專利名稱：增強(qiáng)荷電分析物穿過跨膜蛋白孔的移位的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)荷電分析物穿過跨膜蛋白孔的移位(translocation)。移位是通過增加所述孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷來進(jìn)行增強(qiáng)。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明增強(qiáng)的孔。
背景技術(shù)：
隨機(jī)檢測是一種依賴于對分析物分子與受體之間個(gè)體結(jié)合事件的觀察結(jié)果的傳感方法。隨機(jī)傳感器可通過如下方式形成將納米尺寸的單孔置入絕緣膜中，并且在存在分析物分子的情況下測量電壓驅(qū)動的穿過所述孔的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。電流波動的發(fā)生頻率可揭示在所述孔中結(jié)合的分析物的濃度。分析物的種類是通過其特征性電流特征，特別是電流阻斷的持續(xù)時(shí)間和程度而揭示(Braha, 0. ,Walker,B.，Cheley，S. ,Kasianowicz, J. J.，Song，L.， Gouaux, J.Ε., and Bayley, H. (1997)Chem. Biol. 4,497-505 ；and Bayley, H. , and Cremer, P.S. (2001)Nature 413,226-230) 形成細(xì)菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已用于對許多類型的分子進(jìn)行的隨機(jī)檢測(Bayley，H.，and Cremer, P. S. (2001)Nature 413,226-230 ；Shin, S. -H. , Luchian, Τ. , Cheley, S. , Braha, 0. , and Bayley, H. (2002)Angew. Chem. Int. Ed. 41, 3707-3709 ；Guan, Χ. ,Gu,L.-Q. ,Cheley,S. ,Braha,0.,and Bayley,H. (2005)ChemBioChem 6,1875-1881)。在這些研究的過程中，已發(fā)現(xiàn)，對α-HL進(jìn)行改造以直接結(jié)合小的有機(jī)分析物的嘗試是很費(fèi)力的，并且鮮有成功的實(shí)例(Guan, X.，Gu, L. -Q.，Cheley，S.，Braha, 0.， and Bayley, H. (2005)ChemBioChem 6，1875-1881)。

發(fā)明內(nèi)容
當(dāng)分析物移位穿過跨膜蛋白孔時(shí)，它們能夠以該分析物特異性的方式影響流經(jīng)所述孔的電流。這使得能夠使用隨機(jī)傳感來檢測所述分析物。所述分析物一般通過與所述孔相互作用來影響流經(jīng)所述孔的電流。每當(dāng)所述分析物與所述孔相互作用時(shí)就有特征性電流流經(jīng)所述孔。發(fā)明人意外地證明了增加孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷可增強(qiáng)荷電分析物移位通過所述孔。例如，增加孔的桶或通道和/或入口的凈正電荷可增強(qiáng)荷負(fù)電分析物穿過所述孔的移位。增加所述桶或通道和/或入口的凈相反電荷可增加荷電分析物穿過所述孔的移位頻率。它還可降低所述分析物穿過所述孔的移位闕值電壓。它還可降低所述分析物移位穿過所述孔的移位速度。此外，其中所述分析物進(jìn)入所述孔但未被移位的事件幾乎被消除。以該方式增強(qiáng)的孔是可用于對荷電分析物的隨機(jī)傳感的有用工具，尤其是用于測序核酸。因此，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)荷電分析物移位穿過跨膜蛋白孔的方法，所述方法包括(a)增加所述孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷；并且
