專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改進(jìn)的細(xì)胞免疫原性的抗病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防病毒感染的組合物、方法及試劑盒。本文所述的多價(jià) (例如二價(jià))疫苗并入了計(jì)算優(yōu)化的病毒多肽，其可增加接種對(duì)象的細(xì)胞免疫應(yīng)答的多樣性或廣度和深度。
背景技術(shù)：
引起針對(duì)病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗必須反映全球的病毒多樣性，以便有效地治療或預(yù)防病毒感染。例如，強(qiáng)烈而多樣的HIV-I特異性T細(xì)胞應(yīng)答的啟動(dòng)可能對(duì)于有效的 HIV-I疫苗至關(guān)重要。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答與人類(lèi)緩慢的疾病進(jìn)程相關(guān)，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物接種模型中，CTL應(yīng)答的重要性已得到很好的確證。由于高度易變的包膜(Env) 是中和針對(duì)HIV的抗體的主要靶點(diǎn)，并且疫苗抗原也需要進(jìn)行調(diào)整以引起這些抗體應(yīng)答， T細(xì)胞疫苗組分能夠靶向作用于更加保守的蛋白以引發(fā)更可能是交叉反應(yīng)的應(yīng)答。但是即使是最保守的HIV-I蛋白也足夠多樣以至于變異將成為問(wèn)題。人工中央序列疫苗法，如共有和始祖HIV-I序列，基本上能“分開(kāi)”株系間的差異，與天然病毒株疫苗相比，能夠刺激具有增強(qiáng)的交叉反應(yīng)的應(yīng)答。共有抗原代表合成的抗原序列，其為所有流行株(circulating strain)中唯一最好的“平均水平”。雖然這些抗原能夠引起直接的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是在先前的疫苗策略中，這些應(yīng)答的廣度和強(qiáng)度未得到大幅度的提高。用于治療或預(yù)防病毒感染的下一代疫苗的開(kāi)發(fā)必須引起細(xì)胞免疫廣度的增長(zhǎng)，以使接種結(jié)果成功。在治療或預(yù)防HIV-I時(shí)，對(duì)這類(lèi)疫苗的需求是尤為緊急的。發(fā)明概述第一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種用于治療或降低哺乳動(dòng)物如人類(lèi)的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗，其包括至少兩個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽(如2、3、4、5或多個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽)，其中所述優(yōu)化病毒多肽與相同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。在其它實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-I)，并且病毒基因產(chǎn)物包括feig、Pol、Env, Nef、Tat、Rev、 Vif、Vpr或Vpu。在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括僅兩個(gè)(no more than two) % Gag,Pol, EnV、Nef Jat、ReV、Vif、Vpr或Vpu病毒基因產(chǎn)物之一相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗不包括與Gag和Nef相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽。在又一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括至少兩個(gè)對(duì)于選自feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu的第一個(gè)病毒基因產(chǎn)物的不同的優(yōu)化病毒多肽(例如2、3、4、5或多個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽)，以及包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)于與選自feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu的第一個(gè)病毒基因產(chǎn)物不同的第二個(gè)病毒基因產(chǎn)物的不同的優(yōu)化病毒多肽(例如2、3、4、5或多個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽)。第二個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種用于治療或降低哺乳動(dòng)物如人類(lèi)1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-I)感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗，其包括具有至少7個(gè)連續(xù)氨基酸(如，長(zhǎng)度為至少 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，100， 150，175，200，250，300，350，400，450，500或更多的連續(xù)氨基酸)的優(yōu)化病毒多肽，該氨基酸與SEQ IDNOS 1-29所描述的序列中的任意一個(gè)具有至少85 %的氨基酸序列同一性 (identity)。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽具有至少7個(gè)連續(xù)的氨基酸(如，長(zhǎng)度為至少 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，100， 150,175, 200, 250, 300, 350,400,450, 500或更多的連續(xù)氨基酸)，該些氨基酸與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個(gè)具有氨基酸序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽具有SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個(gè)的氨基酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括至少兩個(gè)優(yōu)化病毒多肽，其選自組a)-k)中的任意一個(gè)或多個(gè)a) SEQ ID NOS :1 和 2 ;b)SEQ ID NOS :3、4和 5 ;c)SEQ IDNOS :6 和 7 ;d)SEQ ID NOS :8-12 ;e)SEQ ID NOS 13、14 禾口 15 ;f)SEQ IDNOS 16、17 禾口 18 ;g)SEQ ID NOS :19 和 20 ;h)SEQ ID NOS :21、 22 和 23 ;i) SEQ ID NOS :24 和 25 ;j) SEQ ID NOS :26 和 27 ;k) SEQ IDNOS :21_22。在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗可包括一對(duì)選自上組a)-k)中任意一個(gè)的優(yōu)化病毒多肽，以及一個(gè)或多個(gè)來(lái)自相同或不同的組a)-k)的不同的優(yōu)化病毒多肽。在其它實(shí)施方式中，疫苗可包括至少三個(gè)或四個(gè)或多個(gè)優(yōu)化病毒多肽，其來(lái)自組a) -k)中的一個(gè)或多個(gè)。第三個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種用于治療或降低哺乳動(dòng)物如人類(lèi)的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗，其包括至少兩對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽，其中每一對(duì)優(yōu)化病毒多肽與相同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)，并且其中僅僅兩個(gè)(no more than two)已并入疫苗的優(yōu)化病毒多肽與相同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括至少三對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括至少四對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、 沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。在其它實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-I)，并且病毒基因產(chǎn)物包括fetg、P0l、Env、Nef、Tat、Rev、 Vif、Vpr或Vpu。在又一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗僅包括兩個(gè)與病毒基因產(chǎn)物&^、？0^1^、徹廠 Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu之一相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗不包括與Gag和Nef相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽。在又一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括至少三對(duì)與病毒基因產(chǎn)物feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu中的任意三個(gè)相對(duì)應(yīng)的不同的優(yōu)化病毒多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗包括至少四對(duì)與病毒基因產(chǎn)物fetg、Pol、Env、Nef、Tat、 Rev、Vif、Vpr或Vpu中的任意四個(gè)相對(duì)應(yīng)的不同的優(yōu)化病毒多肽。在本發(fā)明前三個(gè)方面中任意一個(gè)方面的實(shí)施方式中，疫苗引起針對(duì)病毒基因產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗引起針對(duì)HIV-I的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在又一個(gè)實(shí)施方式中，至少一個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列由核酸或載體編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體為重組腺病毒，如血清26型腺病毒(Ad26)、血清34型腺病毒(Ad34)、血清35 型腺病毒(Ad3Q、血清48型腺病毒(Ad48)或血清5HVR48型腺病毒(Ad5HVR48)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結(jié)合。第四個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種包括優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的核苷酸， 該優(yōu)化病毒多肽具有至少7個(gè)連續(xù)的氨基酸(如，長(zhǎng)度為至少8，9，10，11，12，13，14，15，16， 17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，100，150，175，200，250，300，350，400， 450，500或更多的連續(xù)氨基酸)，該核苷酸序列與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個(gè)具有至少85%的氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽具有至少7個(gè)連續(xù)的氨基酸(如，長(zhǎng)度為至少 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25,26,27,28,29,30,50,100，150，175，200，250，300，350，400，450，500 或更多的連續(xù)氨基酸)，該優(yōu)化病毒多肽與SEQ IDNOS 1-29所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)具有序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽具有SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包括載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體為重組腺病毒， 如血清沈型腺病毒(Ad26)、血清34型腺病毒(Ad34)、血清35型腺病毒(Ad3Q、血清48型腺病毒(Ad48)或血清5HVR48型腺病毒(Ad5HVR48)。第五個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種優(yōu)化病毒多肽，其具有至少7個(gè)連續(xù)的氨基酸(如，長(zhǎng)度為至少 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27， 28，29，30，50，100，150，175，200，250，300，350，400，450，500 或更多的連續(xù)氨基酸)，該優(yōu)化病毒多肽與SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)具有至少85%的氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽具有至少7個(gè)連續(xù)的氨基酸(如，長(zhǎng)度為至少 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50， 100，150，175，200，250，300，350，400，450，500或更多的連續(xù)氨基酸)，該優(yōu)化病毒多肽的序列與SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)完全一致。在另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽具有SEQID NOS 1-29所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)。第六個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)給予本發(fā)明所述的疫苗或核酸，治療或降低哺乳動(dòng)物如人類(lèi)的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒或多瘤病毒引起。在又一個(gè)實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺
