加Na+依賴性液體吸收的測試化合物的方法。
其它優(yōu)點(diǎn)，部分將在說明書下文中得到說明，部分將從說明書中顯而易見，或者可通過實(shí)施下述方面而獲知。通過隨附的權(quán)利要求中具體指出的要素和組合，將認(rèn)識到并獲得下述的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)理解的是，前述的一般性說明和隨后的詳細(xì)說明均僅為示例性和解釋性的，并非限制性的。


了下述的多個(gè)方面內(nèi)容，這些附圖包含于本說明書中并且構(gòu)成說明書的一部分。
圖1為說明嘧啶和嘌呤生物合成途徑的示意圖。
圖2表示RSV感染對外周氧合作用的影響。(A)在有知覺的BALB/c小鼠(每天n＝10-36)中RSV感染對SmO2(混合氧飽和度)影響的時(shí)程。(B)假感染小鼠和RSV感染第2天的小鼠在肺泡液體清除(AFC)時(shí)期開始時(shí)和終末時(shí)的3導(dǎo)聯(lián)ECG(心電圖)描圖樣本。(C)RSV感染對第2天％ΔHR 30的影響(假感染小鼠n＝17；RSV感染小鼠n＝11)。與假感染小鼠比較，*p＜0.05。
圖3表示RSV感染對BALB/c小鼠的鼻電位差(NPD)的影響。(A)假感染小鼠和RSV感染第4天的小鼠的NPD代表性描圖。(B)RSV感染對基礎(chǔ)NPD的影響。(C)RSV感染對NPD的氨氯吡嗪脒(amiloride)敏感部分(NPDAMIL)的影響。(D)向假感染小鼠和RSV感染第4天的小鼠的鼻上皮施加±60nA脈沖時(shí)NPD改變的描圖樣本。(E)向鼻上皮施加±60nA脈沖后RSV感染對ΔNPD的影響。所有組均n＝5-9。圖中的描圖樣本上的虛線表示0mV，箭頭表示加入100μM氨氯吡嗪脒的時(shí)間。與假感染動(dòng)物比較，*p＜0.05，**p＜0.005。
圖4表示RSV感染后，核苷酸合成的抑制對體重的影響。(A)來氟米特(leflunomide)(一種UTP合成抑制劑)對BALB/c小鼠(未治療的小鼠n＝35；來氟米特治療的小鼠n＝19)RSV感染后的急性體重減輕的影響。(B)6-MP治療對BALB/c小鼠(未治療的小鼠n＝35；6-MP治療的小鼠n＝30)RSV感染后的急性體重減輕的影響。在各時(shí)間點(diǎn)與未治療的小鼠的體重比較，*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005。
圖5表明來氟米特(LEF)管飼小鼠的效應(yīng)使p.i.第2天的RSV介導(dǎo)的AFC抑制逆轉(zhuǎn)。LEF的效應(yīng)被同時(shí)給予尿苷阻滯。
圖6表明來氟米特(LEF)管飼小鼠的效應(yīng)使p.i.第2天的RSV誘導(dǎo)的肺部含水量的增加逆轉(zhuǎn)。LEF的效應(yīng)被同時(shí)給予尿苷阻滯。重要的是，用LEF和/或尿苷的治療對p.i.第二天的小鼠肺組織中的病毒復(fù)制沒有作用。
圖7表明向AFC滴注劑(instillate)加入廣譜的容積調(diào)節(jié)的陰離子通道(VRAC)抑制劑，使p.i.第2天的RSV介導(dǎo)的AFC抑制逆轉(zhuǎn)。
圖8表示RSV感染后，核苷酸合成的抑制對肺部含水量的影響。(A)來氟米特和尿苷的治療對第2天肺部含水量的影響(所有組均n＝7-8)。(B)6-MP對第2天肺部含水量的影響(未感染的小鼠，n＝8；未治療的RSV感染的小鼠，n＝7；6-MP治療的小鼠，n＝15)。通過濕重干重之比測定肺部含水量。與未感染小鼠的濕重干重之比比較，***p＜0.0005。
圖9表示小鼠肺中核苷酸合成抑制對RSV復(fù)制的影響。(A)來氟米特和尿苷的治療對第2天病毒復(fù)制的影響(未治療的小鼠、尿苷治療的小鼠以及來氟米特和尿苷治療的小鼠，n＝6；來氟米特治療的小鼠，n＝12)。(B)6-MP對第2天病毒復(fù)制的影響(未治療的小鼠，n＝6；6-MP治療的小鼠，n＝12)。(C)連續(xù)的來氟米特治療對第8天病毒復(fù)制的影響(未治療的小鼠，n＝6；來氟米特治療的小鼠，n＝12)。(D)至第2天的來氟米特治療對第8天病毒復(fù)制的影響(兩組均n＝6)。虛線表示測定方法的檢出限。與未治療的小鼠的病毒滴度比較，***p＜0.0005。
圖10表示來氟米特治療對RSV感染后低氧血癥的影響。(A)來氟米特治療對第2天小鼠SmO2的影響(未治療的、RSV感染的小鼠，n＝8；來氟米特治療的、RSV感染的小鼠，n＝7)。(B)RSV感染和來氟米特治療對第2天％ΔHR30的影響(未治療的、RSV感染的小鼠，n＝11；來氟米特治療的、RSV感染的小鼠，n＝9)。與未治療的值比較，*p＜0.05。
圖11表示來氟米特的治療對BALB/c小鼠的NPD的影響。(A)來氟米特治療的、RSV感染的小鼠在第4天的NPD描圖樣本。(B)來氟米特的治療對RSV感染的小鼠的基礎(chǔ)NPD的影響。(C)來氟米特的治療對RSV感染的小鼠的NPDAMIL的影響。所有組均n＝5-9。圖中描圖樣本上的虛線表示0mV，箭頭表示加入100μM氨氯吡嗪脒的時(shí)間。與未治療的動(dòng)物的NPD比較，*p＜0.05，**p＜0.005。
圖12表明感染后(p.i.)第2天和第4天時(shí)RSV感染顯著抑制基礎(chǔ)肺泡液體清除率(AFC)。與未感染的小鼠(U)相比，假感染(M)對AFC沒有影響?；A(chǔ)AFC在第2天被抑制43％(相對于假感染的值)，在第4天被抑制26％。AFC的氨氯吡嗪脒敏感性也在p.i.第1天降低，在p.i.第2天和第4天消失。
圖13表明向AFC滴注劑加入二氫乳清酸還原酶(25μm A77-1726)逆轉(zhuǎn)p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制。A77-1726的作用被同時(shí)向AFC滴注劑中加入50mM尿苷完全逆轉(zhuǎn)，但不能由25mM染料木黃酮(非特異性酪氨酸激酶抑制劑)重現(xiàn)。
圖14表明向AFC滴注劑中加入IMP脫氫酶抑制劑(25μm 6-MP或MPA)對p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制僅有很小的作用。IMP脫氫酶抑制劑較小的作用是ATP缺失的結(jié)果，而ATP是嘧啶從頭合成的必需前體。由于可通過嘌呤補(bǔ)救途徑合成ATP，MPA的作用被同時(shí)向AFC滴注劑中加入50mM次黃嘌呤(HXA)完全逆轉(zhuǎn)。
具體實(shí)施例方式
通過參考下文本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)敘述及本說明書中所包括的實(shí)施例和附圖以及它們的先前的和以下的說明，可使本發(fā)明更易被理解。
本申請通篇引用了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引用的方式全文納入本申請，以便更充分地描述與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)狀況?；谝匈噮⒖嘉墨I(xiàn)的句子中所論述的包含在所述參考文獻(xiàn)中的素材，公開的參考文獻(xiàn)也通過引用的方式單獨(dú)地并特別地納入本說明書。
除非上下文另外清楚指明，本說明書和所附的權(quán)利要求所使用的單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”和“該”包括它們所指物質(zhì)的復(fù)數(shù)。因此，例如，提到的“一種嘧啶合成抑制劑”包括一種或多種嘧啶合成抑制劑的混合，等等。類似地，提到的“一種肺上皮細(xì)胞”包括一種或多種肺上皮細(xì)胞。因此，例如，適于向“一種肺上皮細(xì)胞”給藥的組合物即適于向一種或多種這類細(xì)胞給藥。
本說明書通篇可使用一些縮寫，這些縮寫具有以下含義。所述縮寫包括但不限于AFC(肺泡液體清除(率))、ALF(airspace lining fluid，氣室襯里層液體)、BALF(支氣管肺泡灌洗液)、ΔNPD(鼻電位差的變化)、DHOD(二氫乳清酸脫氫酶)、HXA(次黃嘌呤)、HRSTART(通氣期初始時(shí)的心率)、HREND(通氣期結(jié)束時(shí)的心率)、LEF(來氟米特)、MPA(霉酚酸)、6-MP(6-巰基嘌呤)、NPD(鼻電位差)、NPDAMIL(鼻電位差的氨氯吡嗪脒敏感的部分)、NRte(鼻跨上皮電阻)、％ΔHR30(30分鐘通氣期的心率變化百分比)、P2YR(P2Y嘌呤能核苷酸受體)、RSV(呼吸道合胞病毒)、SmO2(平均血紅蛋白O2飽和度)和VRAC(容積調(diào)節(jié)的陰離子通道)。此外還可使用其它縮寫，所述的其它縮寫對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的和/或從使用給出縮寫的上下文來看是清楚的。