(b)確定所述分析物穿過所得孔的移位是否被增強(qiáng)。本發(fā)明還提供了 -跨膜蛋白孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷的增加用于增強(qiáng)荷電分析物穿過所述孔的移位的用途；-一種由本發(fā)明的方法增強(qiáng)的跨膜蛋白孔；-一種跨膜蛋白孔，其中所述桶或通道和/或入口的凈相反電荷已被增加以增強(qiáng)荷電分析物穿過所述孔的移位；-編碼本發(fā)明的跨膜蛋白孔的多核苷酸；-編碼具有序列SEQID NO :6、8或10或者它們的變體序列的跨膜蛋白孔亞基的多核苷酸；-一種確定在樣本中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)使所述樣本與本發(fā)明的跨膜蛋白孔在以下條件下接觸允許所述分析物(若存在)移位穿過所述孔并與所述孔相互作用；并且(b)測量在相互作用過程中通過所述孔的電流，從而確定所述分析物的是否存在；-一種測序目標(biāo)核酸序列的方法，包括(a)將所述目標(biāo)序列推過或拉過本發(fā)明的跨膜蛋白？L，使所述目標(biāo)序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；并且(b)測量在每個(gè)相互作用過程中通過所述孔的電流，從而確定所述目標(biāo)序列的序列；以及-一種測序核酸的試劑盒，包含本發(fā)明的跨膜蛋白孔和核酸處理酶(nucleicacid handling enzyme)。


圖1示出了通過α -溶血素(α -HL)納米孔(PDB 7AHL)的截面。(a)所述WT α -HL 納米孔中的電荷分布。α-HL的荷正電氨基酸被涂成藍(lán)色，荷負(fù)電氨基酸被涂成紅色。(b) 在該工作中被修飾的α -HL納米孔中的位點(diǎn)。Lys-8為紫色。由離子對Glu_lll/LyS-147形成的縮窄處(constriction)被涂成綠色。Met-113、Thr-115、Thr_117，Gly-119、Asn_121、 Asn-123和Thr-125被涂成橙色。圖2示出了在+120mV下DNA穿過所述α -HL孔的移位。(a)DNA與所述WT α -HL 孔的五種類型的相互作用。A類型事件簡單低振幅事件(被解釋為DNA直接通過所述孔)； B類型簡單中振幅事件(DNA被捕獲在前廳(vestibule)中并從入口一側(cè)——順側(cè)—— 出孔)；C類型在同一事件中的中振幅信號，之后是低振幅信號(DNA先停留在前廳中，之后通過所述β桶從反側(cè)出去)；D類型在同一事件中的中低振幅信號，之后是中振幅信號 (DNA直接進(jìn)入β桶，然后縮回前廳并從順側(cè)出孔)；E類型在同一事件中的中振幅信號， 之后是低振幅信號，之后是第二中振幅信號(DNA進(jìn)入前廳，穿過β桶，但又縮回至前廳并從順側(cè)出孔)。(b)事件柱狀圖，顯示2500個(gè)事件的平均殘余電流，表示為穿過WTa-HL 孔的開孔電流的分?jǐn)?shù)。代表A類型和B類型事件的峰被標(biāo)識。特征為其平均事件電流的 C、D和E類型事件出現(xiàn)在所述兩個(gè)主峰之間。(C)A類型事件的DNA移位時(shí)間的柱狀圖。DNA (0. 95 μ Μ)在 IM KClUOOyM EDTA、25mM Tris. HCl (pH 8.0)中從所述順側(cè)腔室呈現(xiàn)。圖3示出了通過突變引入或除去的荷電側(cè)鏈對+120mV下DNA移位頻率的作用。(a)M113R-WT (0. 46 μ M DNA,順側(cè))，(b)ElllN-ffT (0. 47 μ Μ), (c)WT (0. 53 μ Μ), (d) M113R-RL2 (0. 74 μ Μ), (e) RL2 (0. 60 μ Μ)和(f)M113D_RL2 (2· 0 μ Μ)。M113D-RL2 顯示出在最高達(dá)+300mV下無電流阻斷。其他條件記載在圖2的說明中。圖4示出了 α -HL的β桶中的精氨酸置換對DNA在+120mV下穿過所述孔的移位頻率的作用。DNA移位的頻率被標(biāo)準(zhǔn)化為ΙμΜ DNA。線是DNA移位頻率相對于表示為殘基數(shù)目的精氨酸置換距縮窄處的距離的單指數(shù)擬合。所述突變以所述RL2為背景。其他條件記載在圖2的說明中。圖5示出了 DNA捕獲率的電壓依賴性。將所述DNA移位頻率以對數(shù)標(biāo)度繪圖并且標(biāo)準(zhǔn)化為1 μ M DNA。僅所述移位事件(即A類型和C類型)包含在所述分析中。M113R-WT (紅圈)、E11IN-WT (藍(lán)色菱形)、M113R-RL2 (黑方塊)、WT (綠色下三角)和RL2 (藍(lán)色上三角)。 所述線示出了用方程式1對數(shù)據(jù)的擬合。圖6示出了 DNA穿過所述α -HL孔的移位的模型。為了穿過所述孔(V)，DNA必須首先與所述孔的順側(cè)入口碰撞(II)，被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述前廳(III)并且進(jìn)入所述β桶 (IV)。所述DNA可延長它在所述前廳中的停留時(shí)間并且產(chǎn)生對應(yīng)于VI和VII的中振幅和低振幅事件?？赏ㄟ^實(shí)驗(yàn)方法觀察到的過程被標(biāo)識為事件并且用慢的事件間速率顯示。除移位外，所有步驟都是可逆的。在A類型事件中，DNA與所述孔碰撞，進(jìn)入所述前廳，然后直接移位穿過所述β桶，從所述孔的反側(cè)出去。在該過程中對所述桶(IIIe IV)的采樣太快而無法觀察。