一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗或核酸引起針對(duì)病毒基因產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。第七個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)合成本發(fā)明所述的疫苗，制備用于治療或降低哺乳動(dòng)物如人類(lèi)的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗的方法。第八個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)將本發(fā)明的核酸與細(xì)胞接觸并分離出優(yōu)化病毒多肽，制備用于治療或降低哺乳動(dòng)物如人類(lèi)的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗的方法。在本發(fā)明的第七個(gè)或第八個(gè)方面的實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽在給予哺乳動(dòng)物時(shí)引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答可針對(duì)病毒基因產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、 皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒或多瘤病毒引起。在又一個(gè)實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是 1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-I)，并且病毒基因產(chǎn)物包括feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、CN 102282175 A
Vpr 或 Vpu ο第九個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種試劑盒，其包括本發(fā)明的疫苗、藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑及其使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包括佐劑。最后一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種試劑盒，其包括本發(fā)明的核酸，藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑及其使用說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包括佐劑。在本發(fā)明所有方面的實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽由為在人類(lèi)中表達(dá)而優(yōu)化的核苷酸序列編碼(例如，SEQ ID NOS :5、10、11、12、15、18和23中的任意一個(gè))。定義“優(yōu)化的病毒多肽”或“計(jì)算優(yōu)化的病毒多肽”指的是一種免疫原性多肽，其不是天然存在的病毒肽、多肽或蛋白。優(yōu)化病毒多肽序列起初是通過(guò)修飾一個(gè)或多個(gè)天然存在的病毒基因產(chǎn)物(例如肽、多肽和蛋白)的氨基酸序列而生成，以增加哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))免疫(例如，當(dāng)并入本發(fā)明所述的疫苗)后所產(chǎn)生的抗病毒免疫應(yīng)答(例如，細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答)的廣度、強(qiáng)度、深度或壽命。因此，優(yōu)化病毒多肽可能與“親本”病毒基因序列相對(duì)應(yīng)；可替換地，優(yōu)化病毒多肽可能不與特定的“親本”病毒基因序列相對(duì)應(yīng)，而可能與病毒的變異株或準(zhǔn)種產(chǎn)生的類(lèi)似物的序列相對(duì)應(yīng)。對(duì)優(yōu)化病毒多肽中包括的病毒基因序列進(jìn)行的修飾包括氨基酸的添加、替換和刪除。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化病毒多肽是兩個(gè)或多個(gè)天然存在的病毒基因產(chǎn)物(例如，天然或臨床的病毒分離物)的復(fù)合或融合的氨基酸序列，其中每個(gè)潛在的抗原表位(例如，每個(gè)連續(xù)或重疊的氨基酸序列，其長(zhǎng)度為 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30或多個(gè)氨基酸)經(jīng)分析和修飾，以提高所生成的優(yōu)化病毒多肽的免疫原性。與不同病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽也可融合以促進(jìn)其并入本發(fā)明的疫苗。生成優(yōu)化病毒多肽的方法在，例如，F(xiàn)isher等“全球性HIV-I變體中潛在T細(xì)胞表位的最佳覆蓋率的多價(jià)疫苗(Polyvalent Vaccine for Optimal Coverage of Potential T-CeIl Epitopes in Global HIV-I Variants) ”Nat. Med. 13 (1) :100-106(2007)以及國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本TO 2007/024941中所描述，此處以引用方式并入。一旦生成了優(yōu)化病毒多肽序列，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)或管理相對(duì)應(yīng)的多肽(例如，重組病毒載體，如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)WO 2006/040330和W02007/104792所公開(kāi)的腺病毒載體，此處以引用方式并入)?！八帉W(xué)上可接受的載體”指的是接受治療的哺乳動(dòng)物在生理上可接受的、并且保留與其共同給予的化合物的治療性質(zhì)的載體。典型的藥學(xué)上可接受的載體為生理鹽水。其它生理上可接受的載體及其配方對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且在例如Remington’ s Pharmaceutical Sciences (18thedition,ed. A. Gennaro,1990,Mack Publishing Company, Easton, PA)中描述，此處以引用方式并入?！拜d體”指的是DNA構(gòu)建體，其包含可操作的連接到下游基因或編碼區(qū)域(例如， 編碼多肽或多肽片段的cDNA或基因組DNA片段)的啟動(dòng)子。在受體細(xì)胞(例如原核或真核細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，取決于表達(dá)載體中的啟動(dòng)子)或生物體 (包括，例如人類(lèi))中導(dǎo)入載體后，細(xì)胞能夠表達(dá)載體編碼的mRNA，之后其翻譯為本發(fā)明所述的編碼的優(yōu)化病毒多肽。體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的載體在本領(lǐng)域是熟知的，并在此處作進(jìn)一步描述。載體可能是基因工程質(zhì)粒，病毒或衍生自例如噬菌體、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒或皰疹病毒的人工染色體。
“病毒基因產(chǎn)物”指的是任何天然存在的病毒肽、多肽、或蛋白、或其片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，病毒基因產(chǎn)物衍生自1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-I)。HIV-I病毒基因產(chǎn)物包括 Gag、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr 和 Vpu 多肽。


圖1為說(shuō)明針對(duì)恒河猴中的全球潛在T細(xì)胞表位(PTE)肽，計(jì)算優(yōu)化的HIV-lGag、 Pol和Env病毒多肽的擴(kuò)大的廣度的圖表。用優(yōu)化病毒多肽(藍(lán)色)免疫的動(dòng)物以最大數(shù)量與記憶肽池反應(yīng)。圖2為顯示計(jì)算修飾的HlV-lfeig、Pol和Env病毒多肽擴(kuò)大了表位特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的廣度的圖表。圖3說(shuō)明在用來(lái)自本發(fā)明的計(jì)算修飾的病毒多肽的HIV-I病毒基因產(chǎn)物feg、P0l 和Env進(jìn)行免疫后的恒河獼猴以及接種共有HIV-I抗原或者HIV-I進(jìn)化支C分離抗原的動(dòng)物中檢測(cè)到的細(xì)胞免疫應(yīng)答的廣度。用優(yōu)化病毒多肽(藍(lán)色)免疫的動(dòng)物以最大數(shù)量與記憶肽池反應(yīng)。由于動(dòng)物是遠(yuǎn)交種，池在動(dòng)物與動(dòng)物之間不同。kg、Pol和Env各自引起多種細(xì)胞免疫應(yīng)答，并可以共享反應(yīng)模式。圖4A-4C為顯示用病毒多肽(Pol (圖4A)、Gag (圖4B)和Env (圖4C))測(cè)試的不同疫苗(二價(jià)鑲嵌序列(Mos2)、M共有序列(Mcon)和優(yōu)化的進(jìn)化支C (OptC))之間共享的潛在表位的圖表。圖4A-C顯示不同疫苗候選物對(duì)目前HIV數(shù)據(jù)庫(kù)全長(zhǎng)基因組和PTE肽的
相對(duì)覆蓋率。圖5為一圖表，其顯示PTE肽與二價(jià)鑲嵌(Mos2)疫苗的反應(yīng)數(shù)量(認(rèn)為每個(gè)應(yīng)答是一個(gè)獨(dú)立事件，不論重疊與否)大于與M組共有(Mcon)疫苗和天然病毒株疫苗(優(yōu)化的進(jìn)化支C(天然C(最佳)))的反應(yīng)數(shù)量，已選擇該天然病毒株疫苗以產(chǎn)生M組集合(OptC) 疫苗抗原的最佳覆蓋率。圖5顯示蛋白、⑶8+T細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞在每只動(dòng)物中的PTE肽應(yīng)答數(shù)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)上，Mos2 > Mcon OptC (Mcon顯示比OptC更多的應(yīng)答的趨勢(shì))。Mos2 與 Mcon 相比的 Wilcoxon ρ 值ρ 值=0. 001058。圖6為一圖表，其顯示引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的PTE肽的數(shù)量。二價(jià)鑲嵌(Mos2)疫苗中的中位數(shù)為16(范圍12- )的PTE肽引發(fā)CD8+T細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答，而中位數(shù)僅為6 (范圍 0-7)的Mcon肽和OptC肽中的中位數(shù)僅為3 (范圍；0-3)的肽引發(fā)CD8+T細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答。 二價(jià)鑲嵌(Mos2)疫苗中的中位數(shù)為4(范圍2-6)的PTE肽觸發(fā)CD4+T細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答，而中位數(shù)僅為1(范圍0-2)的Mcon肽和OptC肽中的中位數(shù)僅為0.5(范圍0_2)的肽觸發(fā) CD4+T細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答。因此，應(yīng)答的趨勢(shì)是Mos2 > Mcon > OptC。圖7為一示意圖，總結(jié)了由每只被研究動(dòng)物的T細(xì)胞識(shí)別的所有CD8+T細(xì)胞Gag PTE肽的圖譜(見(jiàn)下面的實(shí)施例幻。動(dòng)物編號(hào)，肽池和肽編號(hào)標(biāo)記每個(gè)活性肽的邊界。