本說明書中范圍可通過以下方式表述從“約”一個(gè)具體值，和/或至“約”另一個(gè)具體值。當(dāng)表述為該范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從一個(gè)具體值和/或至另一個(gè)具體值。類似地，當(dāng)數(shù)值通過使用前置的“約”表述為近似值時(shí)，應(yīng)理解為由具體值形成另一個(gè)實(shí)施方案。應(yīng)進(jìn)一步理解的是每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一端點(diǎn)相關(guān)時(shí)和獨(dú)立于另一端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。
如本說明書通篇所使用，“受試者”意為個(gè)體。因此所述“受試者”可包括馴養(yǎng)的動(dòng)物，例如貓、狗等，牲畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鳥。一種情況是，受試者是牛類，例如，黃牛(Bos taurus)、瘤牛(Bos indicus)或其雜交種。另一種情況是，受試者是哺乳動(dòng)物例如靈長類動(dòng)物或人。
“任選的”或“任選地”意為隨后描述的事件或情形可發(fā)生或可不發(fā)生，而該描述包括事件或情形發(fā)生的情況以及不發(fā)生的情況。例如，用語“任選地組合物可包含一種組合”意為該組合物可包含一種不同分子的組合或者可不包含一種組合，從而該描述既包括這種組合也包括不含這種組合(即組合的各成分)。
術(shù)語“較高”、“增加”、“升高”或“提高”是指增加至高于對照值(例如基礎(chǔ)水平)。術(shù)語“低”、“較低”、“減小”或“減輕”是指降低至低于對照值(例如基礎(chǔ)水平)。例如，基礎(chǔ)水平是加入試劑之前或不加這些試劑的正常體內(nèi)水平，所述試劑例如來氟米特、A77-1726或另一種嘧啶合成抑制劑。對照水平還可包括未處于疾病狀態(tài)的受試者或樣本的水平。對照值可由疾病或治療之前或之后的同一個(gè)或同一批受試者或樣本而確定。對照值可來自于未患疾病或未接受治療的非同一個(gè)或非同一批受試者或樣本。
本發(fā)明提供一種包含嘧啶合成抑制劑和可藥用載體的組合物。該組合物可用于使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體清除率增加的方法，治療受試者肺部疾病的方法，減少受試者的一種或多種呼吸道合胞病毒感染癥狀或體征的方法，鑒別具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者并向該受試者給予包含有效量嘧啶合成抑制劑的組合物的方法，鑒別患有呼吸道合胞病毒感染的受試者并向該受試者給予包含可有效使受試者Na+依賴性肺泡液減少的量的嘧啶合成抑制劑的組合物的方法，以及篩選使肺上皮細(xì)胞增加Na+依賴性液體吸收的測試化合物的方法，這些內(nèi)容在下文得到更詳細(xì)地?cái)⑹觥?br> 本說明書所使用的“治療”包括受試者特定呼吸道感染的癥狀或體征的減少。因此，公開的組合物和方法可用于減少受試者一種或多種呼吸道感染癥狀或體征。所述癥狀和體征包括但不限于鼻漏、低氧血癥、肺水腫、心功能減弱、咳嗽、體重減輕、喘鳴、惡病質(zhì)和肺充血。
可用所公開的組合物和方法治療的一種示例性疾病為呼吸道合胞病毒(RSV)感染。RSV抑制BALB/c小鼠的Na+依賴性肺泡液體清除(AFC)，而P2Y核苷酸受體拮抗劑和嘧啶分解酶(pyrimidinolytic enzyme)阻滯AFC的抑制。RSV感染導(dǎo)致UTP和ATP均釋放入ALF，AFC的減少與導(dǎo)致宿主明顯生理損傷的RSV感染早期有關(guān)。
與對照嬰兒相比，在因嚴(yán)重RSV感染而通氣的嬰兒肺部，表面活性蛋白SP-A和SP-D的水平降低，主要表面活性磷脂即雙十六烷基磷脂酰膽堿的量降低，并且恢復(fù)的表面活性物質(zhì)的生物物理學(xué)表面活性受損(Kerr和Patton，1999)。雖然β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑(βARA)類支氣管擴(kuò)張藥已用于通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP來改善成人呼吸窘迫綜合征的肺泡液體清除率，但RSV感染后，呼吸上皮中的β-腎上腺素能受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)異常，這可能是RSV治療中βARA效果較差的原因。因此，就RSV感染而言，公開的方法和組合物用于提高嬰兒的如雙十六烷基磷脂酰膽堿的表面活性磷脂的水平，或者改善β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑(βARA)類支氣管擴(kuò)張藥的功效。
此外，流行病學(xué)研究提出嬰兒中嚴(yán)重的呼吸道合胞病毒(RSV)誘發(fā)的細(xì)支氣管炎和變應(yīng)性疾病關(guān)系密切。本發(fā)明所提供的組合物和方法可用于在RSV感染過程中減輕RSV誘導(dǎo)的氣道的過敏性，并減少隨后的哮喘發(fā)生的易感性。RSV感染對于牛(即黃牛和瘤牛，或其雜交種)也尤為重要，這種感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病。
肺泡液體清除率與肺上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。例如，肺泡上皮壁由兩種細(xì)胞組成I型細(xì)胞和II型細(xì)胞。I型細(xì)胞占肺泡上皮的絕大部分(約95％)。II型細(xì)胞產(chǎn)生表面活性物質(zhì)。現(xiàn)認(rèn)為I型和II型細(xì)胞均以主動(dòng)方式轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子。位于上皮細(xì)胞基底外側(cè)表面的鈉鉀泵形成有利于鈉離子從肺泡腔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的跨過頂膜的電化學(xué)梯度。鈉主要通過被稱作通道的蛋白質(zhì)跨過肺泡上皮。一旦在細(xì)胞質(zhì)中，即通過利用ATP的鈉鉀泵將它們穿過基底外側(cè)膜排出。為保持電中性，氯離子通過位于細(xì)胞間的通路或通過細(xì)胞通道而隨著鈉離子流動(dòng)。離子的流動(dòng)造成間質(zhì)和肺泡腔間的滲透壓差，從而有利于液體重吸收。
主動(dòng)鈉轉(zhuǎn)運(yùn)在許多病理狀況下(病毒感染、肺炎、急性肺損傷等)在限制肺泡腔液體量中具有重要作用。在基礎(chǔ)條件下，呼吸上皮的最主要離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程是主動(dòng)的、氨氯吡嗪脒敏感的、從腔液(lumenal fluid)向上皮下的胞間隙的Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)。肺泡襯里層液(ALF)中的Na+離子主要通過頂膜中的陽離子和Na+選擇性、氨氯吡嗪脒敏感性上皮Na+通道(ENaC)而被動(dòng)擴(kuò)散入支氣管肺泡上皮細(xì)胞。Cl-離子通過細(xì)胞側(cè)面通路或可能通過囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosistransmembrane regulator，CFTR)而隨著Na+流動(dòng)以保持電中性。NaCl的轉(zhuǎn)運(yùn)形成跨上皮滲透梯度。由于呼吸上皮的跨上皮水滲透性較高，因此上述梯度使水被動(dòng)地自氣室向間質(zhì)流動(dòng)，由此清除氣室液體。
RSV介導(dǎo)的AFC抑制與低氧血癥、受損的心臟功能以及支氣管肺泡灌洗液中升高的UTP和ATP含量有關(guān)。而且，盡管使用來氟米特全身性地抑制嘧啶從頭合成對肺中RSV復(fù)制沒有直接抗病毒作用，但卻不僅改善了RSV感染小鼠的AFC和肺的含水量，而且改善了RSV感染小鼠的生理損傷(包括體重減輕、SmO2和心功能降低、以及鼻電位差變化)。RSV介導(dǎo)的AFC抑制可通過容積調(diào)節(jié)的陰離子通道(VRAC)的藥物阻斷而阻滯，表明UTP的從頭合成和經(jīng)VRAC的釋放對RSV介導(dǎo)的AFC抑制的發(fā)生是必要的，并且證明對于為減輕RSV感染癥狀或其它呼吸感染癥狀而設(shè)計(jì)的抑制劑療法而言，嘧啶的從頭合成和釋放路徑是引人注目的靶點(diǎn)。
圖1為說明嘧啶和嘌呤生物合成途徑的示意圖。UTP自谷氨酰胺、ATP和HCO3-開始從頭合成。UTP還可經(jīng)補(bǔ)救途徑自尿苷開始合成。來氟米特及其活性代謝物A77-1726均抑制將二氫乳清酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿榍逅岬亩淙榍逅崦摎涿傅幕钚?。兩種物質(zhì)均阻斷嘧啶的從頭合成，但對嘧啶補(bǔ)救途徑或嘌呤合成沒有影響。
