專利名稱：刺激或增強骨形成和細(xì)胞自我更新的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的組合物和方法，包含拮抗和/或抑制Wnt蛋白的叫 Dickkopf-2 ( Dkk2 )的蛋白，用于刺激或增強礦化作用，并刺激細(xì)胞 更新。Dkk2可刺激骨形成，并且它的此種作用是獨立于Wnt蛋白， Wnt蛋白能被Dkk2抑制和/或拮抗。更具體地說，Dkk2刺激成骨細(xì) 胞分化及因此而發(fā)生的礦化作用。Dkk2還在造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干 細(xì)胞的分化和自我更新中，特別是在成骨作用(osterblastogenesis ) 和破骨作用(osterclastogenesis)過程中起作用。
在此申請中引用或提到的所有專利，專利申請，專利出版物，科 學(xué)文章，及類似物在此以其全部內(nèi)容一并歸入本申請的參考文獻(xiàn)，以 便更全面地講述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況。
背景技術(shù)：
人與小鼠遺傳學(xué)方面的證據(jù)表明，作為Wnt共同受體的低密度 脂蛋白受體蛋白5 (LRP)"在骨重建中起重要作用"。此外，經(jīng)典 (canonical) Wnt蛋白和活化了的P-連環(huán)蛋白刺激成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的 堿性磷酸酶(AP )的活性"。然而經(jīng)典Wnt蛋白及其拮抗物Dickkopf (Dkk)分子在骨發(fā)生中的確切作用至今仍不清楚。通常認(rèn)為，Dkk蛋 白在骨發(fā)生過程中起負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用。Dkk蛋白是一組富含半胱氨 酸的分泌型蛋白。這些Dkk蛋白在Wnt的信號傳導(dǎo)中顯示負(fù)調(diào)節(jié)因子作用。已有四種Dkk蛋白在人體中被確認(rèn)。它們分別被稱為Dkkl, Dkk2， Dkk3,及Dkk4。
根據(jù)對人的研究，LRP-5的突變與骨量具有相關(guān)性，說明LRP-5 在調(diào)節(jié)骨發(fā)育中起關(guān)鍵性作用"。這個結(jié)論在對LRP-5基因遭到破壞 的小鼠的研究以及在對帶有以骨組織為目標(biāo)的造成骨量增強的LRP-5 的突變體的小鼠的研究中得到了證實8，9。另有證據(jù)指出經(jīng)典Wnts的 分類是根據(jù)它們穩(wěn)定(3-連環(huán)蛋白進(jìn)而激活LEF-1/TCF轉(zhuǎn)錄的能力1D， 或者根據(jù)它們穩(wěn)定P-連環(huán)蛋白進(jìn)而刺激成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的AP活性的 能力而決定的3'7。以上所有這些發(fā)現(xiàn)都提示經(jīng)典Wnt蛋白的信號傳導(dǎo) 參與調(diào)節(jié)骨發(fā)生。然而其機制卻仍不清楚。
除了別的細(xì)胞以外，人的骨髓還含有造血干細(xì)胞(HSCs)和間 充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。在體內(nèi)，干細(xì)胞具有自我再生的特點，這使 得它們可以無止境地更新。這種更新的特性在體外生長的細(xì)胞卻并不 常見。MSCs分化成諸如成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等之類的間 充質(zhì)組織細(xì)胞譜系。而造血干細(xì)胞則是包括血細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞語 系的前體細(xì)胞。單核細(xì)胞前體來自早期造血干細(xì)胞。破骨細(xì)胞是由單 核細(xì)胞前體融合而來的。作為T淋巴細(xì)胞一個亞類的自然殺傷T (NKT)細(xì)胞來自造血干細(xì)胞。當(dāng)通過它們的T細(xì)胞受體(TCR)受 到刺激時，NKT細(xì)胞會產(chǎn)生高水平的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因 子進(jìn)而可以調(diào)控免疫反應(yīng)，比如抑制自體免疫，排斥腫瘤及與組織移 植有關(guān)的反應(yīng)。
MSCs亦稱為骨髓基質(zhì)細(xì)胞，骨原細(xì)胞及成骨細(xì)胞干細(xì)胞。它們 作為飼養(yǎng)層調(diào)節(jié)著微環(huán)境，使造血千細(xì)胞得以維持，擴充和更新。成 骨細(xì)胞已顯示是那些可以在骨內(nèi)膜表面產(chǎn)生造血生長因子的基質(zhì)細(xì) 胞，因而它在造血干細(xì)胞的發(fā)育中起重要作用。已有實驗證實增加成 骨細(xì)胞的數(shù)目可以提高造血干細(xì)胞的總數(shù)。"，"
還有研究指出，經(jīng)典Wnt蛋白之一，即Wnt3a對干細(xì)胞生長， 特別是造血干細(xì)胞的生長起直接調(diào)節(jié)作用。Wnt3a參與很多包括干細(xì) 胞的增殖及自我更新在內(nèi)的發(fā)育事件。""Wnt3a還通過基質(zhì)細(xì)胞間接地調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞系的發(fā)育。(Yamane, et al， "Wnt Signaling Regulates Hemopoiesis Through Stromal Cells")。已有實驗表明，夕卜 源的Wnt的拮抗劑Dickkopf-1 ( Dkk-1)可以增強培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì) 胞的增殖。加入Dkkl的抗體則使間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖減低。Dkkl對 培養(yǎng)的MG-63骨肉瘤細(xì)胞也有同樣的效果。"，"然而對Dkk蛋白在體 內(nèi)及體外對造血干細(xì)胞，NKT細(xì)胞，和其它干細(xì)胞的作用仍不清楚。 本發(fā)明闡述了 Dkk蛋白對各種各樣的千細(xì)胞的作用。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及解決幾個像骨質(zhì)疏松等骨病那樣的與骨重建有關(guān)的 問題的方法和組合物。本發(fā)明還提供協(xié)助治愈骨折及其它損傷和病變 的組合物的應(yīng)用。特別是，本發(fā)明還涉及在哺乳動物受試者中刺激或 增強成骨細(xì)胞礦化作用的方法，包括給所述受試者施用有效量的Dkk 蛋白，Wnt的抑制劑，或Wnt的拮抗劑。
本發(fā)明更進(jìn)一步地提供對臨床病癥的基因療法，所述臨床病癥的 特點為礦化作用不夠，該方法包括包括施用有效量的Dkk蛋白，Wnt 抑制劑，或Wnt拮抗劑或通過增加Dkk蛋白，Wnt抑制劑，或Wnt 拮抗劑的表達(dá)。
在本發(fā)明的另一方面，Dkk、 Wnt抑制劑、Wnt拮抗劑或其它相 關(guān)蛋白的基因表達(dá)、檢測和定量都可能成為診斷多種骨病的方法。
另一方面，本發(fā)明還提供Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 的突變體或改變的形式，包括那些可以選擇性地刺激骨細(xì)胞分化但卻 缺少抑制Wnt信號傳導(dǎo)的能力的突變體或改變的形式。
此發(fā)明還提供其它修飾，例如Dkk的融合蛋白，其顯示在刺激 礦化作用方面具有增強的特異性靶向和生物活性。
本發(fā)明更進(jìn)一步地涉及開發(fā)與Dkk有關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠或Dkk2 超量表達(dá)的實驗動物。這些動物可用來作為在體內(nèi)評估和鑒定Dkk的 突變種或改變的Dkk及相關(guān)的融合蛋白的模型。
本發(fā)明還涉及方法和組合物，其解決了 Wnt、 Dkk、 Wnt抑制劑、
22Wnt拮抗劑或相關(guān)蛋白對造血干細(xì)胞，NKT細(xì)胞，和其它可以自我更 新的干細(xì)胞在體內(nèi)外自我更新的效能。
再有另一方面，本發(fā)明還涉及開發(fā)用于治療的Dkk,比如骨髓移 植和在體內(nèi)外擴增造血干細(xì)胞、NKT細(xì)胞及其它干細(xì)胞。
附圖簡述
圖l說明經(jīng)典Wnt對成骨細(xì)胞的增殖和分化的刺激作用。

圖1A: 顯示的是從帶有由2. 3Kb CollAl啟動子控制的GFP轉(zhuǎn)基因的三個月 大的小鼠中提取出的骨髓基質(zhì)(BMS)，其中這些小鼠已用對照腺病 毒或Wntl腺病毒感染，或經(jīng)過Wnt3aCM處理。在5天后，細(xì)胞被 染色以顯示AP活性，或在所標(biāo)明的時間將其固定，而后染色以檢測 礦化作用[b， VonKossa銀染；c， Alizarrin Red染色；圖1B是成骨 標(biāo)記OC和BSP在不同分化階段的表達(dá)的Northern分析。
圖2展示了 Dkkl, Dkk2，和Wnt7b在成骨細(xì)胞中的表達(dá)。圖 2A是實時RT-PCR的結(jié)果，它顯示了在BMS細(xì)胞分化過程中Dkkl 和Dkk2表達(dá)增加而Wnt7b的表達(dá)卻呈先增加后降低的狀況。圖2B， 圖2C和圖2D是小鼠長骨切片原位雜交的照片。圖2B顯示Dkkl主 要在骨細(xì)胞表達(dá)。圖2C顯示Dkk2主要在成骨細(xì)胞表達(dá)。圖2D顯示 Wnt7b也在成骨細(xì)胞中表達(dá)。
圖3用實時RT-PCR說明了 Wnt5a和Wnt5b在BMS細(xì)胞分化 過程中的表達(dá)。圖3A和圖3B顯示在成骨細(xì)胞分化過程中，Wnt5a 與Wnt5b表達(dá)都呈先增加后降低狀況。
圖4表明Dkkl可以在前期階段抑制成骨細(xì)胞分化。來自2. 3 CollAl小鼠的BMS培養(yǎng)物用重組的Dkkl蛋白(1jiM)或?qū)φ站彌_ 液處理。在所示的時間測定GFP的表達(dá)。圖4A顯示GFP在Dkkl 處理過的培養(yǎng)物表達(dá)得比用對照處理過的培養(yǎng)物(圖4B)要少的多。 這些結(jié)果表明Dkkl在所示的時間抑制成骨細(xì)胞分化(圖4C)。
圖5證明經(jīng)典Wnt并不影喻成骨細(xì)胞分化的后期。圖5A顯示 Wntl腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)物與對照腺病毒(圖5B)轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS
23培養(yǎng)物相比其礦化程度在所示的時間(圖5C)是沒有變化的。
圖6說明經(jīng)典Wnt在成骨細(xì)胞對Dkk2有上調(diào)作用。圖6A是 Northern印跡的結(jié)果，該結(jié)果顯示Dkk2 mRNA水平在由對照腺病毒 轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測不到，而在由Wntl腺病毒 轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞培養(yǎng)物中卻明顯增高。圖6B顯示來自2.3Col-GFP 小鼠的BMS細(xì)胞在加入Wnt3a后24小時內(nèi)即可開始表達(dá)GFP。這 個結(jié)果說明經(jīng)典Wnt可以刺激成骨細(xì)胞的分化。圖6C是來自 2.3Col-GFP小鼠的BMS細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)抗Dkk2抗體免疫染色后的照 片。從照片可見表達(dá)的Dkk2與成骨細(xì)胞分化標(biāo)志2.3Col-GFP定位相 同。
圖7顯示Dkk2刺激礦化作用圖7A顯示在MC3T3細(xì)胞被 SupDkk2或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，用實時RT-PCR測定了在分化的不同 時間Dkk2表達(dá)的相對水平。圖7B顯示SupDkk2轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì) 胞礦化的情況。圖7C顯示了對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞礦化的情況。 這些結(jié)果指出Dkk2的表達(dá)與礦化有很強的相關(guān)性。圖7D顯示了經(jīng)表 達(dá)Dkk2的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)物在所示的時間用二曱酚橙染色的 情況(圖7F)。圖7E顯示了經(jīng)對照腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)物在所 示的時間用二曱盼橙染色的情況(圖7F)。在Dkk2轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可見 一種獨特的鉀化模式。
圖8表明一種稱為sFRP3的Wnt抑制劑不能刺激礦化。BMS培 養(yǎng)物經(jīng)表達(dá)sFRP3的腺病毒或?qū)φ障俨《咎幚?，我們看不到那種圖 7E中所見到的那種獨特的鈣化模式。