組用符號(hào)表示*，Mos2 ;￥，ConM; 士，OptC。此處Gag作為實(shí)施例被包括。即使動(dòng)物是遠(yuǎn)交種， CD8應(yīng)答仍?xún)A向于聚類(lèi)。鑲嵌疫苗與單價(jià)疫苗相比具有潛在的優(yōu)勢(shì)。鑲嵌型(mosaic，嵌合體)有更好的機(jī)會(huì)刺激應(yīng)答，其與更普通的變體相作用。鑲嵌型還刺激針對(duì)在混合物中存在的不同形式的多重應(yīng)答。因此，鑲嵌型有阻斷普通逃逸途徑的潛力。在我們的研究中，鑲嵌疫苗傾向于刺激T細(xì)胞應(yīng)答，識(shí)別更多重疊肽。有許多活性肽定位的熱點(diǎn)。設(shè)計(jì)PTE肽以使用于評(píng)估疫苗的肽試劑中的HIV-IM組的潛在表位(或9個(gè)氨基酸連續(xù)段的九聚體)的覆蓋率最大化。不可避免地，在PTE肽中有許多重疊，但是由于算法，重疊通常是與某些變異的重疊。圖7公開(kāi)了 SEQ ID N0:42。圖8為一示意圖，總結(jié)了由每只被研究動(dòng)物的T細(xì)胞識(shí)別的⑶4+T細(xì)胞(iag PTE 肽的圖譜(mapping)。圖 8 公開(kāi)了 SEQ ID NO :43。圖9為一圖表，其描述了針對(duì)ConM疫苗或最佳天然疫苗的PTE應(yīng)答的典型模式， 比對(duì)了引起應(yīng)答的肽和疫苗相關(guān)區(qū)域的肽。疫苗和目標(biāo)PTE肽之間的具有同一性的穩(wěn)定肽段的良好匹配對(duì)于實(shí)現(xiàn)對(duì)這些疫苗的反應(yīng)是必要的。圖9桉出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了 SEQ ID NOS 44-57。圖10為一圖表，其說(shuō)明了鑲嵌疫苗產(chǎn)生多個(gè)應(yīng)答，識(shí)別具有不明顯抗原性競(jìng)爭(zhēng)和具有寬泛局部應(yīng)答的多個(gè)變異重疊肽。尤其識(shí)別四個(gè)易變(variable)的PTE肽。此外，在重疊區(qū)域，兩個(gè)鑲嵌形式以及兩者的結(jié)合均被識(shí)別。最后，新形式( 被識(shí)別。圖10桉出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了 SEQ ID NOS 58-63。圖11為一圖表，其說(shuō)明了在鑲嵌疫苗接種的動(dòng)物中(361-07)⑶8+PTE肽應(yīng)答的典型模式。測(cè)試了 22個(gè)PTE肽并確定了 8個(gè)CD8應(yīng)答區(qū)域；5個(gè)區(qū)域包括與在一個(gè)或另一個(gè)鑲嵌序列(mosaic)中的氨基酸匹配的易變的肽。確定了 5個(gè)CD4應(yīng)答區(qū)域。因此，對(duì)鑲嵌序列的T細(xì)胞應(yīng)答在給定區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)更多易變的肽。這對(duì)于CD8T細(xì)胞應(yīng)答似乎尤為真實(shí)。 這可能是引發(fā)多個(gè)T細(xì)胞克隆而識(shí)別表位變體的結(jié)果，而且這可能阻斷合適的逃逸途徑。 不僅有更多的應(yīng)答，而且它們更深入并且覆蓋了更多的變體。圖11桉出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了如SEQ ID NOS 64-101所描述的⑶8應(yīng)答。按出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了如SEQ ID NOS 102-117 所描述的⑶4應(yīng)答。圖12為一圖表，其顯示了重疊的易變PTE肽的數(shù)量，該P(yáng)TE肽貫穿了疫苗引起的 T細(xì)胞所靶向的區(qū)域。圖13為一圖表，其顯示相對(duì)于Mcon和OptC疫苗，2個(gè)鑲嵌抗原疫苗產(chǎn)生更多的針對(duì)含有一個(gè)或多個(gè)重疊PTE肽的區(qū)域的T細(xì)胞應(yīng)答。圖13與圖5相似，猴子從右至左以相同的順序顯示，但改變其比例以反映對(duì)含有一個(gè)或多個(gè)重疊PTE肽而不是單肽的區(qū)域的應(yīng)
答數(shù)量。圖14為一圖表，其顯示在給予動(dòng)物二價(jià)鑲嵌疫苗(Mod)、Mcon疫苗和OptC疫苗后，T細(xì)胞應(yīng)答的數(shù)量。二價(jià)鑲嵌(Mod)疫苗在CD8+T細(xì)胞中引發(fā)中位數(shù)為8的應(yīng)答，而 Mcon疫苗和OptC疫苗分別引發(fā)中位數(shù)僅為3 (范圍0_6)和1.5(范圍0- 個(gè)肽的CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答。二價(jià)鑲嵌(Mod)疫苗在CD4+T細(xì)胞中引發(fā)中位數(shù)為3(范圍2-5)的應(yīng)答，而 Mcon疫苗和OptC疫苗分別引發(fā)中位數(shù)僅為1 (范圍0-2)和0. 5 (范圍0_2)的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。因此，應(yīng)答的趨勢(shì)是Mos2 > Mcon > OptC。圖15為一圖表，其顯示鑲嵌疫苗與進(jìn)化支C(進(jìn)化枝C)天然疫苗相比能夠引起更多的應(yīng)答與進(jìn)化支C天然蛋白交叉反應(yīng)GAG整合肽(pooled peptide)代表5個(gè)蛋白。接種了 M組共有序列或最佳覆蓋率進(jìn)化支C天然蛋白的動(dòng)物對(duì)來(lái)自這些蛋白的肽有0-2個(gè)應(yīng)答，而接種了鑲嵌疫苗的動(dòng)物能夠應(yīng)答1-5個(gè)肽池。與Mcon或最佳C序列相比，鑲嵌疫苗引起對(duì)每個(gè)測(cè)試蛋白的更多的應(yīng)答。由鑲嵌疫苗引起的T細(xì)胞應(yīng)答也識(shí)別更多的貫穿真實(shí) Gag蛋白的整合肽組。10-12個(gè)亞池=IOX十五聚體肽(96ZM Gag除外，其為5X 二十聚體肽)。
圖16為一圖表，其顯示隨著時(shí)間的推移，鑲嵌設(shè)計(jì)對(duì)于病毒多肽中的變化穩(wěn)定 (例如(^ag M)。圖17為一圖表，其顯示利用九聚體優(yōu)化的覆蓋率在接近(例如，八-十二聚體) 優(yōu)化長(zhǎng)度時(shí)穩(wěn)定(顯示的是kg)。圖18為一圖表，其顯示變異數(shù)量的增加使覆蓋率增加，但僅有遞減的恢復(fù) (return)(顯示的是 Gag)。圖19A-19B為顯示表位特異性T淋巴細(xì)胞對(duì)PTE肽應(yīng)答的廣度和幅度的圖表。圖 19A為一圖表，其顯示了在表達(dá)鑲嵌序列(藍(lán)色)、M共有序列(綠色)、進(jìn)化支B+進(jìn)化支 C (紫色)或最佳天然進(jìn)化支C (紅色)HIV-lfeig、P0l和Env抗原的rAc^6載體的單次免疫后，表位特異性CD4+(頂部)和CD8+(底部)T淋巴細(xì)胞對(duì)單個(gè)PTE肽應(yīng)答的數(shù)量。單個(gè)猴子描繪在χ軸上。每種顏色的不同陰影反映了對(duì)不同抗原(Gag、Pol、Env)的應(yīng)答。圖19B 為一圖表，其顯示⑶4+(頂部)和⑶8+(底部)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答區(qū)域的數(shù)量。圖 20A-20C示出一圖解，其顯示定位(mapping)于HIV-IGag(圖 20A) (SEQ ID NO 118)、Pol(圖 20B) (SEQ ID NO :119)禾口 Env (圖 20C) (SEQ ID NO :120)蛋白序列的免疫 4 周后，CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)PTE肽的應(yīng)答。顏色表示接受鑲嵌序列(藍(lán)色)、M共有序列(綠色)、進(jìn)化支B+進(jìn)化支C(紫色)或最佳天然進(jìn)化支C(紅色)HIV-mag、Pol和Env抗原的猴子。對(duì)于每個(gè)表位，猴子編號(hào)、抗原(G，Gag;P，Pol ；E，Env)、子池編號(hào)和單個(gè)PTE肽編號(hào)均有顯示。圖21A-21C 示出一圖解，其顯示定位于 HIV-I Gag(圖 21A) (SEQ IDNO :121)， Pol(圖 21B) (SEQ ID NO :122)禾口 Env(圖 21C) (SEQ ID NO :123)蛋白序列的免疫 4 周后， CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)PTE肽的應(yīng)答。顏色表示接受鑲嵌序列(藍(lán)色)、M共有序列(綠色)、進(jìn)化支B+進(jìn)化支C (紫色)或最佳天然進(jìn)化支C (紅色)HIV-mag、Pol和Env抗原的猴子。 對(duì)于每個(gè)表位，猴子編號(hào)、抗原(G，Gag ；P, Pol ；E，Env)、子池編號(hào)和單個(gè)PTE肽編號(hào)均有顯
7J\ ο圖22示出一個(gè)圖解，其顯示使用表達(dá)鑲嵌序列、M共有序列、進(jìn)化支B+進(jìn)化支C或最佳天然進(jìn)化支C HIV-lGag.Pol和Env抗原的rAc^6載體免疫4周后，所有猴子中具有活性PTE肽的疫苗序列的比對(duì)。對(duì)于每只猴子，疫苗序列顯示在頂部，活性PTE肽顯示在由抗原(G，Gag;P，Pol ；Ε,Env)和PTE肽編號(hào)表示的疫苗序列下方。最小重疊區(qū)域以粗體顯示。 兩個(gè)鑲嵌序列或兩個(gè)進(jìn)化支B+進(jìn)化支C抗原之間的序列多態(tài)性顯示為藍(lán)色。疫苗序列與活性PTE肽之間的差異顯示為紅色。圖22按出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了 SEQ ID NOS 124-640?？赡芎忻庖邞?yīng)答表位的肽內(nèi)最小區(qū)域，基于其出現(xiàn)時(shí)的活性肽間的重疊，在疫苗中是粗體的。如果沒(méi)有重疊肽，我們推測(cè)表位可以在肽中的任何位置，因此整個(gè)區(qū)域是粗體的。我們不能區(qū)分肽內(nèi)部具有不同邊界的不同的T細(xì)胞應(yīng)答靶向表位，或當(dāng)變體存在時(shí)可耐受變異的更多雜亂的克隆T細(xì)胞應(yīng)答；在疫苗免疫應(yīng)答中兩種情況均是有利的。靶向區(qū)域的數(shù)量與說(shuō)明數(shù)據(jù)所需的T細(xì)胞應(yīng)答的最小數(shù)量相對(duì)應(yīng)。疫苗和肽不匹配處的氨基酸寫(xiě)為紅色；如果它們落入可能帶有表位的區(qū)域，它們?yōu)榇煮w紅色。當(dāng)多個(gè)肽重疊時(shí)，重疊區(qū)域外的氨基酸差異以非粗體紅色標(biāo)記。疫苗總是在頂部。代表每個(gè)蛋白(Gag為G，Pol為P，Envelope為E)的字母和肽編號(hào)用來(lái)標(biāo)記每個(gè)活性PTE肽。蛋白和HXB2編碼接在每個(gè)肽后。
對(duì)于鑲嵌序列和進(jìn)化支B+C疫苗，每個(gè)含有2個(gè)抗原并且均包括在比對(duì)中；疫苗中的氨基酸差異標(biāo)記為藍(lán)色，如果活性肽在第二鑲嵌序列中帶有變異氨基酸，也標(biāo)記為藍(lán)色。 在兩個(gè)疫苗抗原具有差異的每個(gè)位置，活性肽也標(biāo)記為粗體，以顯示包括兩個(gè)變體的位置可能影響疫苗免疫應(yīng)答并且使廣度和深度更大。例如，總結(jié)的第一個(gè)疫苗是進(jìn)化支B+C疫苗，動(dòng)物觀7_95是應(yīng)答被列出的第一只動(dòng)物。有3個(gè)針對(duì)PTE肽的⑶8應(yīng)答，1個(gè)針對(duì)⑶4。兩個(gè)⑶8肽E^和E282顯示大量的重疊，因此兩者可能是相同CTL應(yīng)答的靶點(diǎn)；因此我們也注意到僅有2個(gè)CD8應(yīng)答區(qū)域，以及1個(gè)CD4應(yīng)答區(qū)域。對(duì)于每個(gè)應(yīng)答區(qū)域，我們寫(xiě)出每個(gè)區(qū)域中重疊肽的數(shù)量(例如，CD8 12CD4 1)以評(píng)估應(yīng)答的深度；兩個(gè)為紅色，表明重疊區(qū)域在活性肽中易變。如果疫苗不同， 如第二活性區(qū)域中的D/E，則標(biāo)記為藍(lán)色。僅重疊的區(qū)域?yàn)榇煮w。E282中的H在兩個(gè)疫苗中均未發(fā)現(xiàn)，因此標(biāo)記為紅色；它在重疊區(qū)域中因此為粗體。每個(gè)活性肽具有其蛋白和相應(yīng)的HXB2編號(hào)，標(biāo)記在右側(cè)。圖23A-23C為圖表，其顯示了從最低到最高排列的所有(iag、Pol和Env特異性 CD8+(圖23A和23B)和CD4+(圖23C) T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的幅度。圖24A-C顯示了對(duì)PTE肽的表位特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的深度。圖24A為一圖解，其顯示在接受了最佳天然進(jìn)化支C抗原的猴子366中，定位的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的實(shí)例。 圖24B為一圖解，其顯示在接受了二價(jià)鑲嵌抗原的猴子361中，定位的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的實(shí)例。在圖24A禾口 24B中，疫苗序列顯示在頂端(OptC ；Mosl, Mos2)，活性PTE肽顯示在由抗原(G，Gag ；P, Pol ；E, Env)和PTE肽編號(hào)表示的疫苗序列的下方。最小重疊區(qū)域以粗體顯示。兩個(gè)鑲嵌抗原間的序列多態(tài)性顯示為藍(lán)色。疫苗序列與活性PTE肽之間的差異顯示為紅色。所有由應(yīng)答區(qū)域構(gòu)成的陽(yáng)性肽的完整比對(duì)均顯示在圖22中。圖24C為一圖表，其顯示了用表達(dá)鑲嵌序列、M共有序列、進(jìn)化支B+進(jìn)化支C或最佳天然進(jìn)化支C抗原的rAd26 載體進(jìn)行免疫后，CD4+(頂部)和CD8+(底部)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的深度。