在B類型事件中，DNA進(jìn)入所述孔，但不穿過所述β桶，它與前廳進(jìn)行長時(shí)間的相互作用以產(chǎn)生所述中振幅事件(I — II — III — VI)。在這種情況下，DNA 從其進(jìn)入時(shí)的同一順側(cè)入口出孔(VI —III —II —I)。如B類型事件一樣，C類型事件首先顯示出中振幅電流((I —II —III —VI)，但是之后DNA的一個(gè)末端進(jìn)入所述β桶 (VII)并且出現(xiàn)移位事件(VII —V—I)。在D類型事件中，所述DNA最可能進(jìn)入所述β 桶(I — II — III — IV)，但隨后停止移位(VII)，縮回到所述前廳中(VI)并且從順側(cè)出孔 (VI — III — II — I)。最后，在E類型事件中，所述DNA如在C類型事件中所述開始移位通過所述β桶(I —II —III —VI —VII —V)，但是隨后縮回至所述前廳中(V —VII —VI)， 然后如D類型事件中所述從所述順側(cè)出孔(VI — III — II — I)。預(yù)計(jì)給出中振幅事件的中間體被以黃色編號，但是II和III太短促而無法觀察。預(yù)計(jì)給出低振幅事件的中間體以紅色編號，但是IV太短促而無法觀察。圖7示出了同七聚體突變體α -HL孔E111N-WT和M113R-WT的DNA阻斷。 (a)+200mV下在DNA誘導(dǎo)的阻斷過程中通過ElllN-WT的電流，表示為相對于在半對數(shù)標(biāo)度上展示的事件持續(xù)時(shí)間的所述開孔電流的分?jǐn)?shù)。(b)M113R-WT的對應(yīng)圖。(C)ElllN-WT(菱形)和M113R-WT (圓形)的長時(shí)阻斷，作為所施加的從+100至+200mV的電勢的總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。將約0. 5 μ M的DNA加至所述順側(cè)腔室；在每個(gè)實(shí)驗(yàn)后確定所述提取物的濃度。其他的條件參見圖2的說明。圖8示出了多種α -HL孔的DNA阻斷的平均事件電流的振幅柱狀圖。主峰代表A 類型事件(DNA移位)。每圖均包含1000個(gè)事件。條件記載在圖2的說明中。圖9示出了將DNA(LOyM)加入到反側(cè)腔室后(a)M113R-RL2和(b)N121R-RL2的電流阻斷。施加的電勢是_120mV。對于這些突變體，通過所述開孔的電流在負(fù)電勢下比在正電勢下噪聲更大。其他條件記載在圖2的說明中。圖10示出了+120mV下穿過WT-α-HL納米孔的DNA移位的罕見(<1%)電流阻斷事件，顯示出在所述中振幅和低振幅狀態(tài)之間的多重轉(zhuǎn)變。條件記載在圖2的說明中。圖 11 顯示了 :a)通過 7R 納米孔的截面。使用 PyMOL (DeLano Scientific LLC, ν 1.0)軟件將所述WT納米孔(PDB :7AHL)中位點(diǎn)113、115、117、119、121、123和125處的氨基酸用精氨酸置換。荷負(fù)電的殘基被涂成紅色，荷正電的殘基被涂成藍(lán)色。b)在所述腔室的順側(cè)加入1 μ M的ssDNA后在+120mV下7R(上面)和RL2- α -HL納米孔(下面)的單通道記錄。實(shí)驗(yàn)是在包含IOOuM EDTA(ρΗ 8)的IM KCl 25mMTris. HCl中進(jìn)行。圖12示出了穿過7R納米孔的DNA移位。a)顯示在所述腔室的順側(cè)加入0. 7 μ M 的ssDNA(9aner)時(shí)穿過7R孔的移位時(shí)間分布的事件柱狀圖。事件< 5ms被歸為7R納米孔的短暫門控(參見Si)。b)在DNA移位過程中DNA移位事件(τ > 5ms)相對于剩余電流的2-D分布圖。顏色代表如插圖所示的事件的密度。c)DNA穿過7R納米孔的最可能的 DNA移位速度對所施加的電壓的依賴性。紅線顯示單指數(shù)擬合。圖13示出了 +120mV下ssDNA移位過程中通過WT和經(jīng)修飾的α -HL納米孔的剩余電流。誤差表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。除了 WT和2Ν，所有納米孔都以RL2為背景。從左起第四個(gè)至最后一個(gè)柱涉及荷額外正電荷的納米孔。圖14示出了所述DNA移位速度對7R異聚體的內(nèi)部電荷的依賴性。將數(shù)據(jù)擬合至單指數(shù)曲線(上圖)。異聚體納米孔是通過混合RL2的單體(空心圓)和7R的單體(紫色圓)來獲得。以該方式，可形成含有7至49額外正電的八種不同類的七聚體(7RmRL2n-m ； η = 7，亞基總數(shù)，m = 0. · · 7)(下圖)。圖15示出了 7R納米孔的潛在用途。a)通過讀出通道電流對單鏈進(jìn)行測序。所述7R通道被納入用通道探針功能化的固相納米孔中。測量通過ssDNA的橫向通道電流以識別單個(gè)堿基，所述ssDNA移位穿過所述孔。7R將控制每個(gè)核苷酸在所述通道探針之間的停留時(shí)間。