圖9說明Dkk2是礦化所必需的。誘導(dǎo)來自小鼠顱蓋骨的成骨細(xì) 胞培養(yǎng)物分化。15天之后用二曱酚橙染色以示礦化。來自野生型(圖 9a和圖9d)和雜合型(圖9b和圖9e)小鼠的培養(yǎng)物都表現(xiàn)出強礦化 作用，而那些來自Dkk2敲除小鼠(圖9c和圖9f)的培養(yǎng)物卻看不到 任何礦化跡象。圖9d，圖9e和圖9f是在顯微鏡下用透射光照的照片。
圖10顯示Dkk2是前成骨細(xì)胞(pre-osteoblast)形成的正調(diào)節(jié) 因子。在第5天用染AP的方法來監(jiān)測來自野生型小鼠，Dkk2敲除小鼠和雜合型小鼠的細(xì)胞培養(yǎng)物的成骨細(xì)胞集落形成，可以發(fā)現(xiàn)Dkk2 敲除小鼠(圖10A)形成集落的數(shù)目比野生型小鼠(圖10B)及雜合 型小鼠(圖10C)形成集落的數(shù)目明顯減少。
圖ll說明了 Dkk2對破骨細(xì)胞形成的作用。在小鼠的骨髓培養(yǎng) 液中加入M-CSF和RANKL以i秀導(dǎo)其分化。6天后用抗酒石酸酸性磷 酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)對破骨細(xì)胞染色 并在顯微鏡下觀察多核細(xì)胞的形態(tài)。破骨細(xì)胞的數(shù)目在Dkk2敲除小 鼠(圖11C)的骨髓培養(yǎng)物中比來自野生型小鼠(圖11A)或雜合型 小鼠(圖11B)的骨髓培養(yǎng)物明顯減少。
圖12的草圖出示了經(jīng)典Wnt和Dkk蛋白是如何對骨發(fā)生起調(diào)節(jié) 作用的模型。在前成骨細(xì)胞階段，經(jīng)典Wnt(比如Wnt7b)的表達(dá)會 增加，經(jīng)典Wnt刺激前成骨細(xì)胞增殖并分化為成骨細(xì)胞。在這分化過 程中，Dkk2的表達(dá)上調(diào)，其又進(jìn)一步刺激了分化。Dkk2的這種作用 是獨立于其在成骨細(xì)胞成熟的生長期所呈現(xiàn)的對Wnt信號傳導(dǎo)的拮 抗作用的。
發(fā)明詳細(xì)
本發(fā)明提供了治療骨病，骨折，骨損傷及其它骨異常的方法和組 合物。這種治療是通過給哺乳動物受試者施用有效量的Dkk蛋白， Wnt抑制劑，Wnt拮抗劑或任何其它相關(guān)蛋白，使其礦化作用得到刺 激或增強而完成的。
Dkk可以包含Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4，或它們之間的任意 組合。Dkk蛋白還包含獨立于任何可以被任何Dkk蛋白抑制或拮抗的 Wnt的蛋白，獨立調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)的蛋白，或酶的同源物，具 有類似功能的不相關(guān)蛋白，或Dkk的同源物。Wnt拮抗劑包含Dkk、 蛋白質(zhì)、糖類、化學(xué)制品、脂類、糖蛋白、糖脂、多肽、核酸、小分 子、Wntl、 Wnt2、 Wnt3、 Wnt3a、 Wnt4a、 Wnt5a、 Wnt5b、 Wnt6、 Wnt7a、 Wnt7b、 Wnt7c、 Wnt8、 Wnt8a、 Wnt8b、 Wnt8c、 Wntl0a、 Wntl0b、 Wntll、 Wntl4、 Wntl5、 Wntl6或至少以下蛋白質(zhì)之一，或至少以下蛋白質(zhì)的一個片段Dkk蛋白，新月(crescent)蛋白， cerebrus蛋白，軸(Axin)蛋白，F(xiàn)rzb蛋白，糖原合酶激酶蛋白，T 細(xì)胞因子蛋白，蓬亂(dishevelled)蛋白，或sFRP3蛋白。Wnt抑制 劑可以包含Dkk、蛋白質(zhì)、糖類、化學(xué)制品、脂類、糖蛋白、糖脂、 多肽、核酸、小分子、Wntl、 Wnt2、 Wnt3、 Wnt3a、 Wnt4a、 Wnt5a、 Wnt5b、 Wnt6、 Wnt7a、 Wnt7b、 Wnt7c、 Wnt8、 Wnt8a、 Wnt8b、 Wnt8c、 WntlOa、 WntlOb、 Wntll、 Wntl4、 Wntl5、 Wntl6或至少 以下蛋白質(zhì)之一，或至少以下蛋白質(zhì)的一個片段Dkk蛋白，新月 (crescent)蛋白，cerebrus蛋白，軸(Axin )蛋白，F(xiàn)rzb蛋白,糖原 合酶激酶蛋白，T細(xì)胞因子蛋白，蓬亂(dishevelled)蛋白，或sFRP3 蛋白。蛋白質(zhì)或其片段可以用生物手段來自自然，也可用重組DNA 方法獲得。如以人為治療對象，這些蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)片段優(yōu)選來自非 人來源?？赡馨l(fā)生的免疫反應(yīng)可以通過給受試者施用免疫抑制劑或應(yīng) 用一種試劑特異的免疫操作法減弱或消除，此技術(shù)在Rabbani, E. et al 在1999年7月16日提交的題為"NoveI Selective Immune Down Regulation(SIDR) Mediated Translation Process for Preventing or Treating Disease in a Subject, and Compositions of Matter Comprising Trained or Programmed Cells, Tissues or Organs Useful for SIDREstAlishment"的專利申請(申請?zhí)?9/356， 294)中有所 說明。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用一種特定的Dkk蛋白即Dkk2 蛋白治療骨病、骨折、骨損傷及異常。在刺激或增強礦化作用方面， Dkk2已顯示出增強的特異性靶向能力和增強的生物活性。在現(xiàn)有技 術(shù)中，我們知道Dkkl和Dkk2可以充當(dāng)Wnt抑制劑，進(jìn)而造成其抑 制骨形成，刺激，增強或重建。特別是如果在前成骨細(xì)胞期加入Dkkl (一種強抑制劑)或Dkk2 (—種弱抑制劑)，則對骨生成沒有刺激或 增強作用。本發(fā)明顯示如果加入Dkk2 ( —種強刺激劑)或Dkkl ( — 種弱刺激劑)，骨形成會受到刺激或增強。Dkk2是通過一條獨立于 其作為Wnt信號傳導(dǎo)拮抗劑的途徑來刺激培養(yǎng)的成骨細(xì)胞礦化的?？梢韵嘈臘kk2所實施的這一功能是通過一條非Wnt的途徑，因為Dkkl ( 一種更強的Wnt拮抗劑)，或Axin ( —種胞內(nèi)Wnt抑制劑)，或 Frzb都沒有觀察到這種刺激礦化作用的功能。成骨細(xì)胞的分化伴有 Dkk2表達(dá)的上調(diào)。除了刺激成骨細(xì)胞分化以外，Dkk2還抑制已產(chǎn)生 的Wnt。
從實驗可以觀察到Wnt蛋白可刺激骨原細(xì)胞(osteoblast progenitor )的自我更新。包括Wnt7b， Wnt3a和Wntl在內(nèi)的Wnt 蛋白已顯示出它們不但可以刺激骨原細(xì)胞的更新，還可以通過激活成 骨細(xì)胞特異的2， 3kb CollAl啟動子來刺激成骨細(xì)胞的分化。本發(fā)明 提出經(jīng)典Wnts，包括Wnt7b， Wnt3a及Wntl，在成骨細(xì)胞分化中起 重要作用。如果給前成骨細(xì)胞加入Wnt，前成骨細(xì)胞就會分化為成骨 細(xì)胞。如果在Dkk2可以刺激或增加礦化的階段，給體外成熟的成骨 細(xì)胞加Wnt， Wnt則不會刺激或提高礦化。
成骨細(xì)胞位于龕，在那里我們還可發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞。在這個龕內(nèi)，造 血干細(xì)胞在不斷地更新自己。由于成骨細(xì)胞產(chǎn)生Wnt，特別是Wnt7b， 且Wnt7b已顯示可在體內(nèi)使干細(xì)胞增多25，26，所以成骨細(xì)胞可以刺激 造血干細(xì)胞的自我更新27，28。如果把Wnt或可以產(chǎn)生Wnt的成骨細(xì)胞 加到在體外培養(yǎng)的造血干細(xì)胞中，這些干細(xì)胞就會表現(xiàn)出自我更新。 由于Dkk2可以抑制Wnt，所以當(dāng)把Dkk2加入這些細(xì)胞時，這些細(xì) 胞就會終止更新而開始分化。
本發(fā)明還指出Dkk2可以在體內(nèi)增加成骨細(xì)胞的數(shù)目。由于成骨 細(xì)胞可以刺激造血干細(xì)胞的自我更新27，28，因而Dkk2也應(yīng)通過另 一個 不同才幾制或途徑造成干細(xì)胞更新。
基因工程，基因操作或其它基因治療方法可以用來治療以礦化不 足為特征的臨床病癥。這些方法包括引入新的基因，除去體內(nèi)已有的 基因或引入更多拷貝的體內(nèi)已有的基因以增加或減少其表達(dá)。比如如 果理想的結(jié)果是提高或超量表達(dá)Dkk、 Wnt抑制劑、Wnt拮抗劑或相 關(guān)蛋白，礦化作用就會得到刺激或增強。這種現(xiàn)象我們在Dkk2-超表 達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中已經(jīng)見到。本發(fā)明使這種變異小鼠成為在體內(nèi)評價和鑒定Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑及相關(guān)的融合蛋白的突變體和 改變的形式的模型。這些融合蛋白在刺激或提高礦化方面具有增強的 特異性靶向和生物活性。這些突變體、改變的形式和融合蛋白還包括 那些可以選擇性地刺激骨細(xì)胞分化或增生但缺乏抑制Wnt信號傳導(dǎo) 的能力的蛋白。
基因操作可以通過瞬時表達(dá)或永久性地引入新的遺傳性狀而實 施。操作可在離體細(xì)胞上進(jìn)行，而后再將其引入體內(nèi)。相反的，操作 也可在體內(nèi)進(jìn)行。離體施行瞬時表達(dá)的方法包括在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中 加入寡核苷酸或多聚核苷酸，或用常用于瞬時表達(dá)的載體感染，比如 腺病毒。在體外施行永久表達(dá)的方法包括配體介導(dǎo)的攝入(詳見 Rabbani E.于1995年12月15日提交的題為"Novel Property Effecting and/or Property Exhibiting Compositions for Therapeutic and Diagnostic Uses"專利，專利申請?zhí)枮?8/574， 443)，用帶有選擇性 標(biāo)志的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的細(xì)胞，或用病毒載體感染細(xì)胞。實例為基 于逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺伴隨病毒(AAV)的載體。用現(xiàn)有技術(shù)可以在體內(nèi) 或體外改變引入物的向性以便把它們引入恰當(dāng)?shù)陌壹?xì)胞。
在已開發(fā)出的造成Dkk2表達(dá)降低或消失的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā) 現(xiàn)其最后結(jié)果是骨密度降低。因此無論在細(xì)胞培養(yǎng)的體外模型還是在 轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)模型，都發(fā)現(xiàn)Dkk2對骨發(fā)生起重要的調(diào)節(jié)作用。
進(jìn)一步說，在Dkk2基因敲除的小鼠，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都有 所減少。這種降低又造成而后的Dkk2細(xì)胞的減少。這說明Dkk2對 成骨作用和破骨作用都是必需的。因為破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分別來自 造血干細(xì)胞(HSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，而且造血干細(xì)胞的數(shù) 目與成骨細(xì)胞數(shù)目是平行的，減少成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞就會造成造血 干細(xì)胞或間充質(zhì)千細(xì)胞減少。已有實驗證實Dkk對來自骨髓的人類成 體干細(xì)胞的增殖和重新進(jìn)入細(xì)胞周期是必需的。由于Dkk2蛋白在來 自造血及間充質(zhì)千細(xì)胞的語系的分化和增殖中顯示了其重要作用， Dkk2似乎也參與造血及間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化和自我更新。由 于實驗證實在成骨細(xì)胞分化過程中Wnt7b呈上調(diào)狀態(tài)，Wnt7b對細(xì)
28胞的分化和增殖也有作用。新近研究表明，在某種情況下，可在體外
激活人的NKT Va24細(xì)胞使其進(jìn)入分化或增殖8、 9*。因此Dkk蛋白、 Dkk衍生物、Wnt抑制劑、Wnt拮抗劑和其它相關(guān)蛋白可以被開發(fā)為 造血千細(xì)胞、NKT細(xì)胞、和其它種細(xì)胞更新的治療劑。