單個(gè)猴子描繪在 χ軸上。對(duì)于每個(gè)表位區(qū)域，顯示一個(gè)應(yīng)答變異(淺陰影)或> 1個(gè)應(yīng)答變異(深陰影)。 圖24A按出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了 SEQ ID N0S641-650。圖24B按出現(xiàn)順序分別公開(kāi)了 SEQ ID NOS 651-685。圖25為一圖表，其顯示了對(duì)來(lái)自進(jìn)化支A、B和C的HIV-IGag肽的表位特異性T 淋巴細(xì)胞應(yīng)答的廣度。利用來(lái)自下列HIV-IGag株的重疊肽的子池來(lái)評(píng)估細(xì)胞免疫應(yīng)答的廣度進(jìn)化支C DU422、進(jìn)化支C ZM651、共有序列C、共有序列A和共有序列B。用表達(dá)鑲嵌序列(藍(lán)色)、M共有序列(綠色)、進(jìn)化支B+進(jìn)化支C (紫色)或優(yōu)化天然進(jìn)化支C (紅色)HlV-lfeg、Pol和Env抗原的rAc^6載體進(jìn)行單次免疫后，顯示了陽(yáng)性子池的數(shù)量。單個(gè)猴子描繪在χ軸上。圖^A-D為圖表，其顯示加強(qiáng)免疫后的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。顯示了每只猴子在初免后第4周(每個(gè)畫(huà)面左側(cè))和加強(qiáng)后第44周(每個(gè)畫(huà)面右側(cè))單個(gè)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的幅度(圖2躺和廣度(圖^B)。在第O周用rAc^6載體對(duì)猴子進(jìn)行初免，并且在第40周用表達(dá)鑲嵌序列、M共有序列或最佳天然進(jìn)化支C HIV-I Gag.Pol和Env抗原的rAd5HVR48載體進(jìn)行加強(qiáng)。單個(gè)猴子描繪在χ軸上。在圖26A中，紅色表示CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，藍(lán)色表示 CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，用線條描繪在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均觀察到的應(yīng)答，用點(diǎn)描繪僅在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到的應(yīng)答。在圖26B中，每種顏色的不同陰影反映對(duì)不同抗原(Gag、Pol、Env)的應(yīng)答。圖^C為一圖表，其顯示在0、4、44周的Env特異性ELISA終點(diǎn)效價(jià)。圖^D為一圖表，其顯示在第44周時(shí)對(duì)1級(jí)進(jìn)化支A (DJ263. 8)，進(jìn)化支B (SF162. LS)和進(jìn)化支C (MW965. 26)病毒的中和抗體(NAb)效價(jià)。對(duì)鼠白血病病毒的NAb效價(jià)作為陰性對(duì)照，在所有樣品中<20。圖27為一圖表，其顯示不同的疫苗抗原對(duì)PTE肽的理論覆蓋率。顯示了被鑲嵌序列(藍(lán)色)、M共有序列(綠色)、進(jìn)化支B+進(jìn)化支C (紫色)或優(yōu)化天然進(jìn)化支C (紅色) HIV-lGag, Pol和Env抗原所覆蓋的9個(gè)氨基酸PTE肽的百分比。發(fā)明詳述本發(fā)明的特征在于一種優(yōu)化的病毒多肽，其是從天然存在的病毒基因產(chǎn)物計(jì)算衍生的。使用一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽或并入一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的疫苗(例如載體)對(duì)對(duì)象(例如人類(lèi))進(jìn)行免疫后，本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽使病毒特異性免疫(例如，細(xì)胞免疫，如基于T細(xì)胞的免疫應(yīng)答)的廣度和深度增高。本發(fā)明提供疫苗，其可給予已感染或具有感染病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象(例如人類(lèi))。本發(fā)明所述疫苗并入了至少兩個(gè)不同的每個(gè)相應(yīng)的病毒基因產(chǎn)物所代表的優(yōu)化病毒多肽。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并入兩個(gè)不同優(yōu)化病毒多肽使疫苗中的覆蓋率和免疫原性表位表現(xiàn)增加，導(dǎo)致在對(duì)象接種后，病毒特異性免疫應(yīng)答總數(shù)量增長(zhǎng)。本發(fā)明還提供了給予和制備用于對(duì)象(例如人類(lèi))的疫苗、 載體和優(yōu)化病毒多肽的方法。此處所述的組合物、方法和試劑盒通過(guò)提供至少兩個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽，能夠明顯增加病毒特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的多樣性、廣度和/或深度。本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽本發(fā)明提供多價(jià)(例如二價(jià))疫苗，其并入了對(duì)應(yīng)于并來(lái)自天然傳播的病毒基因產(chǎn)物的計(jì)算優(yōu)化(computationally-optimized)的病毒多肽。多價(jià)鑲嵌蛋白由天然序列通過(guò)計(jì)算機(jī)上執(zhí)行的(in silico)重組并優(yōu)化而裝配得到，以便對(duì)于給定的價(jià)提供潛在T細(xì)胞表位(PTEs)最大化的覆蓋率。鑲嵌抗原為全長(zhǎng)蛋白，其設(shè)計(jì)成保留天然的抗原表達(dá)和加工。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用對(duì)應(yīng)于并來(lái)自單病毒基因產(chǎn)物(即二價(jià)疫苗)的兩個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽進(jìn)行免疫，與傳統(tǒng)的并入來(lái)自相同病毒基因產(chǎn)物(例如，基于臨床分離株的序列) 的天然存在的多肽，或來(lái)自相同病毒基因產(chǎn)物的天然存在多肽的共有序列的單價(jià)或多價(jià)疫苗相比，能夠明顯引起更高數(shù)量的細(xì)胞免疫應(yīng)答(例如T細(xì)胞應(yīng)答)。因此，關(guān)于并入了計(jì)算優(yōu)化(或計(jì)算機(jī)上優(yōu)化)的病毒多肽的疫苗，其序列提供流行病毒序列的非稀有短節(jié)段最大化的覆蓋率，該疫苗能夠提高免疫應(yīng)答的廣度和深度。一種遺傳算法用來(lái)創(chuàng)建優(yōu)化病毒多肽組，作為任意一組天然存在的病毒基因產(chǎn)物序列的片段的“鑲嵌”混合物，提供作為輸入數(shù)據(jù)。該遺傳算法策略使用來(lái)自普通病毒群體的未經(jīng)比對(duì)的蛋白序列作為輸入數(shù)據(jù)組，因此具有“不依賴(lài)于比對(duì)”的優(yōu)點(diǎn)。其創(chuàng)建的人工優(yōu)化病毒多肽類(lèi)似于在自然界中發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白，但不是天然存在的?？梢哉{(diào)整遺傳算法以根據(jù)預(yù)期靶點(diǎn)或期望的免疫應(yīng)答來(lái)優(yōu)化不同長(zhǎng)度的病毒多肽。由于大部分T細(xì)胞表位的長(zhǎng)度為九個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽所利用的遺傳算法基于優(yōu)化給定病毒基因產(chǎn)物(例如，HIV-Ifeig)的每個(gè)連續(xù)的九聚體氨基酸序列。根據(jù)該方法，可排除自然界中不存在的或非常稀有的(例如)九聚體——相對(duì)于基于共有序列的疫苗策略是一種改進(jìn)，因?yàn)楹笳呖砂恍┫∮谢蜃匀唤缰懈静淮嬖诘?例如)九聚體。用于遺傳算法中的適合度的定義是，最“合適的”多價(jià)混合物是在群體中產(chǎn)生所有九聚體的最佳覆蓋率(完美匹配的最高分?jǐn)?shù))的輸入病毒序列的組合，并且滿足群體中無(wú)九聚體缺失或稀有的限制。 用于生成本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的遺傳算法在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)WO 2007/024941中進(jìn)一步描述，此處以引用方式并入。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了并入單一優(yōu)化HIV-I多肽(例如，在SEQ ID NOS :1- 中所描述的多肽)的多價(jià)(例如二價(jià))HIV-I疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于一種并入兩個(gè)或多個(gè)優(yōu)化HIV-I多肽的多價(jià)疫苗。在每種情況下，優(yōu)化HIV-I 多肽都是基于全球流行的所有HIV-I變體，稱(chēng)為HIV-I主要(M)組。發(fā)明人生成了一組優(yōu)化的HIV-I多肽(SEQ ID NOS :1- )，其增加基于M組鑲嵌基因的細(xì)胞免疫的廣度和深度， 該M組鑲嵌基因中每個(gè)基因僅利用兩個(gè)變體(例如，兩個(gè)多肽序列，每個(gè)為feig、Pol、Env, Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu)。我們已經(jīng)在恒河猴(Rhesus macaques)中獲得新的并且驚人的結(jié)果，在多價(jià)(例如二價(jià))HIV-IM組疫苗中使用這些優(yōu)化HIV-I多肽，與其它兩個(gè)領(lǐng)先疫苗抗原策略(M共有序列抗原和最佳天然進(jìn)化支C抗原)相比，引起明顯更大的HIV-I 特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的廣度和深度。本發(fā)明提供了與不同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽的融合。上述遺傳算法可用于生成在本發(fā)明的疫苗中所使用的融合多肽。例如，Gag/Nef(SEQ ID NOS :19-20)、 Gag/Pol (SEQ ID NOS :21-27) ,Gag/Pol/Nef (SEQ ID NOS :28-29)的優(yōu)化HIV-1 多肽融合可并入本發(fā)明的載體中，以給予感染HIV-I或具有感染HIV-I風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象(例如人類(lèi))。本發(fā)明所述疫苗(不論是多肽還是核酸的形式)還可以包括一個(gè)或多個(gè)非“鑲嵌”多肽(或分別編碼它們的序列)，如，例如，最佳進(jìn)化支C序列(SEQ IDNOS 30-36)或共有序列(SEQ ID NOS 37-39)。本發(fā)明公開(kāi)的優(yōu)化病毒多肽可通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)進(jìn)行傳統(tǒng)制備，如Merrifield， J. Amer. Chem. Soc. 85 :2149(1963)(也見(jiàn)于例如 Memmer 等，164Gene 49(1995))中所描述。 例如，該疫苗可容易地使用固相肽合成(SPPQ制備。自動(dòng)固相合成可通過(guò)使用很多熟知的、市售的自動(dòng)合成器中的任何一個(gè)進(jìn)行，如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的 ABI433A肽合成器?？商鎿Q地，本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽可通過(guò)使用可實(shí)現(xiàn)優(yōu)化病毒多肽細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的核酸或載體(例如，病毒載體，如腺病毒)對(duì)細(xì)胞或有機(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)而進(jìn)行重組化生產(chǎn)。編碼本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的核酸和載體可通過(guò)熟知的重組 DNA技術(shù)合成，包括本文中描述的技術(shù)。本發(fā)明的疫苗本發(fā)明的特征還在于一種疫苗，其可給予已感染病毒或具有感染病毒(例如 HIV-1)風(fēng)險(xiǎn)的患者。本發(fā)明的疫苗包含至少一個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽，如本文所討論。 本發(fā)明的疫苗可以是編碼兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的核酸(例如， 重組體的免疫原性組分(例如亞單元)或完整有機(jī)體(例如，完整病毒)病毒載體)。核酸包括并入兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的載體(例如，病毒載體，如腺病毒)。本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽，以及并入了優(yōu)化病毒多肽的疫苗、核酸和載體，可在細(xì)胞或有機(jī)體中進(jìn)行重組化表達(dá)，或可直接給予已感染病毒或具有感染病毒風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象(例如人類(lèi))。