專(zhuān)利名稱(chēng)：5,8－二取代喹唑啉及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多取代喹唑啉新化合物、合成及其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性，更具體地說(shuō)為含5，8-二取代-4-羥基喹唑啉化合物作為高效的靶向表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER2的抗腫瘤藥的合成及用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)家族屬于I型受體酪氨酸激酶超家族，是細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和存活的重要調(diào)節(jié)因子，其成員有erbB-1(EGFR，HER1)，erbB-2(HER2)，erbB-3(HER3)及erbB-4(HER4)，它們結(jié)構(gòu)相似，均由胞外配體結(jié)合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)及高度保守的蛋白酪氨酸激酶區(qū)組成。這一結(jié)構(gòu)既具受體的功能，又具有胞外信號(hào)直接轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)效應(yīng)的能力，是一種新穎的跨膜傳遞方式。一旦特異性配體如EGF或TGF-α結(jié)合上去，就能夠通過(guò)相應(yīng)的酪氨酸激酶地自身磷酸化作用(autophosphorylation)而激活受體，從而激發(fā)了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)連鎖反應(yīng)。這些信號(hào)傳遞包括Ras激酶蛋白和促細(xì)胞分裂激酶蛋白MAPK的活化，此二者的活化又激活細(xì)胞核內(nèi)的多種蛋白，包括細(xì)胞周期增殖的關(guān)鍵循環(huán)蛋白D1，從而導(dǎo)致DNA合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活等一系列重要的細(xì)胞事件發(fā)生(Jorissen，R.N.；Walker，F(xiàn).W.；Pouliot，N.；Garrett，T.P.J.；Ward，C.W.；Burgess，A.W.Epidermal growth factor receptormechanism of activation and signaling.Exp.Cell Res.2003，284，31-53)。生長(zhǎng)因子受體的過(guò)度活化導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的增殖，從而產(chǎn)生各種類(lèi)型的過(guò)度增生疾病，如非小細(xì)胞肺癌、白血病、乳腺癌、腦癌、動(dòng)脈粥樣硬化和血管形成術(shù)后的再狹窄。生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的抑制被證實(shí)具有調(diào)節(jié)不受控制的細(xì)胞復(fù)制的效用，因此成為新型的抗腫瘤藥治療的靶標(biāo)(Ritter，C.A.and Arteaga，C.L.The epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinasea promising therapeutic target in solid tumors.Semin.Oncol.2003，30，3-11)。
目前許多合成的化合物具有抑制細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(EGFR-PTK)的活性，尤其以喹唑啉類(lèi)化合物研究得最深入，其中ZD1839于2003年被FDA批準(zhǔn)上市用于治療非小細(xì)胞肺癌(Ranson，M.Epideraml growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors.British JCancer 2004，90，2250-2255.)。但文獻(xiàn)報(bào)道的作為酪氨酸激酶抑制劑的喹唑啉化合物主要集中在4-取代苯胺基-6，7-二取代喹唑啉結(jié)構(gòu)類(lèi)型(Bridges，A.J.Chemical inhibitors of proteinkinases.Chem.Rev.2001，101，2541-2571.)，我們通過(guò)分子模型計(jì)算，設(shè)計(jì)合成了4-羥基-5，8-二取代喹唑啉的新系列化合物，通過(guò)優(yōu)化取代基的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的小分子藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找一類(lèi)具有抗腫瘤活性的抑制細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)的喹唑啉類(lèi)新化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一類(lèi)5，8-二取代-4-羥基喹唑啉化合物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供5，8-二取代-4-羥基喹唑啉化合物在醫(yī)學(xué)上的用途。
本發(fā)明設(shè)計(jì)是基于EGFR酪氨酸激酶蛋白質(zhì)與小分子抑制劑相互作用的晶體結(jié)構(gòu)(Wood，E.R.；Truesdale，A.T.；McDonald，O.B.；Yuan，D.；Hassell，A.；Dickerson，S.H.；Ellis，B.；Pennisi，C.；Horne，E.；Lackey，K.；Alligood，K.J.；Rusnak，D.W.；Gilmer，T.M.and Shewchuk，L.Aunique structure for epidermal growth factor receptor bound to GW572016(Lapatinib)relationships among protein conformation，inhibitor off-rate，and receptor activity in tumor cells.Cancer Res.2004，64，6652-6659)，通過(guò)聚焦型化合物庫(kù)的合成方法，即以藥效團(tuán)喹唑啉環(huán)為核心結(jié)構(gòu)，通過(guò)芳基親核取代反應(yīng)在喹唑啉環(huán)的5-位引進(jìn)不同的取代基，配合硝化反應(yīng)和還原反應(yīng)和磺酰化反應(yīng)引進(jìn)不同的8-位取代基，合成出一系列5，8-二取代-4-羥基喹唑啉新化合物，同時(shí)在細(xì)胞水平測(cè)定了各化合物對(duì)細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。
