專利名稱：一類免疫佐劑及其在抗病毒疫苗或藥物制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地講，涉及一類人或動(dòng)物熱休克蛋白gp96和hsp108(均屬HSP90家族)或hsp70全長(zhǎng)分子或其氨基端片段作為一類新的免疫佐劑，提高抗原免疫活性。病毒表位肽、共價(jià)連接的多表位重組體或蛋白抗原與上述熱休克蛋白全長(zhǎng)分子或其氨基端片段混合或共價(jià)或非共價(jià)連接使用，該佐劑可數(shù)十倍的提高抗原免疫活性，達(dá)到清除病毒、治療疾病的目。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)又稱應(yīng)激蛋白，是一類在生物進(jìn)化中高度保守，并且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。根據(jù)其分子量大小和結(jié)構(gòu)主要分成HSP90、HSP70等近十個(gè)家族。Gp96是HSP90家族中的重要成員，在正常組織和腫瘤組織中均有廣泛表達(dá)，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(Endoplasmic reticulum，ER)上，是ER中最豐富的蛋白質(zhì)之一。一般認(rèn)為gp96是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，但研究證實(shí)gp96在某些小鼠腫瘤細(xì)胞表面也有表達(dá)，且表達(dá)量隨腫瘤免疫原性增強(qiáng)而增加。細(xì)胞表面gp96的表達(dá)在種系發(fā)生上具有保守性，并不僅限于某些哺乳動(dòng)物腫瘤，在脊椎動(dòng)物的一些免疫細(xì)胞上也有選擇性表達(dá)。Gp96作為分子伴侶，可結(jié)合未折疊的多肽鏈，阻止蛋白質(zhì)聚集，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、伸展、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)的分泌。在正常情況下gp96在細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，但熱休克、重金屬中毒、葡萄糖缺乏、細(xì)菌和病毒感染等應(yīng)激條件以及細(xì)胞分化等可誘導(dǎo)其表達(dá)增加。干擾素-α(IFN-α)和干擾素-γ(IFN-γ)也可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)gp96的表達(dá)。
應(yīng)用gp96多肽復(fù)合物疫苗可以自體治療腫瘤。Antigenics公司開(kāi)發(fā)的黑色素瘤自體治療已做完三期臨床。然而自體疫苗不能廣泛應(yīng)用于不同個(gè)體，而且往往攜帶多價(jià)抗原，不利于進(jìn)行有針對(duì)性的特異抗原的免疫治療。目前臨床應(yīng)用的免疫佐劑多為鋁制劑，由于其佐劑效果不穩(wěn)定，不能增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)等缺點(diǎn)而使其應(yīng)用受限。我們的研究結(jié)果顯示gp96、hsp108或hsp70全長(zhǎng)分子及其N端可以作為免疫佐劑，增強(qiáng)肽特異的CTL反應(yīng)或蛋白特異的抗體的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有佐劑的不足，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一類人或動(dòng)物的具有免疫增強(qiáng)活性一類新型佐劑，其特征在于是由gp96、hsp108或hsp70的N端重組片段組成的蛋白。此類免疫佐劑與相應(yīng)的抗原結(jié)合形成免疫刺激物，提高機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明是我們前期工作“乙肝病毒抗原多肽與熱休克蛋白的復(fù)合物及其應(yīng)用”(專利號(hào)ZL 01 1 04060.2；證書號(hào)第109175號(hào))的新進(jìn)展。 由 于 gp96(NM_003299，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝4507676)hsp70(NM_005345http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝26787973)和hsp108(AF387865，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝14579648)全長(zhǎng)DNA克隆表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，難于作為疫苗或藥物之用。我們對(duì)gp96、hsp70和hsp108的氨基端，即N-端片段重組DNA的詳細(xì)研究證明N-端表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定并具有免疫佐劑活性。
本發(fā)明提供的免疫佐劑包括Hgp96，Hhsp70，Chsp108的N-端重組片段，如人Hgp96N-端片斷如序列表1No.2所示的具有267個(gè)氨基酸的序列的蛋白、序列表1No.4所示的具有315個(gè)氨基酸的序列的蛋白、序列表1No.6所示的具有333個(gè)氨基酸的序列的蛋白及序列表1No.8所示的具有349個(gè)氨基酸的序列組成的蛋白；人hsp70(Hhsp70)N-端片斷具有如序列表2No.2所示的由202個(gè)氨基酸序列組成的蛋白；雞hsp108(Chsp108)N-端片斷具有如序列表3No.2所示的由335個(gè)氨基酸序列組成的蛋白；還包括由于其基因的缺失、插入和突變產(chǎn)生的與上述所述Hgp96、Chsp108和Hhsp70N-端各片段的氨基酸序列至少有60％同源性的，并且具有相同功能的衍生蛋白。本發(fā)明以小鼠為動(dòng)物模型，對(duì)乙肝病毒HBV表位肽STLPETTVVRR，F(xiàn)LPSDFFPSV，IPIPSSWAF，WLSLLVPFV、FLLSLGIHL；HCV的表位肽YLLPPRGPRL、GFADLMGYIPL；HIV-1的表位肽SILDIRQGPK、CQGVGGPGHK；SARS-CoV的表位肽LLLDRLNQL、VVFLHVTYV；FMDV的表位肽IKRAETYCPR、HKQKIVAPEK進(jìn)行了研究，得到相同結(jié)論，本發(fā)明提供的免疫佐劑可以促進(jìn)HBV、HCV、HIV-1、SARS-CoV、FMDV等病毒表位特異性的CTL反應(yīng)，提高機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答。其中一個(gè)實(shí)例是采用乙肝病毒(HBV)等病毒鼠源Kd限制性的表位肽，其HBV特異9肽與gp96N末端片段gp96N22-355混合物免疫小鼠，刺激增強(qiáng)小鼠特異CTL的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的免疫佐劑與乙肝病毒的表面抗原HBsAg復(fù)合物免疫小鼠，可以顯著的增強(qiáng)HBsAg抗體產(chǎn)生滴度。