本發(fā)明的載體本發(fā)明的特征還在于編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列(例如DNA或RNA)的載體。載體可以是包括編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的載體(例如脂質(zhì)體)、質(zhì)粒、黏粒、酵母人工染色體或病毒。載體能夠包括其他的來(lái)自幾個(gè)來(lái)源的核酸序列。編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的載體可以使用任何本領(lǐng)域公知的重組分子生物技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。對(duì)靶細(xì)胞或有機(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后，載體可在染色體外或可整合入宿主細(xì)胞的染色體。每個(gè)靶細(xì)胞中載體的核酸組分可以為單或多拷貝數(shù)，可為線型、環(huán)形或串聯(lián)狀。本發(fā)明的載體也可以包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ序列，以實(shí)現(xiàn)單次核酸轉(zhuǎn)錄表達(dá)多個(gè)肽或多肽鏈。例如，本發(fā)明的載體可以編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽以及其它多肽(例如，可檢測(cè)的標(biāo)記，如綠色熒光蛋白(GFP))。本發(fā)明所述的載體進(jìn)一步包括促進(jìn)本發(fā)明優(yōu)化病毒多肽表達(dá)的基因表達(dá)元件。有助于編碼本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的載體的表達(dá)的基因表達(dá)元件包括，但不限于(a)調(diào)節(jié)序列，如病毒轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及其增強(qiáng)子元件，如SV40早期啟動(dòng)子、勞斯(Rous)肉瘤病毒LTR 和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒LTR ； (b)例如來(lái)自SV40晚期區(qū)的拼接區(qū)和多腺苷酸化位點(diǎn)；以及(c)例如在SV40中的多腺苷酸化位點(diǎn)。還包括來(lái)源于復(fù)制的質(zhì)粒、抗生素耐藥性或選擇性基因、多克隆位點(diǎn)(例如，限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))以及其它病毒基因序列(例如， 編碼病毒結(jié)構(gòu)元件、功能元件或調(diào)節(jié)元件的序列，如HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR))。本發(fā)明載體也可以包括本發(fā)明的用于在人類(lèi)中表達(dá)而優(yōu)化的優(yōu)化病毒多肽，如， 例如SEQ ID NOS 11,14-18和23中的任意一個(gè)。本發(fā)明的載體可以被設(shè)計(jì)成包括多克隆位點(diǎn)(MCS)，該多克隆位點(diǎn)含有如下酶切位點(diǎn):Xbal-EcoRI-Kozak-起始· · ·終止-BamHI-NheI ；以及如下序列TCTAGA GAATTC GCCACC[ATG基因TAA TGA]GGATCCGCTAGC。具有該MCS的載體可與優(yōu)化病毒多肽共同使用， 該優(yōu)化病毒多肽不具有內(nèi)部)(bal、EcoRI, BamHI, NheI位點(diǎn)也不具有6個(gè)或多個(gè)C或G的節(jié)段。體內(nèi)給予本發(fā)明的特征在于一種用于體內(nèi)給予對(duì)象(例如人類(lèi))一種或多種本發(fā)明的疫苗 (例如，編碼兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽)的方法，以促進(jìn)兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的表達(dá)。給予對(duì)象疫苗后，將表達(dá)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽，能夠引起針對(duì)病毒免疫原的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答(例如，細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答)?？墒褂萌舾煞N載體來(lái)將編碼本發(fā)明所述的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列直接遞送至對(duì)象(例如人類(lèi))。本發(fā)明的載體包括病毒、裸露DNA、寡核苷酸、陽(yáng)離子類(lèi)脂 (例如脂質(zhì)體)、陽(yáng)離子聚合物(如多核糖體)、病毒顆粒和樹(shù)枝狀聚合物。本發(fā)明提供細(xì)胞 (例如血細(xì)胞)的體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后將這些細(xì)胞給予供體對(duì)象，以表達(dá)本發(fā)明的具有免疫原特性的優(yōu)化病毒多肽。根據(jù)本發(fā)明所述方法能夠被分離并且進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞包括但不限于血細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。干細(xì)胞也適合用本發(fā)明的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。全能、多能性、多能或單能干細(xì)胞，包括骨髓祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞(HSC)，可被分離并利用編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且根據(jù)本發(fā)明的方法給予對(duì)象。用于表達(dá)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒載體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，對(duì)在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中以及在隨后接受細(xì)胞的對(duì)象中的蛋白表達(dá)的強(qiáng)度和壽命有著很強(qiáng)的影響。本發(fā)明提供自然界中壽命短暫的(例如腺病毒載體)或壽命長(zhǎng)的(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)載體。調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)是本領(lǐng)域已知的，可用于調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類(lèi)型對(duì)蛋白表達(dá)的強(qiáng)度和壽命也有著很強(qiáng)的影響。例如，可以預(yù)期具有高周轉(zhuǎn)率的細(xì)胞類(lèi)型具有更短的蛋白表達(dá)周期。體外轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明的特征還在于一種用于體外細(xì)胞(例如，血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，隨后將這些細(xì)胞給予對(duì)象(例如人類(lèi))。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞為所處理對(duì)象的自體細(xì)胞。可使用編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，以使優(yōu)化病毒多肽能夠在處理的對(duì)象中進(jìn)行短暫或長(zhǎng)期表達(dá)。將這些修飾的細(xì)胞給予對(duì)象后，會(huì)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒載體，以引起針對(duì)病毒免疫原的保護(hù)性或治療性的免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答)?？墒褂萌舾煞N載體來(lái)將編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列遞送至細(xì)胞(例如血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)。本發(fā)明所述載體包括病毒、裸露DNA、寡核苷酸、 陽(yáng)離子類(lèi)脂(例如脂質(zhì)體)、陽(yáng)離子聚合物(如多核糖體)、病毒顆粒和樹(shù)枝狀聚合物。本發(fā)明提供細(xì)胞(例如血細(xì)胞)的體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后將這些細(xì)胞給予供體對(duì)象，以表達(dá)本發(fā)明所述的具有免疫原特性的優(yōu)化病毒多肽。根據(jù)本發(fā)明所述方法，能夠被分離并且進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞包括但不限于血細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。干細(xì)胞也是用于用本發(fā)明所述的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的合適的細(xì)胞。全能、多能性、多能或單能干細(xì)胞，包括骨髓祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞 (HSC)，可被分離并利用編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且根據(jù)本發(fā)明所述的方法給予對(duì)象。用于表達(dá)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒載體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，對(duì)在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中以及在隨后接受細(xì)胞的對(duì)象中的蛋白表達(dá)的強(qiáng)度和壽命有著很強(qiáng)的影響。本發(fā)明提供在自然界中壽命短暫的(例如腺病毒載體)或壽命長(zhǎng)的(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)載體。調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)是本領(lǐng)域已知的，其可用于調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類(lèi)型對(duì)蛋白表達(dá)的強(qiáng)度和壽命也有著很強(qiáng)的影響。例如，可以預(yù)期具有高周轉(zhuǎn)率的細(xì)胞類(lèi)型具有更短的蛋白表達(dá)周期。病毒載體編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的病毒載體可用作本發(fā)明的疫苗。例如，一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列可重組地插入適于對(duì)象或從對(duì)象中分離的細(xì)胞(例如，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)之后將細(xì)胞給予對(duì)象)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，體內(nèi)給予)的天然或修飾(例如，減毒)的病毒基因組的核苷酸序列中?？梢詫?duì)病毒進(jìn)行額外的修飾，以提高感染性或趨性(例如假型)，減少或消除復(fù)制能力，或降低病毒組分的免疫原性(例如， 所有與免疫原性疫苗因子不相關(guān)的組分)。本發(fā)明所述載體可以由轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)并分泌到細(xì)胞外的空間或留在表達(dá)細(xì)胞中(例如，作為細(xì)胞內(nèi)分子或呈現(xiàn)在細(xì)胞表面)。嵌合或假型病毒載體也可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述優(yōu)化病毒多肽的表達(dá)。典型的載體描述如下。腺病毒