本發(fā)明的一類(lèi)5，8-二取代喹唑啉化合物，具有如下結(jié)構(gòu)1
其中，R1
RO-，RNH-，RR’N-
R2-NO2，-NHSO2R，-NRSO2R，-NHR，-OR
R3、R4F、Cl、Br、I等鹵素，或CF3，RO-，RNH-，R2N-
R、R’各自獨(dú)立的為C1-C12直鏈或支鏈或環(huán)狀烷基含飽和和不飽和碳?xì)滏?，C6-C12芳基或雜環(huán)芳基，羧基或羥基或芳基或鹵素等官能團(tuán)取代的烷基，羧基或羥基或芳基或鹵素等官能團(tuán)取代的芳基
該類(lèi)化合物的合成如下反應(yīng)式所示
具體的說(shuō)，5，8-二取代-4-羥基喹唑啉是從3-氯-2-甲基苯胺出發(fā)，經(jīng)氨基保護(hù)、氧化、脫N-保護(hù)基、環(huán)化成喹唑啉環(huán)、硝化和芳環(huán)親核取代反應(yīng)6步反應(yīng)合成得到。首先，商業(yè)可售的原料3-氯-2-甲基苯胺在惰性溶劑如鹵代烷烴、甲苯、苯、四氫呋喃、二氧六環(huán)或乙醚、醋酸或N，N-二甲基甲酰胺等溶劑中上N-保護(hù)基，保護(hù)基是常用的保護(hù)氨基的甲?；⒁阴；蛉〈阴；?、CBZ、BOC、芐基或取代芐基、FMOC，溫度為0℃～室溫，或加熱至溶劑回流；然后苯甲基在高錳酸鉀水溶液中加熱回流氧化成苯甲酸(氧化試劑還可以是重鉻酸酸鉀、三氧化鉻、高碘酸鈉、IBX，Dess-Martin試劑，新制二氧化錳、雙氧水，反應(yīng)溫度控制在0℃～120℃，溶劑為鹵代烴、甲苯、乙腈、乙酸和水)。在一定條件下脫去N-保護(hù)基(對(duì)N-保護(hù)的甲?；?、乙?；蛉〈阴；?、CBZ、BOC在酸性條件下脫去保護(hù)基，對(duì)N-保護(hù)的甲?；?、芐基或取代芐基用催化氫化脫去保護(hù)基，對(duì)N-保護(hù)的FMOC在堿性條件下脫去保護(hù)基，溶劑用鹵代烴、四氫呋喃、1，4-二氧六環(huán)，甲醇、乙醇，溫度為室溫到溶劑回流溫度)，得到的2-氨基-6-氯苯甲酸與甲酰胺在高溫下環(huán)化為喹唑啉，再進(jìn)一步硝化(硝化試劑可以是發(fā)煙硝酸和濃硫酸在0℃～室溫，或次硝酸鉍和二氯亞砜，或硝酸鉀、硝酸鑭和濃硝酸，或硝酸鈉、硝酸鑭和濃鹽酸，溶劑用水、鹵代烴或四氫呋喃，溫度在0℃～室溫)得到8-硝基-5-氯喹唑啉，胺或醇作為親核試劑對(duì)喹唑啉的5-氯進(jìn)行芳基親核取代反應(yīng)得到不同5-取代基-8-硝基-喹唑啉化合物(反應(yīng)溶劑用惰性溶劑如四氫呋喃、乙醚、甲苯、乙腈、1，4-二氧六環(huán)或N，N-二甲基甲酰胺在40℃～100℃加熱發(fā)生親核取代反應(yīng))，8-位硝基可進(jìn)一步還原為氨基(還原劑為Pd/C氫化、鐵粉和醋酸、鐵粉和氯化銨、鋅粉和氯化銨、水合肼、甲酸銨，溶劑用水、乙醇、甲醇或乙腈，溫度在40℃～100℃)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為磺酰胺。
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR和HER-2)酪氨酸激酶抑制活性測(cè)試
EGFR和HER-2酶的提取應(yīng)用Bab-to-Bac昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)有活性的酪氨酸激酶蛋白，用Ni-NTA柱親和純化蛋白。分裝，-70℃保存。將酶反應(yīng)底物Poly(Glu，Tyr)4∶1用無(wú)鉀PBS稀釋成最佳濃度，包被酶標(biāo)板，置37℃反應(yīng)12-16小時(shí)。棄去孔中液體。洗板三次，于37℃烘箱中干燥酶標(biāo)板1-2小時(shí)。每孔加入一定濃度的蛋白酪氨酸激酶10μL，設(shè)好相應(yīng)的無(wú)酶對(duì)照，然后加入用反應(yīng)緩沖液稀釋的一定濃度的ATP溶液80μL啟動(dòng)反應(yīng)。同時(shí)加入不同濃度的待測(cè)化合物10μL，并以一定濃度的DMSO溶液10μL作為相應(yīng)的陰性對(duì)照，置37℃搖床反應(yīng)1小時(shí)。T-PBS洗板三次，每次15分鐘。加入抗體PY99(1∶1000)100μl/孔，37℃搖床反應(yīng)0.5小時(shí)。T-PBS洗板三次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠的IgG(1∶2000)100μl/孔，37℃搖床反應(yīng)0.5小時(shí)。T-PBS洗板三次，加入2mg/ml的OPD顯色液100μl/孔，25℃避光反應(yīng)1-10分鐘。加入2M H2SO4 50μl/孔中止反應(yīng)，用可調(diào)波長(zhǎng)式微孔板酶標(biāo)儀VERSAmax讀數(shù)，波長(zhǎng)為490nm。
測(cè)定藥物對(duì)酪氨酸激酶蛋白的相對(duì)抑制率。
根據(jù)各濃度抑制率，采用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，求出2次實(shí)驗(yàn)的平均IC50值作為抑制能力的最終指標(biāo)。
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR和HER-2)酪氨酸激酶高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性