本發(fā)明所提供的免疫佐劑可以增強(qiáng)表位肽，共價(jià)連接的多表位重組體以及蛋白性抗原產(chǎn)生的CTL水平和抗體水平。病毒表位肽、共價(jià)連接的多表位重組體或蛋白抗原與上述熱休克蛋白全長(zhǎng)分子或其氨基端片段混合或共價(jià)連接使用，作為乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、SARS冠狀病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞馬立克氏病毒等病毒的抗原佐劑或抗原載體可數(shù)十倍的提高抗原免疫活性，達(dá)到清除病毒、治療疾病的目的。所以，本發(fā)明所提供的免疫佐劑可以應(yīng)用于疫苗或藥物的制備。
本發(fā)明提供的免疫佐劑可以與抗原物質(zhì)直接混合、非共價(jià)連接或共價(jià)連接等方式，采用皮內(nèi)注射或皮下注射或腹腔注射等方式進(jìn)行免疫。免疫劑量為0.10μmol或100μmol。


圖1.用ELISPOT技術(shù)測(cè)定HBV 9肽與鼠gp96-N端片段免疫活性為例。
圖2.用Tetramer技術(shù)測(cè)定以HBV 9肽與鼠gp96-N端片段免疫活性為例。
圖351Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定HBV 9肽與鼠gp96-N端片段免疫活性為例。
圖4用ELISA技術(shù)測(cè)定以HBV表面抗原與鼠gp96-N端片段免疫活性為例。
圖5用ELISPOT技術(shù)測(cè)定以HBV表面抗原與鼠gp96-N端片段免疫活性為例。
圖6經(jīng)Hgp96N端誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞。
圖7.Hgp96的N22-336促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，表現(xiàn)為CD40增加(A下)，CD80增加(B下)，CD83出現(xiàn)陽(yáng)性(C下)，CD86表達(dá)增加(D下)。
圖8.Hgp96N22-336促進(jìn)HLA-2限制型的T淋巴細(xì)胞對(duì)核心抗原18-27表位的特異擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式
為了更好的理解本發(fā)明，以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步的進(jìn)行描述，但是，本實(shí)施例并非是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例一本實(shí)施例以小鼠為動(dòng)物模型，對(duì)HBV、HCV、HIV-1、SARS-CoV、FMDV進(jìn)行了研究，得到相同結(jié)論，現(xiàn)以HBV為例1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠gp96-N22-355基因片段的克隆pET-30a質(zhì)粒(來(lái)自novagen)，實(shí)驗(yàn)室保存的鼠pET-30a-gp96(gp96見(jiàn)專利號(hào)ZL 01 1 04060.2)。質(zhì)粒中克隆N端基因。所用引物為引物15′CCGGATCCGAACTTGATGTGGATGGTACA 3′引物25′CCGAGCTCCCAAATGGTGAGAGTATAATTTAC 3′PCR反應(yīng)條件如下94℃4分鐘；94℃50秒，55℃50秒，72℃3分鐘，共30循環(huán)；72℃5分鐘。結(jié)果證明與已知序列相同。
PCR產(chǎn)物為約1Kd的片段，片段的5′端和3′端人為引入BamHI和SacI二個(gè)酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。其序列與已知序列相同。
2.鼠gp96-N22-355片段在大腸桿菌中的表達(dá)與蛋白純化將擴(kuò)增片段經(jīng)BamHI與SacI酶切后連接到表達(dá)載體pGEX6p-1(invitrogen公司)中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(BL21購(gòu)自Invitrogen Cat.No.C6000-03)。經(jīng)1mM異丙基-P-P-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4小時(shí)后得到表達(dá)產(chǎn)物，以10％十二烷(基)硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物分子量為45Kda，與理論值一致。
將gp96-N22-355蛋白用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)層析柱(Pharmacia公司)，經(jīng)親和層析和分子篩superdex G200(PE公司)進(jìn)行純化，以10％SDS-PAGE電泳和銀染鑒定純度，得到大于95％純度的N端蛋白。表達(dá)的蛋白產(chǎn)物用gp96單克隆抗體(NeoMarkers公司)進(jìn)行Western鑒定，獲得陽(yáng)性結(jié)果。
3.gp96-N22-355片段與人工合成的多肽、多表位重組體和蛋白抗原免疫小鼠試驗(yàn)選用生長(zhǎng)6-8周的雌性BALB/cJ小鼠(MHC為H-2dKd)為本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
免疫方式采用將樣品溶于100μl的PBS中頸背皮下注射?？乖钸m免疫劑量為10μg。免疫程序?yàn)榈谝淮蚊庖咭恢芎筮M(jìn)行第二次免疫，效果優(yōu)于免疫一次。采用皮下注射，將gp96-N22-355片段蛋白與Kd限制型抗原混合物溶于緩沖液(90％PBS，10％DMSO/0.1％TFA)中，每支小鼠免疫劑量分別為0.2nmol，2nmol和20nmol，將抗原與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠。gp96-N22-355蛋白與Kd限制型抗原復(fù)合物免疫劑量0.1nmol，采用頸背皮下注射，第一次免疫一周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，7天后進(jìn)行CTL分析。每一處理使用10只小鼠。
4.用ELISPOT方法測(cè)定小鼠多肽CTL小鼠免疫7天后從每只小鼠收獲得約3×107脾細(xì)胞應(yīng)用ELISPOT技術(shù)測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌γ干擾素的分泌水平。將包被抗γ干擾素抗體的96孔板用脫脂奶粉封閉后，加入待測(cè)脾細(xì)胞。用多肽抗原刺激18到40小時(shí)后，棄去上清加入抗γ干擾素的二抗，37度孵育1到2小時(shí)后，加入連接有鏈親和素的堿性磷酸酶，37度孵育1小時(shí)后，加入顯色底物五溴-四氯-三吲哚磷酸酯/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)。20分鐘后蒸餾水終止顯色。計(jì)數(shù)可分泌γ干擾素的細(xì)胞。單獨(dú)應(yīng)用gp96-N22-355和抗原免疫的小鼠不產(chǎn)生抗原特異的可分泌γ干擾素的CTL細(xì)胞，而應(yīng)用gp96-N22-355和抗原混合物免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異的可分泌γ干擾素的CTL細(xì)胞，并且CTL細(xì)胞數(shù)量隨著免疫劑量的增加而增多(圖1)。說(shuō)明gp96-N22-355對(duì)抗原的免疫原性有明顯的增強(qiáng)作用。
