專利名稱：含有jeryl－lynn病毒株的抗流行性腮腺炎疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流行性腮腺炎疫苗，它含有從腮腺炎病毒的Jeryl-Lynn株衍生來(lái)的一種均一純化分離株。
背景技術(shù)：
流行性腮腺炎基本上是一種兒童患疾病，通常只有輕微的臨床癥狀。但某些病例中流行性腮腺炎感染的臨床結(jié)果是嚴(yán)重的。例如，在英國(guó)流行性腮腺炎是15歲以下兒童患腦膜腦炎的最常見(jiàn)病因，也是兒童永久性感覺(jué)神經(jīng)性耳聾的一個(gè)病因。盡管30～40％的自然腮腺炎感染不出現(xiàn)癥狀，但會(huì)累及唾液腺，而且在成年人群中，除了上面提到的神經(jīng)性并發(fā)癥外，流行性腮腺炎還會(huì)導(dǎo)致第一個(gè)三月期流產(chǎn)和睪丸炎，這些都是勿容置疑的事實(shí)，它使許多國(guó)家都施行了人群預(yù)防接種的計(jì)劃。
腮腺炎病毒屬于副粘病毒科，它由大約15.3kb的負(fù)鏈單鏈基因組RNA構(gòu)成，基因順序是3′N-P-M-F-SH-HN-L5′(N為核衣殼蛋白，P為磷蛋白，M為基質(zhì)蛋白，F(xiàn)為融合蛋白，SH為潛在表達(dá)(potentially expressed)的小疏水性蛋白，HN為血凝素神經(jīng)氨酸酶，L為大蛋白)。在眾多腮腺炎病毒株中，Jeryl-Lynn(B-水平，B-level)是一種減毒活變種，經(jīng)序列分析，其特征在于F，P，HN，M基因。
最近有兩種腮腺炎病毒株已獲準(zhǔn)用于抗流行性腮腺炎的預(yù)防接種Urabe Am 9和Jeryl-Lynn。但Urabe Am 9在報(bào)道了一例無(wú)法接受的副作用水平[European Journal of Pediatrics(1993)152387]后，于1992年9月被取消。
Jeryl-Lynn病毒株多年來(lái)一直由Merck Sharp and Dohme以“MumpsVax”的商品名售出。它是從一例患流行性腮腺炎的病人身上取得臨床標(biāo)本，經(jīng)雞胚羊膜接種而得的(Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.123(3)(1966))。
Afzal等人最近報(bào)道(J.ofGen.Virology 199374917)，在英國(guó)用作腮腺炎疫苗的Jeryl-Lynn病毒株事實(shí)上是JL-2和JL-5這兩種病毒的混合物。
Takeuchi等人，Virology(1991)181p364-366也報(bào)道說(shuō)，不同的腮腺炎病毒株在SH基因水平上會(huì)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性(substantial)的核苷酸序列變異。
Afzal等人還強(qiáng)調(diào)，目前的“MumpsVax”疫苗商品是在嚴(yán)格控制的條件下制備出的，這些條件包括一個(gè)細(xì)胞庫(kù)(cell bank)，有傳代限度，以及傾向于在不同批的產(chǎn)品之間保持兩種變異體的比例的條件。然而隨著Jeryl-Lynn株的進(jìn)一步傳代，無(wú)法保證能維持上述兩種變異體之間的這種平衡。而且也很難估計(jì)這兩種變異體在任何一批疫苗里的比例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種疫苗，它包括基本上均一(substantially homogenous)的免疫原性Jeryl-Lynn分離株，所述病毒株為減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，它包含如圖1所示的核苷酸序列。該序列編碼HN基因的N末端以及SH基因。這種病毒株在本文中被稱為SBB JL-1。與現(xiàn)有腮腺炎疫苗商品相比，這種分離株在臨床試驗(yàn)中能誘導(dǎo)出更高的零轉(zhuǎn)化，并具有最高的腮腺炎抗體幾何平均滴度。
所謂基本上均一是指，根據(jù)對(duì)圖1所示序列區(qū)段的限定，所述分離株被另一種Jeryl-Lynn分離株污染的程度不超過(guò)10％，優(yōu)選少于5％，更優(yōu)選少于1％。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗包含一個(gè)純系Jeryl-Lynn分離株，即該疫苗未被其它在圖1所示基因區(qū)段中有差異的Jeryl-Lynn腮腺炎病毒分離株污染。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種疫苗，它包含無(wú)JL-2污染的純化SBB JL-1。
這種純化分離株不會(huì)有亞毒株在不同批之間的潛在差異所帶來(lái)的不便，它提供一種更易確保符合一貫質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(consistent quality guideline)。
