專利名稱：鱷魚血在制備抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物及保健食品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鱷魚血在制備用于抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物及保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年度報告，1996年全球58億人口中因癌癥死亡的有630萬人，約占總死亡人數(shù)的12％，是僅次于心血管疾病的第2大疾病死亡原因。目前全球存活的癌癥患者約有7600余萬人。每年新增癌癥患者約有1030余萬人。在我國癌癥也成了人口死亡的第2大原因，1997年公布的我國90年代人口死亡原因抽樣結(jié)果顯示，癌癥死亡率為10萬人中就有124.46人，死亡率已從二十世紀二十年代的12.57％升至17.49％，20年間上升了11.56％，年死亡人數(shù)也已由90萬人增至130萬人以上。我國現(xiàn)有癌癥患者約400萬人。每年新診斷出160萬癌癥患者。同時，病毒疾病也是危害人類健康的一大殺手，每年感染病毒的人數(shù)不斷增加，以對社會及人類健康造成極大的危害。尋找新型抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物，成為當今社會的重要研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鱷魚血在制備用于抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物及保健食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明經(jīng)實驗證明，鱷魚血對抗腫瘤抗病毒提高免疫力具有良好的療效，同時具有毒性低的優(yōu)點。因此，可用于制備治療抗病毒抗腫瘤提高免疫力的藥物及保健食品。
所述的鱷魚血用于制備抗病毒抗腫瘤提高免疫力的藥物及保健食品，將活體鱷魚經(jīng)過無菌抗凝血抽取血液，并經(jīng)過離心、添加保護劑、冷凍干燥工藝處理后，再無菌包裝用于制備藥物及保健食品。所用鱷魚血冷凍干燥等工藝處理產(chǎn)物可與普通常規(guī)的藥劑填充劑配合，經(jīng)常規(guī)方法，根據(jù)需要制成適當?shù)膭┬停缈诜瑒?、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射粉針劑、滴鼻劑等。通常以口服使用，當然也可以采用其它給藥方式，不同給藥方式給藥劑量有所不同；其每天使用固體口服劑量一般為約0.001～100000毫克，成年人常用量為每天0.05～60000毫克，最常用劑量為5～5000毫克；每天一次或分數(shù)次使用。
具體實施例方式
實施例1一、材料實驗樣品鮮活灣鱷、邏羅鱷，由廣東四會市貞山鱷魚養(yǎng)殖限公司提供。
實驗動物NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)學實驗中心提供，聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP K-30)，由海南南杭藥業(yè)有限公司提供。
二、方法與結(jié)果鱷魚血漿凍干粉制備鮮活鮮活灣鱷、邏羅鱷，分別經(jīng)心臟插管無菌取血，經(jīng)過檸檬酸鈉抗凝、離心，混入5％wt聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP-K30)、冷凍干燥制成粉末，分別制備灣鱷、邏羅鱷鱷魚血漿凍干粉。
灌胃給予受試動物急性毒性實驗選擇健康NIH系小鼠，體重20±2g，40只，雌雄各半，隨機分成2組，即灣鱷血漿給藥組、邏羅鱷血漿給藥組，每組20只，雌雄各半。禁食12小時，提供飲水，分別將鱷魚血冷凍粉劑以生理鹽水配成含血漿凍干粉0.4g/ml溶液，灣鱷血漿給藥組、邏羅鱷血漿給藥組小鼠分別一次灌胃灣鱷血漿溶液、邏羅鱷血漿溶液0.8ml/20g體重，連續(xù)觀察七天，小鼠活動敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)，限于給藥濃度和體積不能再增大，不能測出其LD50。故進行最大耐受量試驗。
另選擇健康小鼠40只，雌雄各半，隨機分成2組，即灣鱷血漿給藥組、邏羅鱷血漿給藥組，每組20只，雌雄各半。禁食12小時，提供飲水，分別將鱷魚血膠囊粉劑以生理鹽水配成含血漿凍干粉0.4g/ml溶液，灣鱷血漿給藥組、邏羅鱷血漿給藥組小鼠分別于24小時內(nèi)分6次灌服鱷魚血漿溶液，每次0.5ml/20g體重，觀察7天，此期間讓小鼠自由進食和飲水，小鼠活動敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)。