5.Tetramer方法測(cè)定抗原對(duì)小鼠的CTL小鼠免疫7天后從每只小鼠收獲得約3×107脾細(xì)胞，應(yīng)用Tetramer技術(shù)測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞表達(dá)抗原特異T細(xì)胞受體的水平。將多肽抗原與MHC重鏈和輕鏈在體外一起復(fù)性合成Kd9肽特異的四聚體復(fù)合物(Tetramer)。收集脾細(xì)胞，加入tetramer于37度孵育20分鐘，再加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD8抗體和PE-cy5標(biāo)記的抗CD3抗體。在流式細(xì)胞儀上分析Tetramer，CD8，CD3，均是陽(yáng)性的細(xì)胞。單獨(dú)應(yīng)用gp96-N22-355或抗原免疫的小鼠不產(chǎn)生抗原特異的可以被抗原Tetramer染色的CTL細(xì)胞，而應(yīng)用gp96-N22-355和多肽混合物免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異的被多肽抗原Tetramer染色的CTL細(xì)胞，并且CTL細(xì)胞數(shù)量隨著免疫劑量的增加而增多(圖2)。說(shuō)明gp96-N22-355對(duì)多肽的免疫原性有明顯的增強(qiáng)作用。
6.用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠多肽CTL小鼠免疫7天后，從每只小鼠收獲得約3×107脾細(xì)胞應(yīng)用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞體外殺傷靶細(xì)胞的功能。脾細(xì)胞懸于含有10mMHEPES緩沖液、5×10-5M巰基乙醇，抗生素和10％(V/V)胎牛血清(FCS)培養(yǎng)液中，6天后收集脾細(xì)胞進(jìn)行4小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)(具體方法見(jiàn)Kuhrober，A，et al.1997.International Immunology，9(8)1203-1212)測(cè)定細(xì)胞毒性活性。靶細(xì)胞用10μg/ml抗原于37℃致敏30分鐘后加入不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞，反應(yīng)體系為100μl的完全培養(yǎng)基。37℃共培養(yǎng)4小時(shí)后收集上清測(cè)定特異裂解率。單獨(dú)應(yīng)用gp96-N22-355和多肽免疫的小鼠不產(chǎn)生抗原特異的可殺傷靶細(xì)胞的CTL細(xì)胞，而應(yīng)用gp96-N22-355和抗原混合物免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異的可以殺傷靶細(xì)胞的CTL細(xì)胞，并且CTL細(xì)胞數(shù)量隨著免疫劑量的增加而增多(圖3)。說(shuō)明gp96-N22-355對(duì)抗原的免疫原性有明顯的增強(qiáng)作用。
7.gp96-N22-355片段與HBV表面抗原免疫小鼠選用生長(zhǎng)6-8周的雌性BALB/cJ小鼠(MHC為H-2dKd)為本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
免疫方式采用將樣品溶于100 1的磷酸緩沖液(PBS)中頸背皮下注射。蛋白最適免疫劑量為10μg。免疫程序?yàn)榈谝淮蚊庖咭恢芎筮M(jìn)行第二次免疫，效果優(yōu)于免疫一次。采用皮下注射，將gp96-N22-355片段與上述病毒表面抗原結(jié)合物溶于緩沖液(90％PBS，10％二甲基亞砜/0.1％TFA)中，每支小鼠免疫劑量分別為10μg。每次免疫后15天取血，測(cè)定抗表面抗原的抗體并進(jìn)行CTL分析。單獨(dú)應(yīng)用gp96-N22-355免疫的小鼠不產(chǎn)生抗原特異的抗體，而應(yīng)用gp96-N22-355和HBV、AIV?；騈DV表面抗原結(jié)合物免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異的抗體，其抗體量為單獨(dú)應(yīng)用表面抗原產(chǎn)生抗體的10倍(圖4)。殺傷靶細(xì)胞的CTL細(xì)胞也有相應(yīng)增加，而且CTL細(xì)胞數(shù)量隨著免疫劑量的增加而增多。說(shuō)明gp96-N22-355對(duì)病毒抗原的免疫原性有明顯的增強(qiáng)作用。單獨(dú)應(yīng)用gp96-N22-355免疫的小鼠不產(chǎn)生抗原特異的可以殺傷靶細(xì)胞的CTL細(xì)胞，而應(yīng)用gp96-N22-355和病毒表面抗原結(jié)合物免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異的CTL為單獨(dú)應(yīng)用表面抗原產(chǎn)生CTL的5倍(圖5)。說(shuō)明gp96-N22-355對(duì)蛋白抗原的免疫原性有明顯的增強(qiáng)作用。
本實(shí)驗(yàn)室首次重組表達(dá)了人熱休克蛋白gp96N端的22-288，22-336，22-355，22-370及hsp70 N端的161-362。利用提取和重組的熱休克蛋白刺激體外由外周血分化誘導(dǎo)來(lái)的非成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)gp96的重組片段可以誘導(dǎo)非成熟DC細(xì)胞的成熟，使共刺激分子CD80，CD86表達(dá)提高，使標(biāo)志性的細(xì)胞表面分子CD83由陰性變?yōu)殛?yáng)性，使得DC細(xì)胞呈遞加工抗原的能力增強(qiáng)。用人熱休克蛋白gp96及其重組片段分別與HBV、HCV、HIV-l或SARS-CoV乙肝病毒的核心表位聯(lián)合刺激抗原呈遞細(xì)胞，然后與健康人外周血來(lái)源的 T淋巴細(xì)胞混合，可以體外誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒肽特異性的CTL細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)生的CTL細(xì)胞可以特異性的殺傷帶有對(duì)應(yīng)表位的靶細(xì)胞。
實(shí)施例二在細(xì)胞水平上以在抗原呈遞過(guò)程中起重要作用的人DC細(xì)胞為材料，研究熱休克蛋白Hgp96及Hhsp70不同片段對(duì)DC細(xì)胞活化的影響。對(duì)HBV、HCV、HIV-1、SARS-CoV、FMDV進(jìn)行了研究，得到相同結(jié)論，以HBV為例8.從人肝組織中純化Hgp96全長(zhǎng)蛋白將50g車禍死亡的正常人肝組織勻漿后離心，用50％-70％的(NH4)2SO4沉淀，沉淀溶解后采用ConA Sepharose(Pharmacia公司)進(jìn)行親和層析，結(jié)合的蛋白用10％的α-甲基葡萄糖苷洗脫，洗脫液上POROS20QE(PE公司BioCAD灌注層析系統(tǒng))進(jìn)行陰離子層析，經(jīng)過(guò)這三步純化獲得＞95％純度的Hgp96蛋白。Hgp96蛋白用gp96/grp94單克隆抗體(NeoMarkers公司)進(jìn)行Western blot鑒定。其純度用SDS-PAGE、銀染和反相高效液相色譜(HPLC)鑒定。