本發(fā)明的均一(homogenous)Jeryl-Lynn可以如下獲得將MumpsVax商品在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中傳代并篩選純培養(yǎng)物，所述篩選可以是進(jìn)行有限稀釋并檢查所得分離株，或者是進(jìn)行單個(gè)空斑分離。其它合適的細(xì)胞系包括Vero細(xì)胞和MRC5細(xì)胞。這就要求存在能有效檢測(cè)出群體中較小比例的已知病毒變異株的方法。這類檢查方法包括由Chumakov等人提出的針對(duì)減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的Maprec檢測(cè)(WO 92/07958和PNAS 1991，88；199-203)，還有直接對(duì)病毒空斑進(jìn)行測(cè)序和對(duì)病毒空斑進(jìn)行差異雜交。
優(yōu)選本發(fā)明的疫苗還包含其它成分，諸如減毒麻疹病毒，和/或減毒風(fēng)疹病毒，它們的滅活形式或亞單位形式，從而能提供抗麻疹和/或風(fēng)疹感染的保護(hù)作用。三價(jià)的腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹疫苗在本領(lǐng)域已廣為人知，本發(fā)明中的腮腺炎分離株也可以按照與現(xiàn)有那些疫苗相似的方式配制成三價(jià)疫苗。更進(jìn)一步地，或者備選地，本發(fā)明的疫苗可包含減毒水痘-帶狀皰疹活病毒，以提供抗水痘(varicella，chicken pox)或帶狀皰疹(Zoster，shingle)的保護(hù)作用。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，水痘-帶狀皰疹病毒是Andre F E PostgraduateMED J.(1985)61(Suppl.4)，113-120或Veskari T等，Acta paediatr.Scand.801051-1057，1991公開(kāi)的OKa株。優(yōu)選本發(fā)明疫苗是四價(jià)的，能提供抗腮腺炎病毒，風(fēng)疹麻疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒的保護(hù)作用。
本發(fā)明還提供了制備全病毒疫苗的方法，例如在有合適穩(wěn)定劑存在的條件下將病毒凍干，或?qū)⒈景l(fā)明的病毒株與合適的載體或佐劑混合。還優(yōu)選將本發(fā)明病毒株配制在脂質(zhì)體中或是用載體顆粒進(jìn)行配制。更進(jìn)一步地，或者備選地，該配制劑中還可加入免疫刺激物，如3-脫氧?；膯瘟柞ｎ愔珹(3 de-O-acyl monophosphoryl Lipid A，Ribi Immunochem)或是皂素(saponin)衍生物QS21(Cambridge Biotech)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療人類流行性腮腺炎感染的方法，包括給有相應(yīng)需要的病人施用免疫有效劑量的本發(fā)明疫苗。
本發(fā)明疫苗的施用方式，可以是任一種能將免疫保護(hù)量的病毒株和疫苗中其它免疫原性成分運(yùn)送給受試者的合適途徑。但優(yōu)選經(jīng)肌肉或深部皮下途徑的非腸道方式施用所述疫苗。還可以根據(jù)需要采用其它施用方式，如口服或經(jīng)其它非腸胃途徑，即皮內(nèi)、鼻內(nèi)、或靜脈。
此種疫苗的既能提供免疫保護(hù)作用又無(wú)毒的適當(dāng)劑量，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易地測(cè)定出來(lái)，意即，本發(fā)明疫苗中所含有的、既引起免疫保護(hù)又無(wú)毒性的本發(fā)明病毒量，落在傳統(tǒng)全病毒疫苗中的抗原有效量的范圍之內(nèi)。但應(yīng)理解，任何具體病人的具體劑量水平將取決于多種因素，包括年齡，總體健康水平，性別和飲食；用藥的時(shí)間，用藥的途徑；與施用的任何其它藥物的協(xié)同效應(yīng)；以及想要達(dá)到的保護(hù)反應(yīng)程度。當(dāng)然，如果需要的話，可以以適當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)施用。在單價(jià)疫苗中較典型的是每劑至少3.7log TCID50的病毒，而更常用的是每劑4.5log TCID50。在腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹三價(jià)疫苗中，腮腺炎病毒成分將達(dá)到4.8log TCID50左右，以補(bǔ)償其它兩種病素成分的干擾。


圖1顯示了JL-1腮腺炎病毒分離株的SH基因編碼區(qū)以及SH-HN基因間區(qū)段的cDNA序列。
具體實(shí)施例方式