重組腺病毒在用作表達(dá)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的載體時(shí)提供數(shù)個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)。病毒可制備成高效價(jià)，可感染非復(fù)制的細(xì)胞，也可在接觸靶細(xì)胞群后提供體外靶細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，腺病毒不將其DNA整合入宿主的基因組中。因此，其作為表達(dá)載體的使用降低了誘導(dǎo)自發(fā)增殖異常的風(fēng)險(xiǎn)。在動(dòng)物模型中，通常發(fā)現(xiàn)腺病毒載體介導(dǎo)約一星期的高水平表達(dá)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)(編碼本發(fā)明所述優(yōu)化病毒多肽的核酸的表達(dá))的持續(xù)時(shí)間可通過(guò)使用細(xì)胞或組織特異性啟動(dòng)子延長(zhǎng)。腺病毒載體自身的分子工程中的其它改進(jìn)產(chǎn)生更持久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和更少的炎癥。這見(jiàn)于所謂的“第二代”具有在另外的早期腺病毒基因中的特異性突變的載體，以及實(shí)際上已利用Cre-Lox策略刪除了所有病毒基因的“沒(méi)有生機(jī)的(膽小的，gutless) ”載體(Engelhardt 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 6196(1994)和 Kochanek 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :5731 (1996)，此處每個(gè)以引用方式并入)ο公開(kāi)于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)WO 2006/040330和WO 2007/104792 (此處每個(gè)以引用方式并入)的稀有血清型和嵌合腺病毒載體，作為本發(fā)明所述的載體尤其有用。例如，重組腺病毒rAd26、rAd34、rAd35、rAd48和rAd5HVR48能夠編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽。一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的重組病毒載體可給予對(duì)象，以治療或預(yù)防病毒感染。腺相關(guān)病毒(AAV)腺相關(guān)病毒(AAV)，來(lái)自非致病性細(xì)小病毒，由于這些載體引起幾乎無(wú)抗載體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中產(chǎn)生持續(xù)數(shù)月的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，因此也可以用于表達(dá)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽。逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒用于本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的表達(dá)。與腺病毒不同，逆轉(zhuǎn)錄基因組是基于RNA的。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞時(shí)，會(huì)將其RNA與數(shù)種酶一起導(dǎo)入該細(xì)胞。來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒RNA分子將通過(guò)稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程產(chǎn)生雙鏈的DNA拷貝，稱(chēng)為前病毒。在轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核后，前病毒DNA整合入宿主細(xì)胞染色體，持久地改變所轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞及任何來(lái)自該細(xì)胞的后代細(xì)胞的基因組。持久地將基因?qū)爰?xì)胞或有機(jī)體的能力是用于基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒的必然特征。逆轉(zhuǎn)錄病毒包括慢病毒，其為包括人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒家族，包括若干輔助蛋白以促進(jìn)病毒感染和前病毒整合。目前，“第三代”慢病毒載體具有完全無(wú)復(fù)制能力、廣泛的趨向性以及對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的特征(見(jiàn)于，例如 Mangeat 禾口 Trono, Human Gene Therapy 16(8) :913(2005)以及 Wiznerowicz 禾口 Trono, Trends Biotechnol. 23(1) :42 (2005)，此處每個(gè)以引用方式并入)。其它病毒載體除了腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，本領(lǐng)域已知其它病毒載體和技術(shù)可用于在細(xì)胞(例如血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)或?qū)ο?例如人類(lèi))中表達(dá)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽。這些病毒包括痘病毒(例如牛痘病毒和修飾的安卡拉牛痘病毒或(MVA)；見(jiàn)于，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，603，112 和5，762，938，此處每個(gè)以引用方式并入)、皰疹病毒、披蓋病毒(例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒；見(jiàn)于，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，643，576，此處以引用方式并入)、小核糖核酸病毒(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒；見(jiàn)于，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，639，649，此處以引用方式并入)、桿狀病毒以及其它由 Wattanapitayakul 禾口 Bauer 所描述的(Biomed. Pharmacother, 54 :487 (2000)，此處以引用方式并入)。其它表達(dá)載體裸露DNA和寡核苷酸編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的裸露DNA或寡核苷酸也可用于在細(xì)胞(例如血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)或?qū)ο?例如人類(lèi))中表達(dá)這些多肽。見(jiàn)于，例如，Cohen， Science 259:1691-1692(1993) ；Fynan 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，90 11478 (1993)；禾口 Wolff等，BioTechniques 11 :474485 (1991)，在本文中每一個(gè)以引用方式并入。這是最簡(jiǎn)單的非病毒轉(zhuǎn)染方法。遞送裸露DNA的有效方法有如電穿孔和“基因槍”的使用，其用高壓氣體和載體微粒(例如金)將DNA包被的金微粒射入細(xì)胞中。脂復(fù)合物和聚合復(fù)合物為提高編碼本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的核酸遞送進(jìn)入細(xì)胞或?qū)ο?，脂?fù)合物 (例如脂質(zhì)體)和聚合復(fù)合物可以用于保護(hù)載體DNA在轉(zhuǎn)染過(guò)程中免于不希望的降解。質(zhì)粒DNA可以覆蓋著像膠束或脂質(zhì)體的組織結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)。當(dāng)該組織結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)合時(shí)，被稱(chēng)為脂復(fù)合物(lipoplex)。有三種類(lèi)型的脂類(lèi)，陰離子的(帶負(fù)電荷的)、中性的或陽(yáng)離子的 (帶正電荷的)。利用陽(yáng)離子脂類(lèi)的脂復(fù)合物已證明對(duì)基因轉(zhuǎn)運(yùn)有用。陽(yáng)離子脂類(lèi)，由于其正電荷，自然地與帶負(fù)電荷的DNA形成復(fù)合物。同樣由于其電荷，它們與細(xì)胞膜相互作用， 發(fā)生脂復(fù)合物的內(nèi)吞，并將DNA釋放至細(xì)胞質(zhì)。陽(yáng)離子脂類(lèi)也保護(hù)DNA免于被細(xì)胞降解。聚合物與DNA的復(fù)合物稱(chēng)為聚合復(fù)合物(polyplex)。大多數(shù)聚合復(fù)合物由陽(yáng)離子聚合物組成，其產(chǎn)生是由離子相互作用所調(diào)節(jié)的。聚合復(fù)合物和脂復(fù)合物作用方式之間的較大差異是，聚合復(fù)合物不能將其DNA負(fù)載釋放至細(xì)胞質(zhì)中，因此，必須用內(nèi)涵體溶解劑 (以溶解在細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程中生成的內(nèi)涵體)如滅活的腺病毒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。然而，這并非總是如此；聚合物如聚乙烯亞胺具有其特有的內(nèi)涵體破壞方法，如同殼聚糖和三甲基殼聚糖那樣?？捎糜谂c編碼本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的核酸結(jié)合以形成脂復(fù)合物或聚合復(fù)合物的典型的陽(yáng)離子脂類(lèi)和聚合物包括但不限于，聚乙烯亞胺、脂轉(zhuǎn)染試劑(IiPOfectin)、 脂轉(zhuǎn)染胺試劑(lipofectamine)、聚賴(lài)氨酸、殼聚糖、三甲基殼聚糖和海藻酸鹽。雜交方法幾種基因轉(zhuǎn)移的雜交方法結(jié)合了兩種或多種技術(shù)。病毒顆粒，例如，將脂復(fù)合物 (例如脂質(zhì)體)與滅活的病毒結(jié)合。已顯示該方法與單獨(dú)使用病毒或脂質(zhì)體方法相比，導(dǎo)致在呼吸道上皮細(xì)胞中更有效的基因轉(zhuǎn)移。其它方法涉及將其它病毒載體與陽(yáng)離子脂質(zhì)或雜交病毒混合。這些方法中每一個(gè)都可用于促進(jìn)編碼本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞(例如血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)或?qū)ο?例如人類(lèi))中。樹(shù)枝狀聚合物樹(shù)枝狀聚合物也可用于將編碼本發(fā)明所述的優(yōu)化病毒多肽的核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞 (例如血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)或?qū)ο?例如人類(lèi))中。樹(shù)枝狀聚合物是高度支化的球形大分子。微粒的表面可在許多方面發(fā)揮作用，并且所產(chǎn)生構(gòu)建體的許多性質(zhì)由其表面決定。尤其可能構(gòu)建陽(yáng)離子樹(shù)枝狀聚合物(即具有表面正電荷的樹(shù)枝狀聚合物)。當(dāng)存在于基因材料如DNA或RNA中，電荷互補(bǔ)性導(dǎo)致核酸與陽(yáng)離子樹(shù)枝狀聚合物的短暫的結(jié)合。一旦到達(dá)目標(biāo)，樹(shù)枝狀聚合物-核酸復(fù)合物通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用攝入細(xì)胞內(nèi)。體內(nèi)給予
本發(fā)明的特征在于一種使用本發(fā)明的疫苗對(duì)對(duì)象(例如人類(lèi))進(jìn)行免疫的體內(nèi)方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的一個(gè)或多個(gè)疫苗可直接給予對(duì)象，以引起針對(duì)病毒 (HIV-I)的保護(hù)性或治療性的免疫應(yīng)答(例如，細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答)?？商鎿Q地，可將如上所述的編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的優(yōu)化病毒多肽的載體直接給予對(duì)象以預(yù)防或治療病毒感染。有效地在體內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的載體(例如病毒載體)能夠在所處理對(duì)象中引起廣泛的、持久的以及有效的免疫應(yīng)答。在表達(dá)載體的核酸組分轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞(例如血細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞)后，宿主細(xì)胞產(chǎn)生并呈現(xiàn)或分泌本發(fā)明所述的疫苗，隨后用于活化免疫系統(tǒng)的組分，如抗原呈遞細(xì)胞(APCs)、T細(xì)胞和B細(xì)胞，導(dǎo)致免疫的建立。藥物組合物本發(fā)明的特征在于本發(fā)明的疫苗、載體和優(yōu)化病毒多肽與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、緩沖液或其它可接受的載體的組合。疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的配方會(huì)使用或?qū)崿F(xiàn)有效量的優(yōu)化病毒多肽免疫原的表達(dá)。也就是說(shuō)，會(huì)包括一定量的抗原，其導(dǎo)致所處理對(duì)象(例如人類(lèi))產(chǎn)生特異性和充分的免疫應(yīng)答，以保護(hù)對(duì)象以免隨后暴露于病毒(例如HIV-1)或治療已有的病毒感染。例如，本發(fā)明的疫苗的配方可實(shí)現(xiàn)一定量的抗原表達(dá)，其導(dǎo)致對(duì)象產(chǎn)生廣泛和特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。使用本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽處理的對(duì)象也可產(chǎn)生抗病毒抗體(例如中和抗體)，該抗體可向?qū)ο筇峁┍Ｗo(hù)性或治療性的益處。本發(fā)明的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽可單獨(dú)或與本領(lǐng)域已知的任何藥學(xué)上可接受的載體、鹽或佐劑結(jié)合后直接給予對(duì)象。