根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以90μl/孔種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)再加藥10μl/孔。每個(gè)濃度設(shè)三復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對(duì)照及無(wú)細(xì)胞凋零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)，然后傾去培養(yǎng)液，用10％冷TCA固定細(xì)胞，4℃放置1小時(shí)后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/ml溶液100μl/孔，室溫中染色15分鐘，去上清液，用1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶標(biāo)儀(VERSAmax)515nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。按下列公式計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，半數(shù)抑制量IC50值采用Logit法計(jì)算。以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，求出2次實(shí)驗(yàn)的平均IC50值作為抑制能力的最終指標(biāo)。
抑制率＝(對(duì)照組OD值-給藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100％
兩種過(guò)度表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的人乳腺癌細(xì)胞系被用來(lái)測(cè)試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3過(guò)度表達(dá)ErbB2(HER2)，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468過(guò)度表達(dá)EGFR。
表1.化合物1a-n對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果
a細(xì)胞系SK-BR-3(乳腺癌)過(guò)度表達(dá)erbB2；細(xì)胞系MDA-MB-468(乳腺癌)過(guò)度表達(dá)EGFR.
b劑量依賴(lài)曲線(xiàn)在5個(gè)濃度值測(cè)得；抑制細(xì)胞生長(zhǎng)50％時(shí)的藥物濃度值IC50(μM)從這些曲線(xiàn)中獲得.
cB17作為陽(yáng)性對(duì)照(Wang，S.；Yang，D.；Enyedy，I.US Patent US2004023957-A1，2004.).
表2.化合物1a-n對(duì)EGFR和ErbB-2酪氨酸激酶蛋白的抑制效果
細(xì)胞水平的藥理結(jié)果顯示，這類(lèi)5，8-二取代4-羥基喹唑啉化合物是一類(lèi)高活性的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑，對(duì)于細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和ErbB-2過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系顯示非常高的抑制活性，尤其是5-位是苯胺取代的衍生物活性最好，而5-苯胺的3-位和4-位取代基是鹵素和供電子基團(tuán)可大大促進(jìn)這類(lèi)化合物的5，8-二取代4-羥基喹唑啉化合物的腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。最好的化合物對(duì)EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-468生長(zhǎng)的半抑制濃度IC50小于0.01μM，抑制活性高于陽(yáng)性對(duì)照化合物B-17；對(duì)ErbB-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞SK-BR-3的生長(zhǎng)的半抑制濃度IC50為7.0μM。
藥理結(jié)果顯示，這類(lèi)5，8-二取代4-羥基喹唑啉化合物是一類(lèi)高活性的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑，具有很強(qiáng)的抑制人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，尤其對(duì)于細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和ErbB-2過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系顯示非常高的選擇性，最好的化合物對(duì)EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-468生長(zhǎng)的半抑制濃度IC50小于0.01μM，抑制活性高于陽(yáng)性對(duì)照化合物B-17；對(duì)ErbB-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞SK-BR-3的生長(zhǎng)的半抑制濃度IC50為7.0μM。在分子水平的酶活性測(cè)試表明，我們的化合物對(duì)EGFR酪氨酸激酶和ErbB-2酪氨酸激酶有一定的抑制作用。
分子水平的酶活性測(cè)試顯示，這些化合物對(duì)EGFR和ErbB-2酪氨酸激酶有一定的抑制效果，這類(lèi)5，8-二取代4-羥基喹唑啉化合物對(duì)人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有非常顯著的抑制作用，是一類(lèi)高活性的新結(jié)構(gòu)的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)例1 5-苯胺-8-硝基-4羥基喹唑啉1a
步驟13-氯-2-甲基-N-乙酰苯胺(化合物2)
3-氯-2-甲基苯胺(2.34克，16.50毫摩爾)溶解6毫升二氯甲烷，強(qiáng)烈攪拌下緩慢滴加醋酸酐(2.53克，24.75毫摩爾)。產(chǎn)生的大量灰色乙?；a(chǎn)物沉淀用布氏漏斗過(guò)濾，用水洗。粗產(chǎn)物用乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1重結(jié)晶得到白色結(jié)晶產(chǎn)物(2.73克，90.2％)。1HNMR(DMOS-d6，400MHz)9.70(s，1H)，7.40(d，J＝8.40，1H)，7.37(t，J＝8.01，1H)，1.99(s，3H)；MS(EI)m/z 183(M+)；Anal.(C9H10ClNO)C，H，Ncalcd58.86，5.49，7.63.