9.Hgp96 N端和Hhsp70 N端重組片段的基因克隆和重組表達(dá)設(shè)計(jì)引物，從pET-30a-Hgp96質(zhì)粒中克隆N端基因。所設(shè)計(jì)的引物和反應(yīng)條件為Hgp96 N端22-288(DNA序列具有如表序列1No.1所示的801個(gè)核苷酸的序列、其所編碼的蛋白具有如序列表1No.2所示的267個(gè)氨基酸的序列。)引物1CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG引物2GCCTCGAGTCAAGTTTCAGTCTTGCTGCTHgp96 N端22-336(DNA序列具有如表序列1No.3所示的945個(gè)核苷酸的序列、其所編碼的蛋白具有如序列表1No.4所示的315個(gè)氨基酸的序列)引物1CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG
引物2GCACTCGAGTCACATAAGTTCCCAGTCCCAHgp96N端22-355(DNA序列具有如表序列1No.5所示的999個(gè)核苷酸的序列、其所編碼的蛋白具有如序列表1No.6所示的333個(gè)氨基酸的序列。)引物1CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG引物2GCACTCGAGTCATTCATCTTCTTCTACTTCHgp96 N端22-370(DNA序列具有如表序列1No.7所示的1047個(gè)核苷酸的序列、其所編碼的蛋白具有如序列表1No.8所示的349個(gè)氨基酸的序列。)引物1CTGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGATG引物2GGTCTCGAGTCACATGGGGTCATCACTTTCHhsp70 N端161-362(DNA序列具有如表序列2No.1所示的606個(gè)核苷酸的序列、其所編碼的蛋白具有如序列表2No.2所示的202個(gè)氨基酸的序列。)引物1CTGGATCC GCGGGTGTGATCGCGGGGCT引物2GGTCTCGAGTCAGCTCTTTGCACCTTGGPCR反應(yīng)條件如下94℃變性1分鐘；56℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30循環(huán)；72℃末次延伸15分鐘。
PCR產(chǎn)物分別約為800-1000bp的片段，片段的5′端和3′端人為引入二個(gè)酶切位點(diǎn)BamHI和XholI。
將擴(kuò)增片段經(jīng)BamHI與XholI酶切后連接到表達(dá)載體pGEX-6p1(invitrogen公司)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后產(chǎn)物表達(dá)，以10％SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物分子量分別為30Kda，36Kda，38Kda，40Kda與理論值一致。
將Hgp96 N端重組蛋白過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖(Glutathione Sepharose)4B親和層析柱(Pharmacia公司)進(jìn)行親和層析，然后用superdex 200進(jìn)行分子篩層析。SDS-PAGE電泳鑒定純度，得到大于95％純度的Hgp96N端重組蛋白。表達(dá)的Hgp96蛋白產(chǎn)物用gp96/grp94單克隆抗體(NeoMarkers公司)和GST抗體進(jìn)行Western blot鑒定，證明得到產(chǎn)物為Hgp96的一部分。
10.Hgp96刺激抗原呈遞細(xì)胞的活化將純化的Hgp96蛋白與多粘菌素(polymyxin B sulfate)(sigma)10ug/ml混合，室溫放置1小時(shí)，或者將純化的Hgp96過(guò)detoxi柱(Pierce)柱，除去內(nèi)毒素的影響。將LPS按照濃度梯度稀釋為0.2ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml，然后與多粘菌素(sigma)10ug/ml混合，室溫放置1小時(shí)。將處理好的Hgp96(濃度梯度0.3ug/ml，3ug/ml，10ug/ml，100ug/ul)和LPS(濃度梯度0.2ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml)加入到外周血單核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)分化到的第六天的非成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDC)(圖6)中，37度5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的變化，檢測(cè)為CD14-，HLA-DR+，CD40high，CD86high，CD83+，與第六天的imDC(CD14-，HLA-DR+，CD40low，CD86low，CD83-，)比較，3-10ug/ml(0.02-0.1nm)的Hgp96及可以促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的成熟(圖6)。實(shí)驗(yàn)證明gp96對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的活化作用不是由于污染的內(nèi)毒素引起的。
11.Hgp96的N端促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞DC的活化將純化的gp96N端蛋白(N288，N336，N355，N370)過(guò)detoxi柱(Pierce)柱除內(nèi)毒素。刺激前將其與多粘菌素(sigma)10ug/ml混合，室溫放置1小時(shí)，按照濃度梯度梯度0.3ug/ml，3ug/ml，10ug/ml，100ug/ul加入到培養(yǎng)到第六天的非成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDC)中，37度5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的變化，檢測(cè)為CD14-，HLA-DR+，CD86高，CD83+，與第六天的imDC(CD14-，HLA-DR+，CD86低，CD83-，)比較，3-10ug/ml(0.02-0.1nm)的gp96 N端及可以促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的活化。實(shí)驗(yàn)證明gp96對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的活化作用不是由于污染的內(nèi)毒素引起的。而N端片段中的N336和N355對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的活性較強(qiáng)(圖7)。
12.Hgp96活化的DC細(xì)胞和乙肝核心抗原特異表位刺激天真 T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增表20淋球菌造模組白兔治療后陰道組織病理改變