b)使用電生理學(xué)技術(shù)的鏈測序。將含有內(nèi)部正電荷的β桶連在所述α-HL納米孔的順側(cè)入口，用于控制ssDNA的速度。單個(gè)核苷酸之間的差異是通過由所述DNA移位所生成的所述納米孔電導(dǎo)率變化來測量。序列表說明SEQ ID NO=I示出了編碼野生型(WT) a -溶血素的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO :2示出了 WT a -溶血素的一個(gè)亞基的氨基酸序列。氨基酸2至6、73 至75、207至209、214至216和219至222形成a -螺旋。氨基酸22至30、；35至44、52至 62、67 至 71、76 至 91、98 至 103、112 至 123、137 至 148、154 至 159、165 至 172、229 至 235、 243至洸1、266至271、285至286和291至293形成β -折疊(β-strand)。所有其他非末端氨基酸，即 7至21、31 至；34、45至51、63至 66、72、92 至 97、104 至 IllUM 至 136、149 至 153,160 至 164,173 至 206,210 至 213、217、218、223 至 228,236 至 242,262 至 265,272 至274和287至290形成環(huán)區(qū)。氨基酸1和294是末端氨基酸。SEQ ID NO :3示出了編碼α -溶血素RL2的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。RL2是半合成基因的產(chǎn)物，所述半合成基因是設(shè)計(jì)為使編碼所述跨膜β桶的序列發(fā)生盒式誘變(Cheley, S.，Braha, 0.，Lu，X.，Conlan, S.，and Bayley, H. (1999) Protein Sci. 8，1257-U67)。它在所編碼的多肽序列中包含6個(gè)沉默限制性位點(diǎn)和5個(gè)改變的氨基酸(K8A、 VlML、G130S、m39Q和I142L)。D8RL2是具有八天冬氨酸尾的RL2。SEQ ID NO :4示出了 α -溶血素RL2的一個(gè)亞基的氨基酸序列。與上文針對SEQ ID NO :2討論的氨基酸相同的氨基酸形成α-螺旋、β-折疊、環(huán)區(qū)和末端氨基酸。SEQ ID NO 5示出了編碼α -溶血素M113R-WT的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO 6示出了 α -溶血素M113R-WT的一個(gè)亞基的氨基酸序列。SEQ ID NO 7示出了編碼α -溶血素E111N-WT的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO 8示出了 α -溶血素E111N-WT的一個(gè)亞基的氨基酸序列。SEQ ID NO 9示出了編碼在實(shí)施例中使用的α -溶血素A8R-RL2的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。SEQ ID NO
酸序列。SEQ ID NO
的多核苷酸序列。SEQ ID NO
基酸序列。SEQ ID NO
的多核苷酸序列。SEQ ID NO
基酸序列。SEQ ID NO 15示出了在實(shí)施例中使用的DNA序列。
具體實(shí)施例方式應(yīng)理解，可根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)的具體需要對所公開的產(chǎn)物和方法的不同應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的目的，而非意在進(jìn)行限制。此外，除非上下文另有清楚的指明，否則本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”也包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如，提及“一種分析物”包括“多種分析物”，提及“一個(gè)跨膜蛋白孔”包括兩個(gè)或更多個(gè)這類孔，提及“核酸序列”包括兩種或多種這樣的序列，等等。本文中——無論在上文還是下文——引用的全部出版物、專利和專利申請均以引用的方式全文納入本文。增強(qiáng)移位的方法本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)荷電分析物穿過跨膜蛋白孔的移位的方法。所述跨膜蛋白孔一般被用于通過隨機(jī)傳感來檢測所述分析物。隨著所述分析物移位通過所述孔，它一般與所述孔相互作用并且以該分析物特異性的方式影響流經(jīng)所述孔的電流。只要所述分析物與所述孔相互作用，特征性的電流就流經(jīng)所述孔。這使得可使用隨機(jī)傳感檢測所述分析物。所述方法可以任何方式增強(qiáng)所述分析物的移位。所述方法優(yōu)選可(1)增加所述分析物移位通過所述孔的頻率，(2)降低所述分析物移位通過所述孔的闕值電壓，(3)降低所