步驟22-(乙酰胺)-6-氯苯甲酸(化合物3)
化合物2(3.3克，18.0毫摩爾)，六水合硫酸鎂(4.3克，38.8毫摩爾)和水混合加熱到135℃回流。高錳酸鉀(11.4克，72.2毫摩爾)的水溶液(100毫升)緩慢滴加到上述溶液中(約3小時(shí))。加料完畢后，升溫到160℃回流2小時(shí)，停止加熱，待冷卻后用布氏漏斗過(guò)濾，濾液用6M的鹽酸水溶液調(diào)PH＝1.0，大量白色固體產(chǎn)物析出，過(guò)濾收集固體產(chǎn)物，真空干燥后用甲醇重結(jié)晶得白色結(jié)晶純品產(chǎn)物(2.5克，65.7％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)，δ9.70(s，1H)，7.40(d，J＝8.04，1H)，7.37(t，J＝8.01，1H)，7.31(d，J＝8.06，1H)，1.99(s，3H)；MS(EI)m/z 213(M+)；Anal.(C9H8ClNO3)C，H，N，calcd50.60，3.77，6.56，found50.42，3.54，6.45.
步驟35-氯-4-羥基喹唑啉(化合物5)
化合物3(250毫克，1.17毫摩爾)加入4毫升濃鹽酸，加熱到80-90℃攪拌1.5小時(shí)，溫度不宜高于90℃。停止加熱，待冷卻后有白色結(jié)晶體析出，過(guò)濾收集固體產(chǎn)物，用甲醇重結(jié)晶后得2-胺基-6氯苯甲酸(4)，直接用于下一步反應(yīng)。往化合物4(1.2克，5.8毫摩爾)中加入1.5毫升甲酰胺，加熱，在130℃下攪拌45分鐘，在175℃下攪拌75分鐘。停止加熱，待冷卻后得到的半透明固體用1.5毫升甲基纖維素溶解攪拌，所得到漿狀物傾倒入5毫升冰水中，過(guò)濾收集固體粗產(chǎn)物，用柱層析法分離提純產(chǎn)物得0.75克白色固體產(chǎn)物5，展開(kāi)劑用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1，收率67.6％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)，δ12.09(br，1H)，8.07(s，1H)，7.71(t，J＝8.25，7.7，1H)，7.59(d，J＝8.0，1H)，7.51(d，J＝7.43，1H)；MS(EI)m/z180(M+)；Anal.(C8H5ClN2O)C，H，N，calcd53.21，2.79，15.51，found53.14，2.72，15，36.
步驟45-氯-8-硝基-4-羥基喹唑啉(化合物6)
往化合物5(155毫克，0.86毫摩爾)中加入3毫升濃硫酸，并用冰浴冷卻，緩慢滴加發(fā)煙硝酸(3毫升)約10分鐘。滴加完畢后保持0℃繼續(xù)攪拌10分鐘，停止反應(yīng)，將反應(yīng)溶液傾倒入碎冰中，用20％的氫氧化鈉水溶液中和調(diào)pH＝7，過(guò)濾收集固體產(chǎn)物，用少量水洗兩次。用乙醇-水體系重結(jié)晶得淡黃色固體產(chǎn)物(193.5毫克)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ12.68(br，1H)，8.27(d，J＝8.86，1H)，8.22(s，1H)，7.75(d，J＝8.85，1H)；MS(EI)m/z 225(M+)；Anal(C8H4ClN3O3)C，H，N，calcd42.59，1.79，18.63，found42.47，1.68，18.60.
步驟55-苯胺-8-硝基-4-羥基喹唑啉(化合物1a)
化合物6(100毫克，0.44毫摩爾)溶解于18毫升四氫呋喃中，加入82毫克苯胺(0.88毫摩爾)?；旌象w系加熱回流24小時(shí)(80-90℃)，停止反應(yīng)，減壓蒸除大部分四氫呋喃，加入水稀釋(15毫升)，用20％的鹽酸溶解調(diào)pH＝7，用乙酸乙酯萃取兩次(2×20毫升)，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱層析分離得棕色固體純品(90毫克，72.5％)，展開(kāi)劑體系為乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1。Mp233-235℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.88(br，1H)，8.81(s，1H)，8.80(d，J＝9.08，1H)，7.34(d，J＝8.9，1H)，7.0-7.2(m，5H)；MS(EI)m/z 282(M+)；Anal.(C14H10N4O3)C，H，N，calcd59.57，3.57，19.85，found59.45，3.44，19.98.
目標(biāo)化合物1b-1t用類(lèi)似方法制得。
實(shí)施例25-芐胺-8-硝基-4羥基喹唑啉1b
起始原料用芐胺(94毫克，0.88毫摩爾)，得到桔紅色固體產(chǎn)物(100毫克，76.9％)。Mp182-184℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz).10.00(br，1H)，8.68(d，J＝9.1，1H)，7.2-7.3(m，5H)，6.77(d，J＝8.99，1H)，4.25(s，2H)；MS(EI)m/z 296(M+)；Anal.(C15H12N4O3)，C，H，N，calcd60.81，4.08，18.91，found60.72，4.11，18.87.