1)對(duì)SH基因進(jìn)行初步測(cè)序在25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)滿的單層Vero細(xì)胞上，用dMEM Biorich培養(yǎng)基(50/50V/V)加0.5％胎牛血清，接種約3.0log TCID50的MumpsVax病毒商品，進(jìn)行傳代。34℃溫育7天，然后收獲受感染的細(xì)胞，用Ferré和Garduno(Nucleic Acids Research 1989，17；2141)的方法提取RNA，置于100mcl水中，用二乙基焦碳酸鹽于100℃處理5分鐘。取5mcl這樣的提取物加入以下試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄40個(gè)單位的RNAsin(Boehringer Mannheim，Germany)，4mcl 5X濃縮的逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(Bethesda Besearch Labs)，2mcl四種脫氧核苷三磷酸的混合物濃度為10mM，10pmole NH2寡核苷酸引物，1mclMoloney鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda Research Labs，每mcl200個(gè)單位)，加水使終體積為20mcl。寡核苷酸NH2與腮腺炎病毒Urabe株的F基因具有同源性。將混合物在37℃溫育45分鐘，然后于95℃加熱5分鐘。以寡核苷酸NH8和NH14作引物將cDNA經(jīng)連續(xù)兩輪PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，用1mcl 1000倍稀釋的第一輪反應(yīng)物作為第二輪反應(yīng)的起始物。每輪PCR由25個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)均是94℃加熱1分鐘，53℃加熱1分鐘，72℃加熱1分鐘。在有氟二脫氧核苷酸終止物的情況下，以NH8或NH14作引物進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物用Applied Biosystems自動(dòng)測(cè)序儀(373ADNA Sequencer)按儀器配有的操作程序和說(shuō)明進(jìn)行分析，從而從兩個(gè)方向?qū)ο鄳?yīng)于SH基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所述序列中，有多個(gè)位置存在不同讀取結(jié)果(ambiguity)，經(jīng)證實(shí)兩條鏈上都是如此。所得序列與Takeuchi等人(Viroloy 1991，181364-366)報(bào)道的Jeryl-Lynn序列相比，在361個(gè)堿基中有17個(gè)不同，其中包括4個(gè)未確定(unassign)堿基。所得基因序列與Afzal等人(J.Gen.Virol.1993，74；917-920)報(bào)道的JL-5分離株的序列相比，319個(gè)堿基中有9個(gè)不同，其中有4個(gè)未確定堿基。另一種情況是，不在Vero細(xì)胞上傳代，而是用超速離心收獲4.0～5.0log TCID50的MumpsVax病毒，再用隨機(jī)引物將這些病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以寡核苷酸NH30bis和NH3 1bis作引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后直接對(duì)相同區(qū)段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果還是會(huì)發(fā)現(xiàn)不同讀取結(jié)果。
2)對(duì)SH基因進(jìn)行克隆用MumpsVax病毒感染Vero細(xì)胞，再按上述方法制備總RNA。該RNA用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用寡核苷酸NH22和NH23作引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(NH22包含Hind III限制位點(diǎn)，NH23包含BamHI限制位點(diǎn)，從而便于對(duì)擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行克隆)。將擴(kuò)增的DNA用HindIII和BamHI這兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割后，克隆到載體pUC9上。最后得到11個(gè)克隆，它們各有一個(gè)相應(yīng)于腮腺炎病毒SH基因區(qū)段的插入子。所有11個(gè)克隆具有與Takeuchi等的(在上述引文中)報(bào)道的序列相對(duì)應(yīng)的序列。此外，有5個(gè)克隆具有DdeI酶切位點(diǎn)，而其它6個(gè)克隆沒(méi)有。未發(fā)現(xiàn)與JL-5序列相應(yīng)的插入子。該結(jié)果，以及測(cè)序得到的不同讀取結(jié)果，都暗示由Afzal等人鑒定出的JL-2變異體是MumpsVax病毒中的一個(gè)重要或容易檢測(cè)的部分。
3)直接從MumpsVax傳代MumpsVax也直接在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上傳代。從包括lot MJ05在內(nèi)5個(gè)不同批次的細(xì)胞的第三代培養(yǎng)中回收病毒，以便制備MJ05A42的凍干樣品用來(lái)注射動(dòng)物。用這5批病毒制備物感染Vero細(xì)胞，回收RNA，按上述方法以NH8和NH14作引物進(jìn)行擴(kuò)增，以備DNA測(cè)序，唯一不同的是用隨機(jī)引物啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。所有5批病毒均顯示出與JL-2(Takeuchi等人)相同的序列，而且沒(méi)有不同讀取結(jié)果。