:10示出了在實(shí)施例中使用的α-溶血素A8R-RL2的一個(gè)亞基的氨基 11示出了編碼在實(shí)施例中使用的α-溶血素M113K-RL2的一個(gè)亞基 :12示出了在實(shí)施例中使用的α-溶血素M113K-RL2的一個(gè)亞基的氨 :13示出了編碼在實(shí)施例中使用的α-溶血素M113R-RL2的一個(gè)亞基 :14示出了在實(shí)施例中使用的α-溶血素M113R-RL2的一個(gè)亞基的氨述分析物移位通過所述孔的速度，或者(4)降低所述分析物和所述孔之間非移位相互作用的數(shù)目。非移位相互作用是其中所述分析物進(jìn)入所述孔并且與所述孔相互作用，但是沒有移位通過所述孔的事件。在一些情況下，所述非移位相互作用被消除。所述方法優(yōu)選可增強(qiáng)⑴和⑵；⑴和⑶；⑴和⑷；⑵和⑶；⑵和⑷；⑶和⑷；⑴、⑵和⑶； ⑴、(3)和⑷；⑴、(2)和⑷；或(2)、(3)和⑷。所述方法最優(yōu)選可增強(qiáng)⑴、(2)、(3) 和G)。換言之，所述方法最優(yōu)選增強(qiáng)所述分析物移位通過所述孔的頻率、降低所述分析物移位通過所述孔的闕值電壓、降低所述分析物移位通過所述孔的速度并且降低所述分析物和所述孔之間非移位相互作用的數(shù)目。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定凈相反電荷的增加是否會增強(qiáng)所述分析物穿過所述孔的移位。例如，所述分析物可與未增強(qiáng)的或野生型的孔以及其中其桶或通道和/或入口的凈相反電荷已增強(qiáng)的相同類型孔相接觸，并且可以確定所述兩種孔之間分析物移位的任何差異。分析物移位可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來測量。一種方法記載于實(shí)施例中。通過增強(qiáng)所述分析物移位穿過所述孔的移位，本發(fā)明的方法提供了用于隨機(jī)傳感所述分析物的改良孔。增強(qiáng)的穿過所述孔的移位可導(dǎo)致更敏感的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)(1)使得在高濃度和低濃度下均可檢測所述分析物；( 使得可檢測甚至在雜質(zhì)中的所述分析物； (3)使得可更快速地檢測所述分析物；(4)減少由非移位相互作用產(chǎn)生的背景噪音；并且 (5)使得可在較低電壓下檢測所述分析物。對于測序核酸序列最重要的是，增強(qiáng)的移位尤其是增加的移位頻率，可導(dǎo)致對所述序列中連續(xù)核苷酸的讀取之間的停滯時(shí)間減少。這使得可以更快地對核酸進(jìn)行測序。降低穿過所述孔的移位速度會增加對所述核酸序列中連續(xù)核苷酸的讀取時(shí)間，并因此使得所述核酸的序列可以被更準(zhǔn)確地確定。分析物所述分析物可以是任何荷電物質(zhì)。如果分析物帶有凈電荷則它是荷電的。所分析物可以荷負(fù)電也可以荷正電。如果分析物帶有凈負(fù)電荷則它是荷負(fù)電的。如果分析物帶有凈正電荷則它是荷正電的。合適的分析物包括但不局限于金屬離子、無機(jī)鹽、多聚物(如聚合酸或堿)、染料、 漂白劑、藥物、診斷劑、消遣性藥物(recreational drug)、爆炸物和環(huán)境污染物。所述分析物可以是從細(xì)胞中分泌的分析物。或者，所述分析物可以是存在于細(xì)胞內(nèi)因此必須將其從所述細(xì)胞中提取出來的分析物。所述分析物優(yōu)選是多聚物。所述多聚物優(yōu)選是核酸序列。核酸是荷負(fù)電的。核酸是包含兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的大分子。由酶處理的核酸可包含任意核苷酸的任何組合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工的。核苷酸一般包含核堿基(nuclecAase)、糖和至少一個(gè)磷酸基團(tuán)。所述核堿基一般是雜環(huán)的。核堿基包括但不局限于嘌呤和嘧啶，更具體地是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖一般是戊糖。核苷酸糖包括但不局限于核糖和脫氧核糖。所述核苷酸一般是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。所述核苷酸一般包含一磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可連接在核苷酸的5’或3’側(cè)。