這些治療劑可以通過被直接引入疾病的、骨折的或病變的部位的 方法使其在像骨髓移植這樣的情況得到應(yīng)用。這些治療劑也可通過把 它們在體外與從受試者體內(nèi)取出的細(xì)胞混合使這些細(xì)胞增殖，而后將 原來取出的及后來增殖的細(xì)胞一并重新輸回該受試者體內(nèi)的方法得以 間接使用。具體地說，可以從有病的受試者中取出想要的細(xì)胞，把它 們與飼養(yǎng)層細(xì)胞一起培養(yǎng)，并加入有效量的Dkk、 Wnt抑制劑、Wnt 拮抗劑或相關(guān)蛋白以刺激想要的細(xì)胞更新。飼養(yǎng)層細(xì)胞可包括間充質(zhì) 干細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞或其它種可以促使細(xì)胞生長或分化的細(xì)胞。而后把 已更新了的細(xì)胞重新輸入該受試者。細(xì)胞也可從另一受試者取出，更 新后再輸入有病的受試者。
本發(fā)明還描述了治療感染性疾病的方法及組合物。這些疾病包括 任何由病毒或免疫藥物介導(dǎo)的肝炎、細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染 或寄生蟲感染。病毒感染可以是HBV、 HCV或HIV的感染。治療包 括在體外更新已轉(zhuǎn)導(dǎo)了的細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是為了引入至少一個可以治 療這種疾病的抗病基因。
一個優(yōu)選的實施方案包括從被病毒感染的受試者身上取出 CD34+細(xì)胞，然后在體外通過轉(zhuǎn)導(dǎo)向這些細(xì)胞引入可以抗這種疾病的 基因，繼而將這些轉(zhuǎn)導(dǎo)了的細(xì)胞與飼養(yǎng)層及足以使這些細(xì)胞更新的量 的Dkk、或Wnt抑制劑、或Wnt拮抗劑或相關(guān)蛋白在一起做體外培 養(yǎng)。當(dāng)這些細(xì)胞增殖后，將它們重新輸回感染的受試者。
本發(fā)明還提供了在體外篩選酶同源體、具有類似功能的無關(guān)蛋 白、或Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的同源物的方法。優(yōu)選的實施 方案在第一個試管中備有Dkk2表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞； 在第二個試管中備有對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞；在第三個試管中 備有由Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞。然后測定各試管內(nèi)礦化量。 如果第一個試管內(nèi)礦化的量大于第二個試管，且第三個試管內(nèi)礦化的 量與第一個試管內(nèi)礦化的量大致相同，則這種Dkk、 Wnt抑制劑或 Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物也具有 提高或刺激礦化的功能。
另一種優(yōu)選實施方案也提供體外篩選Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt 拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物的方法。即 在第一個試管中備有Dkk2表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)細(xì)胞；在第二 個試管中備有對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)細(xì)胞；在第三個試管中備有 由Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān) 蛋白、或同源物轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)細(xì)胞。然后測定每一個試管內(nèi)礦化 的量。如果第一個試管內(nèi)礦化的量大于第二個試管，且第三個試管內(nèi) 礦化的量與第一個試管內(nèi)礦化的量大致相同，則這種Dkk、 Wnt抑制 劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物也
具有提高或刺激礦化的功能。
還有一種實施方案為在體外篩選那些給哺乳動物治療某種疾病
的Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān) 蛋白、或同源物的方法。這種方法是將調(diào)節(jié)性的、或免疫調(diào)節(jié)性的、 或NKT細(xì)胞放入帶有飼養(yǎng)層細(xì)胞的第一個試管；將調(diào)節(jié)性的、或免 疫調(diào)節(jié)性的、或NKT細(xì)胞加上Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶 同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物放入第二個試管；將調(diào) 節(jié)性的、或免疫調(diào)節(jié)性的、或NKT細(xì)胞及Dkk蛋白放入帶有飼養(yǎng)層 細(xì)胞的第三個試管。而后測定各試管內(nèi)細(xì)胞更新或增殖的量。如果第 二試管內(nèi)的細(xì)胞量多于第一試管內(nèi)的細(xì)胞量，并與第三試管內(nèi)的細(xì)胞 數(shù)目大致相同，則這種Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、 具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物也具有造成細(xì)胞更新或增殖的功 能。
還有一個篩選Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具 有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物的實施方案，包括(l)用對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)MC3T3細(xì)胞；和(2 )用包含Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗 劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)MC3T3細(xì)胞。用AlizarrinRed將這些被轉(zhuǎn)導(dǎo)了的細(xì)胞染色以檢測 礦化的情況。如果對照(1)沒有顯示礦化，而(2)顯示了礦化，則 這種Dkk、 Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無 關(guān)蛋白、或同源物也具有提高或刺激礦化的功能。
另一種體外篩選的優(yōu)選實施方案包括用BMS培養(yǎng)細(xì)胞替代前面
所述步驟中用的MC3T3細(xì)胞，而后在染色時用二甲酚橙替代 Alizairin Red。
本發(fā)明還提供了一種體外檢測法，其中將Dkk、 Wnt抑制劑或 Wnt拮抗劑的酶同源物、具有類似功能的無關(guān)蛋白、或同源物加入 Dkk2基因敲除小鼠，從而提高或刺激礦化。
材料和方法
BMS細(xì)胞培養(yǎng)及骨分化的誘導(dǎo)
從3個月大的小鼠用過去已描述過的方法建立BMS細(xì)胞培養(yǎng)物 "。這些BMS細(xì)胞以10xl(^細(xì)胞/孔的密度短暫地培養(yǎng)在含有100單 位/毫升青霉素、100單位/毫升鏈霉素及10。/。胎牛血清的a-培養(yǎng)基中。 五天后，用4。/。多聚甲醛將此細(xì)胞培養(yǎng)物在4X:固定10分鐘。成骨細(xì) 胞集落可通過用AP ( Sigma Diagnostics )染色來觀察。當(dāng)細(xì)胞鋪滿時 便可在10nM地塞米松、8mM P-磷酸甘油、50微克/毫升抗壞血酸存 在的情況下誘導(dǎo)成骨分化。其培養(yǎng)液每兩天更換一次。用Von Kossa 硝酸^L或Alizarrin Red染色可觀察礦化的情況。
骨髓細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)
將從小鼠骨髓中提取出的細(xì)胞以5x10s細(xì)胞/孔的密度接種在含 有抗生素、10%胎牛血清、10納克/毫升MCSF和60納克/毫升RANKL 的a-培養(yǎng)基的48孔培養(yǎng)板中。其培養(yǎng)基每兩天更換一次。第六天時， 成骨細(xì)胞經(jīng)4。/。多聚甲醛在4'C固定10分鐘，并用TRAP染色后可視化(Sigma Diagnostics )。
來自小鼠顱蓋骨的成骨細(xì)胞的培養(yǎng)
自5-8天大的小鼠獲取顱蓋骨，用PBS洗滌兩次并用含有0.05% 胰蛋白酶、0.2mMEDTA、 0.5亳克/毫升膠原酶P的PBS進(jìn)行消化以 釋》文成骨細(xì)胞。經(jīng)離心收集成骨細(xì)胞并以2xl()S細(xì)胞/孔的密度接種在 含有100單位/毫升青霉素、100單位/毫升鏈霉素、10%胎牛血清和1% 非必需氨基酸的DMEM的6孔培養(yǎng)板中。待七天后，細(xì)胞鋪滿。將 培養(yǎng)液更換成含有抗生素、10。/。胎牛血清、5mM P-磷酸甘油及25微 克/亳升抗壞血酸的oc-培養(yǎng)基。培養(yǎng)液每天更換一次。其礦化的情況可 通過用20nM二曱酚橙染活細(xì)胞培養(yǎng)物而觀察。
免疫染色
將BMS細(xì)胞接種在6-孔板內(nèi)的蓋玻片上。在不同的時間點將蓋 玻片固定，并用Vector Laboratories的Blocking Reagent封閉。細(xì)胞 經(jīng)透化后，先用抗-Dkk2單克隆抗體，而后用羅丹明綴合的第二抗體 染色。
OPCR和Northern分析
用Trizol試劑(Invitrogen)按廠商說明書提取總RNA。為進(jìn)行 QPCR,首先用實時RT-PCR的SuperScriptTM First Strand Synthesis System(Invitrogen )將RNA逆轉(zhuǎn)錄。QPCR是用QuantiTectTM SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen )在DNA Engine OPTICONTM ( MJ Research Inc )上進(jìn)行。每個樣品都用P-肌動蛋白作為內(nèi)部參照。應(yīng)用 過去已描述過的公式24，可參照P-肌動蛋白mRNA的水平將mRNA 的相對變化標(biāo)準(zhǔn)化。為了做Northern分析，先要將RNA (10ng)在 瓊脂糖凝膠上分離。待將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上后，用"P標(biāo)記的探 針檢測。SiRNA及Dkk的表達(dá)
將以HI啟動子為基礎(chǔ)的SiRNA生產(chǎn)單位插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 上，用此載體生產(chǎn)出逆轉(zhuǎn)錄病毒，并用其感染MC3T3細(xì)胞。被此栽 體穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞經(jīng)潮霉素(Calbiochem-Novabiochem Co.)篩選 出來。此后將那些抗潮霉素的細(xì)胞合并進(jìn)行研究。
為了使Wntl， Dkkl, Dkk2和sFRP3在BMS細(xì)胞中超量表達(dá)， 先建立了含有Wntl， mDkkl， mDkk2，或sFRP3表達(dá)盒的腺病毒。 用此腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BMS細(xì)胞培養(yǎng)物，可用20nM 二曱酚橙染活細(xì)胞培 養(yǎng)物以觀察其礦化的情況。
原位雜交
用Dkkl, Dkk2和Wnt7b的全長編碼區(qū)合成反義和有義的探針。 探針用RNA labelling Kit (Roche ， Indianapolis, IN. USA )標(biāo)記上 洋地黃毒苷。來自三周大的小鼠脛骨的切片經(jīng)脫蠟、再水化后，用4% 多聚甲醛固定。切片再經(jīng)2%甘氨酸、蛋白酶K處理，用乙酸酐/TEA 溶液乙?；螅c洋地黃毒苷標(biāo)記的探針雜交。經(jīng)50%的曱酰胺、 5xSSC和5。/。SDS在70'C洗滌30分鐘兩次后，再用50%的曱酰胺、 2xSSC在65。C洗滌30分鐘。在此之后，切片先與抗-洋地黃毒苷-堿性 磷酸酶的抗體溫育，后與氮藍(lán)四唑/4-溴-5-氯-丐l咪磷酸(Nitro Blue Tetrazolium/4誦bromo誦5-chloro indolylphosphate ) —:^^^"fM《《!f 藍(lán)色。另外，切片還經(jīng)過甲基綠(核)及橘黃G (細(xì)胞質(zhì))的復(fù)染。
BMD測量
首先建立了 一個Dkk2基因敲除的小鼠模型。當(dāng)小鼠兩個月大時， 在PIXImus小動物DEXA系統(tǒng)(GE-Lunar， Madison， WI)上用雙 能X-線吸收測量法(double-energy X國ray absorptionometry， DXA)
檢測這些小鼠骨礦化密度。
實施例1. 用經(jīng)典Wnt刺激成骨細(xì)胞礦化