為了更進(jìn)一步調(diào)查這一點(diǎn)，按上述方法對(duì)病毒空斑進(jìn)行直接測(cè)序。用上述5批病毒感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)物，對(duì)所得空斑進(jìn)行處理以備測(cè)序，其中用到NH30bis和NH31bis作引物。5批中一共測(cè)了26個(gè)空斑，其中13個(gè)空斑給出與Takeuchi等報(bào)道的JL-2序列相同的序列；5個(gè)空斑給出與JL-5非常相似的序列，只有第270和279位的兩個(gè)堿基有差別；8個(gè)空斑的序列有不同讀取結(jié)果，暗示它是病毒混合物。
4)直接對(duì)病毒空斑進(jìn)行測(cè)序MumpsVax的三種稀釋液，估計(jì)每0.50ml等份有100，50和10個(gè)病毒顆粒，用它們感染5cm Petri培養(yǎng)皿中已鋪滿、并棄去培養(yǎng)液的單層Vero細(xì)胞，用不含血清的dMEM Biorich(50∶50 V/V)培養(yǎng)基(Biorich)洗皿。在34℃使病毒吸附30分鐘。用保持在42℃的瓊脂覆蓋細(xì)胞，瓊脂層包括2.5 mldMEM Biorich培養(yǎng)基，0.5％胎牛血清，以及2.5ml 3％(W/V)的低膠化溫度瓊脂糖。固化后，將該瓊脂層用3ml dMEM Biorich培養(yǎng)基(含0.5％胎牛血清)覆蓋，并在34℃溫育。溫育7天后，棄去表面的液體培養(yǎng)基，加0.03％(W/V)中性紅溶液擴(kuò)散1小時(shí)后，就可見(jiàn)到空斑。然后去掉液體和瓊脂，將一張干尼龍膜用手指壓在培養(yǎng)皿的底部。將該膜加數(shù)滴2x SSC浸濕，再提起。將膜在2x SSC中浸泡5分鐘，再在含0.2％(W/V)SDS的2x SSC中浸泡30分鐘，然后在UV光下暴露3至5分鐘，使病毒固定在膜上。從尼龍膜上剪下20個(gè)獨(dú)立的空斑，將這些膜片浸在100mcl水中，加1mcl RNAsin(Boehringer Mannheim，40個(gè)單位)，65℃加熱30分鐘。將100mcl液體轉(zhuǎn)移到新試管里，加10mcl 3M醋酸鈉，再加250mcl乙醇，使核酸沉淀。將混合物于-20℃過(guò)夜或于-70℃放置1小時(shí)，然后離心。沉淀物干燥后，加入以下溶液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄4mcl 5x濃縮的逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(Bethesda ResearchLabs)，2mcl 0.1 M二硫蘇糖醇，1mcl脫氧核苷三磷酸混合物(PerkinElmer-Cetus，10mM濃度)，1mcl N6隨機(jī)引物寡核苷酸(New England Biolabs，濃度100mcg/ml)，11mcl水。然后加1mcl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃溫育1小時(shí)，然后95℃溫育5分鐘。取此混合物10mcl，加寡核苷酸引物NH30bis和NH31bis各500ng，并加PCR緩沖液，和1mcl Stoffel DNA聚合酶(PerkinElmer-Cetus，10μg/100 mcl終體積。將此混合物加熱30個(gè)循環(huán)，每循環(huán)為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。所得片段用Magicprep試劑盒(PromegaBiotech A7170)照其說(shuō)明進(jìn)行純化。用NH30bis或NH31bis作引物，采用氟二脫氧核苷酸終止物進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，在Applied Biosystems(373A)自動(dòng)測(cè)序儀上用廠家提供的方法和反應(yīng)物通過(guò)非放射性方法進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這20個(gè)來(lái)自MumpsVax的空斑中，19個(gè)與Takeuchi等人(上文)報(bào)道的JL-2序列在275個(gè)堿基中有11個(gè)堿基不同，與Afzal等人(上文)報(bào)道的JL-5序列有2個(gè)堿基不同。有1個(gè)空斑給出不同的讀取結(jié)果。該結(jié)果暗示MumpsVax可能包含一或多種在這個(gè)區(qū)段內(nèi)與Afzal等發(fā)現(xiàn)的JL-5優(yōu)勢(shì)株有差異的變異體。JL-5與所測(cè)序的空斑不同的兩個(gè)堿基是在第279和290的位置，位于SH和HN編碼區(qū)之間的基因間區(qū)段中。