◆表中數(shù)字為病理學(xué)異常例數(shù)，每組動(dòng)物數(shù)為6只淋球菌造模組治療第8天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)糜爛，統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用spss軟件采用X2檢驗(yàn)方法分析，高劑量組、中劑量、淋必治組無(wú)差異，但與生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.05)4.4結(jié)果分析用兩種致病菌直接注入新西蘭大白兔陰道內(nèi)，能成功地制備出霉菌性陰道炎和淋菌性陰道炎動(dòng)物模型，從外觀，陰道分泌物檢測(cè)，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，陰道組織病理學(xué)檢查證明了動(dòng)物陰道炎的存在，其特點(diǎn)為陰道分泌物膿球是主要指標(biāo)，能很好地反映陰道炎的存在，與現(xiàn)行的臨床診斷吻合。組織病理學(xué)以充血水腫明顯的非特異性改變。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)有一定的意義。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)陰道炎發(fā)生后陰道內(nèi)存在菌群失調(diào)。
經(jīng)過(guò)從受試動(dòng)物的一般情況，陰道外觀模擬臨床檢測(cè)的陰道分泌物潔度，致病菌和正常菌群的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，組織病理學(xué)等多項(xiàng)檢查，全面評(píng)價(jià)二聯(lián)活菌制劑的療效。結(jié)果表明，二聯(lián)活菌制劑能有效地治療白色念珠菌和淋球菌所致的陰道炎，中高劑量的治愈率均達(dá)到了80％以上。與臨床主要治療藥物氟康唑和淋必治的療效接近。從細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的角度，二聯(lián)活菌潔陰劑有明顯的抑制白色念珠菌和淋球菌的作用。中高劑量的效果與氟康唑和淋必治的抑殺菌效果接近。氟康唑和淋必治抑殺白色念珠菌和淋球菌的能力強(qiáng)于二聯(lián)活菌制劑。重要的是，二聯(lián)活菌潔陰劑在產(chǎn)生有效治療作用的基

15.Hgp96的N端與表1所列其它限制型的乙肝病毒表位聯(lián)合刺激，促進(jìn)肽特異的CTL擴(kuò)增按照實(shí)施例14的方法將gp96的N端與表1所列表位聯(lián)合刺激，可以引起肽特異CTL的擴(kuò)增。
16.Hgp96與乙肝病毒的表1所列多表位聯(lián)合刺激，促進(jìn)多個(gè)肽特異的CTL的擴(kuò)增按照實(shí)施例14的方法將gp96與多個(gè)表位聯(lián)合，TETRAMER染色證明可以誘導(dǎo)多個(gè)肽特異CTL克隆的擴(kuò)增。
17.Hgp96的N端與乙肝病毒的多表位聯(lián)合刺激，促進(jìn)多個(gè)肽特異的CTL的擴(kuò)增按照實(shí)施例13的方法，將gp96的N端與多個(gè)表位聯(lián)合，TETRAMER染色證明可以誘導(dǎo)多個(gè)肽特異CTL克隆的擴(kuò)增。
實(shí)施例三本實(shí)施例以SPF雞為動(dòng)物模型，以Chsp108 N21-355為佐劑，對(duì)MDV、AIV和NDV蛋白抗原進(jìn)行研究，得到相同結(jié)論?，F(xiàn)以MDV為例1.從雞肝臟中提取HSP90家族的Chsp108及其基因序列分析根據(jù)上述的提取方法。分別取-70℃保存的健康和雞馬立克氏病毒(MDV)感染引發(fā)的雞腫瘤肝臟組織80克，加入4倍體積低滲緩沖液，至冰浴中用勻漿器勻漿至95％以上肝細(xì)胞破碎。14000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘除去細(xì)胞碎片及其他雜質(zhì)，超速離心。上清用50％～70％的飽和硫酸氨沉淀，沉淀溶解后過(guò)親和層析柱，結(jié)合的糖蛋白用10％的α-葡萄糖苷酸鈉洗脫。收集洗脫液。在AKTA層析系統(tǒng)上過(guò)陰離子柱。結(jié)合的蛋白先用300毫摩爾/升NaCl洗脫，然后梯度洗脫直至NaCl濃度為1000毫摩爾/升。每1毫升收集1次，收集液經(jīng)SDS-PAGE電泳并銀染檢測(cè)。在400～600毫摩爾/升濃度的NaCl時(shí)被洗脫下來(lái)得到純化的Chsp108蛋白，分子量約108kDa。銀染結(jié)果顯示純度在95％以上。對(duì)Chsp108進(jìn)行了基因序列分析，MDV感染引發(fā)的雞腫瘤肝臟組織的Chsp108與正常雞肝臟組織的Chsp108氨基酸完全相同，沒(méi)有發(fā)生變異；2.Chsp108 N21-355片段的克隆從實(shí)驗(yàn)室保存的雞pET-30a-hsp108質(zhì)粒中克隆N端基因(hsp108出處為GeneBank收錄，收錄號(hào)為AF387865)。所用引物為引物15′TTACCCGGGTGAGGAGGTGGATGTGGAT 3′引物25′CCGAGCTCCCAAATGGTGAGAGTATAATTTAC 3′PCR反應(yīng)條件如下94℃4分鐘；94℃50秒，55℃50秒，72℃3分鐘，共30循環(huán)；72℃5分鐘。結(jié)果證明與已知序列相同。
PCR產(chǎn)物為約1Kd的片段，片段的5′端和3′端人為引入SmaI和SacI二個(gè)酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。其序列與上述序列相同，其序列具有如序列表3No.1所示的核苷酸序列，其所編碼的蛋白具有如序列表3No.2所示的335個(gè)氨基酸序列。
3.Chsp108 N21-355片段在大腸桿菌中的表達(dá)與蛋白純化將擴(kuò)增片段經(jīng)SmaI與SacI酶切后連接到表達(dá)載體pGEX6p-1中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)1mM異丙基-P-P-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4小時(shí)后得到表達(dá)產(chǎn)物，以10％十二烷(基)硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物分子量為45kDa，與理論值一致。
將Chsp108N-端片段蛋白用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)層析柱(Pharmacia公司)，經(jīng)親和層析和分子篩superdex G200(PE公司)進(jìn)行純化，以10％SDS-PAGE電泳和銀染鑒定純度，得到大于95％純度的N端蛋白。表達(dá)的蛋白產(chǎn)物用gp96單克隆抗體(NeoMarkers公司)進(jìn)行Western鑒定，獲得陽(yáng)性結(jié)果。
4.Chsp108 N21-355與MDV gB糖蛋白抗原免疫雞免疫方式采用將樣品溶于100ml的磷酸緩沖液(PBS)中皮下注射。免疫程序?yàn)榈谝淮蚊庖呷芎筮M(jìn)行第二次免疫。采用皮下注射，將Chsp108 N-端片段與上述MDV gB糖蛋白抗原結(jié)合物溶于緩沖液(90％PBS，10％二甲基亞砜/0.1％TFA)中，每支雞免疫劑量分別為10μg。每次免疫后15天取血，測(cè)定抗MDV gB糖蛋白抗原的抗體。單獨(dú)應(yīng)用Chsp108N-端片段免疫的雞不產(chǎn)生抗原特異的抗體，而應(yīng)用Chsp108N-端片段和MDV gB糖蛋白抗原結(jié)合物免疫的小鼠產(chǎn)生抗原特異的抗體，其抗體量為單獨(dú)應(yīng)用MDV gB糖蛋白抗原產(chǎn)生抗體的10倍。說(shuō)明Chsp108 N-端片段對(duì)蛋白抗原的免疫原性有明顯的增強(qiáng)作用。在新城疫病毒和禽流感病毒的研究中應(yīng)用實(shí)施2，3中的研究方法，發(fā)現(xiàn)雞肝臟Chsp108 N-端片段同樣可以增強(qiáng)雞對(duì)上述病毒抗原的免疫反應(yīng)。