藥學(xué)上可接受的鹽可能包括制藥工業(yè)中常用的無(wú)毒酸加成鹽或金屬?gòu)?fù)合物。酸加成鹽的例子包括有機(jī)酸如乙酸、乳酸、撲酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、琥珀酸、 苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲基磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或類(lèi)似物；共聚物酸如單寧酸、羧甲基纖維素或類(lèi)似物；和無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或類(lèi)似物。金屬?gòu)?fù)合物包括鋅、鐵及類(lèi)似物。典型的藥學(xué)上可接受的載體是生理鹽水。其它生理上可接受的載體及其配方對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且在例如，Remi股ton' s Pharmaceutical Sciences, (18th 版),ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA 中描述。本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的預(yù)防性或治療性有效量的藥物配方與藥學(xué)上可接受的適合于給予途徑的載體混合后，可通過(guò)口服、胃腸道外(例如，肌肉、腹腔內(nèi)、靜脈或皮下注射，吸入，皮內(nèi)注射，滴眼或植入)、鼻腔、陰道、直腸、舌下或局部給予。配方中本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的濃度可在約0.1-100質(zhì)量％間變化。用于胃腸道外給予含有本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的組合物的配方包括無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液或乳劑。適宜的載體的例子包括丙二醇、聚乙二醇、 植物油、凝膠、氫化萘以及可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。這種配方也可包含添加劑，如防腐齊U、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。可生物相容、生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙醇酸交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的釋放。其它可能有用的包含本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的組合物的胃腸道外遞送系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯共聚物微粒、滲透泵、植入式輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。液體配方可通過(guò)例如細(xì)菌濾器過(guò)濾、在組合物中加入滅菌劑或輻照或加熱組合物進(jìn)行滅菌?？商鎿Q地，也可以無(wú)菌、固態(tài)的組合物形式生產(chǎn)，該組合物在溶解于無(wú)菌水或一些其它的無(wú)菌可注射介質(zhì)后立即使用。
用于直腸或陰道給予含有本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的組合物優(yōu)選栓劑，其可能含有除活性物質(zhì)以外的賦形劑，如可可油或栓劑蠟。用于鼻腔或舌下給予的組合物也用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑進(jìn)行制備。用于吸入給予的配方可能含有賦形劑例如乳糖，或可能是含有例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水性溶劑，或可能是油性溶劑，以滴鼻劑或噴霧劑形式或作為凝膠給予。本發(fā)明所述的組合物中活性成分的量可以是不同的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得準(zhǔn)確的個(gè)體劑量可能有所調(diào)整，取決于多種因素，包括所給予的肽、給予時(shí)間、給予途徑、配方的性質(zhì)、排泄的速率、對(duì)象疾病的性質(zhì)以及患者的年齡、體重、健康狀況和性別。此外，由疫苗、 載體或優(yōu)化病毒多肽所治療的疾病的嚴(yán)重程度也對(duì)劑量水平產(chǎn)生影響。通常，劑量水平在 0. 1 μ g/kg體重至100mg/kg體重間，每天單劑量或分為多個(gè)劑量給予。優(yōu)選地，一般劑量范圍在每天250 μ g/kg體重至5. Omg/kg體重間。由于不同給予途徑的效率不同，可以預(yù)期所需劑量有廣泛變化。例如，與靜脈注射給予相比，通常預(yù)期口服給予需要更高的劑量水平。 這些劑量水平的變化可以使用本領(lǐng)域熟知的優(yōu)化用標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序進(jìn)行調(diào)整。通常，準(zhǔn)確的預(yù)防性或治療性有效的劑量能夠由主治醫(yī)生參考如上確定因素進(jìn)行確定。在給予患者的每個(gè)劑量中存在的本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的量是鑒于對(duì)患者年齡、體重、性別、一般身體狀況及類(lèi)似情況的考慮而選擇的。在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞免疫應(yīng)答)或產(chǎn)生外源性效應(yīng)而無(wú)明顯不良副作用所需的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的量根據(jù)所使用的藥物組合物和可選佐劑的存在進(jìn)行變化。如果需要，初始劑量可選地跟隨反復(fù)的加強(qiáng)。方法可涉及長(zhǎng)期給予本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽。對(duì)于治療性用途或預(yù)防性用途，免疫疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的重復(fù)劑量是可取的， 例如每年加強(qiáng)或其它時(shí)間間隔的加強(qiáng)。當(dāng)然，所給予的劑量根據(jù)已知因素如特定疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的藥效學(xué)特征及其給予模式和途徑；接受者的年齡、健康狀況和體重；癥狀的性質(zhì)和程度，同時(shí)治療的種類(lèi)，治療的頻率和所需的效果有所不同。本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽可在長(zhǎng)期治療中給予由于針刺或母性感染而具有急性感染風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象。該“急性”感染的劑量頻率范圍可從每日劑量到每周一次或兩次肌注或靜注，持續(xù)約6 星期。疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽也可在長(zhǎng)期治療中給予已感染患者，或晚期感染病毒(例如HIV-1)的患者。在已感染患者中，長(zhǎng)期給予的頻率范圍可從每日劑量到每周一次或兩次肌注或靜注，并取決于存在于本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽中的免疫原的半衰期。佐劑本發(fā)明所述的用于接種需要其的哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))的針對(duì)病毒的疫苗可與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的佐劑共同給予或連續(xù)給予，以增加疫苗的免疫原性。批準(zhǔn)用于人類(lèi)的佐劑包括鋁鹽(明礬)。這些佐劑已用于某些疫苗，包括乙型肝炎、白喉、狂犬病、脊髓灰質(zhì)炎及流感疫苗。其它有用的佐劑包括完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、胞壁酰二肽(MDP)、MDP的合成類(lèi)似物、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2-[l，2-二棕櫚?；?S-甘油-3-(羥基磷酰氧基)]乙酰胺(MTP-PE)和含有可代謝油和乳化劑的組合物，其中所述油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，該乳劑的油滴基本上所有的直徑小于一微米。試劑盒
本發(fā)明提供試劑盒，其包括含有本發(fā)明所述的用于預(yù)防或治療病毒感染的治療有效量的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。所述試劑盒包括使用說(shuō)明書(shū)，以允許臨床醫(yī)生(例如醫(yī)生或護(hù)士)給予其中所含的組合物。優(yōu)選地，所述試劑盒包括多包裝的單劑量藥物組合物，其含有有效量的本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽?？蛇x地，試劑盒可包括給予藥物組合物所必需的儀器或裝置。例如，本發(fā)明所述試劑盒可提供一個(gè)或多個(gè)預(yù)充注射器，其含有有效量的本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽。此外，所述試劑盒也可包括其它組分，例如已感染病毒或具有感染病毒風(fēng)險(xiǎn)的患者使用含有本發(fā)明所述的疫苗、載體或優(yōu)化病毒多肽的藥物組合物的使用說(shuō)明書(shū)或給予日程。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以作出各種對(duì)本發(fā)明所述的組合物、方法和試劑盒的修改和變化而不違背本發(fā)明的精神和范圍。因此其意圖是，如果本發(fā)明所述的修改和變化落入所附權(quán)利要求及其等同物的范圍，其被本發(fā)明所涵蓋。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明由如下實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，該些實(shí)施例并不意在限制本發(fā)明。實(shí)施例1鑲嵌抗原Gag、Pol、Nef和Env序列(SEQ ID NOS :1_8)使用如上討論的遺傳算法進(jìn)行構(gòu)建。然后修改這些序列，通過(guò)消除Env (SEQ IDNOS :9-11)中的切割/融合活性，消除Pol (SEQ ID NOS :12-14)中的催化活性，消除Nef (SEQ ID NOS 16-18)中的十四烷基化位點(diǎn)，以及構(gòu)建包括feigNef、feigPol或feigPolNef(SEQ ID NOS :19-29)的融合構(gòu)建體，使這些序列對(duì)于疫苗開(kāi)發(fā)具有實(shí)用性。也描繪了比對(duì)最佳天然進(jìn)化支C基因(SEQ ID NOS 30-36)。實(shí)施例2用來(lái)自M共有序列(組1)、二價(jià)M鑲嵌序列(組幻或最佳天然進(jìn)化支C序列(組 3)的表達(dá)( g、Pol和Env基因的3X101°Vp rAc^6載體對(duì)20只恒河猴進(jìn)行免疫。M共有序列代表合成序列，該合成序列代表全球流行病毒中唯一最好的“平均水平”。二價(jià)M鑲嵌序列描述如上。最佳天然進(jìn)化支C序列是來(lái)自性質(zhì)最“類(lèi)似共有序列”的真實(shí)進(jìn)化支C HIV-I 病毒的天然存在的序列。通過(guò)評(píng)價(jià)來(lái)自全球潛在T細(xì)胞表位(PTE)肽組中的應(yīng)答肽的數(shù)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞免疫的廣度。所述PTE肽代表> 85%的全球HIV-I序列，并由NIH免費(fèi)提供。結(jié)果顯示新型二價(jià)M鑲嵌序列顯著優(yōu)于其它兩個(gè)主要抗原概念。如表1所示，與M 共有抗原和最佳天然進(jìn)化支C抗原相比，二價(jià)M鑲嵌抗原引起Gag特異性、Env特異性、Pol 特異性和總T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的廣度顯著增加。(平均值代表每組猴子的平均#表位；SEM代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。表1 恒河猴中鑲嵌HIV-lGag/Pol/Env抗原針對(duì)全球PTE肽的擴(kuò)展廣度
權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動(dòng)物病毒感染或降低哺乳動(dòng)物病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗，包括至少兩個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽，其中所述優(yōu)化病毒多肽與相同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對(duì)所述病毒基因產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其中所述病毒基因產(chǎn)物選自由feg、P0l、Env、Nef、Tat、 Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗僅包含兩個(gè)優(yōu)化病毒多肽，所述優(yōu)化病毒多肽與選自由feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的病毒基因產(chǎn)物之一相對(duì)應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的疫苗，其中所述疫苗不包括與Gag和Nef相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化病毒多肽。