任選地，組合物包含嘧啶合成抑制劑來氟米特。任選地，組合物包含嘧啶合成抑制劑A77-1726。任選地，組合物包含來氟米特和A77-1726的組合和/或來氟米特或A77-1726與另一種嘧啶合成抑制劑的組合。來氟米特是活性代謝物為A77-1726的前藥，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其商品名為ARAVA(Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)。來氟米特和A77-1726均作為酶即二氫乳清酸還原酶(也被稱為二氫乳清酸脫氫酶或二氫乳清酸酶)的抑制劑而發(fā)揮作用，該酶是三功能酶復(fù)合體CAD(氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和二氫乳清酸酶)的組成成分，CAD是嘧啶從頭合成途徑的中心組分。因此，由于含有來氟米特和A77-1726，組合物就可以為二氫乳清酸還原酶抑制劑。
組合物可于可藥用載體中進(jìn)行體內(nèi)給藥?！翱伤幱谩币鉃樯飳W(xué)上或其它因素上無不良作用的物質(zhì)。因此，可對受試者給予該物質(zhì)而不引起不良的生物學(xué)效應(yīng)或者不以有害的方式與含有該物質(zhì)的藥用組合物所含的任意其它成分相互作用。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，當(dāng)然選擇使活性成分的任何降解最小并且使受試者副作用最小的載體。該物質(zhì)可在溶液中、懸浮體中(例如包含在微粒、脂質(zhì)體或細(xì)胞中)。這些可通過抗體、受體或受體配體靶向于特定的細(xì)胞類型。
RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995中描述了合適的載體及其制劑。通常，合適量的可藥用鹽用于制劑中以使該制劑等滲。可藥用載體的實(shí)例包括但不限于鹽水、林格氏液(Ringer’ssolution)和葡萄糖溶液。溶液的pH優(yōu)選約5至約8.5，更優(yōu)選約7.8至約8.2。其他的載體包括緩釋制劑例如包含抗體的固體疏水聚合物半滲透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成形制品例如膜、脂質(zhì)體或微粒的形式。根據(jù)例如給藥途徑和給藥組合物的濃度，某種載體為更優(yōu)選的，這一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)是顯而易見的。例如對適于吸入和/或鼻內(nèi)給藥的具體載體或者適用于對肺上皮細(xì)胞局部給藥的組合物的具體載體的選擇即在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。
除了各成分和載體外，組合物還可包含增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。組合物還可包含一種或多種活性成分例如抗微生物藥物、抗炎藥物、麻醉劑等。
公開的組合物適于向受試者的一種肺上皮細(xì)胞或多種肺上皮細(xì)胞局部給藥。因此，包含嘧啶合成抑制劑的組合物任選地適于經(jīng)吸入給藥(即該組合物為吸入劑)。另外，該組合物任選地為氣霧化的。再另外，該組合物任選為噴霧化的?？山?jīng)噴射或微滴機(jī)制的給藥方式通過鼻或口進(jìn)行組合物吸入給藥。也可經(jīng)插管法向呼吸系統(tǒng)(例如肺)的任何區(qū)域直接遞送。任選地，組合物給藥的肺上皮細(xì)胞位于受試者的鼻腔、鼻道、鼻咽、咽、氣管、支氣管、細(xì)支氣管或肺泡中。任選地，組合物給藥的肺上皮細(xì)胞為支氣管肺泡上皮細(xì)胞。而且，如果向多種肺上皮細(xì)胞給予組合物，那么細(xì)胞任選可位于任意或所有以上解剖部位或者位于這些部位的組合。
肺上皮細(xì)胞的局部給藥相應(yīng)地可通過經(jīng)噴霧法、氣霧作用或直接肺滴注的肺部遞送進(jìn)行。因此，適于向受試者肺上皮細(xì)胞局部給藥的組合物包括適于例如作為噴霧化或氣霧化制劑的吸入給藥的組合物。例如，可通過吸入器例如定量劑量吸入器或干粉吸入器、吹入器、噴霧器的方式或任何其它常規(guī)已知的可吸入藥物給藥方法向個(gè)體給予組合物。
本發(fā)明組合物可以是可吸入溶液。該可吸入溶液可適于經(jīng)噴霧法給藥。組合物也可以水性懸浮液形式提供。任選地，本發(fā)明的制劑包括水性懸浮液中的治療有效量的嘧啶合成抑制劑。
任選地，組合物可通過加壓氣霧劑的方式給藥，該氣霧劑單獨(dú)地包含一種嘧啶合成抑制劑或者其鹽或酯及至少一種推進(jìn)劑或及一種表面活性劑或表面活性劑的混合物?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)已知的推進(jìn)劑。
本發(fā)明還提供包括本發(fā)明所提供的組合物和噴霧器的組合。包含本發(fā)明所教導(dǎo)的試劑和組合物的容器也是本發(fā)明所公開的。該容器可以是例如鼻噴霧器、噴霧器、吸入器、瓶或任意其它含有組合物的粘膜表面給藥形式的工具。任選地，該容器可給予定量劑量的組合物。
任何噴霧器可與本發(fā)明公開的組合物和方法一同使用。具體而言，本發(fā)明所使用的噴霧器使包括有本發(fā)明提供的組合物而不含推進(jìn)劑的液體制劑霧化。該噴霧器可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法產(chǎn)生霧化的氣霧，所述方法包括但不限于壓縮氣體、超聲波或振動(dòng)。該噴霧器可進(jìn)一步具有內(nèi)擋板。該內(nèi)擋板與噴霧器外殼一起通過碰撞從氣霧中選擇性地除去大液滴，并使大液滴返回貯液器中。由此產(chǎn)生的氣溶膠細(xì)微滴通過吸入空氣/氧氣而夾帶入肺中。
因此，使不含推進(jìn)劑的液體制劑噴霧化的噴霧器適于與本發(fā)明提供的組合物一起使用。該噴霧器的實(shí)例在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且是市售的。本發(fā)明使用的噴霧器還包括但不限于噴射霧化器、超聲噴霧器和其它噴霧器。噴射霧化器的實(shí)例在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且是市售的。
組合物可為無菌的，被過濾并裝于小瓶中，所述小瓶包括提供用于噴霧器并被適當(dāng)?shù)貒婌F化的單位劑量無菌制劑。每個(gè)單位劑量小瓶可以是無菌的并被適當(dāng)?shù)仂F化而不污染其它小瓶或下一劑量。
任選地，公開的組合物以適于鼻內(nèi)給藥的形式存在。該組合物適于經(jīng)一個(gè)或兩個(gè)鼻孔向鼻內(nèi)和鼻道遞送，并且可包括通過噴射機(jī)制或微滴機(jī)制或者經(jīng)氣霧化作用遞送。
如果組合物用于不使用局部肺部給藥的方法中，則可通過本領(lǐng)域已知的其它方法給予該組合物，例如口服、胃腸外(例如靜脈內(nèi))、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射和經(jīng)皮給藥。
本發(fā)明還提供包括至少一份定量劑量的包含治療量嘧啶合成抑制劑的組合物的裝置，其中每份定量劑量包括用于治療受試者肺部疾病的嘧啶合成抑制劑的治療量或治療量的一部分。該嘧啶合成抑制劑可包括以上公開的嘧啶合成抑制劑或其組合。
本發(fā)明還提供一種使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體清除率增加的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的嘧啶合成抑制劑相接觸。所述接觸使細(xì)胞的Na+依賴性液體清除率增加。任選地，肺上皮細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。任選地，肺上皮細(xì)胞在體外被接觸。
本發(fā)明還提供治療受試者肺部疾病的方法，該方法包括使受試者的多種肺上皮細(xì)胞與有效量的嘧啶合成抑制劑相接觸。有效量的嘧啶合成抑制劑使得受試者的Na+依賴性肺泡液體清除率增加。該方法可用于受試者患有呼吸道合胞病毒感染或具有發(fā)生呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的情形。引起可使用所公開方法的疾病的其它肺部病原體包括但不限于副黏病毒(呼吸道合胞病毒[人和牛]、間質(zhì)肺病毒(metapneumovirus)、副流感病毒、麻疹病毒)、正黏病毒(A型、B型和C型流感病毒)、痘病毒(天花、猴痘)、新世界漢坦病毒、鼻病毒、冠狀病毒(嚴(yán)重急性呼吸綜合征的病因)、皰疹病毒(單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneurnoniae)、流感嗜血菌(Hemophilusinfluenzae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎枝原體(Mycoplasmapneumoniae)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、衣原體、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogene)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)。