骨髓基質(zhì)(BMS)細(xì)胞是從三個月大的小鼠分離出來的，帶有 2.3Kb CollAl啟動子控制的綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因(2.3 Col-GFP) "。 2.3 Col-GFP轉(zhuǎn)基因只在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞表達(dá)，因此 可把GFP當(dāng)成成骨細(xì)胞的標(biāo)志。在BMS培養(yǎng)的第十天，可用表達(dá)熒 光素酶的對照腺病毒，或表達(dá)Wntl的腺病毒將其感染。在培養(yǎng)的第 二十天，將培養(yǎng)物固定并用Von Kossa銀染或Alizarrin Red染色以檢 測礦化情況。并通過Northern分析的方法檢測兩個被廣泛用于鑒定成 骨細(xì)胞分化的標(biāo)志骨唾液酸蛋白(bonesailioprotein， BSP)及骨鉤 蛋白(OC)。
在成骨誘導(dǎo)因子地塞米松，抗壞血酸和P-磷酸甘油存在的條件 下，經(jīng)Wntl表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或經(jīng)過Wnt3a條件培養(yǎng)基處理，使原代 BMS培養(yǎng)物礦化增強(圖1A)。這種礦化增強是由于骨細(xì)胞增多而 造成的，這也可作為終末分化的標(biāo)志。BSC和OC標(biāo)記的表達(dá)在用 Wntl腺病毒感染的細(xì)胞中也有所增加(圖IB)。
2. 經(jīng)典Wnt刺激骨原細(xì)胞的AP活性
骨髓基質(zhì)(BMS )細(xì)胞是從三個月大的帶有2.3 Col-GFP轉(zhuǎn)基因 的小鼠分離出來的。在BMS培養(yǎng)的第十天，可用表達(dá)熒光素酶的對 照腺病毒，或用表達(dá)Wntl的腺病毒將其感染。在培養(yǎng)的第十五天將 細(xì)胞染色以檢測AP的活性。
正如圖1A-a所見，經(jīng)表達(dá)Wntl的腺病毒感染的BMS培養(yǎng)物似 乎比那些用對照腺病毒感染的BMS培養(yǎng)物顯示了更多的AP染色。計 算集落數(shù)目證明，Wiit-1感染提高了集落的大小但沒有提高集落的數(shù) 目。此結(jié)果與過去關(guān)于經(jīng)典Wnts可以刺激AP活性3'7 (可能是通過 刺激成骨細(xì)胞母細(xì)胞的增殖)及LRP-5缺陷會降低成骨細(xì)胞母細(xì)胞增 殖的發(fā)現(xiàn)是一致的8。
3. BMS培養(yǎng)物中內(nèi)源性經(jīng)典Wnt的鑒定
34為了鑒定Wnt在BMS培養(yǎng)物中的表達(dá)模式，我們用實時逆轉(zhuǎn)錄 -聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定了 19種Wnt mRNA在原代BMS培 養(yǎng)物中的表達(dá)。在不同的時間從小鼠的BMS培養(yǎng)物中提取RNA，然 后用實時RT-PCR測定這19種Wnts的mRNA水平。用實時RT-PCR 還測定了 Dkkl和Dkk2在BMS培養(yǎng)物中的表達(dá)。
實時RT-PCR的方法還被用于克隆Wnt7b cDNA，并通過LEF-1 熒光素酶報道基因試驗證明它是一個經(jīng)典Wnt。為了鑒定Wnt7b， Dkkl和Dkk2在體內(nèi)的表達(dá)，用小鼠長骨的切片j故了以Wnt7b， Dkkl 和Dkk2的cDNA為探針的原位雜交。
試驗結(jié)果顯示，在經(jīng)典Wnts中，只有Wntl和Wnt7b的RNA 在原代BMS培養(yǎng)物中檢測得到。Wntl的表達(dá)很微量，其表達(dá)量在整 個分化過程中不改變。相反，Wnt7b的表達(dá)水平在分化過程中變化很 大。在第五天加入分化培養(yǎng)基之后，第八天，Wnt7bmRNA的水平最 高。在這之后，它的水平降低(見圖2A) 。 Dkk2 mRNA水平在分化 過程中顯著增高，而Dkkl mRNA只在分化末期才升高(圖2A)。
原位雜交的結(jié)果顯示，Dkkl在骨細(xì)胞中表達(dá)(圖2B)，而Dkk2 和Wnt7b則在成骨細(xì)胞中表達(dá)。在骨原細(xì)胞的分化過程中，Wnt5a 和Wnt5b明顯增高(見圖3A和圖3B )。
4.骨原細(xì)胞內(nèi)Dkkl對Wnt功能的拮抗作用
BMS細(xì)胞是從三個月大的帶有2.3 Col-GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠分離 出來的。第六天，將重組Dkkl蛋白(ljiM)或?qū)φ站彌_液加至BMS 培養(yǎng)物中。而后用熒光顯微鏡術(shù)檢測GFP的表達(dá)。GFP的表達(dá)在那 些經(jīng)Dkkl蛋白處理過的細(xì)胞(圖4A)比對照細(xì)胞有所降低(圖4B)。 另外可見的是GFP的表達(dá)與在帶有由2.3kb CollAl啟動子控制的 GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠中的礦化有很強的相關(guān)性"。由Dkkl造成的GFP 表達(dá)的降低意味著由經(jīng)典Wnt介導(dǎo)的骨原細(xì)胞的前期分化可能被 Dkkl蛋白阻斷了。 l 12' 135. 經(jīng)典Wnt對成骨細(xì)胞分化后期的礦化沒有刺激作用
BMS細(xì)胞是從三個月大的帶有2.3Col-GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠分離出 來的。在第十五天，BMS培養(yǎng)物被帶有Wntl的腺病毒或?qū)φ障俨《?感染。在第十七天，對BMS培養(yǎng)物進(jìn)行二甲酚橙染色以觀察礦化的 情況。
試驗結(jié)果指出在BMS培養(yǎng)物后期加入經(jīng)典Wnt對礦化作用沒有 任何作用(見圖5)。
6. 經(jīng)典Wnt在骨原細(xì)胞分化過程中對Dkk2表達(dá)有上調(diào)作用
最初由顱蓋骨培養(yǎng)物而來的MC3T3細(xì)胞可以被誘導(dǎo)而進(jìn)入骨分 化。雖然MC3T3的礦化不像BMS培養(yǎng)物那樣強，但許多成骨細(xì)胞分 化的標(biāo)志，包括OC， BSP及膠原蛋白I，的表達(dá)都與原代培養(yǎng)的表達(dá) 模式相似。MC3T3細(xì)胞經(jīng)Wntl-腺病毒或?qū)φ障俨《巨D(zhuǎn)導(dǎo)。在分化的 不同時間點提取其細(xì)胞mRNA，而后用Northern印跡分析方法檢測 Dkk2的表達(dá)。
從2.3 Col-GFP小鼠而來的BMS培養(yǎng)物，在其第十天用Wnt3a CM或?qū)φ誄M處理，然后在第十一天檢查GFP的表達(dá)。把需檢測的 BMS細(xì)胞接種在蓋玻片上。當(dāng)GFP表達(dá)時，就用抗-Dkk2的單克隆 抗體和羅丹明(Red)標(biāo)記的抗小鼠的第二抗體做免疫染色。GFP和 羅丹明可通過共聚焦顯微術(shù)來檢測。
Wntl轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞內(nèi)Dkk2 mRNA的水平比對照細(xì)胞的 明顯增高(圖6A)。圖6B顯示經(jīng)典Wnt可啟動2.3Col-GFP。 Dkk2 的表達(dá)與2.3Col-GFP的表達(dá)定位相同(圖6C)。
7. Dkk2在培養(yǎng)的骨原細(xì)胞后期刺激礦化
為了檢測Dkk2在成骨細(xì)胞早期生長和分化中所起的作用，用 siRNA減低(knock down) Dkk2的表達(dá)"。這里釆用一種在體內(nèi)生 產(chǎn)siRNA的策略，其中H1RNA聚合酶III啟動子驅(qū)動特異性地粑向 Dkk215 (SupDkk2)的發(fā)夾雙鏈體siRNA的合成。用Dkk2 siRNA穩(wěn)、定地轉(zhuǎn)導(dǎo)MC3T3細(xì)胞(產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒及對照逆轉(zhuǎn)錄病毒)，然后 誘導(dǎo)其分化。在不同的時間點用實時RT-PCR的方法檢測Dkk2的表 達(dá)，并用VonKossa4艮染法檢測礦化作用。
經(jīng)第八天誘導(dǎo)分化之后，在第十三天，BMS培養(yǎng)物被Dkk2表達(dá) 腺病毒或?qū)φ障俨《巨D(zhuǎn)導(dǎo)，其后在第十七天用二曱酚橙將BMS培養(yǎng) 物染色以顯示礦化。
用SupDkk2穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞(SupDkk2細(xì)胞)直到被 誘導(dǎo)分化后的第六天都顯示了較低水平的Dkk2 mRNA (大約是對照 細(xì)胞的三分之一，圖7A)。出乎意料的是，Dkk2 mRNA的水平從第 九天開始在SupDkk2細(xì)胞中增高。到第十二天，SupDkk2細(xì)胞Dkk2 mRNA的水平比僅用對照siRNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MC3T3細(xì)胞高5倍 (圖7A)。相反，Dkk2表達(dá)水平在對照MC3T3細(xì)胞的分化過程中并 沒有明顯變化(圖7A)。 SupDkk2細(xì)胞在近第20天開始顯示出礦化。 在其后幾天內(nèi)礦化的程度大大增加(圖7B)。未被轉(zhuǎn)導(dǎo)和僅被對照載 體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞只顯示出背景水平的礦化，甚至在三十五天之 后測定也是如此(圖7C ) 。 SupDkk2 MC3T3細(xì)胞在Dkk2表達(dá)模式 及礦化能力方面比對照MC3T3細(xì)胞更接近原代BMS培養(yǎng)物。此結(jié)果 可以被這樣解釋在MC3T3細(xì)胞，siRNA對Dkk2表達(dá)的抑制可增 強經(jīng)典Wnt的信號傳導(dǎo)活性，這種信號傳導(dǎo)活性在正常情況下是被 Dkk所抑制的。此種Wnt的信號傳導(dǎo)的增加上調(diào)Dkk2的表達(dá)，使之 最終逃脫了 siRNA的抑制。這種高水平的Dkk2又造成MC3T3細(xì)胞 進(jìn)一步地分化。
受腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS細(xì)胞中Dkk2的超表達(dá)使得礦化得到刺激 (圖7D)。對比之下，那些被對照腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS細(xì)胞卻沒有顯 出多戶4匕(圖7E)。
8. Wnt抑制劑sFRP3對成骨細(xì)胞礦化的作用
sFRP3充當(dāng)?shù)氖强扇苄缘腤nt結(jié)合蛋白，它可拮抗Wnt的信號 傳導(dǎo)。這里它的使用可以幫助觀測它對礦化的作用35，36。在BMS培養(yǎng)的第十三天，將其用表達(dá)sFRP3的腺病毒或?qū)φ障俨《巨D(zhuǎn)導(dǎo)，然后在 第十七天用二曱酚橙染色以顯示礦化。
結(jié)果表明比較用表達(dá)sFRP3的腺病毒或?qū)φ障俨《巨D(zhuǎn)導(dǎo)的 BMS培養(yǎng)物，二者在礦化程度方面沒有區(qū)別。sFRP3似乎對在BMS 培養(yǎng)物的某些成骨細(xì)胞階段的礦化沒有任何作用，盡管Dkk2在此階 段可以刺激礦化。這說明在此階段抑制Wnt對礦化沒有影響(圖8)。
9. Dkk2基因敲除小鼠的骨密度降低
野生型及Dkk2敲除型的雄性小鼠在笫五十五天大時接受了在 PIXImus小動物DEXA系統(tǒng)(GE國Lunar， Madison, WI)中進(jìn)行的 以雙能X-線吸光測定法為方法的總骨礦物密度的測量。
表l顯示Dkk2敲除型小鼠的總骨密度比野生型小鼠小7.286%。 此結(jié)果說明Dkk2在發(fā)育過程中對骨形成起重要作用。
表1雄性小鼠總骨礦物密度(BMD )
野生型(+/+) (g/cm2)Dkk2敲除型 (-/-) (g/cm2)%P值
0.05046 (N=17 )0.4678 (N=17 )7.2860.00056
10.來自Dkk2基因敲除的成骨細(xì)胞培養(yǎng)物的礦化降低
成骨細(xì)胞培養(yǎng)物來自小鼠(野生型及Dkk2敲除型)的顱蓋骨。 第六天，在培養(yǎng)基中加入lmM抗壞血酸和5mM P-磷酸甘油以誘導(dǎo)其 分化。第十五天用二曱酚橙染色以示礦化。
到第十五天時，雖然在來自野生型小鼠(圖9a和9d)或雜合型 小鼠(圖9b和9e)的細(xì)胞培養(yǎng)物中已可見明顯的礦化，但在來自Dkk2 敲除型小鼠(圖9c和9f)的細(xì)胞培養(yǎng)物中卻檢測不到礦化。圖9d、 圖9e和圖9f顯示的是在顯微鏡下用透射光所攝的礦化圖像。
3811.在Dkk2敲除型小鼠中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞形成都有所降低
來自野生型、Dkk2敲除型及雜合型小鼠的BMS培養(yǎng)物在第五天 染其AP活性以監(jiān)測成骨細(xì)胞集落形成。為了監(jiān)測破骨細(xì)胞的形成， 骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物需在其培養(yǎng)基中加入30納克/毫升巨嗜細(xì)胞集落刺激 因子(M-CSF)和60納克/毫升核因子kB (NF-kB)配體的受體激活 劑(RANKL)。第六天用TRAP染破骨細(xì)胞，而后在顯微鏡下觀察 多核細(xì)胞的形態(tài)。
來自Dkk2敲除型小鼠的細(xì)胞培養(yǎng)物中成骨細(xì)胞集落的數(shù)目(圖 10C)比來自野生型小鼠(圖10A)或雜合型小鼠(圖10B)的培養(yǎng) 物明顯減少。