實(shí)施例35-(3-氯苯胺)-8-硝基-4羥基喹唑啉1c
起始原料用3-氯苯胺(211毫克，0.88毫摩爾)，得到黃色固體(110毫克，79.5％)。Mp235-237℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.90(br，1H)，11.45(s，1H)，8.27(s，1H)，8.23(d，J＝9.07，1H)，7.32(t，J＝7.93，1H)，7.16(d，J＝9.07，1H)，7.16-7.07(m，2H)，6.95(d，J＝7.96，1H)；MS(EI)m/e 316(M+)；Anal.(C14H9ClN4O3)C，H，N，Calcd53.09，2.86，17.69.Found53.24，2.97，17.57.
實(shí)施例35-(4-氯苯胺)-8-硝基-4羥基喹唑啉1d
起始原料用4-氯苯胺(112毫克，0.88毫摩爾)，得到黃色固體(106毫克，76.8％)。Mp241-243℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.48(br，1H)，8.28(s，1H)，8.20(d，J＝9.08，1H)，7.32(d，J＝8.51，2H)，7.10(d，J＝9.06，1H)，6.99(d，J＝8.52，2H)；MS(EI)317(M++1)；Anal.(C14H9ClN4O3)，C，H，N，Calcd53.09，2.86，17.69，F(xiàn)ound52.86，3.21，17.35.
實(shí)施例55-(3-甲基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1e
起始原料用4-甲基苯胺(95毫克，0.88毫摩爾)，得到棕黑色固體(185毫克，71.2％)。Mp215-217℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.85(br，1H)，11.42(s，1H)，8.26(s，1H)，8.18(d，J＝9.89，1H)，7.15(t，J＝7.69，1H)，7.08(d，J＝8.79，1H)，6.93(d，J＝9.89，1H)，6.78(s，1H)，6.76(d，J＝8.79，1H)，2.23(s，3H)；MS(EI)m/e＝296(M+)；Anal.(C15H12N4O3)C，H，NCalcd60.81，4.08，18.91；Found60.92，4.11，18.76.
實(shí)施例65-甲氧基-8-硝基-4-羥基喹唑啉1f
往化合物6(100毫克，0.44毫摩爾)中加入10毫升甲醇和100毫克甲醇鈉(1.85毫摩爾)固體。混合體系在70℃下加熱回流24小時(shí)。停止反應(yīng)，蒸除大部分甲醇溶劑，加入水稀釋(15毫升)，用20％的鹽酸溶液調(diào)pH＝7，用乙酸乙酯萃取兩次(2*20毫升)，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱層析分離得到白色固體產(chǎn)物(65毫克，66.8％)，展開(kāi)劑為乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1。MP209-210℃，1H MNR(DMSO-d6，300MHz)δ11.28(br，1H)，9.13(s，1H)，8.67(d，J＝8.79，1H)，6.83(d，J＝8.66，1H)，3.90(s，3H)；MS(EI)m/z 221(M+)；Anal.(C9H7N3O4)C，H，N，calcd48.87，3.19，19.00，found48.77，3.23，18.89.
實(shí)施例75-乙氧基-8-硝基-4羥基喹唑啉1g
化合物1g的制備方法與化合物1f的制備方法相同。起始原料用乙醇鈉(125毫克，1.85毫摩爾)，10毫升乙醇做溶劑，得到白色固體80毫克，產(chǎn)率77.6％。Mp195-198℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.28(br，1H)，9.14(s，1H)，8.63(d，J＝8.20，1H)，6.81(d，J＝8.40，1H)，4.12(m，J＝6.9，2H)，1.48(t，J＝6.9，3H)；MS(EI)m/z 235(M+)；Anal.(C10H9N3O4)C，H，N，calcd51.07，3.86，17.87，found51.13，3.68，17.74.
實(shí)施例85-(4-甲氧基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1h
化合物1h的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用4-甲氧基苯胺(108毫克，0.88毫摩爾)，得到墨綠色固體(81毫克，58.9％)。Mp200-203℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.65(br，1H)，δ11.40(s，1H)，8.24(s，1H)，8.14(d，J＝9.07，1H)，7.02(d，J＝9.07，1H)，6.95(d，J＝9.06，2H)，6.85(d，J＝9.06，2H)，3.73(s，3H)；MS(EI)m/e 312(M+)；Anal.(C15H12N4O4)C，H，N，Calcd57.69，3.87，17.94；Found57.79，3.98，17.67.
實(shí)施例95-(4-胺基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1i
化合物1i的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用4-胺基苯胺(48毫克，0.44毫摩爾)，得到棕黑色固體(68毫克，51.4％)。Mp223-226℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.28(br，1H)，8.21(s，1H)，8.08(d，J＝9.06，1H)，6.90(d，J＝9.07，1H)，6.68(d，J＝8.52，2H)，6.47(d，J＝8.79，2H)；MS(EI)m/z M+＝297；Anal.(C14H11N5O3)C，H，N，Calcd56.56，3.73，23.56，F(xiàn)ound56.70，3.46，23.44.