9.一種用于治療哺乳動(dòng)物中1型人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-I)感染或降低其風(fēng)險(xiǎn)的疫苗，包含含有至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的優(yōu)化病毒多肽，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個(gè)具有至少85%的氨基酸序列同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述優(yōu)化病毒多肽包含至少七個(gè)連續(xù)氨基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個(gè)具有氨基酸序列同一性。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述優(yōu)化病毒多肽包含SEQIDNOS :1- 所描述的任意一個(gè)序列中的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對(duì)HIV-I的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少兩個(gè)所述優(yōu)化病毒多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的疫苗，其中所述至少兩個(gè)所述優(yōu)化病毒多肽包含a) SEQIDNOS:1 禾口 2 ;b)SEQIDNOS:3 禾口 4 ;c) SEQIDNOS:5 和 6 ；d) SEQIDNOS:7 禾口 8 ；e)SEQIDNOS9 禾口 10 ；f) SEQIDNOS10 禾口 11 ；g) SEQIDNOS9 禾口 11 ；h) SEQIDNOS12 禾口 13 ；i)SEQIDNOS13 禾口 14 ；j) SEQIDNOS12 禾口 14 ；k) SEQIDNOS3 禾口 15 ；1)SEQIDNOS4 禾口 15 ；m) SEQIDNOS16 禾口 17 ；n) SEQIDNOS17 禾口 18 ；ο) SEQIDNOS16 禾口 18 ；ρ) SEQIDNOS19 禾口 20 ；q) SEQIDNOS21 禾口 22 ；r) SEQIDNOS22 禾口 23 ；s) SEQIDNOS21 禾口 23 ；t)SEQIDNOS24 禾口 25 ；u) SEQIDNOS26和27 ；或ν) SEQIDNOS28 禾口 29。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少三個(gè)所述優(yōu)化病毒多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少四個(gè)所述優(yōu)化病毒多肽。
18.一種用于治療哺乳動(dòng)物病毒感染或降低其風(fēng)險(xiǎn)的疫苗，包括至少兩對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽，其中每一對(duì)所述優(yōu)化病毒多肽與相同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)，并且其中僅兩個(gè)已結(jié)合到所述疫苗中的優(yōu)化病毒多肽與所述相同的病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，其中所述哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對(duì)所述病毒基因產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，包含至少三對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，包含至少四對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，其中所述病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、 痘病毒、或多瘤病毒引起。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的疫苗，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的疫苗，其中所述至少兩對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽與選自由 feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的任意兩個(gè)病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗，其中所述至少兩個(gè)病毒基因產(chǎn)物不是Gag和Nef。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗，包含至少三對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽，所述優(yōu)化病毒多肽與選自由feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的任意三個(gè)病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。
28.根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，包含至少四對(duì)不同的優(yōu)化病毒多肽，所述優(yōu)化病毒多肽與選自由feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的任意四個(gè)病毒基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。
29.根據(jù)權(quán)利要求M所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對(duì)HIV-I的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
30.根據(jù)權(quán)利要求1、9或18所述的疫苗，其中至少一個(gè)不同的優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列由核酸或載體編碼。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的疫苗，其中所述載體是重組腺病毒。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的疫苗，其中所述重組腺病毒是腺病毒血清型^(Ad26)、腺病毒血清型34(Ad34)、腺病毒血清型35(Ad3Q、腺病毒血清型48 (Ad48)或腺病毒血清型 5HVR48(Ad5HVR48)。
33.根據(jù)權(quán)利要求1、9或18所述的疫苗，進(jìn)一步與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結(jié)合。
34.一種包含優(yōu)化病毒多肽的核苷酸序列的核酸，所述優(yōu)化病毒多肽包含至少七個(gè)連續(xù)的氨基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)具有至少85%的氨基酸序列同一性。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸，其中所述優(yōu)化病毒多肽包含至少七個(gè)連續(xù)氨基酸， 其與SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)具有序列同一性。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸，其中所述優(yōu)化病毒多肽包含SEQIDNOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸，進(jìn)一步包含載體。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸，其中所述載體是重組腺病毒。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的核酸，其中所述重組腺病毒是腺病毒血清型^(Ad26)、腺病毒血清型34 (Ad34)、腺病毒血清型35 (Ad35)、腺病毒血清型48 (Ad48)或腺病毒血清型 5HVR48(Ad5HVR48)。
40.一種優(yōu)化病毒多肽，包含至少七個(gè)連續(xù)的氨基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)具有至少85 %的氨基酸序列同一性。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的優(yōu)化病毒多肽，其中所述優(yōu)化病毒多肽包含至少七個(gè)連續(xù)氨基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)具有序列同一性。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的優(yōu)化病毒多肽，其中所述優(yōu)化病毒多肽包含SEQID NOS 1-29所描述的氨基酸序列中的任意一個(gè)。
43.一種用于治療哺乳動(dòng)物病毒感染或降低其風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物根據(jù)權(quán)利要求1、9或18所述的疫苗，或根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述疫苗或核酸引起針對(duì)所述病毒基因產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、 痘病毒、或多瘤病毒引起。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
48.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病毒基因產(chǎn)物選自由feg、Pol、Env,Nef、 Tat、Rev、Vif、Vpr 和 Vpu 組成的組。
49.一種制備用于治療哺乳動(dòng)物病毒感染或降低哺乳動(dòng)物病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗的方法，所述方法包含合成根據(jù)權(quán)利要求1、9或18所述的疫苗。
50.一種制備用于治療哺乳動(dòng)物病毒感染或降低哺乳動(dòng)物病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的疫苗的方法，所述方法包含以下步驟a)將權(quán)利要求37所述的核酸與細(xì)胞接觸；和b)分離所述優(yōu)化病毒多肽。
51.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的方法，其中當(dāng)所述優(yōu)化病毒多肽給予哺乳動(dòng)物時(shí)引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。
52.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類(lèi)。
53.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的方法，其中所述疫苗引起針對(duì)所述病毒基因產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
54.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的方法，其中所述病毒感染由逆轉(zhuǎn)錄病毒、呼腸孤病毒、 小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、 布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是1型人類(lèi)免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述病毒基因產(chǎn)物選自由feg、Pol、Env、Nef、 Tat、Rev、Vif、Vpr 和 Vpu 組成的組。
57.一種試劑盒，包含a)根據(jù)權(quán)利要求1、9或18所述的疫苗；b)藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑；和c)其使用說(shuō)明書(shū)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的試劑盒，進(jìn)一步包含佐劑。
59.一種試劑盒，包含a)根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸；b)藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑；和c)其使用說(shuō)明書(shū)。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的試劑盒，進(jìn)一步包含佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防病毒感染的組合物、方法及試劑盒。本發(fā)明所述的多價(jià)(例如二價(jià))疫苗并入了計(jì)算優(yōu)化的病毒多肽，其可增加接種對(duì)象的細(xì)胞免疫應(yīng)答的多樣性或廣度和深度。
文檔編號(hào)C07K17/00GK102282175SQ200980154787
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
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