類似的是，來自Dkk2敲除型小鼠的細(xì)胞培養(yǎng)物中破骨細(xì)胞的數(shù) 目(圖11C)比野生型小鼠(圖11A)或雜合型小鼠(圖11B)也明 顯減少。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的來源不同。前者來自造血干細(xì)胞，而 后者來自間充質(zhì)干細(xì)胞。
權(quán)利要求
1. 一種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白。
2. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白。
3. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白。
4. 一種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞的增殖的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白。
5. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白。
6. 權(quán)利要求l-5任一項的方法，其中施用包括通過吸入、口服、 靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、舌下、 局部、直腸或皮下施用的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
7. 權(quán)利要求l-5任一項的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl, Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
8. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Dkk蛋白。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述組合物還包含在制藥學(xué)上可以 接受的載體。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、糖 錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
12. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Wiit抑制劑。
13. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Wnt抑制劑。
14. 一種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用至少一種 Wnt抑制劑。
15. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用至少一種Wnt抑制劑。
16. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Wnt抑制劑。
17. 權(quán)利要求的方法，其中施用包括通過吸入、口服、靜脈內(nèi)、 腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、舌下、局部、 直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
18. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Wnt抑制劑。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物還包含在制藥學(xué)上可 以接受的載體。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、 糖錠、液體、凝膠膠囊、糖漿、漿液或懸浮液。
21. 庫又利要求12-16和18中任一項的方法，其中所述Wnt抑制 劑包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、核酸、 脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、 脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜 環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖 類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白或化學(xué)制品的片段。
22. 權(quán)利要求12-16和18中任一項的方法，其中所述Wnt抑制 劑包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段Dkk蛋 白、新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋 白、T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白或sFRP3蛋白。
23. 權(quán)利要求12-16和18中任一項的方法，其中所述Wnt抑制 齊寸包括Wntl, Wnt2， Wnt3， Wnt3a， Wnt4a， Wnt5a, Wnt5b， Wnt6, Wnt7a， Wnt7b， Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b， Wnt8c, Wntl0a， WntlOb， Wntll， Wntl4， Wntl5或Wntl6。
24. 權(quán)利要求12-16和18中任一項的方法，其中所述Wnt抑制 齊J包括Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
25. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Wnt拮抗劑。
26. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Wnt拮抗劑。
27. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用至少一種 Wnt拮抗劑。
28. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用至少一種Wnt拮抗劑。
29. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用至少一種Wnt 拮抗劑。
30. 權(quán)利要求25-29中任一項的方法，其中施用包括通過吸入、 口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、 舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
31. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Wnt拮抗劑。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物還包含在制藥學(xué)上可 以接受的載體。
33. 權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、 糖錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
34. 權(quán)利要求25-29和31中任一項的方法，其中所述Wnt拮抗 劑包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、核酸、 脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、 脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜 環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖 類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白或化學(xué)制品的片段。
35. 權(quán)利要求25-29和31中任一項的方法，其中所述Wnt拮抗 劑包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段Dkk蛋 白、新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋 白、T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白或sFRP3蛋白。
36. 權(quán)利要求25-29和31中任一項的方法，其中所述Wnt拮抗劑包括Wntl， Wnt2， Wnt3， Wnt3a， Wnt4a， Wnt5a， Wnt5b, Wnt6， Wnt7a， Wnt7b， Wnt7c， Wnt8， Wnt8a， Wnt8b， Wnt8c, Wntl0a， WntlOb， Wntll， Wntl4， Wntl5或Wntl6。
37. 權(quán)利要求25-29和31中任一項的方法，其中所述Wnt拮抗 齊']包括Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
38. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Dkk2蛋白。
39. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Dkk2蛋白。
40. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用至少一種 Dkk2蛋白。
41. 一種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用至少一種Dkk2蛋白。
42. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用至少一種Dkk2蛋白。
43. 權(quán)利要求38-42中任一項的方法，其中施用包括通過吸入、 口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、 舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
44. 一種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Dkk2蛋白。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中所述組合物還包含在制藥學(xué)上可 以接受的載體。
46. 權(quán)利要求44的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、 糖錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
47. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Dkk蛋 白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
48. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Dkk蛋 白，所述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
49. 一種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白， 所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
50. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Dkk蛋白， 所述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
51. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用至少一種 Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用 的。
52. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用至少一種 Dkk蛋白，所述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
53. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用至少一種Dkk蛋 白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
54. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用至少一種Dkk蛋 白，所述蛋白獨立于任何可以-故Dkk抑制或拮抗的Wnt。
55. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用至少一種Dkk 蛋白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
56. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用至少一種Dkk 蛋白，所述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
57. 權(quán)利要求47-56中任一項的方法，其中施用包括通過吸入、 口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、 舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
58. 權(quán)利要求47-56中任一項的方法，其中所述Dkk蛋白包括 Dkkl， Dkk2， Dkk3, Dkk4或其任何組合。
59. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)作用的。
60. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Dkk蛋白，所述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制或拮 抗的Wnt。
61. 權(quán)利要求59和60中任一項的方法，其中所述組合物還包含 在制藥學(xué)上可以接受的載體。
62. 斥又利要求59和60中任一項的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、糖錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
63. 權(quán)利要求59和60中任一項的方法，其中所述Dkk蛋白包 括Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
64. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Wnt抑 制劑，所述抑制劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用 的。
65. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用至少一種Wnt抑 制劑，所述抑制劑獨立于任何可以;故Dkk抑制的Wnt。
66. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Wnt抑制 劑，所述抑制劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
67. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用至少一種Wnt抑制 劑，所述抑制劑獨立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
68. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用Wnt抑制 劑，所述抑制劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
69. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用Wnt抑制 劑，所述抑制劑獨立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
70. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用Wnt抑制劑，所 述抑制劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
71. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用Wnt抑制劑，所 述抑制劑獨立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
72. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Wnt抑制劑， 所述抑制劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
73. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Wnt抑制劑， 所述抑制劑獨立于任何可以;故Dkk抑制的Wnt 。
74. 權(quán)利要求64-73中任一項的方法，其中施用包括通過吸入、 口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、 舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
75. 權(quán)利要求64-73中任一項的方法，其中所述Dkk蛋白包括 Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
76. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少 一種Wnt抑制劑，所述抑制劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典 Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
77. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Wnt抑制劑，所述抑制劑獨立于任何可以;故Dkk抑制 的Wnt。
78. 權(quán)利要求76和77中任一項的方法，其中所述組合物還包含 在制藥學(xué)上可以接受的栽體。
79. 權(quán)利要求76和77中任一項的方法，其中所述組合物配制成 片劑、丸劑、糖錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
80. 權(quán)利要求64-73， 76和77中任一項的方法，其中所述Wnt 抑制劑包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、 核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、 糖脂類、脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀 分子、雜環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性 脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白或化學(xué)制品的片段。
81. 權(quán)利要求64-73, 76和77中任一項的方法，其中所述Wnt 抑制劑包括以下蛋白質(zhì)的至少 一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段 Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶 激酶蛋白、T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白或sFRP3蛋白。
82. 權(quán)利要求64-73， 76和77中任一項的方法，其中所述Wnt 抑制劑包4舌Wntl， Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt4a， Wnt5a， Wnt5b， Wnt6, Wnt7a, Wnt7b， Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b， Wnt8c， Wntl0a， WntlOb, Wntll， Wntl4， Wntl5或Wntl6。
83. 權(quán)利要求64-73， 76和77中任一項的方法，其中所述Wnt 4中制劑包4舌Dkkl， Dkk2, Dkk3， Dkk4或其4壬4可纟且合。
84. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用Wnt拮抗劑，所 述拮抗劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
85. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用Wnt拮抗劑，所述拮抗劑獨立于任何可以;故Dkk拮抗的Wnt。
86. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用Wnt拮抗劑，所述 拮抗劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
87. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用Wnt拮抗劑，所述 拮抗劑獨立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
88. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用Wnt拮抗 劑，所述拮抗劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
89. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用Wnt拮抗 劑，所述拮抗劑獨立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
90. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用Wnt拮抗劑，所 述拮抗劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
91. 一種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用Wnt拮抗劑，所 述拮抗劑獨立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
92. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Wnt拮抗劑， 所述拮抗劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)功能的。
93. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Wnt拮抗劑， 所述拮抗劑獨立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
94. 權(quán)利要求84-93中任一項的方法，其中施用包括通過吸入、 口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、 舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
95. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Wnt拮抗劑，所述拮抗劑起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典 Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
96. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Wnt拮抗劑，所述拮抗劑獨立于任何可以被Dkk拮抗 的Wnt。
97. 權(quán)利要求95和96中任一項的方法，其中所述組合物還包含 在制藥學(xué)上可以接受的栽體。
98. 4又利要求95和96中任一項的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、糖錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
99. 權(quán)利要求84-93, 95和96中任一項的方法，其中所述Wnt 拮抗劑包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、 核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、 糖脂類、脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀 分子、雜環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性 脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白或化學(xué)制品的片段。
100. 權(quán)利要求84-93， 95和96中任一項的方法，其中所述Wnt 拮抗劑包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段 Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶 激酶蛋白、T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白或sFRP3蛋白。