三、結(jié)論小鼠每天灌胃分別給予灣鱷血漿溶液、邏羅鱷血漿最大耐受量應(yīng)不小于0.4×6×0.5×50＝60g/kg，屬于實際無毒級。
實施例2 抗腫瘤及提高機體免疫功能的藥理作用一、材料及方法癌細胞株 人肺癌細胞95-D、人胃癌細胞BGC、人肝癌細胞HepG2細胞，由中山大學國家高技術(shù)(863)海洋生物功能基因組開放實驗室提供；人鼻咽癌瘤源，由中山大學實驗動物中心提供。
取約104個人肺癌細胞95-D、人胃癌細胞BGC、人肝癌細胞HepG2細胞、C57BL/6小鼠黑色素瘤細胞B16分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180μl，于37℃含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。設(shè)陰性對照孔(含相同濃度的聚乙烯吡咯烷酮輔料對照)及灣鱷血漿凍干粉、邏羅鱷血漿凍干粉，用生理鹽水溶解，各組設(shè)5個濃度，每濃度3個平行孔，每孔分別加樣品20μl，于37℃含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT(用生理鹽水配制成5mg/ml)20μl，37℃溫育4h，使MTT還原為甲臜(Formanza)。吸出上清液，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，使Formanza溶解。
指標測定 最后用酶標定量儀測定492nm處光密度值。陰性對照相比，計算腫瘤細胞抑制率。
將瘤源裸鼠脫頸處死，取出鼻咽癌腫瘤組織，切成2mm×2mm×2mm的小瘤塊，用套管針將瘤塊接種于每只裸鼠的背部皮下，制備成為人鼻咽癌裸鼠模型。
裸鼠50只，接種后次日隨機分為5組，即空白對照組、灣鱷血漿凍干粉低、高劑量給藥組、邏羅鱷血漿凍干粉低、高劑量給藥組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥28天，處死動物，測定體重、腫瘤、胸腺、脾臟重量，按公式計算抑瘤率＝(空白對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重×100％胸腺指數(shù)(mg/10g體重)＝胸腺重量/體重脾臟指數(shù)(mg/10g體重)＝脾臟重量/體重二、實驗結(jié)果表1灣鱷血漿凍干粉對95-D癌細胞的抑制率劑量(μg/mL) 900 400 150 60 40抑制率(％) 82.070.960.730.026.2表2邏羅鱷血漿凍干粉對95-D癌細胞的抑制率劑量(μg/mL)900 400 150 60 40抑制率(％) 89.073.964.7 40.032.2表3灣鱷血漿凍干粉對HepG2細胞、B16癌細胞的抑制率劑量(μg/mL) 900 400 150 60 40抑制率 HepG2 84.5 75.962.3 51.244.3(％) B16 78.2 60.151.2 48.933.2表4邏羅鱷血漿凍干粉對HepG2細胞、B16癌細胞的抑制率劑量(μg/mL)900 400 150 60 40抑制率HepG2 93.078.4 44.9 45.735.6(％) B16 86.270.3 76.3 43.130.1表5鱷魚血漿凍干粉對荷人鼻咽癌裸鼠的影響(x±SD，n＝10)組別 劑量 體重(g) 瘤重 胸腺指數(shù) 脾贓指數(shù)(mg/kg) 始 末 (g)mg.10g-1mg.10g-1空白對照組5％PVP19.6±1.325.4±2.21.5±0.3 25.9±3.2 58.6±6.2K-30灣鱷血漿凍干粉5020.6±1.3Δ24.3±3.5Δ0.6±0.4***32.6±3.5***64.3±4.7*給藥組100 19.8±1.6Δ26.1±3.1Δ0.3±0.3 36.7±4.3***68.2±5.8**灣鱷血漿凍干粉5020.7±1.8Δ25.6±3.0Δ0.5±0.3 33.3±3.6***64.5±4.2*給藥組100 20.5±1.5Δ24.6±1.8Δ0.3±0.2 37.2±3.5***67.3±4.8**與空白對照組相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.空白對照組給予等體積5％PVP K-30溶液。
實施例3 提高機體免疫功能的藥理作用一、材料及方法
NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)藥實驗動物中心提供。環(huán)磷酰胺，由上海華聯(lián)制藥公司生產(chǎn)。胸腺肽腸溶片，由西安迪賽生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