5)空斑雜交為了嘗試更直接地測(cè)定MumpsVax及其衍生培養(yǎng)物中JL-5和JL-2型變異體的比例，采用了一種空斑雜交方法。以MumpsVax病毒和傳代的MJ05病毒感染Vero細(xì)胞單層，得到空斑，印到尼龍膜上，按前述方法固定核酸。尼龍膜先在200ml下述溶液中于65℃預(yù)雜交3小時(shí)5x SSC(SSC是0.15M氯化鈉0.01M檸檬酸鈉pH 7.2)，10x濃縮的Denhardts溶液(它是0.2％W/VFicoll 400，0.2％小牛血清，0.2％聚氯乙烯，0.1％(W/V)SDS，50mcg/ml鮭精DNA。然后在50ml溶液中于65℃輕微振蕩2.5小時(shí)，以便進(jìn)行雜交，所用的溶液具有與前述溶液相同的成分、已預(yù)熱至65℃、還加入了放射性探針和冷的競(jìng)爭(zhēng)探針溶液。用作變異體特異性探針的寡核苷酸是BC 252(能與JL-5變異體雜交)和BC 253(能與JL-2變異體雜交)。它們都要在包含下列成分的溶液中激活(kination)而標(biāo)記為γ32P-ATP100ng待標(biāo)記的寡核苷酸，3mcl 10x濃縮的激酶緩沖液(包括0.5M Tris-HCl pH7.6，0.1M MgCl2，50mM二硫蘇糖醇，1mM亞精胺和1mM EDTA pH8.0)，3mcl32P-ATP(Amersham International，3000Ci/nmole，10mCi/mcl)和2mcl T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)，用無(wú)菌水補(bǔ)足30mcl。將此混合溶液于37℃溫育30分鐘后，在95℃加熱5分鐘終止反應(yīng)，然后加入重量比為100∶1的冷的競(jìng)爭(zhēng)寡核苷酸探針，即每100ng標(biāo)記探針要加10mcg冷競(jìng)爭(zhēng)寡核苷酸，然后將混合物加入雜交溶液中。雜交后，將膜在100ml與雜交溶液成分相同的溶液中于65℃30分鐘洗滌一次，再在100ml下述溶液中65℃洗2個(gè)30分鐘SSC 5x，0.1％SDS。然后使膜干燥，并用增感屏使膜在X-射線膠片上曝光。當(dāng)MumpsVax用這種技術(shù)檢測(cè)時(shí)，與JL-5變異體特異性BC 252寡核苷酸雜交的空斑大大多于與BC 253雜交的空斑。當(dāng)檢查MJ05時(shí)，雖然與兩種探針雜交的空斑數(shù)基本相等，但與BC253雜交的空斑要比與BC252雜交的空斑相對(duì)多一點(diǎn)。
6)對(duì)純Jeryl-Lynn分離株進(jìn)行純化為獲得純的JL-5和JL-2變異體分離株，對(duì)一份標(biāo)明滴度為4-6logTCID50感染單位的商品化MumpsVax(批號(hào)92A06，來(lái)自Merck Sharp andDohme，存放在Public Heath Laboratory Services，Porton Down，Wiltshire，UK，登記號(hào)為Jeryl-Lynn Mumps strainV93110585，1993年11月5日)樣品進(jìn)行有限稀釋，然后在96孔微滴板上以約每孔0.1感染單位的接種量感染雞胚成纖維細(xì)胞。將這些板在34℃溫育11天以使病毒增殖。全部192個(gè)接種孔中有17孔出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，說(shuō)明有病毒生長(zhǎng)。將這些孔接種到另一批CEF細(xì)胞培養(yǎng)物中。使滴度約4.9 log TCID50的第二次傳代物濾過(guò)0.8μm濾膜，并以42,000rpm離心1小時(shí)，將病毒沉淀用100mcl H2O重新懸浮，以此來(lái)確定所分離的病毒的特性(identity)。加入1mcl RNase抑制劑(BoehringerMannheim，40單位/mcl)，65℃溫育30分鐘，再加1/10體積的3M醋酸鈉(pH4.5)，然后加2.5倍體積的乙醇。-20℃沉淀過(guò)夜或-70℃沉淀1小時(shí)，然后在Eppendorf臺(tái)式(bench-up)離心機(jī)中4℃離心30分鐘，并將沉淀干燥。
對(duì)所得病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，方法是向所述沉淀中加入20mcl下述混合物4mcl 5x核心RT緩沖液(Bethesda Research Labs)，2mcl 10nM脫氧核苷三磷酸混合物(Perkin Elmer，Cetus)，1mcl隨機(jī)引物N6(Biolabs，100mcg/ml)，11mcl H2O，1mcl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethsda Research Labs)。37℃溫育1小時(shí)后，95℃經(jīng)歷5分鐘以抑制逆轉(zhuǎn)錄酶。取加熱后的混合物10mcl，在終體積100mcl中，用引物NH30bis和NH31bis，按以下程序，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。所得片段用Magic Prep(Promega)按廠家提供的實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行純化。