101. 權(quán)利要求84-93， 95和96中任一項的方法，其中所述Wnt 拮抗劑包括Wntl， Wnt2， Wnt3， Wnt3a， Wnt4a， Wnt5a， Wnt5b， Wnt6， Wnt7a, Wnt7b， Wnt7c， Wnt8， Wnt8a， Wnt8b， Wnt8c， Wntl0a， WntlOb, Wntll, Wntl4， Wntl5或Wntl6。
102. 權(quán)利要求84-93， 95和96中任一項的方法，其中所述Wnt 4吉抗劑包4舌Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其4壬<可纟且合。
103. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用Dkk2蛋白，所 述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
104. —種刺激或增強骨形成的方法，包括施用Dkk2蛋白，所 述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
105. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述 蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
106. —種刺激或增強礦化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述 蛋白獨立于任何可以凈皮Dkk抑制或拮抗的Wnt。
107. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用Dkk2蛋 白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
108. —種刺激或增強成骨細(xì)胞礦化的方法，包括施用Dkk2蛋 白，所述蛋白獨立于任何可以;陂Dkk抑制或拮抗的Wnt。
109. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用Dkk2蛋白，所 述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
110. —種調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞增殖的方法，包括施用Dkk2蛋白，所 述蛋白獨立于任何可以;故Dkk抑制或拮抗的Wnt。
111. 一種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Dkk2蛋白， 所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
112. —種直接加速成骨細(xì)胞分化的方法，包括施用Dkk2蛋白， 所述蛋白獨立于任何可以;陂Dkk抑制或拮抗的Wnt。
113. 權(quán)利要求103-112中任一項的方法，其中施用包括通過吸 入、口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、 粘膜、舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組 合施用。
114. 一種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是獨立于其調(diào)控經(jīng)典 Wnt信號傳導(dǎo)作用的。
115. —種用于治療骨病、骨折、骨損傷或骨異常的治療組合物， 包含至少一種Dkk2蛋白，所述蛋白獨立于任何可以被Dkk抑制的 Wnt。
116. ;K利要求114和115中任一項的方法，其中所述組合物還 包含在制藥學(xué)上可以接受的載體。
117. 權(quán)利要求114和115中任一項的方法，其中所述組合物配 制成片劑、丸劑、糖錠、液體、凝膠膠嚢、糖漿、漿液或懸浮液。
118. —種增進(jìn)細(xì)胞自我更新的體外方法，包括a) 從受試者獲取細(xì)胞；和b) 在體外提供(i) 飼養(yǎng)層，和(ii) 足以刺激所述細(xì)胞更新的量的Dkk蛋白，Wnt抑制劑或 Wnt拮抗劑。
119. 權(quán)利要求118的方法，其中所述飼養(yǎng)層包括間充質(zhì)干細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞或可以增進(jìn)細(xì)胞生長或分化的其它細(xì)胞類型。
120. 權(quán)利要求118的方法，其中所述細(xì)胞包括造血千細(xì)胞。
121. 權(quán)利要求118的方法，其中所述細(xì)胞包括調(diào)節(jié)的、免疫調(diào) 節(jié)的或NKT細(xì)胞。
122. 權(quán)利要求118的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl，Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
123. 權(quán)利要求118的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、核酸、 脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、 脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜 環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖 類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白或化學(xué)制品的片段，或其任何組合。
124. 權(quán)利要求118的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段Dkk蛋白、 新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、 T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白、sFRP3蛋白或其任何組合。
125. 權(quán)利要求118的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括Wntl, Wnt2， Wnt3, Wnt3a， Wnt4a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6， Wnt7a， Wnt7b， Wnt7c， Wnt8， Wnt8a， Wnt8b， Wnt8c, Wntl0a， WntlOb， Wntll， Wntl4， Wntl5， Wntl6或其任何組合。
126. —種治療哺乳動物受試者的疾病的方法，包括a) 從所述受試者或其他受試者獲取細(xì)胞；b) 在下述物質(zhì)的存在下體外更新所述細(xì)胞(i) 伺養(yǎng)層，和(ii) 足以刺激所述細(xì)胞更新的量的Dkk蛋白，Wnt抑制劑或 Wnt拮抗劑；c) 把所述更新的細(xì)胞重新施用給所述受試者。
127. 權(quán)利要求126的方法，其中所述飼養(yǎng)層包括間充質(zhì)干細(xì)胞, 基質(zhì)細(xì)胞或可以增進(jìn)細(xì)胞生長或分化的其它細(xì)胞類型。
128. 權(quán)利要求126的方法，其中所述細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。
129. 權(quán)利要求126的方法，其中所述細(xì)胞包括調(diào)節(jié)的，免疫調(diào) 節(jié)的或NKT細(xì)胞。
130. 權(quán)利要求126的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl,Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
131. 權(quán)利要求126的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、核酸、 脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、 脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜 環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖 類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白、化學(xué)制品的片段，或其任何組合。
132. 權(quán)利要求126的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段Dkk蛋白、 新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、 T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白、sFRP3蛋白或其任何組合。
133. 權(quán)利要求133的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括Wntl， Wnt2, Wnt3， Wnt3a， Wnt4a, Wnt5a， Wnt5b, Wnt6， Wnt7a, Wnt7b， Wnt7c， Wnt8， Wnt8a， Wnt8b, Wnt8c， Wntl0a， WntlOb， Wntll， Wntl4, Wntl5， Wntl6或其任何組合。
134. —種治療哺乳動物受試者的疾病的方法，包括a) 從所述受試者獲取細(xì)胞；b) 在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞以引入至少一個抗特定疾病的基因；c) 在下列物質(zhì)存在下使所述被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞體外更新(i) 飼養(yǎng)層，和(ii) 足以刺激所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞更新的量的Dkk蛋白、Wnt抑 制劑或Wnt拮抗劑。d) 把所述更新的細(xì)胞重新施用給所述受試者。
135. 權(quán)利要求134的方法，其中所述飼養(yǎng)層包括間充質(zhì)干細(xì)胞， 基質(zhì)細(xì)胞或可以增進(jìn)細(xì)胞生長或分化的其它細(xì)胞類型。
136. 權(quán)利要求134的方法，其中所述細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。
137. 權(quán)利要求134的方法，其中所述細(xì)胞包括調(diào)節(jié)的，免疫調(diào) 節(jié)的或NKT細(xì)胞。
138. 權(quán)利要求134的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl,Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
139. 權(quán)利要求134的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、核酸、 脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、 脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜 環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖 類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白、化學(xué)制品的片段，或其任何組合。
140. 權(quán)利要求134的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段Dkk蛋白、 新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、 T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白、sFRP3蛋白或其任何組合。
141. 權(quán)利要求134的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括Wntl， Wnt2， Wnt3, Wnt3a， Wnt4a, Wnt5a, Wnt5b， Wnt6， Wnt7a， Wnt7b， Wnt7c, Wnt8, Wnt8a， Wnt8b, Wnt8c， Wntl0a， WntlOb， Wntll, Wntl4， Wntl5或Wntl6。
142. —種治療哺乳動物受試者的病毒感染的方法，包括a) 從被病毒感染的受試者獲取CD34+細(xì)胞；b) 在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞以引入抗所述病毒的基因；c) 在下列物質(zhì)存在的情況下使所述被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞體外更新(i) 飼養(yǎng)層，和(ii) 足以刺激所迷細(xì)胞更新的量的Dkk蛋白、Wnt抑制劑或 Wnt拮抗劑；d) 把所述更新的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞重新施用給所述受試者。