本發(fā)明還提供了減少具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者的一種或多種呼吸道合胞病毒感染癥狀或體征的方法，該方法包括向受試者給予包含有效量嘧啶合成抑制劑的組合物。如上所述，這些癥狀或體征包括但不限于鼻漏、低氧血癥、肺水腫、心臟功能減弱、咳嗽、體重減輕、喘鳴、惡病質(zhì)和肺充血。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者。例如，這種確定可由醫(yī)生或獸醫(yī)根據(jù)受試者的醫(yī)療史、表現(xiàn)的癥狀/體征、身體檢查、診斷測試或其任意組合來作出。
本發(fā)明還提供一種包括鑒別具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者和向該受試者給予包含有效量嘧啶合成抑制劑的組合物的方法。此外，還提供一種包括鑒別患有呼吸道合胞病毒感染的受試者和向該受試者給予包含可有效使受試者Na+依賴性肺泡液減少的量的嘧啶合成抑制劑的組合物的方法。
在所公開的方法中，嘧啶合成抑制劑任選地為來氟米特、A77-1726或其組合。此外，來氟米特和/或A77-1726可與一種或多種其它嘧啶合成抑制劑結(jié)合用于公開的方法中。
術(shù)語“有效量”、“有效劑量”或“治療量”可以互換使用。術(shù)語“有效量”定義為產(chǎn)生所需生理反應(yīng)的任意必需量。用于所公開的方法的組合物的給藥有效量和給藥時(shí)間安排可憑經(jīng)驗(yàn)確定，并且做這種確定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的。用于所公開的方法的組合物的有效給藥劑量范圍大至產(chǎn)生使疾病癥狀受到影響的所需效應(yīng)。該劑量不應(yīng)大至引起不良副作用，例如不良交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等。
通常，治療量或治療劑量根據(jù)受試者的年齡、狀況、性別和患病程度、給藥途徑或治療方案中是否包括其它藥物而變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定該治療量或治療劑量。如果有任何禁忌癥發(fā)生，個(gè)別醫(yī)生或獸醫(yī)可調(diào)節(jié)劑量。劑量可以在一天或幾天內(nèi)變化，并且在一天或幾天內(nèi)每天給予一次或多次劑量的給藥。用于所公開的方法的組合物的所需有效量可根據(jù)所使用的方法和所治療的氣道病癥、所使用的具體的嘧啶合成抑制劑和/或載體以及給藥的方式等而變化。因此不可能明確地說明每種組合物的確切的量。然而，在給出本說明書教導(dǎo)的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)即可確定適宜的量。例如，體內(nèi)使用的二氫乳清酸還原酶或嘧啶合成抑制劑可以以約10-50mg/kg的劑量、以約25-45mg/kg的劑量或以約30-40mg/kg的劑量給藥。
可按合理的間隔以氣溶膠給予治療量、有效量或有效劑量的A77-1726、來氟米特和/或其它嘧啶抑制劑，并保持有效。例如可一天、數(shù)天、一周或更長時(shí)間內(nèi)S.I.D.、B.I.D.、Q.I.D.或者每小時(shí)一次或多次地給予有效劑量的本發(fā)明所述組合物。因此，例如可在1天、2天、3天、4天、5天、6天或一周或更長時(shí)間或其任意間隔或其任意組合的期間內(nèi)，每1、2、4、8、12或24小時(shí)或者其組合或其間隔給予一次該組合物。間隔意為在所給值內(nèi)的時(shí)間的任意增量。因此組合物例如可在12小時(shí)內(nèi)每三小時(shí)進(jìn)行給藥，等等。任選地，一次給予組合物。該時(shí)間進(jìn)程可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如用于確定有效劑量的上述參數(shù)來確定。
根據(jù)本發(fā)明所述方法給予的具體劑量組合物的有效性，可通過評價(jià)已知可用于評價(jià)患有例如RSV感染的肺部感染患者或具有感染肺部感染風(fēng)險(xiǎn)患者的狀態(tài)的醫(yī)療史、指征、癥狀和客觀實(shí)驗(yàn)室測試的具體各方面來測定。這些指征、癥狀和客觀實(shí)驗(yàn)室測試將根據(jù)具體的所治療或預(yù)防的疾病或病患變化，這一點(diǎn)對于任何治療這類患者的臨床醫(yī)生或在該領(lǐng)域內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的研究者而言應(yīng)是已知的。例如，如果基于與適當(dāng)?shù)膶φ战M的比較和/或與對普通群體或特定個(gè)體的正常疾病進(jìn)程的認(rèn)識的比較1)受試者身體狀況顯示得到改善(例如肺充血減輕或消除)，2)疾病即感染的進(jìn)程顯示出得到穩(wěn)定、減慢或逆轉(zhuǎn)，或者3)對治療該疾病或疾患的其它藥物的需要減少或避免了，那么就認(rèn)為一個(gè)具體的治療方案是有效的。可在群體中的單個(gè)受試者中測定(例如使用流行病學(xué)研究)這種作用。
本發(fā)明的教導(dǎo)還可用于篩選的方法。例如本發(fā)明提供一種篩選使肺上皮細(xì)胞增加Na+依賴性液體吸收的測試化合物的方法，該方法包括當(dāng)存在過量的UTP時(shí)使肺上皮細(xì)胞與測試化合物相接觸，檢測肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收，由相比于對照的Na+依賴性液體吸收的增加指示出使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物。任選地，細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。任選地，細(xì)胞在體外被接觸。該方法任選地還包括去除UTP和檢測Na+依賴性液體吸收增加的可逆性。
在另一個(gè)篩選方法的實(shí)例中，篩選使Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物的方法包括使測試化合物與表達(dá)編碼嘧啶合成基因的異源核酸的細(xì)胞相接觸，并檢測細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收，由相比于對照水平的Na+依賴性液體吸收的增加指示出使Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物。任選地，細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。任選地，細(xì)胞在體外被接觸。
又一個(gè)篩選使呼吸上皮的Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物的方法包括用RSV感染H441細(xì)胞或細(xì)胞系，使受感染的細(xì)胞或細(xì)胞系與測試化合物相接觸，并測量跨受感染細(xì)胞或受感染細(xì)胞系的細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。由相比于對照的跨受感染的H441細(xì)胞或細(xì)胞系的離子轉(zhuǎn)運(yùn)的增加，指示出使Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物。離子轉(zhuǎn)運(yùn)可與跨對照細(xì)胞或細(xì)胞系的離子轉(zhuǎn)運(yùn)比較，對照細(xì)胞或細(xì)胞系任選可以是非RSV感染的H441細(xì)胞系，或者可以是不存在測試化合物時(shí)受感染的H441細(xì)胞或細(xì)胞系。任選地，測試化合物包括嘧啶合成抑制劑。任選地，細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。任選地，細(xì)胞在體外被接觸。