實(shí)施例105-(4-芐氧基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1j
化合物1j的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用4-芐氧基苯胺(175毫克，0.88毫摩爾)，得到棕黃色固體(110毫克，64.7％)。Mp220-222℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.40(br，1H)，8.25(s，1H)，8.15(d，J＝9.07，1H)，7.46-7.35(m，5H)，7.02(d，J＝9.07，1H)，6.94(s，4H)，5.05(s，1H)；MS(EI)m/e 388(M+).Anal.(C21H16N4O4)C，H，N，Calcd.64.94，4.15，14.43，F(xiàn)ound64.82，4.45，14.56.
實(shí)施例115-吡咯啉-8-硝基-4-羥基喹唑啉1k
化合物1k的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用吡咯啉(63毫克，0.88毫摩爾)，得到棕色固體(90毫克，78.5％)。Mp208-210℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.30(br，1H)，8.12(s，1H)，8.09(d，J＝9.07，1H)，6.72(d，J＝9.07，1H)，3.29(dt，4H)，1.89(dt，4H)；MS(EI)m/e 260(M+)；Anal.(C12H12N4O3)C，H，N，Calcd55.38，4.65，21.53，F(xiàn)ound55.41，4.35，21.78.
實(shí)施例125-(2H-吡咯)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1l
化合物1l的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用2H-吡咯(61毫克，0.88毫摩爾)，得到棕黑色固體(79毫克，69.8％)。Mp154-160℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.41(br，1H)，8.11(s，1H)，7.99(d，J＝8.99，1H)，6.79(d，J＝8.99，1H)，6.79(d，J＝9.06，1H)，5.91(s，2H)，3.98(s，4H)；MS(EI)m/e 257(M+-1)；Anal.(C12H10N4O3)C，H，N，Calcd55.81，3.90，21.70，F(xiàn)ound55.79，3.86，21.92.
實(shí)施例135-N-(甲硫氨酸)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1m
化合物1m的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用甲硫氨酸(131毫克，0.88毫摩爾)，得到棕色固體(76毫克，51.2％)，展開(kāi)劑體系為氯仿∶甲醇＝2∶1。Mp214-217℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.78(br，1H)，10.34(br，1H)，8.23(s，1H)，8.11(d，1H，J＝9.07)，6.91(d，1H，J＝9.06)，4.01(s，1H)，2.37(s，2H)，2.2-1.8(m，5H)；MS(EI)m/e 338(M+)；Anal.(C13H14N4O5S)C，H，N，Calcd46.15，4.17，16.56.Found46.23，4.25，16.43.
實(shí)施例145-N-(苯丙氨酸)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1n
化合物1n的制備方法同化合物1a的制備方法。起始原料用苯丙氨酸(133毫克，0.88毫摩爾)，得到棕色固體(74毫克，49.7％)，展開(kāi)劑體系為氯仿∶甲醇＝2∶1。Mp＞250℃；1HNMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.80(br，1H)，11.25(br，1H)，8.22(s，1H)，7.91(d，J＝9.34，1H)，7.25-7.12(d，5H)，5.12(s，1H)；MS(EI)m/e 340(M+)；Anal.(C16H12N4O5)C，H，N Calcd56.47，3.55，16.46，F(xiàn)ound56.22，3.31，16.28.
實(shí)施例155-(4-(4-羥基-8-硝基喹唑啉-5-氨基)苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1o
化合物1o的制備方法同化合物1a。起始原料用1，4-二胺基苯胺(24毫克，0.22毫摩爾)，得到棕黃色固體(67毫克62.6％)。Mp＞250℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ14.06(br，2H)，8.17(s，2H)，7.94(d，J＝9.3，2H)，6.74(d，J＝9.3，2H)，6.71(s，4H)；MS(EI)m/e 486(M+)；Anal.(C22H14N8O6)C，H，N Calcd54.33，2.90，23.04.
實(shí)施例165-(3-氯-4-甲氧基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1p
同化合物1a的制備方法。起始原料用3-氯4-甲氧基苯胺(100毫克，0.68毫摩爾)，得到桔紅色固體(62毫克，81.0％)。Mp＝216℃；1H NMR(CD3OD，300MHz)δ8.14(s，1H)，7.03(d，J＝5.4，2H)，7.01(s，1H)，6.98(d，J＝9.1，2H)，6.91(d，J＝9.1，2H)，3.84(s，3H)；MS(EI)m/e 346(M+)；Anal.(C15H11ClN4O4)C，H，N Calcd51.96，3.20，16.16.
實(shí)施例175-(4-羧基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1q
同化合物1a的制備方法。起始原料用4-羧基苯胺(301毫克，2.2毫摩爾)，得到亮黃色固體(63毫克，44.0％)。Mp＞250℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ13.8(br，1H)，8.22(s，1H)，8.03(d，J＝9.3，2H)，7.80(d，J＝8.2，2H)，6.90(d，J＝9.1，2H)，6.84(d，J＝8.2，2H)；Anal.(C15H10N4O5)C，H，N Calcd55.22，3.09，17.17.