合適的核苷酸包括但不局限于一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷 (ATP)、一磷酸鳥苷(GMP)、二磷酸鳥苷(⑶P)、三磷酸鳥苷(GTP)、一磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、一磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、 一磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、一磷酸脫氧腺苷(dAMP)、二磷酸脫氧腺苷(dADP)、三磷酸脫氧腺苷(dATP)、一磷酸脫氧鳥苷(dGMP)、二磷酸脫氧鳥苷(dGDP)、三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)、一磷酸脫氧胸苷(dTMP)、二磷酸脫氧胸苷(dTDP)、三磷酸脫氧胸苷(dTTP)、一磷酸脫氧尿苷(dUMP)、二磷酸脫氧尿苷(dUDP)、三磷酸脫氧尿苷(dUTP)、一磷酸脫氧胞苷(dCMP)、二磷酸脫氧胞苷 (dCDP)和三磷酸脫氧胞苷(dCTP)。所述核苷酸優(yōu)選選自AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、 dGMP 或 dCMP。所述核酸優(yōu)選為雙鏈，如DNA。所述核酸可以是單鏈，如cDNA或RNA。所述多聚物可以是肽、多肽或蛋白質(zhì)。所述肽、多肽或蛋白質(zhì)可以是天然存在的或非天然存在的。所述多肽或蛋白質(zhì)可在其中包括合成的或經(jīng)修飾的氨基酸。對氨基酸的很多不同類型的修飾是本領(lǐng)域中已知的。對于本發(fā)明，應(yīng)理解所述分析物可通過本領(lǐng)域中可用的任何方法進(jìn)行修飾。所述蛋白質(zhì)可以是酶、抗體、激素、生長因子或生長調(diào)節(jié)蛋白，如細(xì)胞因子。所述細(xì)胞因子可選自白細(xì)胞介素，優(yōu)選IFN-1、IL-2、IL-4、IL_5、IL_6、IL-10、IL-12或IL-13 ；干擾素，優(yōu)選IL-Y ；或其他細(xì)胞因子，如TNF-α。所述蛋白質(zhì)可以是細(xì)菌蛋白、真菌蛋白、病毒蛋白或寄生物衍生的蛋白。在所述蛋白與所述孔接觸之前，可將它展開(unfold)以形成多肽鏈，從而使其進(jìn)入所述孔的桶或通道并且與所述孔相互作用。所述分析物可以是氨基酸。荷電氨基酸是本領(lǐng)域中公知的并且將在下文詳細(xì)討論。所述氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。所述氨基酸可以是合成的或經(jīng)修飾的。 對氨基酸的很多不同類型的修飾是本領(lǐng)域中已知的。所述分析物可以是個(gè)體核苷酸或單核苷酸。個(gè)體核苷酸是未與另一個(gè)多核苷酸通過核苷酸鍵結(jié)合的核苷酸。核苷酸鍵使核苷酸的一個(gè)磷酸基團(tuán)與另一個(gè)核苷酸的糖基團(tuán)連接。個(gè)體核苷酸一般是未與具有至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、 至少200個(gè)、至少500個(gè)、至少1000個(gè)或至少5000個(gè)核苷酸的另一個(gè)多核苷酸序列通過核苷酸鍵結(jié)合的核苷酸。例如，所述個(gè)體核苷酸已被從目標(biāo)多核苷酸序列如DNA或RAN鏈中消化出來。核苷酸是荷負(fù)電的。所述核苷酸可以是上文討論的任何核苷酸。所述核苷酸可來自對核酸序列例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸的消化。核酸序列可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法消化。合適的方法包括但不局限于使用酶或催化劑的方法。對核酸的催化消化公開于Decketal.，Inorg. Chem.，2002 ；41 :669-677中。來自單核酸序列的個(gè)體核苷酸可與所述孔以連續(xù)的方式接觸，以對所述核酸的全部或一部分進(jìn)行測序。按照本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行的核酸測序在下文更詳細(xì)討論。所述核苷酸一般是未經(jīng)修飾的，如當(dāng)所述核苷酸是來自對核酸序列的消化時(shí)?；蛘撸龊塑账峥梢允墙?jīng)修飾的或被破壞的。所述核苷酸一般是甲基化的或氧化的。所述核苷酸可用顯示性標(biāo)簽標(biāo)記。所述顯示性標(biāo)簽可以是使得所述核苷酸可被檢測到的任何合適的標(biāo)簽。合適的標(biāo)簽包括熒光分子、放射性同位素，例如125I、35S，以及接頭例如生物素。所述核苷酸一般存在于任意合適的生物樣本中。合適的生物樣本在下文描述。跨膜蛋白孔跨膜蛋白孔是允許離子順著施加的電勢從所述膜的一側(cè)流到另一側(cè)的多肽。所述孔優(yōu)選允許所述分析物順著施加的電勢從所述膜的一側(cè)流到另一側(cè)。所述孔一般是低聚物。