環(huán)磷酰胺致小鼠免疫功能低下的藥理作用選擇健康NIH系小鼠90只，18～22g，雌雄各半，隨機抽取10只，雌雄各半，作為正常對照組，其余70只口服環(huán)磷酰胺50mg/Kg體重，連續(xù)服用4天后，隨機分成8組，每組10只，雌雄各半，即空白對照組，灣鱷血漿凍干粉低、中、高劑量組，邏羅鱷血漿凍干粉低、中、高劑量組及陽性對照組(胸腺肽組)。灌胃給受試樣品，給受試樣品劑量見表6，連續(xù)給受試樣品40d，第41d各組小鼠禁食一天，但提供飲水。第42d，處死各組小鼠，稱量各組小鼠的體重，胸腺及脾臟重量，計算胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，比較各組間的差異。
對小鼠碳廓清試驗的作用選擇健康NIH系小鼠90只，18～22g，雌雄各半，隨機抽取10只，雌雄各半，作為正常對照組，其余70只口服環(huán)磷酰胺50mg/Kg體重，連續(xù)服用4天后，隨機分成8組，每組10只，雌雄各半，即空白對照組，灣鱷血漿凍干粉低、中、高劑量組，邏羅鱷血漿凍干粉低、中、高劑量組及陽性對照組(胸腺肽組)。灌胃給受試樣品，給受試樣品劑量見表7，連續(xù)給受試樣品40d，第41d各組小鼠禁食一天，但提供飲水。第42d，將印度墨汁，按每10g體重0.1ml計算，經(jīng)鼠尾靜脈注入小鼠，待墨汁注入后立即計時，注入墨汁后2、10min，分別從小鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢取而20μl，加入2ml Na2CO3溶液中，用7550可見光-紫外分光光度計在600nm波長處測光密度(OD)，以Na2CO3溶液作空白對照。最后處死小鼠，稱量體重，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算吞噬指數(shù)(K)及吞噬活性(α)值，比較各組差異。
吞噬指數(shù)K＝(lgOD1-lgOD2)÷(t2-t1)(t為時間，單位為min)吞噬活性α＝體重÷(肝重+脾重)×K表6對小鼠胸腺和脾臟的作用(x±SD，n＝10)項目 劑量 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)組別 (mg/kg)(mg/10g體重) (mg/10g體重)空白對照組5％PVP 16.25±3.21 48.46±8.26K-30灣鱷血漿凍干粉組 60 17.35±3.32Δ56.62±10.31Δ12019.56±3.34*68.47±13.43***24020.27±2.96**76.28±9.96***邏羅鱷血漿凍干粉組60 17.98±3.45Δ57.81±8.42*12019.95±3.82*70.22±9.45***24021.26±3.55**85.29±10.26***陽性對照組24020.56±3.56**76.29±12.45***與空白對照組相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。空白對照組給予等體積5％PVP K-30溶液。
表7對小鼠碳廓清試驗的作用(x±SD，n＝10)項目 劑量 吞噬指數(shù) 吞噬活性組別 (mg/kg)Kα空白對照組 5％PVP 0.0682±0.0098 7.8351±0.2469K-30灣鱷血漿凍干粉組 60 0.1190±0.0240***7.9520±0.2561Δ1200.1832±0.0310***8.5234±0.2835***2400.2266±0.0352***9.694±0.2963***邏羅鱷血漿凍干粉組 60 0.1230±0.0169***7.9932±0.2582***
1200.1925±0.0254***8.6821±0.3243***2400.2264±0.0269***9.9753±0.2562***陽性對照組 2400.1149±0.0210***8.9342±0.3386***與空白對照組相比，ΔP＞0.05，***P＜0.001.空白對照組給予等體積5％PVP K-30溶液。