實(shí)施例185-吡咯-8-硝基-4-羥基喹唑啉1r
同化合物1a的制備方法。起始原料用吡咯(147毫克，2.2毫摩爾)，得到棕黑色固體(75毫克，66.9％)。Mp＞250℃；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ10.8(br，1H)，8.00(s，1H)，7.88(d，J＝9.6，2H)，6.68(s，2H)，6.08(d，J＝9.6，2H)，5.99(s，2H)；Anal.(C12H8N4O3)C，H，NCalcd56.25，3.15，21.87.
實(shí)施例195-(3-氯-4-環(huán)己氧基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1s
同化合物1a的制備方法。起始原料用3-氯4-環(huán)己氧基苯胺(100毫克，0.45毫摩爾)，得到土黃色固體(72毫克，79.1％)。Mp＝190℃；1H NMR(CD3OD，300MHz)δ8.17(s，1H)，8.13(d，J＝9.0，1H)，7.42(d，J＝2.7，1H)，7.27(dd，J＝2.7，9.0，1H)，7.22(d，J＝8.9，1H)，6.98(d，J＝9.0，1H)，4.47(m，1H)，1.93-1.23(m，10H)；；MS(EI)m/e 414(M+)；Anal.(C20H19ClN4O4)C，H，N Calcd57.90，4.62，13.51.
實(shí)施例205-(3-氯-4-羥基苯胺)-8-硝基-4-羥基喹唑啉1t
同化合物1a的制備方法。起始原料用3-氯-4-羥基苯胺(100毫克，0.53毫摩爾)，得到土黃色固體(185毫克，99.4％)。Mp＞250℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ11.34(br，1H)，10.13(br，1H)，8.27(s，1H)，8.13(d，J＝8.9，1H)，7.03(m，2H)，6.85(m，2H)；MS(EI)m/e 332(M+)；Anal.(C14H9ClN4O4)C，H，N Calcd50.54，2.73，16.84.
實(shí)施例215-(4-甲氧基苯胺)-8-氨基-4-羥基喹唑啉1u
5-(4-甲氧基苯胺)-8-硝基-4羥基喹唑啉(10毫克，0.032毫摩爾)溶解于5毫升甲醇中，加入1毫克5％的鈀碳催化劑，常壓常溫氫化，12小時(shí)后停止反應(yīng)，過(guò)濾，抽干濾液后得固體粗產(chǎn)物，甲醇重結(jié)晶得8毫克墨綠色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率為92％)。Mp＞250℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ7.76(s，1H)，7.18(s，2H)，6.76(d，J＝9.0，2H)，6.59(d，J＝9.0，2H)，3.65(s，3H)；MS(EI)m/e 282(M+)；Anal.(C15H14N4O2)C，H，N Calcd63.82，5.00，19.85.
實(shí)施例225-(3-氯苯胺)-8-氨基-4-羥基喹唑啉1v
5-(3-氯苯胺)-8-硝基-4羥基喹唑啉(10毫克，0.032毫摩爾)溶解于5毫升甲醇中，加入1毫克5％的鈀碳催化劑，常壓常溫氫化，12小時(shí)后停止反應(yīng)，過(guò)濾，抽干濾液后得固體粗產(chǎn)物，甲醇重結(jié)晶得9毫克墨綠色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率為98％)。Mp＞250℃；1H NMR(CD3OD，300MHz)δ8.01(s，1H)，7.34(d，J＝9.6，2H)，7.16(d，J＝9.0，1H)，6.86(m，1H)，6.74(d，J＝9.0，1H)，6.62(s，1H)；MS(EI)m/e 286(M+)；Anal.(C14H11ClN4O)C，H，N Calcd58.65，3.87，19.54.
實(shí)施例235-(3-氯-4-芐氧基苯胺)-8-氨基-4-羥基喹唑啉1w
同化合物1a的制備方法。起始原料用3-氯-4-芐氧基苯胺(40毫克，0.207毫摩爾)，得到橘紅色固體(47毫克，60.0％)。Mp＝247℃；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.24(s，1H)，8.17(d，J＝9.0，1H)，7.68(d，J＝9.0，1H)，7.45(m，5H)；7.16(s，1H)，7.05(d，J＝9.1，1H)，6.95(d，J＝9.1，1H)，5.16(s，2H)；Anal.(C21H16N4O4)C，H，N Calcd64.94，4.15，14.43.