序列表1<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>一類新的免疫佐劑及其在抗病毒疫苗或藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用<130>tianpo-6-21<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>801<212>DNA<213>Human gp96<400>1gacgatgaag ttgatgtgga tggtacagta gaagaggatc tgggtaaaag tagagaagga 60tcaaggacgg atgatgaagt agtacagaga gaggaagaag ctattcagtt ggatggatta120aatgcatcac aaataagaga acttagagag aagtcggaaa agtttgcctt ccaagccgaa180gttaacagaa tgatgaaact tatcatcaat tcattgtata aaaataaaga gattttcctg240agagaactga tttcaaatgc ttctgatgct ttagataaga taaggctaat atcactgact300gatgaaaatg ctctttctgg aaatgaggaa ctaacagtca aaattaagtg tgataaggag360aagaacctgc tgcatgtcac agacaccggt gtaggaatga ccagagaaga gttggttaaa420aaccttggta ccatagccaa atctgggaca agcgagtttt taaacaaaat gactgaagca480caggaagatg gccagtcaac ttctgaattg attggccagt ttggtgtcgg tttctattcc540gccttccttg tagcagataa ggttattgtc acttcaaaac acaacaacga tacccagcac600atctgggagt ctgactccaa tgaattttct gtaattgctg acccaagagg aaacactcta660ggacggggaa cgacaattac ccttgtctta aaagaagaag catctgatta ccttgaattg720
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Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly Thr210 215 220Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu Leu225 230 235 240Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn Phe245 250 255Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro Met260 265 270Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp Glu275 280 285Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys Lys290 295 300Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys Pro305 310 315 320Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu325 330<210>7<211>1047<212>DNA<213>Human gp96<400>7gacgatgaag ttgatgtgga tggtacagta gaagaggatc tgggtaaaag tagagaagga 60tcaaggacgg atgatgaagt agtacagaga gaggaagaag ctattcagtt ggatggatta120aatgcatcac aaataagaga acttagagag aagtcggaaa agtttgcctt ccaagccgaa180gttaacagaa tgatgaaact tatcatcaat tcattgtata aaaataaaga gattttcctg240agagaactga tttcaaatgc ttctgatgct ttagataaga taaggctaat atcactgact300gatgaaaatg ctctttctgg aaatgaggaa ctaacagtca aaattaagtg tgataaggag360
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65 70 75 80Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Leu85 90 95Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu Thr100 105 110Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr Asp115 120 125Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly Thr130 135 140Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu Ala145 150 155 160Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly Val165 170 175Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr Ser180 185 190Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn Glu195 200 205Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly Thr210 215 220Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu Leu225 230 235 240Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn Phe245 250 255Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro Met260 265 270Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp Glu275 280 285Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys Lys290 295 300
Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys Pro305 310 315 320Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys Ala325 330 335Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp Pro Met340 345序列表2<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>一類新的免疫佐劑及其在抗病毒疫苗或藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用<130>tian-po-6-21<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>606<212>DNA<213>Human HSP70 N161-362<400>1gcgggtgtga tcgcggggct caacgtgctg cggatcatca acgagcccac ggccgccgcc 60atcgcctacg gcctggacag aacgggcaag ggggagcgca acgtgctcat ctttgacctg120ggcgggggca ccttcgacgt gtccatcctg acgatcgacg acggcatctt cgaggtgaag180gccacggccg gggacaccca cctgggtggg gaggactttg acaacaggct ggtgaaccac240ttcgtggagg agttcaagag aaaacacaag aaggacatca gccagaacaa gcgagccgtg300
aggcggctgc gcaccgcctg cgagagggcc aagaggaccc tgtcgtccag cacccaggcc360agcctggaga tcgactccct gtttgagggc atcgacttct acacgtccat caccagggcg420aggttcgagg agctgtgctc cgacctgttc cgaagcaccc tggagcccgt ggagaaggct480ctgcgcgacg ccaagctgga caaggcccag attcacgacc tggtcctggt cgggggctcc540acccgcatcc ccaaggtgca gaagctgctg caggacttct tcaacgggcg cgacctgaac600aagagc 606<210>2<211>202<212>PRT<213>Human HSP70 N161-362<400>2Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro1 5 10 15Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Thr Gly Lys Gly Glu20 25 30Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser35 40 45Ile Leu Thr Ile Asp Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly50 55 60Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His65 70 75 80Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Gln Asn85 90 95Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg100 105 110Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Ser Leu Phe
115 120 125Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu130 135 140Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu Pro Val Glu Lys Ala145 150 155 160Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Leu Val Leu165 170 175Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu Gln Asp180 185 190Phe Phe Asn Gly Arg Asp Leu Asn Lys Ser195 200序列表3<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>一類新的免疫佐劑及其在抗病毒疫苗或藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用<130>PATENT<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1005<212>DNA<213>chicken<400>1
gctgaggagg tggatgtgga tgcgaccgtg gaagaagatc tgggtaaaag tagagaaggg 60tcccgaactg atgatgaagt tgttcagaga gaggaagaag ctatccagct ggatggccta120aatgcatccc agatcaaaga aatcagagaa aaatctgaga ggtttgcctt tcaagcagaa180gttaacagaa tgacgaagct tattattaac tctttatata agaacaaaga gattttcctg240agagagctta tttcaaatgc ttcagatgct ttggataaga tacgcttaat atccttgact300gatgaaaatg ctcttgctgg taatgaggag ctcactgtta aaatcaagtg tgataaagag360aagaacatgc ttcatgttac agatacgggt attggcatga caaaagagga gttgattaaa420aaccttggta ccattgcaaa gtctggtaca agtgaattct taaacaagat gactgaaatg480caggatgata gccagtcgac atctgagtta attggccagt ttggtgttgg cttttattct540gctttcttgg tagcagacag agttattgtc acatcaaagc acaacaatga tacccaacat600atttgggagt cagattcaaa tgagttctct gtgattgatg atccaagagg aaacactctg660ggacgtggca caaccataac ccttgtcttg aagggagaag cctctgatca tcttgagttg720gacactgtta taaatctagt caagaaatat tcacagttca taaacttccc catatatgtg780tggagcagca agacagagac tgttgaagag ccagttgaag aggaggaagc aaaggaggag840aaagaagaaa cagatgatga tgaagcagcg gttgaagaag aggaggaaga gaagaaacca900aaaactaaga aggttgaaag gactgtctgg gattgggagc tcatgaatga cataaaacca960atctggcaga gaccatctaa agaagttgaa gaggatgaat ataaa 1005<210>2<211>335<212>PRT<213>chicken<400>2Ala Glu Glu Val Asp Val Asp Ala Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly Lys1 5 10 15Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu Glu20 25 30
Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Lys Glu Ile35 40 45Arg Glu Lys Ser Glu Arg Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg Met50 55 60Thr Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe Leu65 70 75 80Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Leu85 90 95Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ala Gly Asn Glu Glu Leu Thr100 105 110Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Met Leu His Val Thr Asp115 120 125Thr Gly Ile Gly Met Thr Lys Glu Glu Leu Ile Lys Asn Leu Gly Thr130 135 140Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu Met145 150 155 160Gln Asp Asp Ser Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly Val165 170 175Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Arg Val Ile Val Thr Ser180 185 190Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn Glu195 200 205Phe Ser Val Ile Asp Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly Thr210 215 220Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Ser Asp His Leu Glu Leu225 230 235 240Asp Thr Val Ile Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn Phe245 250 255Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro Val260 265 270
Glu Glu Glu Glu Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Thr Asp Asp Asp Glu275 280 285Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys Lys290 295 300Val Glu Arg Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys Pro305 310 315 320Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys325 330 335序列表4<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>一類免疫佐劑及其在抗病毒疫苗或藥物制備中的應(yīng)用<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>HBV<400>1Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
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權(quán)利要求
1.一類人或動(dòng)物的具有免疫增強(qiáng)活性的熱休克蛋白免疫佐劑，其特征在于是由gp96、hsp108或hsp70的N端重組片段，即氨基端具有免疫增強(qiáng)活性片段組成的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫佐劑，包括gp96、hsp108或hsp70的N端重組片段如序列表1No.2所示的267個(gè)氨基酸序列組成的蛋白、序列表1No.4所示的315個(gè)氨基酸序列組成的蛋白、序列表1No.6所示的333個(gè)氨基酸序列組成的蛋白及序列表1No.8所示的349個(gè)氨基酸序列組成的蛋白；具有如序列表2No.2所示的由202個(gè)氨基酸序列組成的蛋白；具有如序列表3No.2所示的由335個(gè)氨基酸序列組成的蛋白。
3.據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫佐劑，還包括由于其基因的缺失、插入和突變產(chǎn)生的與所述Hgp96、Chsp108和Hhsp70N-端片段的氨基酸序列至少有60％同源性的，并且具有免疫增強(qiáng)活性功能的衍生蛋白。
4.據(jù)權(quán)利要求1至3所述的免疫佐劑，任選其中之一項(xiàng)在制備疫苗或/和藥物中的應(yīng)用。
5.據(jù)權(quán)利要求1至3所述的免疫佐劑，選與其宿主來(lái)源相同的一項(xiàng)在制備與乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病毒HIV-1、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)和口蹄疫病毒(FMDV)的表位肽，共價(jià)連接的多表位重組體蛋白和抗原構(gòu)成治療性疫苗或藥物，禽流感病毒(AIV)或雞新城疫病毒(NDV)或雞馬立克氏病毒蛋白抗原構(gòu)成治療性疫苗或藥物中的應(yīng)用。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫佐劑，其中乙肝病毒HBV表位肽包括STLPETTVVRR，F(xiàn)LPSDFFPSV，IPIPSSWAF，WLSLLVPFV、FLLSLGIHL；HCV的表位抗原肽，包括YLLPPRGPRL、GFADLMGYIPL；HIV-1的表位肽，包括SILDIRQGPK、CQGVGGPGHK；SARS-CoV的表位肽，包括LLLDRLNQL、VVFLHVTYV；FMDV的表位肽，包括IKRAETYCPR、HKQKIVAPEK。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的免疫佐劑，其通過(guò)與抗原物質(zhì)直接混合、非共價(jià)連接或共價(jià)連接的方式，免疫劑量為0.10nM至100μM，采用皮下注射或皮內(nèi)注射或腹腔注射的方式進(jìn)行免疫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的人或動(dòng)物熱休克蛋白gp96和hsp108 (均屬HSP90家族)或hsp70全長(zhǎng)分子或其氨基端片段為佐劑，以提高抗原免疫活性。病毒表位肽、共價(jià)連接的多表位重組體或蛋白抗原與上述熱休克蛋白全長(zhǎng)分子或其氨基端片段混合或共價(jià)連接使用，作為乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、SARS冠狀病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞馬立克氏病毒等病毒的抗原佐劑或抗原載體可數(shù)十倍的提高抗原免疫活性，達(dá)到清除病毒、治療疾病的目的。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1718243SQ20041006919
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者田波, 高福, 李宏濤, 張玉霞, 周明海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所