將6個(gè)僅與JL-5探針?lè)磻?yīng)的分離株接種到Vero細(xì)胞中，獲得空斑。再轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，使這些膜與BC 252和BC253寡核苷酸雜交，所述兩種寡核苷酸都已如前述通過(guò)激活作用帶上32P標(biāo)記。雜交是在5x SSC中，用約100ng帶標(biāo)記的寡核苷酸和10mcg冷的競(jìng)爭(zhēng)寡核苷酸，在終體積50ml中，于65℃進(jìn)行2.5小時(shí)。每種分離株測(cè)試了大約200個(gè)空斑，無(wú)一與JL-2探針(寡核苷酸BC253)反應(yīng)。所有空斑全都與BC 252反應(yīng)。
有一株病毒分離株，源自微滴板上的9H2A孔，后進(jìn)一步鑒定為SBB株JL-1，將它在CEF細(xì)胞上再傳兩代。末次傳代(從最初的MumpsVax材料算起一共傳了四代)后，用該病毒感染Vero細(xì)胞，得到空斑，轉(zhuǎn)印至尼龍膜上，通過(guò)與經(jīng)激活作用而帶上32P標(biāo)記的寡核苷酸BC 252和BC253雜交來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)。用JL-2特異性探針BC253檢測(cè)了2000多個(gè)空斑，沒(méi)有一個(gè)與該探針?lè)磻?yīng)。用寡核苷酸BC 252測(cè)試了較少數(shù)量的空斑，所有均呈陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)CEF細(xì)胞上第四代傳代物中獲得的JL-1株的病毒集合物進(jìn)行直接測(cè)序，方法是將病毒離心，用乙醇沉淀，然后用隨機(jī)引物按前述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，采用寡核苷酸NH14和BC265作引物，按下列程序擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。所得DNA片段在Magic Prep柱(Promega Biotech)上按廠家的說(shuō)明進(jìn)行純化，在Applied Biosystems 373A自動(dòng)測(cè)序儀上依廠家說(shuō)明并使用NH14，BC265，NH30bis和NH31bis作引物進(jìn)行測(cè)序。于是得到如圖1所示的序列。令人意外的是，這個(gè)序列與Afzal等得到的JL-5分離株的序列在SH和HN基因編碼區(qū)之間的基因間區(qū)段有6個(gè)位點(diǎn)不同。
第二個(gè)鑒定為10H5F并且僅與JL-5探針?lè)磻?yīng)的病毒分離株也進(jìn)行了測(cè)序，方法是用第二代病毒感染Vero細(xì)胞，將空斑轉(zhuǎn)至尼龍膜上，用NH14和BC265寡核苷酸作引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后測(cè)序。如此得到一個(gè)序列，它與上述9H2A的序列相同，但與已公開(kāi)的JL-5分離株序列在SH-HN基因間區(qū)段中有6個(gè)堿基不同。
7)免疫原性用猴測(cè)試實(shí)施例6所得JL-1株的免疫原性。將一種名為MJ11A42的JL-1病毒凍干制品(MumpsVax的第四代傳代物，是在CEF細(xì)胞上于34℃生長(zhǎng)6天后獲得的)，以4.2log TCID50的劑量通過(guò)皮下注射方式免疫一組4只非洲綠猴。另三組的每組4只猴子注射以下物質(zhì)(a)濃度為4.3log TCID50的MumpsVax；(b)凍干制品MJ21A42，濃度為每劑4.3log TCID50，是經(jīng)32℃生長(zhǎng)9天后收獲到的，衍生自MumpsVax在CEF細(xì)胞中的直接傳三代，(c)凍干制品MJ05A42，濃度為每劑4.3 TCID50，是在CEF細(xì)胞中在34℃生長(zhǎng)7天后收獲的病毒，衍生自MumpsVax的三次直接傳代，這三代不同于MJ21A42制品的傳代物。
注射前(第0天)，以及預(yù)防接種后的第28和42天分別抽取血標(biāo)本，用Behring的商品化Enzygnost Anti-Parotitis Virus試劑盒(Behringwerke AG，Marburg，Germany)，按照廠家建議測(cè)試血標(biāo)本中抗腮腺炎病毒的IgG抗體的存在。如表1所示，從純JL-1病毒株衍生的制品在所述動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出比包括MumpsVax在內(nèi)的其它制品更高的抗腮腺炎病毒抗體滴度。另外，將這些血清進(jìn)行兩倍系列稀釋，用MumpsVax作測(cè)試病毒，在空斑減少(reduction)試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。那些注射了MJ11A42的動(dòng)物的血清比其它血清產(chǎn)生的空斑數(shù)減少。