權(quán)利要求
1、一類(lèi)具有如下通式的5，8-二取代喹唑啉化合物，
其中，R1
RO-，RNH-，RR’N-
R2-NO2，-NHSO2R，-NRSO2R，-NHR，-OR
R3、R4獨(dú)立地為F、Cl、Br、I鹵素，或CF3，RO-，RNH-，R2N-
R、R’各自獨(dú)立的C1-C12直鏈或支鏈或環(huán)狀烷基(包括飽和和不飽和烷烴)，C6-C12芳基或雜環(huán)芳基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的烷基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的芳基。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的5，8-二取代喹唑啉化合物，其特征在于
當(dāng)R1為
時(shí)，
R2為-NO2，-NHSO2R，-NRSO2R，-NHR，-OR
R3、R4獨(dú)立地為F、Cl、Br、I鹵素，或CF3，RO-，RNH-，R2N-
R為C1-C12直鏈或支鏈或環(huán)狀烷基(包括飽和和不飽和烷烴)，C6-C12芳基或雜環(huán)芳基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的烷基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的芳基。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的5，8-二取代喹唑啉化合物，其特征在于
當(dāng)R1為RO-時(shí)，
R2-NO2，-NHSO2R，-NRSO2R，-NHR，-OR
R3、R4F、Cl、Br、I鹵素，或CF3，RO-，RNH-，R2N-
RC1-C12直鏈或支鏈或環(huán)狀烷基(包括飽和和不飽和烷烴)，C6-C12芳基或雜環(huán)芳基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的烷基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的芳基。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的5，8-二取代喹唑啉化合物，其特征在于
當(dāng)R1為-NHR或RR’N-時(shí)，
R2-NO2，-NHSO2R，-NRSO2R，-NHR，-OR
R3、R4F、Cl、Br、I鹵素，或CF3，RO-，RNH-，R2N-
R、R’為各自獨(dú)立的C1-C12直鏈或支鏈或環(huán)狀烷基(包括飽和和不飽和烷烴)，C6-C12芳基或雜環(huán)芳基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的烷基，羧基或羥基或芳基或鹵素官能團(tuán)取代的芳基。
5、如權(quán)利要求1所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，包括如下步驟
3-氯-2-甲基苯胺出發(fā)，經(jīng)氨基保護(hù)、氧化、脫N-保護(hù)基、成喹唑啉環(huán)、硝化和芳環(huán)親核取代反應(yīng)得目標(biāo)化合物
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，其特征在于N-保護(hù)基為甲酰基、乙?；蛉〈阴；?、CBZ、BOC、芐基或取代芐基、FMOC；隋性溶劑為鹵代烷烴、甲苯、苯、四氫呋喃、二氧六環(huán)或乙醚、醋酸或N，N-二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為0℃～室溫，或加熱至溶劑回流；
7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，其特征在于
氧化劑為重鉻酸酸鉀、三氧化鉻、高碘酸鈉、高錳酸鉀水溶液、IBX，Dess-Martin試劑，新制二氧化錳、雙氧水，反應(yīng)溫度控制在50℃～120℃，溶劑為鹵代烴、甲苯、乙腈、乙酸和水。
8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，其特征在于N-保護(hù)的FMOC在堿性條件下脫去保護(hù)基，溶劑用鹵代烴、四氫呋喃、1，4-二氧六環(huán)，甲醇、乙醇，溫度為室溫到溶劑回流溫度。
9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，其特征在于環(huán)化反應(yīng)在2-氨基-6-氯苯甲酸與甲酰胺環(huán)化為喹唑啉，環(huán)化溫度為室溫到175℃，可梯度加熱。
10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，其特征在于硝化試劑為煙硝酸和濃硫酸在0℃～室溫，或次硝酸鉍和二氯亞砜，或硝酸鉀、硝酸鑭和濃硝酸，或硝酸鈉、硝酸鑭和濃鹽酸，溶劑用水、鹵代烴或四氫呋喃，溫度在0℃～室溫。
11、根據(jù)權(quán)利要求5所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的制備方法，其特征在于胺或醇作為親核試劑對(duì)喹唑啉的5-氯進(jìn)行芳基親核取代反應(yīng)得到不同5-取代基-8-位硝基-喹唑啉化合物，反應(yīng)溶劑為惰性溶劑四氫呋喃、乙醚、甲苯、乙腈、1，4-二氧六環(huán)或N，N-二甲基甲酰胺在40℃～100℃加熱發(fā)生親核取代反應(yīng)，硝基進(jìn)一步還原為氨基，還原劑為Pd/C氫化、鐵粉和醋酸、鐵粉和氯化銨、鋅粉和氯化銨、水合肼、甲酸銨，溶劑用水、乙醇、甲醇或乙腈，溫度在40℃～100℃，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為磺酰胺。
12、如權(quán)利要求1所述的5，8-二取代喹唑啉化合物的用途在制備治療腫瘤的藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了5，8－二取代喹唑啉及其制備方法和用途，如下具有通式1的化合物。其中R1代表芳基胺、烷基胺或烷氧基，R2代表硝基或氨基或磺酰氨基或烷氧基，這類(lèi)具有5，8－二取代－4－羥基喹唑啉結(jié)構(gòu)的新化合物展示非常高的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，尤其對(duì)于EGFR或ErbB－2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，半抑制濃度IC50能達(dá)到0.01μM。本發(fā)明也揭示了這類(lèi)化合物的制備過(guò)程。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1858040SQ20051002566
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2005年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月8日
發(fā)明者龍亞秋, 金毅, 丁健, 林莉萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所