所述孔優(yōu)選由一些重復(fù)亞基組成，如6個(gè)、7個(gè)或8個(gè)亞基。所述孔更優(yōu)選是七聚體。所述孔一般包含所述離子可從其中流過的桶或通道。所述孔的亞基一般圍繞一個(gè)中心軸并且提供跨膜桶或管道或者跨膜α-螺旋束或通道的鏈。根據(jù)本發(fā)明使用的孔可以是β -桶孔或α -螺旋束孔。β -桶孔包含由β -折疊形成的桶或通道。合適的β-桶孔包括但不局限于β-毒素，如α-溶血素和殺白細(xì)胞素； 和細(xì)菌的外膜蛋白質(zhì)/通道蛋白(porin)，如恥垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis)通道蛋白A(MspA)、外膜通道蛋白F(OmpF)、外膜通道蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟氏球菌屬(Neisseria)自轉(zhuǎn)運(yùn)脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包含由α-螺旋形成的桶或通道。 合適的α-螺旋束孔包括但不局限于內(nèi)膜蛋白和α-外膜蛋白，如WZA。本發(fā)明中使用的最優(yōu)選的孔是α-溶血素或其變體。所述α-溶血素孔是由7個(gè)相同亞基形成(即它是七聚體)。野生型α-溶血素的一個(gè)亞基的序列在SEQ ID Ν0:2中示出。α -溶血素RL2的一個(gè)亞基的序列在SEQ IDNO :4中示出。變體是七聚體孔，所述七聚體孔的七個(gè)亞基中的一個(gè)或多個(gè)具有從SEQ ID NO :2或4變化而來并且保持孔活性的氨基酸序列。變體可包括有利于與所述分析物相互作用的修飾。變體α-溶血素中的1、2、3、4、5、6或7個(gè)所述亞基可具有從SEQID Ν0:2或4變化而來的氨基酸序列。變體孔中的全部7個(gè)亞基一般相同但也可以不同，特別是如果一個(gè)或多個(gè)所述亞基被修飾以有利于與所述分析物相互作用。所述變體可以是由生物體——例如由葡萄球菌屬Staphylococcus)細(xì)菌——表達(dá)的天然存在變體。變體還包括由重組技術(shù)產(chǎn)生的非天然存在變體。在SEQ ID N0:2或4 的氨基酸序列的全長中，以氨基酸同一性計(jì)，變體的亞基優(yōu)選與所述序列具有至少50%的同源性。以氨基酸同一性計(jì)，所述亞基多肽更優(yōu)選在全長上可以與SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列具有至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%的同源性。在200個(gè)或更多，例如230、250、 270或280個(gè)或更多連續(xù)氨基酸的片段中可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性(“硬同源性(hard homology)”)。優(yōu)選的變體在SEQ ID NO :6、8、10、12和 14中示出?？蓪EQ ID NO :2或4的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸置換，例如最多達(dá)1、2、3、4、5、10、 20或30個(gè)置換?？蛇M(jìn)行保守置換，例如，根據(jù)下表1進(jìn)行。表1-保守置換在第二列同一格，優(yōu)選在第三列同一行中的氨基酸可相互置換。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)荷電分析物穿過跨膜蛋白孔的移位的方法，所述方法包括(a)增加所述孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷；并且(b)確定所述分析物穿過所得孔的移位是否被增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中增加凈相反電荷會增加所述分析物穿過所述孔的移位頻率。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中增加凈相反電荷會降低用于所述分析物穿過所述孔的移位闕值電壓。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中增加凈相反電荷會降低所述分析物穿過所述孔的移位速度。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中增加凈相反電荷會降低所述分析物和所述孔之間非移位相互作用的數(shù)目。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述分析物是多聚物。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述分析物是核酸序列