8)臨床研究進(jìn)一步在臨床試驗(yàn)中，用大約15個(gè)月大的血清陰性兒童，測(cè)試JL-1病毒株。使用純的JL-1株作為腮腺炎成分，或使用MumpsVax如實(shí)施例6所述在CEF細(xì)胞上直接傳代而得到的病毒，配制麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹三價(jià)疫苗，并冷凍干燥。試驗(yàn)中還使用了M-M-RII疫苗商品，它由Merck and CoInc生產(chǎn)，可從Merck Frossr Inc Kirkland，Quebec，Canada得到；它含有Jeryl-Lynn(B-水平)株作為腮腺炎成分。
這三種疫苗制品中腮腺炎病毒的滴度經(jīng)測(cè)定為批號(hào)為MJR111D42(含純JL-1株)的疫苗為每劑4.5log TCID，批號(hào)為MJR121C42(含傳代的MumpsVax病毒)的疫苗為每劑4.7logTCID，批號(hào)為80391OU的商品化M-M-RII疫苗為每劑4.5logTCID。
接種前和接種后第42天抽取受試兒童的血標(biāo)本。
抗腮腺炎病毒的IgG抗體的存在，用實(shí)施例6所述商品化試劑盒進(jìn)行測(cè)試。如表3所示，三種制品中，純JL-1株MMR疫苗誘導(dǎo)出最高的血清轉(zhuǎn)換率和最高的幾何平均滴度。
表1

表2

表3血清抗體反應(yīng)陰性的受試者對(duì)腮腺炎病毒的血清轉(zhuǎn)換和幾何平均滴度(GMT)

生物材料保藏的說(shuō)明以下生物材料保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心。

序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Smithkline Beecham Biologicals sa(ii)發(fā)明題目疫苗(iii)序列數(shù)目13(iv)通訊地址(A)收信人 Smithkline BeechamCorporate Intellectual Property(B)街道SB House L/5 Great West Road(C)城市Brentford(D)州Middlesex(E)國(guó)家United Kingdom(F)郵編TW8 9BD(v)計(jì)算機(jī)的可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(viii)代理/代理人資料(A)姓名Dalton，Marcus JW(ix)電訊資料(A)電話44 181 975 4093(B)傳真44 181 975 3688(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度393bp
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否(iv)反義否(vi)來(lái)源(A)生物體腮腺炎病毒(B)株系Jeryl lynn-1(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO1TGAATCTCCT AGGGTCGTAA CGTCTCGTGA CCCTGCCGTC GCACTATGCC GGCAATCCAA 60CCTCCCTTAT ACCTAACATT TCTAGTGCTA ATCCTTCTCT ATCTCATCAT AACCCTGTAT120GTCTGGACTA TATTGACTAT TAACTATAAG ACGGCGGTGC GATATGCAGC ACTGTACCAG180CGATCCTTCT CTCGCTGGGG TTTTGATCAC TCACTCTAGA AAGATCCCCA ATTAGGACAA240GTCCCGATCC GTCACGCTAG AACAAGCTGC ATTCAAATGA AGCTGTGCTA CCATGAGACA300TAAAGAAAAA AGCAAGCCAG AACAAACCTA GGATCATAAC ACAATACAGA ATATTAGCTG360CTATCACAAC TGTGTTCCGG CCACTAAGAA AAT 393(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否
(iv)反義否(vi)來(lái)源(A)生物體nh2(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO2GTAGCACTGG ATGGA 15(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體NH8(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO3TCTGTGTTGT ATTGTGATCC 20(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vi)來(lái)源(A)生物體NH14(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO4
GTCGATGATC TCATCAGGTAC21(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vi)來(lái)源(A)生物體NH22(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO5CGGTAGAAGC TTGTCGATGA TCTCATCAGG TAC33(2) SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體NH23(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO6CGCTGAGGAT CCTCTGTGTT GTATTGTGAT CC 32(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18bp