實(shí)施例為向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本發(fā)明所要求保護(hù)的方法的完整公開和說明而提出以下實(shí)施例，以下實(shí)施例的意圖僅在于作為本發(fā)明的示例，并不意在限制發(fā)明人所認(rèn)為的他們的發(fā)明的范圍，除非是在它們包括于隨附權(quán)利要求的意義上。已努力確保與數(shù)字有關(guān)的準(zhǔn)確性(例如，用量、溫度等)，但還應(yīng)說明可能有一些誤差和偏差。
方法病毒接種體的制備和小鼠的感染。按Davis et al.，″Nucleotide-mediated inhibition of alveolar fluid clearance in BALB/c miceafter respiratory syncytial virus infection，″Am.J.Physiol.LungCell Mol.Physiol.286L112-L120.(2004)所述制備病毒原種并用RSV的A2株(100μL 106PFU)鼻內(nèi)感染任意一種性別的8至12周的無病原體BALB/c小鼠。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)來源于最少兩次獨(dú)立感染。
平均外周血氧飽和度的測定。使用連接到TUFFSATTM脈搏血氧計(jì)(Datex-Ohmeda，Inc.，Madison，WI)的PREEMIE OXYTIP傳感器(Datex-Ohmeda，Inc.，Madison，WI)，對有知覺的小鼠測定外周血氧飽和度。由于小鼠脈率極快，血氧定量法的值為動(dòng)脈血和靜脈血的平均血紅蛋白O2飽和度(SmO2)值。
通氣時(shí)心率的變化的測定。將ECG描圖用于測量AFC測定開始(HRSTART)和終末(HREND)時(shí)的心率(QRS復(fù)合波數(shù)/cm)。按(HRSTART-HREND)/HRSTART計(jì)算30分鐘通氣期內(nèi)心率的改變的百分比(％ΔHR30)。
鼻電位差的測定。如先前Grubb et al.，(1994)″Hyperabsorptionof Na+and raised Ca(2+)-mediated C1-secretion in nasal epitheliaof CF mice，″Am.J.Physiol 266C1478-C1483所述測定麻醉小鼠(以尾部作參考)的跨鼻孔電位差。在用乳酸林格氏液灌注鼻上皮期間記錄基線NPD。通過用含100μM氨氯吡嗪脒的乳酸林格氏液灌注來確定NPD的氨氯吡嗪脒敏感的部分(NPDAMIL)。通過串聯(lián)的12V電池以及200MΩ電阻，跨上皮施加±60nA的電流脈沖。記錄對電流脈沖的反應(yīng)的NPD的變化(與鼻跨上皮電阻NRte成比例)(ΔNPD)。
支氣管肺泡灌洗。使用1ml用于細(xì)胞因子ELISA的無菌生理鹽水或者0.3ml用于核苷酸分析的無菌鹽水，按先前Davis et al.(2004)所述收集支氣管灌洗液(BALF)。離心灌洗收集液(lavagate)以去除細(xì)胞，上清液儲存于-80℃。
BALF中的核苷酸的測定。加熱(100℃，3分鐘)使BALF中的內(nèi)源性核苷酸酶變性，分別使用UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和熒光素-熒光素酶測定法測定UTP/ATP的含量。
BALF中的血紅素的測定。使用Drabkins測定法，利用分光光度法測定BALF血紅素含量。
嘧啶和嘌呤從頭合成的全身性抑制。在感染前及隨后整個(gè)感染期的時(shí)間內(nèi)，每天一次按300μl/小鼠的體積管飼口服給予來氟米特(5-甲基異唑-4-[4-三氟甲基]甲酰苯胺，35mg/kg溶于含1％甲基纖維素的蒸餾水中)共8天。管飼等體積的含1％甲基纖維素的蒸餾水作為賦形劑對照。按每12小時(shí)i.p.注射100μl的體積(8)給予尿苷(1g/kg溶于0.9％NaCl中)。在感染前及隨后整個(gè)感染期的時(shí)間內(nèi)，按每24小時(shí)i.p.注射100μl的體積給予6-MP(35mg/kg溶于1N NaOH中，用2M Na2HPO4調(diào)節(jié)pH至7.9)共5天。
BALF中的促炎細(xì)胞因子的測定。根據(jù)廠商說明書使用Quantikine MELISA試劑盒(R&D System)測定細(xì)胞因子水平。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Instat軟件(GraphPad，San Diego，CA)計(jì)算描述性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。用ANOVA或Student’s檢驗(yàn)，以及適宜的之后的檢驗(yàn)分析組平均值間的差異。所有數(shù)據(jù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果RSV感染對外周血氧合作用的影響。第2天的基礎(chǔ)AFC的減少與相比于假感染動(dòng)物的較小但有意義的外周血SmO2減少(圖2A)有關(guān)。在其它時(shí)間點(diǎn)沒有發(fā)現(xiàn)SmO2下降。
作為低氧血癥的另一個(gè)指標(biāo)，評價(jià)假感染小鼠和第2天的RSV感染小鼠的3導(dǎo)聯(lián)ECG描圖，以證明AFC測定過程中心率的變化(％ΔHR30)。RSV感染與在第2天％ΔHR30的顯著增加相關(guān)(圖2B和2C)。在麻醉過程中兩組間無差異。
RSV感染對鼻電位差的影響。與假感染動(dòng)物比較，第2天的RSV感染對BALB/c小鼠的基礎(chǔ)NPD(鼻電位差)或NPDAMIL(鼻電位差的氨氯吡嗪脒敏感的部分)沒有影響。然而在第4天和第8天基礎(chǔ)NPD和NPDAMIL顯著減小(圖3A-3C)。
測定了向鼻上皮施加±60nA的脈沖而引發(fā)的NPD的變化(ΔNPD)，以此作為對RSV感染后NRte(鼻跨上皮電阻)的估測。在第4天和第8天ΔNPD顯著高于假感染對照(圖3D-3E)。
RSV感染和核苷酸合成的抑制對BALF核苷酸的影響。未感染小鼠的BALF含有等水平的ATP和UTP，該水平未因假感染而受影響。然而RSV感染導(dǎo)致在第2天UTP和ATP水平增加一倍，而BALF血紅素的含量沒有同時(shí)增加(在第2天，相對于未感染小鼠的7.3±0.7μM，為7.3±1.4μM)。在第6天BALF核苷酸水平回到對照水平(表1)。
在第2天，在來氟米特治療的RSV感染的小鼠中沒有檢測到BALF核苷酸水平的增長。事實(shí)上，來氟米特的治療使BALF的兩種核苷酸的含量降低至低于在未治療的未感染小鼠中的含量水平(表1)。并行的尿苷的治療不僅逆轉(zhuǎn)了來氟米特對BALF的UTP和ATP水平的作用，還引起B(yǎng)ALF核苷酸含量相對于未治療的RSV感染小鼠的該含量的顯著增長。
表1 RSV感染和核苷酸合成的抑制對BALF核苷酸水平的影響

A核苷酸水平被評價(jià)的每組小鼠的數(shù)目BBALF中的平均核苷酸濃度±SE(hmol/l)C來氟米特治療的小鼠D來氟米特和尿苷治療的小鼠與未感染的小鼠比較，**p＜0.005，***p＜0.0005核苷酸合成的抑制對小鼠體重的影響。在預(yù)治療時(shí)期，與甲基纖維素治療的或未治療的小鼠比較，來氟米特未引起明顯的體重下降。更重要的是，在感染期間，來氟米特療法顯著降低在BALB/c小鼠中第1天和第2天常見的體重減輕(圖4)的程度。在整個(gè)來氟米特治療期間同時(shí)給予尿苷不阻滯該效應(yīng)。
與上述發(fā)現(xiàn)相反，與未治療的RSV感染的小鼠和來氟米特治療的RSV感染的小鼠比較，6-MP的治療導(dǎo)致在整個(gè)感染前時(shí)期體重顯著減輕、對麻醉的耐受性差(導(dǎo)致個(gè)別死亡)、以及在第1天和第2天體重減輕的顯著增加(圖4B)。
核苷酸合成的抑制對RSV介導(dǎo)的AFC抑制的影響。RSV感染的小鼠的來氟米特的預(yù)治療阻斷了第2天的RSV誘導(dǎo)的AFC抑制(表2)。單獨(dú)管飼甲基纖維素不能模擬該效應(yīng)，而并行的尿苷治療逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。單獨(dú)的尿苷治療對AFC沒有影響。來氟米特的治療還導(dǎo)致正常的AFC的氨氯吡嗪脒敏感性的恢復(fù)與未感染小鼠的61％和未治療第2天小鼠的-8％相比，來氟米特治療的小鼠在第2天的AFC的57％為氨氯吡嗪脒敏感的。
與來氟米特療法的有益作用相反，用嘌呤從頭合成抑制劑6-巰基嘌呤(6-MP)的全身預(yù)治療的類似方案對第2天的AFC沒有影響(表2)。最后一點(diǎn)，來氟米特對未感染小鼠的治療導(dǎo)致AFC的顯著抑制。
表2 核苷酸合成的抑制對第2天的RSV介導(dǎo)的AFC抑制的影響