143. 權(quán)利要求142的方法，其中所述飼養(yǎng)層包括間充質(zhì)干細(xì)胞， 基質(zhì)細(xì)胞或可以促進(jìn)細(xì)胞生長或分化的其它細(xì)胞類型。
144. 權(quán)利要求142的方法，其中所述細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。
145. 權(quán)利要求142的方法，其中所述細(xì)胞包括調(diào)節(jié)的，免疫調(diào) 節(jié)的或NKT細(xì)胞。
146. 權(quán)利要求142的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl，Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
147. 權(quán)利要求142的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜環(huán)有機分子、核酸、 脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖類、糖蛋白、糖脂類、 脂蛋白、化學(xué)制品、或者小分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、環(huán)狀分子、雜 環(huán)有機分子、核酸、脂類、帶電的脂類、極性脂類、非極性脂類、糖 類、糖蛋白、糖脂類、脂蛋白、化學(xué)制品的片段，或其任何組合。
148. 權(quán)利要求142的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括以下蛋白質(zhì)的至少一種或所述蛋白質(zhì)的至少一個片段Dkk蛋白、 新月蛋白、cerebrus蛋白、軸蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、 T細(xì)胞因子蛋白、蓬亂蛋白、sFRP3蛋白或其任何組合。
149. 權(quán)利要求142的方法，其中所述Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑 包括Wntl, Wnt2, Wnt3, Wnt3a， Wnt4a, Wnt5a， Wnt5b， Wnt6， Wnt7a, Wnt7b， Wnt7c， Wnt8， Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c， Wntl0a， WntlOb， Wntll， Wntl4， Wntl5， Wntl6或其4壬何組合。
150. 權(quán)利要求142的方法，其中所述病毒感染包括HBV感染、 HCV感染或HIV感染。
151. 權(quán)利要求126， 134和142中任一項的方法，其中施用包括 通過吸入、口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、 鼻內(nèi)、粘膜、舌下、局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的 任何組合施用。
152. 權(quán)利要求118， 126， 134和142中任一項的方法，其中所 述疾病包括任何類型的病毒介導(dǎo)的或免疫藥物介導(dǎo)的肝炎、細(xì)菌感染、 病毒感染、真菌感染或寄生蟲感染。
153. 權(quán)利要求152的方法，其中所述病毒感染包括HBV感染、HCV感染或HIV感染。
154. 權(quán)利要求118， 126， 134， 142和152中任一項的方法，其 中所述疾病包括結(jié)腸炎、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、系 統(tǒng)性紅斑狼齊、骨質(zhì)疏松、非酒精性脂肪肝、糖尿病、葡萄糖耐受不 良、肥胖癥、代謝綜合征、移植物抗宿主疾病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、眼病、葡萄膜炎(uvitis)、皮 膚疾病、腎臟疾病、血液疾病、ITP、 PA、自身免疫性肝病、其它風(fēng) 濕病(other rheumatologic disease )、內(nèi)分泌疾病、樂K管炎、石更皮病、 CREST、神經(jīng)疾病、肺病、肌炎、耳病、重癥肌無力、非HIVAIDS、 全身性紅斑狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜、硬皮病、混合型結(jié)締組 織疾病(mixed connective tissue disorder)、腹腔疾病、CREST綜合 征(皮內(nèi)鈣質(zhì)沉著、雷諾現(xiàn)象、食管功能不良、指端硬化和毛細(xì)血管 擴張)或任何其他免疫相關(guān)或免疫介導(dǎo)的障礙或疾病。
155. —種體外篩選方法，用于篩選施用給哺乳動物受試者以治 療疾病的以下蛋白的酶同源物、具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白，或 同源物Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑，所述方法包括a) 在體外(i) 在第一個試管中提供調(diào)節(jié)的，免疫調(diào)節(jié)的或NKT細(xì)胞和飼養(yǎng)層；(ii) 在第二個試管中提供調(diào)節(jié)的，免疫調(diào)節(jié)的或NKT細(xì)胞和 Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有相似功能的無 關(guān)或相關(guān)蛋白，或同源物及飼養(yǎng)層；和(iii) 在第三個試管中提供調(diào)節(jié)的，免疫調(diào)節(jié)的或NKT細(xì)胞、 Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑及飼養(yǎng)層；b) 測定每個試管中的細(xì)胞更新量；和c) 證實所述第二試管中的細(xì)胞量比第一試管中的細(xì)胞量大，并 與所迷第三試管中細(xì)胞量大致相同。
156. —種體外篩選方法，用于篩選當(dāng)施用給哺乳動物受試者時 能增強礦化作用的Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物，所述方法包括a) 在體夕卜(i) 在第一個試管中提供由表達(dá)Dkk2的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 MC3T3細(xì)胞；(ii) 在笫二個試管中提供由對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞；和(iii) 在第三個試管中提供由Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt 拮抗劑的酶同源物、具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物轉(zhuǎn) 導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞；b) 測定每個試管中的礦化量；和c) 證實第一試管中的礦化量比第二試管中的礦化量大，并與第 三試管中的礦化量大致相同。
157. —種體外篩選方法，用于篩選當(dāng)施用給哺乳動物受試者時 能增強礦化作用的Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、 具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物，所述方法包括a) 在體外(i) 在第一個試管中提供由表達(dá)Dkk2的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)物；(ii) 在第二個試管中提供由對照腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMS培養(yǎng)物；和(iii) 在第三個試管中提供由Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt 拮抗劑的酶同源物、具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物轉(zhuǎn) 導(dǎo)的BMS培養(yǎng)物；b) 測定每個試管中的礦化量；和c) 證實第一試管中的礦化量比第二試管中的礦化量大，并與第 三試管中的礦化量大致相同。
158. 權(quán)利要求157的方法，其中所述BMS培養(yǎng)物包括分離自攜 帶有GFP轉(zhuǎn)基因的三個月大的小鼠的BMS細(xì)胞，所述GFP轉(zhuǎn)基因 受2.3Kb Coll Al啟動子的控制。
159. —種體外篩選方法，用于篩選當(dāng)施用給哺乳動物受試者時能增強礦化作用的Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、 具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物，所述方法包括a) 在體外(i) 在第一個試管中提供由表達(dá)Dkk2的能增強礦化作用的腺 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞；(ii) 在第二個試管中提供由不能增強礦化作用的對照腺病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)的細(xì)胞；和(iii) 在第三個試管中提供由Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt 拮抗劑的酶同源物、具有相似功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物轉(zhuǎn) 導(dǎo)的細(xì)胞；b) 測定每個試管中的礦化量；和c) 證實第一試管中的礦化量比第二試管中的礦化量大，并與第 三試管中的礦化量大致相同。
160. 用于治療哺乳動物受試者中的疾病的治療組合物，包含a) 更新的干細(xì)胞；b) Dkk蛋白；和c) 飼養(yǎng)層。
161. 用于治療哺乳動物受試者中的疾病的治療組合物，包含a) Dkk蛋白；和b) 飼養(yǎng)層。
162. 用于治療哺乳動物受試者中的疾病的治療組合物，包含a) Dkk蛋白、Wnt抑制劑或Wnt拮抗劑的酶同源物、具有相似 功能的無關(guān)或相關(guān)蛋白質(zhì)，或同源物；和b) 飼養(yǎng)層。
163. 權(quán)利要求160-162的方法,其中所述Dkk蛋白包括Dkkl， Dkk2， Dkk3， Dkk4或其任何組合。
164. 權(quán)利要求160-162的方法，其中所述組合物還包含在制藥 學(xué)上可以接受的載體。
165. 權(quán)利要求160-162的方法，其中所述組合物配制成片劑、丸劑、糖錠、液體、凝膠膠囊、糖漿、漿液或懸浮液。
166. —種治療哺乳動物受試者的疾病的方法，包括a) 從所述受試者或其它受試者獲取細(xì)胞，所述細(xì)胞包括調(diào)節(jié)的， 免疫調(diào)節(jié)的或NKT細(xì);l包；b) 在下列物質(zhì)的存在下使所述細(xì)胞體外更新(i) 飼養(yǎng)層，和(ii) 足以刺激所述細(xì)胞更新的量的Dkk蛋白；c) 把所述更新的細(xì)胞重新施用給所述受試者；和d) 給所述受試者施用足以刺激細(xì)胞在所述受試者內(nèi)的更新的額 外量的Dkk蛋白。
167. 權(quán)利要求166的方法，其中施用包括通過吸入、口服、靜 脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、透皮、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、舌下、 局部、直腸或皮下的方式施用或通過這些方式的任何組合施用。
168. 權(quán)利要求166的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkkl，Dkk2， Dkk3, Dkk4或其任何組合。
全文摘要
提供了用于骨病、骨折、骨損失和其它骨異常的組合物和方法，涉及使用Dkk蛋白、Wnt拮抗劑、Wnt抑制劑或任何其它相關(guān)蛋白，用于刺激或增強礦化作用和用于刺激細(xì)胞更新。一種Dkk蛋白即Dickkopf-2(Dkk-2)不依賴于Wnt蛋白而能刺激骨形成，其中Wnt蛋白可以被Dkk-2抑制和/或拮抗。在刺激或增強礦化作用方面，Dkk-2顯示出增強的特異性靶向能力和增強的生物學(xué)活性。Dkk-2在造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和自我更新中也起作用，特別是在成骨作用和破骨作用中。
文檔編號A61K38/17GK101432010SQ200580024499
公開日2009年5月13日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
發(fā)明者D·吳, P·劉, W·劉, X·李, 迪恩·恩格爾哈德 申請人:Enzo治療公司;X·李;P·劉;W·劉;迪恩·恩格爾哈德