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體NH30(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO7ATCTCCTAGG GTCGTAAC 18(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體NH31(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO8TTTGGATGCA GCTTGTTC 18(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源
(A)生物體NH 30 BIS(xi)序列描述SEQ ID NO9AATCTCCTAG GGTCGTAACG TCTCGTGA 28(2)SEQID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體NH 31 BIS(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO10TTTGAATGCA GCTTGTTCTA GCGT24(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體BC265(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO11CCGACATTAT GAATAGTTTC GAGGGCTCC 29
(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體bc252(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO12ATATCGCACC GCCGTCTTAT AGTTAATAGT C 31(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物體BC253(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO13ATACCGAACC GCCGTATTAT GGTTAATGGT C 32

關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
權(quán)利要求
1.一種減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，其特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含圖1所示的核酸序列。
2.減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株在制備疫苗中的用途，其中所述減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株的特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含圖1所示的核酸序列。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述的減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株是免疫原性基本上均一的Jeryl-Lynn分離株。
4.權(quán)利要求2或3的用途，其中所述的疫苗是腮腺炎疫苗。
5.權(quán)利要求2或3的用途，其中所述的疫苗是聯(lián)合疫苗，該聯(lián)合疫苗還含有一種或多種減毒麻疹病毒、或減毒風(fēng)疹病毒或滅活的麻疹或風(fēng)疹病毒，或是這些病毒的亞單位。
6.如權(quán)利要求2-5之一所述的疫苗，另外還含有一種藥劑以提供抗水痘或帶狀痘疹感染的保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種新的流行性腮腺炎疫苗，它包括從腮腺炎病毒的Jeryl－Lynn株衍生來(lái)的一種均一純化分離株。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中這種疫苗產(chǎn)生的血清轉(zhuǎn)化率和抗體滴度都比已知的商品化疫苗要高。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101092609SQ20071010326
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期1994年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月19日
發(fā)明者奈杰爾·M·哈福德, 布里格特·D·A·科勞, 讓·迪德萊茲 申請(qǐng)人:葛蘭素史密斯克萊生物公司