AAFC被評價(jià)的小鼠的數(shù)目B％AFC平均值±SEC向滴注劑中加入1.5mM氨氯吡嗪脒的AFCD來氟米特治療的小鼠E甲基纖維素治療的小鼠F尿苷治療的小鼠G來氟米特和尿苷治療的小鼠H6-巰基嘌呤治療的小鼠與第2天的AFC比較，**p＜0.005，***p＜0.0005與第2天的AFC的AMIL比較，p＜0.0005為了全身性阻斷嘧啶從頭合成，在感染前8天每天一次管飼小鼠300ml/小鼠的二氫乳清酸還原酶(DHOR)抑制劑來氟米特(5mg/Kg懸浮于1％甲基纖維素中)或賦形劑，并且在p.i.0小時(shí)和24小時(shí)如上所述給藥。p.i.48小時(shí)進(jìn)行AFC研究，AFC滴注劑中未加入添加物。
在所表述的情況下，通過在整個(gè)來氟米特治療期間同時(shí)給予尿苷(1mg/kg I.P.，q12h)來試圖逆轉(zhuǎn)來氟米特(LEF)的效應(yīng)。如圖5所示，用來氟米特(LEF)管飼小鼠逆轉(zhuǎn)了p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制。LEF的效應(yīng)被同時(shí)給予尿苷阻滯。LEF對正常小鼠的AFC沒有影響。
LEF治療還導(dǎo)致p.i.第1天和第2天體重減輕的顯著減少以及支氣管肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子(IFN-a、I1-b、TNF-a、KC)濃度的顯著降低。如圖6所示，用來氟米特(LEF)管飼小鼠逆轉(zhuǎn)了p.i.第2天的RSV誘導(dǎo)的肺含水量增加。來氟米特的效應(yīng)被同時(shí)給予尿苷阻滯。重要的是，用LEF和/或尿苷治療對p.i.第2天肺組織中的病毒復(fù)制沒有作用。
如圖7所示，向AFC滴注劑中加入廣譜的容積調(diào)節(jié)的陰離子通道(VRAC)抑制劑逆轉(zhuǎn)了p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制。盡管所使用的某些抑制劑對多種其它細(xì)胞功能也有不同影響，然而這些試劑具有的VRAC抑制作用為僅有的共同作用。然而，NPPB(100mM)是相對VRAC特異性的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)證實(shí)了在RSV感染早期UTP經(jīng)VRAC自細(xì)胞釋放。此外，氟西汀(fluxetine，10mM)還作為選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑起作用。維拉帕米(verapamil，10mM)還作為Ca++通道阻斷劑起作用。他莫昔芬(tamoxifen，25mM)還是一種抗雌激素。
BALB/c小鼠模型中在感染后的早期時(shí)間點(diǎn)，呼吸道合胞病毒抑制氨氯吡嗪脒敏感性AFC(表示主動(dòng)Na+轉(zhuǎn)運(yùn))，而不誘導(dǎo)顯著的呼吸上皮細(xì)胞病理學(xué)。而且，RSV對AFC的抑制作用由UTP通過它對肺中的P2Y嘌呤能受體的作用來介導(dǎo)。
介導(dǎo)感染后第2天RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的UTP源于從頭合成，該路徑的抑制阻止RSV誘導(dǎo)的AFC的減少及肺含水量的增加而不改變病毒復(fù)制。而且，介導(dǎo)感染后第2天RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的UTP經(jīng)容積調(diào)節(jié)的陰離子通道釋放。
證實(shí)了來氟米特對感染后第2天RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的作用。用來氟米特(5mg/kg，懸浮于1％甲基纖維素，每天一次)口服管飼小鼠預(yù)治療8天，然后用RSV感染并在p.i.24小時(shí)再用來氟米特治療。該方案阻滯了p.i.第2天RSV誘導(dǎo)的AFC的抑制。單獨(dú)管飼甲基纖維素不能模擬該效應(yīng)，而在整個(gè)來氟米特治療期同時(shí)給予尿苷(1mg/kg i.p.q12h，10天)能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。而且單獨(dú)的尿苷治療對AFC也沒有影響。來氟米特對正常(假感染)小鼠的AFC也沒有有害作用。
表3 來氟米特對p.i.第2天RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的影響

AAFC被評價(jià)的小鼠的數(shù)目；B30分鐘后％基礎(chǔ)AFC的平均值±SE；***p＜0.0005(與未治療的小鼠比較)。假感染BALB/c小鼠的AFC30BASAL為37.21±1.2％(n＝8)。
來氟米特的抑制效應(yīng)并不簡單地為抗病毒作用的結(jié)果。病毒復(fù)制不受甲基纖維素、來氟米特或尿苷治療的影響。因此RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的消失并不是簡單的阻滯病毒復(fù)制的結(jié)果，而是來氟米特對嘧啶從頭合成的特異性抑制作用的結(jié)果。
來氟米特療法與RSV感染后第2天增加的肺的濕重∶干重之比(肺含水量和水腫形成的指標(biāo))的正?；嚓P(guān)。并行的尿苷的治療逆轉(zhuǎn)此作用，并導(dǎo)致濕重∶干重之比增加(與假感染小鼠比較)。來氟米特療法顯著降低了p.i.第1天和第2天BALB/c小鼠中常見的體重減輕的程度，表明對食欲的有益作用(可能與抗炎作用有關(guān))。這也表示在此劑量上來氟米特的毒性非常有限。通常當(dāng)?shù)脱跹Y的程度明顯時(shí)，來氟米特療法改善p.i.第2天的平均血氧飽和度。來氟米特療法顯著降低支氣管灌洗液的促炎細(xì)胞因子(干擾素-α、白細(xì)胞介素-1β、KC[人白細(xì)胞介素-8的鼠同系物]和腫瘤壞死因子-α)的水平，該作用僅被并行的尿苷療法部分逆轉(zhuǎn)(因此這可能部分地是藥物的非特異性酪氨酸激酶抑制作用的結(jié)果)。
總之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)來氟米特對RSV疾病具有多種有益作用，但不具有直接的抗病毒作用。這些作用包括消除低氧血癥和肺水腫、體重方面的改善、以及減少肺部炎癥。
核苷酸合成的抑制對肺含水量的影響。來氟米特的全身性療法使第2天肺濕重干重之比恢復(fù)正常，而在來氟米特整個(gè)治療過程中同時(shí)給予尿苷阻滯了該作用(圖8A)。然而，對第2天AFC無有益作用的6-MP全身性療法未改變第2天的肺濕重∶干重之比(圖8B)。
核苷酸合成的抑制對促炎細(xì)胞因子的影響。來氟米特在臨床上用作免疫抑制劑。為證實(shí)該治療方案的有效性，分析其對BALF中的促炎細(xì)胞因子水平的影響。感染后的任何時(shí)間點(diǎn)均檢測不到IL-4或IL-10。在假感染小鼠的BALF中僅檢測到少量的IL-1β和KC(人IL-8的鼠同系物)(表4)。在第2天除IFN-γ外所有其它細(xì)胞因子均呈現(xiàn)顯著量，但在第4天-第8天IL-1β、KC和TNF-γ的水平下降。BALF中，只在第6天和第8天發(fā)現(xiàn)顯著量的IFN-γ。
來氟米特療法顯著降低第2天BALF中的IFN-α、IL-1β、KC和TNF-α的水平(表4)。除IFN-α外，該效應(yīng)僅被并行的尿苷療法部分逆轉(zhuǎn)。
重要的是，6-MP療法導(dǎo)致的BALF的IFN-α、IL-1β、KC和TNF-α水平下降與由來氟米特療法引起的上述水平的下降相當(dāng)(表4)。在用任一試劑治療時(shí)，在第2天兩種療法的小鼠的IFN-α、IL-1β、KC和TNF-α水平無顯著差異。
表4 RSV感染和核苷酸合成的抑制對BALF中促炎細(xì)胞因子的影響

A測定BALF細(xì)胞因子水平的小鼠的數(shù)目BBALF中平均細(xì)胞因子濃度±SE(pg/ml)C來氟米特治療的小鼠D來氟米特和尿苷治療的小鼠E6-巰基嘌呤治療的小鼠F未測定與第2天的水平比較，***p＜0.0005核苷酸合成的抑制對小鼠肺部RSV復(fù)制的影響。在第2天的病毒復(fù)制既不受來氟米特治療的影響，也不受尿苷治療的影響(圖9A)。同樣，6-MP的預(yù)治療對第2天小鼠肺部的病毒復(fù)制沒有顯著抑制作用(圖9B)。當(dāng)在整個(gè)8天感染期內(nèi)連續(xù)用來氟米特治療時(shí)，在第8天病毒復(fù)制持續(xù)為高水平(圖9C)。然而，當(dāng)在第2天以后中止來氟米特治療時(shí)，病毒復(fù)制僅在第8天有很小程度地增加(圖9D)。
來氟米特療法對RSV感染后低氧血癥的影響。來氟米特療法導(dǎo)致第2天SmO2讀數(shù)的正?；?圖10A)。同樣地，來氟米特療法阻滯RSV感染的小鼠在AFC過程中在第2天所見的％ΔHR30的增加(圖10B)。
來氟米特療法對RSV感染后鼻電位差的影響。在整個(gè)感染期使用來氟米特治療完全阻止了RSV誘導(dǎo)的基礎(chǔ)NPD和NPDAMIL下降(圖11A-11C)。