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述孔包含7個(gè)亞基，所述每個(gè)亞基含有SEQID NO 2或其變體。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述孔包含7個(gè)亞基，所述每個(gè)亞基包含SEQID NO 4或其變體。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述分析物荷負(fù)電并且步驟(a)包括增加所述凈正電荷。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述凈正電荷是通過將一個(gè)或多個(gè)荷正電的氨基酸引入所述孔的桶或通道和/或入口中來增加。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述引入通過置換進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)荷正電的氨基酸是組氨酸(H)、賴氨酸 (K)和/或精氨酸(R)。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述凈正電荷是通過用一個(gè)或多個(gè)不荷電的氨基酸、非極性氨基酸和/或芳香族氨基酸置換所述孔的桶或通道和/或入口中的荷負(fù)電的氨基酸來增加。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述入口是分析物進(jìn)入所述桶或通道時(shí)所穿過的所述孔的部分。
16.所述跨膜蛋白孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷的增加用于增強(qiáng)荷電分析物穿過所述孔的移位的用途。
17.—種權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法增強(qiáng)的跨膜蛋白孔。
18.—種跨膜蛋白孔，其中它的桶或通道和/或入口的凈相反電荷已被增加，以增強(qiáng)荷電分析物穿過所述孔的移位。
19.權(quán)利要求17或18的跨膜蛋白孔，其中所述孔包含(a)至少一個(gè)包含SEQID NO 6或其變體的亞基；(b)至少一個(gè)包含SEQID NO 8或其變體的亞基；或(c)至少一個(gè)包含SEQID NO 10或其變體的亞基。
20.權(quán)利要求19的跨膜蛋白孔，其中所述孔是包含7個(gè)亞基的同七聚體，所述亞基為SEQ ID NO :6、8或10或它們的變體。
21.編碼權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)的跨膜蛋白孔的多核苷酸。
22.編碼具有SEQID NO :6、8或10或它們的變體序列的跨膜蛋白孔亞基的多核苷酸。
23.權(quán)利要求22的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :5、7或9或它們的變體中顯示的序列。
24.一種確定樣本中是否存在分析物的方法，包括(a)將所述樣本與權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)的跨膜蛋白孔在如下條件下接觸如果存在所述分析物則使其移位穿過所述孔并與所述孔相互作用；并且(b)在所述相互作用過程中測量通過所述孔的電流，從而確定所述分析物是否存在。
25.一種測序目標(biāo)核酸序列的方法，包括(a)將所述目標(biāo)核酸推過或拉過權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)的跨膜蛋白孔，使得所述目標(biāo)序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；并且(b)在每個(gè)相互作用過程中測量通過所述孔的電流，從而確定目標(biāo)序列的序列。
26.一種用于測序核酸的試劑盒，包含權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)的跨膜蛋白孔和核酸處理酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及增強(qiáng)荷電分析物通過跨膜蛋白孔的移位。移位是通過增加所述孔的桶或通道和/或入口的凈相反電荷來增強(qiáng)。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明增強(qiáng)的孔。
文檔編號C07K14/31GK102317310SQ200980154651
公開日2012年1月11日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者G·瑪格里亞, J·H·P·貝利 申請人:Isis創(chuàng)新有限公司