實施例4 抗病毒藥理作用NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)藥實驗動物中心提供。流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1，由北京醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，病毒唑，購于北京華康藥業(yè)。禽流感病毒H5N1亞型，由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院提供。對因小鼠體內(nèi)感染流感病毒所致死亡的保護作用將選擇健康NIH系小鼠，體重20±2g，90只，雌雄各半，隨機分為病毒對照組、正常對照組、灣鱷血漿凍干粉給藥低、中、高劑量組，邏羅鱷血漿凍干粉給藥低、中、高劑量組，除正常對照組外，其余各組分別以FM1(血凝效價為1∶512)滴鼻感染，給藥組自感染病毒前1d開始到感染后4d，共滴鼻給藥0.05ml/次，2次/d，同時各組按表8劑量連續(xù)10天口服灌胃給藥，病毒對照組及正常對照組給予等體積5％PVP-K30溶液，逐日觀察動物發(fā)病和死亡數(shù)，并觀察15天，計算死亡保護率及生命延長率。
表8鱷魚血漿凍干粉對小鼠感染病毒性肺炎所致死亡的保護作用(x±SD，n＝10)組別N/只 給藥濃度(mg/L) 死亡(n)死亡率(％) 平均存活(d)病毒對照組 105％PVP-K30 8 80 9.7±3.1正常對照組 105％PVP-K30 0 0 15.0±0.0***病毒唑組101000 5 50 13.6±0.6***灣鱷血漿凍干1060 6 60 12.0±2.8**粉給藥組101203 30 13.7±2.4***102403 30 14.3±1.3***邏羅鱷血漿凍1060 6 60 12.2±2.7Δ干粉給藥組 101203 30 13.9±1.9***102402 20 14.7±0.7***與空白對照組相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
將選擇健康NIH系小鼠，體重20±2g，90只，雌雄各半，隨機分為病毒對照組、正常對照組、灣鱷血漿凍干粉給藥低、中、高劑量組，邏羅鱷血漿凍干粉給藥低、中、高劑量組，除正常對照組外，其余分別以禽流感病毒H5N1亞型(血凝效價為1∶256)滴鼻感染，共滴鼻給藥0.05ml/次，1次/d，連續(xù)滴鼻4天，同時各組按表9劑量連續(xù)10天口服灌胃給藥，病毒對照組及正常對照組給予等體積5％PVP-K30溶液，逐日觀察動物發(fā)病和死亡數(shù)，并觀察20天，計算死亡保護率及生命延長率。
表9鱷魚血漿凍干粉對小鼠H5N1所致死亡的保護作用(x±SD，n＝10)組別 N/只給藥濃度(mg/L) 死亡(n)死亡率(％) 平均存活(d)病毒對照 10 5％PVP-K8 80 13.4±3.930正常對照 10 5％PVP-K0 020.0±0.0***病毒唑10 30 5 50 17.1±2.8*1000灣鱷血漿凍干 10 60 6 60 17.0±2.8*粉給藥組 10 120 3 30 18.7±2.4**10 240 2 20 19.3±1.3***
邏羅鱷血漿凍 10 60 6 60 17.2±2.7*干粉給藥組10 120 3 30 18.9±1.9***10 240 2 20 19.7±0.7***與空白對照組相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.00權(quán)利要求
1.鱷魚血在制備用于治療抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物及保健食品中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所用的鱷魚血對活體鱷魚經(jīng)過無菌抗凝血抽取，并經(jīng)過離心、添加保護劑、冷凍干燥工藝處理后，再無菌包裝用于制備藥物及保健食品。
3.按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是將鱷魚血冷凍干燥產(chǎn)物與普通常規(guī)的藥劑填充劑配合，經(jīng)常規(guī)方法制成所需要的藥物及保健食品。
4.按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的藥物及保健食品為含有鱷魚血成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用鱷魚血在制備用于抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物及保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)實驗證明，鱷魚血對抗病毒抗腫瘤提高免疫力具有良好的療效，同時具有毒性低的優(yōu)點。因此，可用于制備治療抗腫瘤抗病毒提高免疫力的藥物及保健食品。
文檔編號A61P31/12GK1634147SQ200410051860
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者許東暉, 許實波, 梅雪婷, 林峰亮 申請人:中山大學