陰離子通道的阻斷對RSV介導(dǎo)的AFC抑制的影響。通過向AFC滴注劑加入每種各結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的VRAC抑制劑，使第2天RSV介導(dǎo)的AFC的抑制被阻斷，上述抑制劑為氟西汀、他莫昔芬、克羅米芬(clomiphene)、維拉帕米、NPPB或IAA-94(表5)。該效應(yīng)被同時(shí)向滴注劑中加入500nMUTP而逆轉(zhuǎn)。相比之下，第2天的AFC不受格列本脲(glibenclamide)對囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子抑制的影響、以及氟甲煙酸對Ca2+激活的Cl-通道活性抑制的影響。
表5 向AFC滴注劑加入陰離子通道抑制劑對第2天RSV介導(dǎo)的AFC的抑制的影響

AAFC被評價(jià)的小鼠的數(shù)目B平均％AFC±SEC5-硝基-2-(3-苯基丙氨基)苯甲酸DR(+)-[(6，7-二氯-2-環(huán)戊基-2，3-二氫-2-甲基-1-氧代-1H-茚-5-基)-氧]乙酸94與第2天的AFC30BASAL比較，**p＜0.005，***p＜0.0005A77-1726對RSV介導(dǎo)的AFC抑制的影響。如先前已知的，BALB/c小鼠鼻內(nèi)感染呼吸道合胞病毒(RSV)A2株導(dǎo)致在感染后(p.i.)第2天和第4天基礎(chǔ)AFC和氨氯吡嗪脒敏感性AFC減小，這種抑制作用是由UTP經(jīng)P2Y受體起作用而介導(dǎo)的(AJPLCMP，2004)。已進(jìn)一步表明，在第2天的RSV介導(dǎo)的AFC抑制被向AFC滴注劑中加入25mM阻斷嘧啶從頭合成的A77-1726阻滯，但不被25mM霉酚酸或6-巰基嘌呤阻滯，霉酚酸和6-巰基嘌呤均阻斷嘌呤從頭合成。A77-1726介導(dǎo)的阻斷被50mM尿苷(它使得可通過補(bǔ)救途徑合成嘧啶)的加入逆轉(zhuǎn)，而不能由25mM染料木黃酮(它模擬A77-1726的非特異性酪氨酸激酶抑制劑作用)重現(xiàn)，說明A77-1726的阻斷效應(yīng)是通過嘧啶從頭合成途徑介導(dǎo)的。類似地，對小鼠使用嘧啶從頭合成抑制劑來氟米特(于1％甲基纖維素中5mg/kgp.o.10天)的治療逆轉(zhuǎn)了RSV對AFC的抑制作用。而且，容積調(diào)節(jié)的陰離子通道(VRAC)功能抑制劑，例如氟西汀(10mM)、維拉帕米(10mM)和他莫昔芬(25mM)，也阻斷p.i.第2天的RSV介導(dǎo)的AFC抑制。綜上，這些數(shù)據(jù)證實(shí)在RSV感染期間抑制AFC的UTP源于嘧啶從頭合成并且經(jīng)VRAC釋放。這些路徑提供了阻滯UTP誘導(dǎo)的AFC減少的新的治療方法，所述AFC的減少促使RSV感染后黏液液體體積增加、氣道充血和鼻漏的形成。
如圖12所示，在感染后(p.i.)第2天和第4天，RSV感染顯著抑制基礎(chǔ)肺泡液體清除率(AFC)。與未感染的小鼠(U)相比，假感染(M)對AFC沒有影響?；A(chǔ)AFC(與假感染的值相比)在第2天被抑制43％，在第4天被抑制26％。AFC的氨氯吡嗪脒敏感性也在p.i.第1天減小，在p.i.第2天和第4天消失。
p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制被向AFC滴注劑中加入腺苷三磷酸雙磷酸酶(降解UTP和ATP)或UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(有葡萄糖-1-磷酸和無機(jī)焦膦酸酶存在時(shí)降解UTP)而逆轉(zhuǎn)，但不被己糖激酶(有葡萄糖存在時(shí)降解ATP)的加入逆轉(zhuǎn)。向滴注劑加入P2Y受體特異性拮抗劑(200mM XAMR0721)也逆轉(zhuǎn)p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制。
在具有正常體溫和血?dú)庵笜?biāo)的麻醉、通氣的BALB/c小鼠上、在氣管滴注0.3ml含5％無脂肪酸的BSA的等滲(isosmolar)NaCl后的30分鐘時(shí)間里進(jìn)行AFC研究。被分析的每組小鼠的數(shù)目列于各圖的相關(guān)圖柱中。
如圖13所示，向AFC滴注劑中加入二氫乳清酸還原酶抑制劑(25μm A77-1726)逆轉(zhuǎn)p.i.第2天RSV介導(dǎo)的AFC抑制。A77-1726的作用被同時(shí)向AFC滴注劑中加入50mM尿苷而完全逆轉(zhuǎn)，但該作用不能由25mM染料木黃酮(非特異性酪氨酸激酶抑制劑)重現(xiàn)。因此A77-1726的作用具有針對嘧啶從頭合成途徑的特異性。
如圖14所示，向AFC滴注劑中加入IMP脫氫酶抑制劑(25μm 6-MP或MPA)對在p.i.第2天的RSV介導(dǎo)的AFC抑制僅有很小的作用。IMP脫氫酶抑制劑的較小作用是ATP缺失的結(jié)果，而ATP是嘧啶從頭合成的必需前體。由于可通過嘌呤補(bǔ)救途徑合成ATP，MPA的作用被同時(shí)向AFC滴注劑中加入50mM次黃嘌呤(HXA)完全逆轉(zhuǎn)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)證實(shí)在RSV感染期間ATP的儲存很少。
在p.i.第2天的RSV誘導(dǎo)的AFC抑制被一種嘧啶從頭合成抑制劑即A77-1726阻滯。A77-1726的作用被促進(jìn)UTP經(jīng)補(bǔ)救途徑合成的外源性尿苷的加入阻斷，并且不能通過模擬A77-1726的非特異性酪氨酸激酶抑制作用的染料木黃酮重現(xiàn)。嘌呤從頭合成抑制劑例如霉酚酸(MPA)和6-巰基嘌呤(6-MP)對RSV介導(dǎo)的AFC抑制僅有很小的阻斷作用，這可能是因?yàn)锳TP合成減少(ATP是嘧啶從頭合成的必需前體)。而該作用又被促進(jìn)ATP經(jīng)補(bǔ)救途徑合成的外源性次黃嘌呤的加入阻斷。有趣的是，在第2天的RSV誘導(dǎo)的AFC抑制還被多種不同的容積調(diào)節(jié)的陰離子通道(VRAC)抑制劑阻滯以及被Rho激酶的抑制所阻滯，其中VRAC已被認(rèn)為是一種ATP和UTP的釋放機(jī)制，而已知Rho激酶被RSV激活，并且還已知它可激活VRAC。
表6 嘧啶和嘌呤合成抑制劑和VRAC抑制劑對p.i.第2天RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的影響

A終濃度(μM)；BAFC被評價(jià)的小鼠的數(shù)目；C30分鐘后平均基礎(chǔ)AFC％±SE；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.0005；(均相對于未治療的小鼠)。
假感染的BALB/c小鼠的AFC30BASAL為37.21±1.2％(n＝8)。
感染后A77-1726治療對p.i.第2天RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的影響。當(dāng)在p.i.24小時(shí)使用A77-1726(50μM于100μl生理鹽水中，分為兩鼻孔)對小鼠鼻內(nèi)給藥治療時(shí)，在p.i.24小時(shí)RSV對AFC的抑制作用被完全阻斷，這說明當(dāng)向肺內(nèi)局部給藥時(shí)，A77-1726對嘧啶從頭合成具有延長的抑制作用。A77-1726的鼻內(nèi)預(yù)治療也與RSV感染后增加的肺濕重干重之比(肺含水量和水腫形成的指標(biāo))的正?；嚓P(guān)。
表7在p.i.24小時(shí)的A77-1726的鼻內(nèi)治療對p.i.第2天的RSV誘導(dǎo)的AFC抑制的影響

AAFC被評價(jià)的小鼠的數(shù)目；B30分鐘后基礎(chǔ)AFC％平均值±SE；C50μM于100μl生理鹽水中，AFC測定前24小時(shí)鼻內(nèi)給藥；D50μM于100μl生理鹽水中，感染后24小時(shí)鼻內(nèi)給藥；***p＜0.0005(相對于未治療的小鼠)對本發(fā)明所述化合物、組合物和方法可作各種修改和變換。本發(fā)明所述化合物、組合物和方法的其它方面應(yīng)從對說明書的考慮以及本發(fā)明公開的化合物、組合物和方法的實(shí)施中顯而易見。應(yīng)當(dāng)理解上述詳細(xì)說明和實(shí)例均為示例性的。
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權(quán)利要求
1.一種包含嘧啶合成抑制劑和可藥用載體的組合物，其中所述組合物適于向受試者肺上皮細(xì)胞局部給藥。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為吸入劑。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為氣霧化組合物。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為噴霧化組合物。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述嘧啶合成抑制劑為來氟米特。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述嘧啶合成抑制劑為A77-1726。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述嘧啶合成抑制劑為二氫乳清酸還原酶抑制劑。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為適于鼻內(nèi)給藥的形式。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肺上皮細(xì)胞位于受試者的鼻腔、鼻道、鼻咽、咽、氣管、支氣管、細(xì)支氣管或肺泡。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述肺上皮細(xì)胞為支氣管肺泡上皮細(xì)胞。
11.一種包括至少一份定量劑量的包含治療量嘧啶合成抑制劑的組合物的裝置，其中每份定量劑量包括治療受試者肺部疾病的嘧啶合成抑制劑的治療量或治療量的一部分。
12.權(quán)利要求11的裝置，其中所述組合物為適于向受試者肺上皮細(xì)胞局部給藥的形式。
13.權(quán)利要求11的裝置，其中所述組合物為吸入劑。
14.權(quán)利要求11的裝置，其中所述組合物為氣霧化組合物。
15.權(quán)利要求11的裝置，其中所述組合物為噴霧化組合物。
16.權(quán)利要求11的裝置，其中所述嘧啶合成抑制劑為來氟米特。
17.權(quán)利要求11的裝置，其中所述嘧啶合成抑制劑為A77-1726。
18.權(quán)利要求11的裝置，其中所述嘧啶合成抑制劑為二氫乳清酸還原酶抑制劑。
19.權(quán)利要求11的裝置，其中所述組合物為適于鼻內(nèi)給藥的形式。
20.權(quán)利要求11的裝置，其中所述肺部疾病為呼吸道合胞病毒感染。
21.一種使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體清除率增加的方法，包括使細(xì)胞與有效量的嘧啶合成抑制劑相接觸，其中所述接觸導(dǎo)致細(xì)胞的Na+依賴性液體清除率增加。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述肺上皮細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述肺上皮細(xì)胞在體外被接觸。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為來氟米特。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為A77-1726。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為二氫乳清酸還原酶抑制劑。
27.一種治療受試者肺部疾病的方法，包括使受試者的多種肺上皮細(xì)胞與有效量的嘧啶合成抑制劑相接觸，其中所述有效量的嘧啶合成抑制劑使得受試者的Na+依賴性肺泡液體清除率增加。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述肺上皮細(xì)胞位于鼻腔、鼻道、鼻咽、咽、氣管、支氣管、細(xì)支氣管或肺泡。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述肺上皮細(xì)胞為支氣管肺泡上皮細(xì)胞。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述肺部疾病為呼吸道合胞病毒感染。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑包括來氟米特。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑包括A77-1726。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述有效量的嘧啶合成抑制劑包括二氫乳清酸還原酶抑制劑。
34.一種減少具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者的一種或多種呼吸道合胞病毒感染癥狀或體征的方法，包括向受試者給予包含有效量嘧啶合成抑制劑的組合物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為二氫乳清酸還原酶抑制劑。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為來氟米特。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為A77-1726。
38.一種方法，包括鑒別具有呼吸道合胞病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者和向該受試者給予包含有效量嘧啶合成抑制劑的組合物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為二氫乳清酸還原酶抑制劑。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為來氟米特。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述嘧啶合成抑制劑為A77-1726。
42.一種方法，包括鑒別患有呼吸道合胞病毒感染的受試者和向該受試者給予包含可有效使受試者的Na+依賴性肺泡液體減少的量的嘧啶抑制劑的組合物。
43.一種治療患有呼吸道合胞病毒感染的受試者的方法，包括向受試者給予權(quán)利要求1的組合物。
44.一種治療患有呼吸道合胞病毒感染的受試者的方法，包括向受試者給予權(quán)利要求2的組合物。
45.一種治療患有呼吸道合胞病毒感染的受試者的方法，包括向受試者給予權(quán)利要求5的組合物。
46.一種治療患有呼吸道合胞病毒感染的受試者的方法，包括向受試者給予權(quán)利要求8的組合物。
47.一種篩選使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物的方法，該方法包括在過量的UTP存在時(shí)使肺上皮細(xì)胞與測試化合物相接觸，檢測肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收，由相比于對照的Na+依賴性液體吸收的增加指示出使肺上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述細(xì)胞在體外被接觸。
50.權(quán)利要求47的方法，還包括去除所述UTP和檢測Na+依賴性液體吸收增加的可逆性。
51.一種篩選使細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物的方法，該方法包括使測試化合物與表達(dá)編碼嘧啶合成基因的異源核酸的細(xì)胞相接觸，并檢測細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收，由相比于對照水平的Na+依賴性液體吸收的增加指示出使Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述細(xì)胞在體外被接觸。
54.一種篩選使呼吸上皮細(xì)胞的Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物的方法，該方法包括用呼吸道合胞病毒感染H441細(xì)胞或細(xì)胞系，使受感染的細(xì)胞或細(xì)胞系與嘧啶合成抑制劑相接觸，并測定跨受感染細(xì)胞或受感染細(xì)胞系的細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，由相比于對照水平的離子轉(zhuǎn)運(yùn)的增加指示出使Na+依賴性液體吸收增加的測試化合物。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述細(xì)胞在體外被接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包含嘧啶合成抑制劑和可藥用載體的組合物。所述組合物可用于使肺上皮細(xì)胞的Na
文檔編號A61K31/42GK1993125SQ200580024561
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者S·馬塔朗, I·C·戴維斯 申請人:Uab研究基金會(huì)